昆虫病毒载体及其应用的制作方法

专利名称：昆虫病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明在美国政府资助下完成(环保局的资助号为CR822902，美国农业部的资助号为58-3148-6-029和94-34190-1204，AGRICCREE的授予号为94-39210-0559)。美国政府在本发明中具有一定的权益。
背景技术：
植物中有用化合物(例如治疗剂、化学原料、化妆品和其它消费品)的合成以及用于作物改良的遗传工程(例如遗传工程抗病原体植物)是在全世界具有日益增加的经济重要性和研究价值的植物生物技术的两个领域(Miele，1997；Franken等，1997；Beachy，1997；Ma等，1996；Estruch等，1997；Palmgren，1997)。另外，植物基因组文库和EST文库的可用性正在改变着商业植物生物技术的潜力(Briggs等，1997；McKusick，1997；和Evans等，1997)。特别是，因为许多植物性状例如产量、收获指数、杂种优势和环境胁迫耐性受几种基因协同作用的调节，所以利用基因序列标志和基因组文库，提供了具有商业价值的基因的鉴定方法或所述基因的现成资源。
正在开发基于几种植物病毒的载体，所述植物病毒例如烟草花叶病毒(TMV)、豇豆花叶病毒(CpMV)、雀麦花叶病毒(例如BMV)和马铃薯Y病毒组(Yusibov等，1997；Reimann-Phillip等，1993；Porta等，1996；Johnson等，1997；Kollar等，1993；Pruss等，1997)，以将选定基因导入植物中，以进行有用化合物的合成。基于病毒的载体为基因转移提供了补充农杆菌介导的转化和粒子轰击法的几个不同的优点。病毒载体易于操作，它们可以通过简单的接种而转移，并且它们在转染的植物中允许高水平的表达。然而，现有的基于植物病毒的载体系统有其限制。它们在其植物寄主中可以引起病害，范围从较轻的病害至灾难性病害。此外，它们本质上在田间是从一个植株自然传播至另一个植株，并且在某些情况下它们可以通过花粉或种子传播至下一代。而且，这些病毒的许多病毒的寄主范围窄，并且由于外源基因的可变表达而具有有限的实用性。
罗达病毒(Nodavirus)是小的昆虫来源的无包被二十面体病毒。蚊子(三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、跗斑库蚊(Culex tarsalis)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)和Toxorhynchitesamboinesis)、印度谷斑螟和黑皮蠹(Plodia interpunctella鳞翅目和Attagenus piceus鞘翅目)的幼虫、蜡螟(Galleria mellonella鳞翅目)和蜜蜂(意大利蜜蜂(Apis mellifera)的幼虫是已知被罗达病毒感染、并且其中病毒感染引起麻痹和死亡的其中某些昆虫寄主(Tesh，1980；Bailey和Scott，1972)。代表性罗达病毒包括黑甲虫病毒(BBV)、禽兽棚病毒(FHV)、布拉拉病毒(BOV)和野田村病毒(Nodamura virus)(NOV)。这些病毒是仅有的已知信使有义的、高等或低等动物的二分基因组RNA病毒(关于综述，参见Hendry，1991)。二分基因组植物病毒是已知的，但其基因组部分在分开的病毒体中包衣壳(Bruening，1977)。
罗达病毒的天然寄主是昆虫，然而罗达病毒可以在动物中繁殖(例如，NOV可以感染小鼠并且可能感染猪，参见Bailey和Scott，1972；Scherer和Hurlbut，1967；Scherer等，1968)，最近已经在海洋鱼类中发现罗达病毒(Mori等，1992；Nishizawa等，1995；Frerichs等，1996)，尽管FHV根本不在高等动物细胞中繁殖。另外，FHV在植物中快速繁殖，而不引起病症(Selling等，1990)。FHV可以通过机械摩擦叶片而被导入植物，或者可以通过用含病毒的溶液喷洒叶片而被导入。然而，FHV移动差，或根本不从感染部位转移。
因此，需要将所需的或预选的核酸区段或序列系统或局部转移至植物、而不引起那些植物病害的载体。
发明概述本发明提供一种可用于将基因转移至植物和动物(例如昆虫)的基于重组病毒核酸的基因转移载体。最好是，所述载体衍生自具有一个二分基因组包括单链线性RNA的病毒，例如罗达病毒(Hendry，1991)、香石竹病毒组(Dianthovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)(Matthews，1991)等。因此，本发明提供一种包含连接的核酸序列的生物活性基因转移载体。所述连接的核酸序列包括一段来源于病毒核酸5’端(例如罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的5’端)的核酸序列；一段包含至少一个目的核酸区段的核酸序列；和一段来源于病毒核酸3’端(例如罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的3’端)的核酸序列。所述包含目的核酸区段的核酸序列最好编码植物病毒移动蛋白、植物病毒外壳蛋白(例如天然外壳蛋白或具有与天然外壳蛋白不同特性的修饰外壳蛋白)、生长激素、毒素(例如亚致死毒素，如生长素或Photorhabdus毒素)、细胞因子、抗病性、抗虫性、雄性不育性、可用于疫苗生产的病毒表面上的抗原性部位、或杀虫剂抗性；和/或包含一个合成基因、导向反义RNA序列/修饰植物特性的酶、标记基因或选择标记、或它们的任何组合。最好是，核酸区段包含经修饰以在植物中增强表达的序列。所述核酸区段最好是连接的，以便产生融合多肽。或者，可以将编码蛋白酶解部位的核酸序列导入每种核酸区段之间。任选的是，每种核酸区段可以操作性地连接于一个转录控制单位，例如启动子。本发明的载体可以与以下载体组合其它基于动物病毒的载体、基于植物病毒的载体或其它基于昆虫病毒的载体，例如基于烟草花叶病毒的载体(Beachy，1997)、基于杆状病毒的载体(Schneemann等，1993)或基于痘苗病毒的载体(Ball，1992)。
本发明的一种优选载体在所述载体的5’端和3’端包含罗达病毒核酸，并且编码植物病毒移动蛋白(MP)。MP有助于病毒或病毒核蛋白(遗传物质加“载体蛋白”)从植物细胞转运至植物细胞。因此，MP在具有本发明载体的植物细胞中的表达，导致载体序列传播至周围植物细胞，这导致那些序列的局部或瞬时传播和表达。因此，当需要瞬时或定位表达并且所述表达足够(如在高通量筛选/基因组学(genomics)中)时，与转基因法相比，本发明载体的传播可以显著减少表达筛选时间。另外，由于罗达病毒、香石竹病毒组和烟草脆裂病毒组可以通过简单地机械摩擦叶片而传播，因此基于这些病毒的载体可以用于现有的植物品种上，而无需制备转基因形式。特别是，本发明提供了一种作物改良方法，所述方法避免了制备转基因作物所需的耗时且昂贵的方法，并且避免了与转基因法相关的种子库和种质保藏中心的外源基因污染的可能性。
本发明还提供一种将预选核酸序列导入宿主细胞的方法。该方法包括使宿主细胞与表达所述预选核酸序列有效量的本发明载体接触，而无需产生感染性病毒粒子。如果所述宿主是一种有机体，没有感染性病毒则完全消除了任何意外的和不希望有的对宿主(例如昆虫或人类)的威胁。最好是，对于植物宿主而言，所述接触包括机械摩擦例如叶片。
本发明还提供可用于将基因转移至宿主细胞的组合物。本发明组合物的一个实施方案包括(a)一定量的编码病毒聚合酶(复制酶)的核酸，例如罗达病毒RNA-1；和(b)一定量的重组核酸。所述重组核酸包含一段衍生自病毒核酸5’端(例如罗达病毒RNA-2的5’端)的核酸序列；包含至少一种目的核酸区段的核酸序列；和一段衍生自病毒核酸3’端(例如罗达病毒RNA-2的3’端)的核酸序列。在本发明组合物中存在编码病毒复制酶的核酸(例如罗达病毒的RNA-1)，使得与编码所述复制酶的核酸共转移至宿主细胞的核酸分子能够扩增。另一方面，复制酶可以由宿主细胞编码。编码复制酶的优选核酸序列包括FHVRNA-1。RNA分子可以在体外制备，例如用T7、T3或SP6聚合酶制备，或者通过从病毒体中分离或从培养的已经用本发明的RNA或DNA分子或组合物转染或已经接触所述RNA或RNA分子或组合物的细胞(例如啮齿动物、果蝇属(Drosophilia)或昆虫细胞)中分离，制备RNA分子。
如果需要系统转移目的基因，则本发明组合物中的核酸序列之一最好编码一种CP，并且任选地也编码一种MP，使得所述载体传播至维管组织(韧皮部)。CP和MP的表达可以允许高产量地合成所需化合物，并且可能导致赋予所有植物组织抗病性。如下所述，可以制备用于系统感染植物的基于FHV的载体，所述载体包括烟草花叶病毒的30kDa移动蛋白(TMV MP；Deom等，1992)和红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV；Xiong等，1993)的外壳蛋白。为了监测载体通过植物的移动，可以将标记基因例如编码绿色荧光蛋白(GFP，Epel等，1996；和Casper等，1996)的基因导入所述载体中。GFP是一种最早从水母(维多利亚水母(Aequorea victoria))(Av)中分离的具有238个氨基酸残基的蛋白。它吸收蓝光，在395nm有最大吸收，并且发射发射峰在590nm的绿光。当GFP在或者原核细胞或者真核细胞中表达时，它能够在用蓝光激发时产生强绿色荧光，并且这种荧光不需要来自其宿主的额外基因产物。
因此，本发明的载体和组合物可以用来合成所需的药理学化合物或其它因子，例如编码抗虫性的因子，还可以用于高通量筛选尚未鉴定的遗传物质，例如来自抗杀虫剂植物的尚未鉴定的遗传物质或编码有用性状的昆虫核酸。例如，将尚未鉴定的来自抗虫植物的遗传物质导入本发明载体中，然后由其表达RNA，并且制备本发明的组合物。使易感所述害虫的植物接触所述组合物，最好通过喷洒接触，然后将其暴露于害虫侵袭。表现出抗性迹象的叶片指示出所导入的遗传物质可以编码抗虫性。
因此，本发明也提供一种用于昆虫和人类的发育基因、调节基因以及抗药性基因和毒性基因的快速检测系统。
对于其中要表达重组蛋白、然后从所述宿主植物中分离所述重组蛋白(例如药用化合物)的应用，最好将本发明的组合物通过摩擦或喷洒施用于所述植物。例如，所述植物的接触区可以使得仅所述植物的叶片接触所述组合物，例如，其叶片没有经济价值的植物，如块茎作物。所述蛋白一经在该植物中表达，就可以从所述植物或其组织中分离和/或纯化所述重组蛋白。
也提供了一种在宿主细胞或宿主中表达预选核酸分子的方法。所述方法包括使宿主细胞或宿主与一定量的本发明组合物接触。优选的组合物包括重组病毒、分离的病毒体RNA、体外制备的RNA转录物或它们的任何组合。然后检测或测定目的基因的表达。因此，本发明还提供一种转基因宿主，其基因组增加了本发明的载体。
对于本发明的基因转移载体和组合物的优选植物宿主包括转基因和非转基因的单子叶植物和双子叶植物，例如芸苔属(Brassica)、甜玉米、黄瓜、大麦、土荆芥例如杂配藜(Chenopofium hybridum)、豇豆、烟草和Nicotiana benthamiana等。所述植物宿主最好是对罗达病毒感染易感的。
附图简述


图1.禽兽棚病毒(FHV)的基因组组构。FHV是一种直径为30nin、具有二分基因组的小二十面体病毒。RNA-1是加帽的，长约3.1kb，并且编码一种约112kDa的复制酶。RNA-2是加帽的，长约1.4kb，并且编码一种44kDa的外壳/衣壳蛋白前体。RNA-3也是加帽的，长约0.39kb，编码一种11.6kDa蛋白。3’末端的实心圆表示这些末端是遮蔽或封闭的。RNA-1和RNA-2两者在同一病毒体中包衣壳。
图2.FHV RNA-2和缺陷干扰型RNA DI-634的结构。DI-634是一种RNA-2的634b自发缺失产物，该产物被有效地复制并包装到病毒体中。标记I、II、III的区段对应于来自FHV RNA-2的5’端、中部和3’端的序列；细线代表从RNA-2缺失的区域。
图3.FHV RNA-2复制所需的顺式作用序列。(A)实心带表示FHVRNA-2的全长cDNA克隆或缺失突变体中存在的cDNA的序列。细线代表缺失的(Δ)碱基，所述缺失的碱基示于每个构建体的右侧。如Zhong等(1992)所述，测定相对于全长克隆(100％)的缺失突变体的复制效率。复制效率非常差的突变体用箭头指示。(B)实心块表示FHVRNA-2复制必需的三个区段。
图4.罗达病毒的RNA-2s中推定包衣壳序列的计算机预测的茎-环结构。FHV、BBV、BOV和NOV的RNA-2s总长分别是1400、1399、1305和1355个碱基(Dasgupta和Sgro，1989)。
图5.显示植物中FHV合成的检测方法的示意图。如Selling等(1990)所述，用FHV RNA接种多种植物种的单个叶片。通过噬斑测定检测，在得自大麦、土荆芥、豇豆和Nivotiana brnthamiana的接种叶片的大多数匀浆中发现FHV的感染性。
图6.RCNMV的基因组组构。RNA-1和RNA-2以实线表示，而ORF以空心框表示。ORF之上或之下的数字表示ORF起始密码子和终止密码子的位置。RNA-1中的核糖体移码区以阴影框标记。预测并观察到的蛋白产物以实心框表示。RCNMV蛋白的已知功能(Matthews，1991)在每种蛋白之下描述。
图7.载体构建、RNA制备、接种和检测的一般策略。
图8.编码绿色荧光蛋白(GFP)的基于罗达病毒RNA-2的载体的构建。用含NsiI位点的引物，通过PCR从TMV cDNA克隆p30BGFPC3中扩增GFP序列。用NsiI消化这种PCR产物和FHV cDNA克隆pBWD2，然后进行连接和转化，产生FHV RNA-2GFP嵌合体pF2G3。显示了核苷酸位置和特有限制位点。
图9.编码烟草花叶病毒移动蛋白(TMV MP)和GFP的基于罗达病毒DI的载体的构建。用含Sac I位点的引物，通过PCR从TMVcDNA克隆p30BGFPC3中扩增GFP序列和MP序列。用Sac I消化这种PCR产物和FHV DI cDNA克隆pD1634，然后进行连接和转化，产生FHV DITMV MPGFP嵌合体pFdTmG3。显示了核苷酸位置和特有限制位点。
图10.编码TMV MP、红三叶草坏死花叶病毒外壳蛋白(RCNMVCP)和GFP的基于罗达病毒DI的载体的构建。从RCNMV cDNA克隆pRC1中扩增RCNMV外壳蛋白序列，将其插入上述pFdTmG3的MP和GFP序列之间，产生pFdTmRcG3。T3＝T3启动子；T7＝T7启动子；RBZ＝核酶。
图11.基于FHV的载体构建体在Nicotiana benthamiana植株上的监视表达。用利用T3或T7 RNA聚合酶体外制备的RNA转录物摩擦叶片，接种叶片。所有植物用作为FHV复制酶来源的FHV RNA-1共同接种。
图12.从TMV MP转基因植株或RCNMV MP转基因植株的N.benthamiana接种叶片和从第二片叶片提取的RNA的RT-PCR。1道；用作模板的纯化的FHV RNA-2(800ng)。2道；模拟(缓冲液)接种的叶片。3道；野生型(非转基因)植株的接种叶片。4道；野生型植株的非接种第二片叶片。5道；TMV MP转基因植株的接种叶片。6道；TMV MP转基因植株的非接种第二片叶片。7道；RCNMV MP转基因植株的接种叶片。8道；RCNMV MP转基因植株的非接种第二片叶片。9道；标记。箭头表示对应于全长FHV RNA-2(1.4kb)的PCR产物。TMV MP和RCNMV MP都使FHV移动至非接种的第二片叶片。
图13A.表达GFP的N.benthamiana植株的叶片。用来自TMV表达载体30BGFPC3(一种10.4kb质粒，含有TMV复制酶、所述30kDa MP、GFP和CP)的1μgRNA转录物接种表达TMV MP的2周龄转基因植株。接种后10天，将植株置于两个长波UV灯之间，并且用Sony 3CCD彩色摄像机(DXC-960MD型)拍摄照片。
图13B.表达GFP的N.benthamiana植株的照片。条件与
图13A中的条件一样，只是用Minolta MaMaxxum 7000i照相机和1000 ASAKodak Ectachrome胶片拍照。将胶片曝光4秒。
图14.在与
图13所述的相同条件下培养和拍照的未接种N.benthamiana植株的叶片。请注意，叶片由于UV灯而呈紫色，但没有观察到绿色荧光。
图15.一种含系统获得性抗性基因SAR 8.2的质粒pCGN1788A的图谱。将BamHI-SstI片段(529bp)引入基于FHV的载体pFdTmRcG3中。
图16.四种Photorhabdus毒素(Pht)基因座-tca、tcb、tcc和tcd的图谱。在每个基因座之下显示了用于基因破坏的限制位点。阴影显示假定蛋白酶切割位点周围的TcaB、TcbA和TcdA之间相似性的区域。将来自基因座tca和tcd的片段(Bowen等，1998)亚克隆到我们的基于FHV的载体pFdTmRcG3中，并测试其毒性。
图17.植株中FHV的产量。通过在果蝇属细胞单层上进行叶片匀浆的噬斑测定，测定产量。产量以每mg叶片组织(100-500mg)的噬斑形成单位(pfu)表示。注意到与非转化(野生型)植株相比，在转基因N.benthamiana植株中100倍的增加。
发明详述I.罗达病毒的复制和传播A.罗达病毒的基因组组构
图1显示了代表性罗达病毒FHV的基因组策略。RNA-1和RNA-2是在一个病毒体中包衣壳的有义RNA。FHV RNA-1(3106个碱基)编码称为A的蛋白(112kDa)，该蛋白负责聚合酶(复制酶)活性。FHVRNA-2(1400个碱基)指导称为α的病毒体衣壳前体(44kDa)的合成，该前体被加工成成熟外壳蛋白(称为β；39kDa)和一个小的4.4kDa蛋白，称为γ。感染FHV的细胞产生一个额外的信使-RNA-3(389个碱基)，编码一种称为B的蛋白(11.6kDa)。RNA-3是一种在RNA-1的3’端含有的亚基因组信使RNA，它不被包衣壳到病毒体中。B蛋白参与聚合酶的功能。所有罗达病毒RNA都在其5’端加帽(m7GpppGp)，并且与任何其它已知的RNA病毒不同，它们的3’末端是被遮蔽或封闭的，如甚至在变性条件下都抗修饰所证实的(Dasgupta等，1984)。
两种基因组RNA的cDNA克隆都可得到，并且由这些克隆制备的体外RNA转录物都具有感染性，并且产生真正的后代病毒体(Dasmahapatra等，1986)。
B.持久性感染和DI RNA的产生在体外，罗达病毒在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞中生长旺盛(Friesen和Rueckert，1981)，并且可以通过噬斑形成定量测定(Selling和Rueckert，1984)。当用FHV以低感染复数(m.o.i.)或高感染复数例如0.1-10感染黑腹果蝇细胞时，病毒引起广泛的细胞病效应并且细胞在3天内死亡。然而，在每轮感染循环中有约1％的感染细胞存活。这些细胞抗FHV和其它相关罗达病毒如BBV(Longworth和Archibald，1975)和BOV(Reinganum等，1985)的超感染。这些感染细胞是病毒源，可以以相似的效率裂解新鲜细胞。因此，这些细胞是以非裂解方式持久性感染的。
来自10个这些持久性感染细胞系的病毒RNA在放线菌素D存在下用3H-尿苷标记，并且在琼脂糖凝胶上分析。放射自显影图表明，在10个系中的至少4个系中，除基因组RNA外还存在小RNA(Selling，1986)。这些较小的RNA中的某些在从持久性感染细胞中纯化的病毒体中发现，表明这些较小的RNA含有复制和包装信号。新鲜的果蝇属细胞用这些RNA加病毒体RNA转染，与野生型FHV相比，引起对噬斑形成的1000倍抑制。这提示，这些RNA与基因组RNA竞争复制，并且干扰基因组RNA的复制，并且可能是复制和包衣壳的更好的模板。这些RNA称为缺陷干扰性(DI)RNA分子。
C.DI RNA的结构DI RNA的酶测序(Dasgupta等，1980)表明，它们保留与病毒体RNA 3’端和5’端相同的序列。对应于FHV RNA-1序列(Dasmahapatra等，1985)和RNA-2序列(Dasgupta和Sgro，1989)的末端的寡核苷酸引物用来在pUC13和pBS+载体中制备cDNA克隆。然后通过双脱氧核苷酸链终止法，用测序酶(United States Biochemicals，Kraft等，1988)对这些cDNA测序。对7种DI RNA分子进行测序。其中6种衍生自基因组RNA-2，而其中一种衍生自基因组RNA-1。根据其结构，衍生自RNA-2的DI RNA分为三组最简单形式的DI(DI-634)，示于图2，由于RNA-2中的两个主要缺失而产生；它保留了得自RNA-25’端的前249个碱基、中部(碱基517-728)和3’端(碱基1228-1400)。没有序列重排。
另一种类型的RNA-2衍生的DI RNA序列具有更为复杂的结构。它们保留了得自基因组RNA 5’端的前15个或41个碱基，然后是得自基因组RNA-2中部的碱基75-249和碱基517-728。这些DI分子的3’一半包括得自RNA-2的5’端和3’端的序列重排。3’端的48个碱基(1353-1400)与基因组RNA-2共线性。
再一种形式的RNA-2衍生的DI保留一段得自5’端的249个碱基，而结构的其余部分包括上述的重排。
衍生自RNA-1的DI RNA保留了得自基因组RNA的三个部分两个末端和中部。有趣的是，虽然结构有变异，但所有这些DI RNA均具有相似的长度；约一半与其相应的基因组RNA一样长。例如，衍生自基因组RNA-2的DI长630-680个碱基，衍生自RNA-1的一个DI长1395个碱基(基因组RNA-1和RNA-2分别为3106个碱基和1400个碱基)。
D.FHV RNA-2的复制和包衣壳信号通过一系列缺失和体外诱变，修饰FHV RNA-2以及DI RNA的cDNA克隆，并且分析其复制和包衣壳活性。图3是显示由RNA-2的cDNA克隆构建的缺失突变体的示意图。得自这些突变体的转录物用来转染果蝇属细胞，并且测定12小时后合成的RNA(Zhong等，1992)。发现得自5’端的60个碱基、147个碱基的内部区(碱基470-616)和3’端最后51个碱基(1350-1400)的一段序列对于FHV RNA-2的有效复制是重要的(B图；分别为区段I、II和III)。当缺失这些区时，RNA-2的体内复制非常差(在图3A中由箭头表示)。
用DI RNA(DI 634，示于图2)对包衣壳信号的相似研究表明，RNA-2的32碱基区(碱基186-217)是有效包装到病毒体中所需的。该区的缺失完全消除了DI RNA包装到病毒体中，但对复制没有影响。已经预测到该序列形成茎-环结构(示于图4)，茎环结构在所有罗达病毒RNA-2s中是保留的(Zhong等，1992)。也发现相似的茎-环结构在酵母的L-A病毒噬菌体Qβ和R17中以及在日冕病毒(Coronaviruses)中用作包装信号。
F.FHV在植物中的繁殖病毒在宿主植物中的繁殖涉及在各种各样组织中的病毒移动/复制。病毒在感染后进入受伤细胞，并且合成其自身的蛋白。病毒编码的非结构蛋白之一-移动蛋白(MP)使得感染性核蛋白得以在细胞之间移动，直至感染达到维管组织。
在称为微管或长距离移动的第二个步骤中，整株植株被感染。为此，感染性核蛋白必须进入维管组织、在维管组织中移动并离开维管组织。研究表明，MP是细胞至细胞移动所需的，但仅MP不足以引起系统感染。在大多数植物病毒中，长距离移动需要外壳蛋白(CP)和宿主因子(关于综述，参见Seron等，1996；Deom等，1992)。
为了确定FHV是否在植株中复制，用FHV RNA接种该植株。在暴露于FHV RNA的大麦(Hordeum vulgare)、豇豆(Vigna sinensis)、土荆芥(杂配藜)、Nicotianabenthamiana(Selling，1990)、水稻、苜蓿、甜玉米、芸苔属植物、黄瓜和拟南芥属(
图17，数据未显示)的整株植株中以及在得自大麦叶片和烟草叶片的原生质体(图5和表1)中，已经检测到新合成的病毒体。
表1接触病毒后的病毒体产生+
+得自Selling，1990在大麦原生质体中，病毒的产量是每个原生质体130pfu，这代表估计最小约3％的原生质体合成病毒体。植株中产生的病毒体含有新合成的RNA以及新合成的衣壳蛋白。时程实验表明，FHV在大麦原生质体中的合成与FHV天然昆虫细胞系宿主(黑腹果蝇)在相当的转染条件下发现的合成相当(Selling等，1990)。由1g大麦原生质体产生约1.4mg FHV，这证明非常高表达水平。
在两片接种的大麦叶片中，FHV产量为每片叶片180和3800pfu(基于果蝇属细胞上的标准FHV噬斑测定)。用FHV感染的土荆芥、豇豆和N.benthamiana观察到的最大平均产量，分别为每片叶片3.4×105、4.2×105和1.2×105pfu(
图17)。
在N.benthamiana中，用FHV RNA接种产生的病毒体不仅在接种叶片中检测到，而且在接种植株的其它叶片中检测到，表明病毒体可以在该植物种中移动。然而，在N.benthamiana中，这种移动限于接种叶片之上和之下的三个叶片。此外，感染性随时间而降低。这可能是由于病毒体在植物中的不稳定性和/或病毒体传播离开接种部位。这些结果表明，植物中的胞内环境适合于仅对昆虫正常固有的病毒的合成，虽然在植物中细胞至细胞移动所必需的病毒编码的蛋白可能不由FHV编码。
II.本发明的载体A.病毒序列本发明的载体包含那些序列传播至细胞所必需的病毒序列以及与所述病毒序列连接的目的序列。因此，所述载体包含顺式的必需非编码序列，即罗达病毒、烟草脆裂病毒组或香石竹病毒组核酸的5’端和3’端；和该载体传播至其它细胞所必需的反式作用序列，即编码病毒MP和/或CP的序列。香石竹病毒组包括香石竹环斑病毒、红三叶草坏死花叶病毒、草木樨坏死花叶病毒和furcraea坏死线条病毒。烟草脆裂病毒组包括豌豆早枯病毒、胡椒环斑病毒、烟草脆裂病毒和哈特舌厥病毒。对于在细胞内扩增载体序列，可以使用病毒复制酶。所述复制酶可以由宿主细胞基因组编码、由在导入所述载体之前、同时或随后导入宿主细胞中的核酸序列编码，或由所述载体编码。
本发明的载体可以编码任何病毒MP，包括但不限于以下病毒的移动蛋白鸭跖草黄斑驳病毒(CoMYV)、CaMV、甘蔗杆状病毒(ScBV)、东格鲁水稻杆状病毒(RTBV)、香石竹蚀环病毒(CERV)、玄参花叶病毒(FMV)、大豆褪绿斑驳病毒(SoyCMV)、菽麻花叶病毒(Deom等，1997)、烟草坏死病毒(Molnar等，1997)、烟草花叶病毒(Slovyev等，1996)、双生病毒群(Sung等，1995)、马铃薯X病毒组、大麦病毒和甜菜黄化病毒(Agranovsky等，1998)、苜蓿花叶病毒(vander Vossen等，1995)、花生褪绿条线病毒(Ducasse等，1995)、菊芋斑皱病毒(Tavassa等，1994)、大麦条纹花叶病毒(Weiland等，1994)、豇豆花叶病毒(Wellink等，1993)、甜菜黄花叶病毒(Karasev等，1992)和芜菁皱叶病毒(Hacker等，1992)。
对于植物的系统和/或局部感染，本发明的载体最好编码一种植物病毒CP。典型的外壳蛋白包括但不限于以下病毒的外壳蛋白番茄丛矮病毒(TBSV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)、黄瓜坏死病毒(CNV)、番茄金花叶病毒(TGMV)、菜豆金花叶病毒(BGMV)、番茄曲叶病毒(TLCV)、南瓜曲叶病毒(SqLCV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、马铃薯Y病毒组、南瓜花叶病毒、大蒜病毒A(Helguera等，1997)、葡萄铬黄花叶病毒(Torregrosa等，1997)、马铃薯病毒Y和马铃薯卷叶病毒(Zhang等，1997)、水稻矮缩病毒(Zheng等，1997)、甜菜坏死黄脉病毒(Fecker等，1996)、蒙大拿大麦黄矮病毒(Geske等，1996)、番木瓜环斑病毒(Scorza等，1995)、豌豆早枯病毒(MacFarlane等，1995)、水稻黄斑驳病毒(Brugidou等，1995)、苹果和梨茎陷斑病毒(Jelkmann，1994)、莴苣侵染性黄化病毒、甜菜黄化病毒和柑橘衰退病毒(Klassen等，1994)、马铃薯病毒X(Truve等，1993)、洋李痘疱病毒(Ravelonandro等，1992)、建兰花叶病毒和白三叶草花叶病毒(Chia等，1992)、黄瓜花叶病毒(Slightom，1991)、苜蓿花叶病毒(Neelman等，1991)、豇豆褪绿斑驳病毒(Allison等，1990)和铬黄花叶病毒(Sacher等，1989)、烟草花叶病毒、花椰菜花叶病毒、芜菁黄花叶病毒、番茄不孕病毒、甜菜坏死黄脉病毒、芜菁皱缩病毒、烟草脆裂病毒、建兰环斑病毒、豇豆褪绿斑驳病毒、烟草蚀纹病毒、甜菜西部黄化病毒、南部菜豆花叶病毒、菽麻花叶病毒、烟草蚀纹病毒、豇豆花叶病毒、玉米线条病毒、甜菜曲顶病毒和番茄卷叶病毒(参见例如Nelson和van Bel，1998的表1、2和3，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中)。
B.用于在植物中表达的其它序列预选基因在植物中的表达可以通过多种元件或机制增强，包括加入启动子、增强子、内含子、前导序列和3’序列以及用植物中优选的密码子取代非植物基因中的天然密码子(Murry等，1989；Perlak等，1991)和除去富含AT的序列、除去或改变隐蔽poly A序列和除去或改变mRNA去稳定序列。
1.启动子、增强子、内含子、前导序列和其它调节序列本发明载体中的预选核酸区段最好有效连接于提供所述预选核酸区段表达的启动子。所述启动子最好是在引入所述载体的宿主细胞(例如植物和/或种子)中有功能的启动子。当预选核酸序列位于所述启动子下游时，将预选核酸序列有效连接于所述启动子。
大多数基因具有称为启动子的核酸区，启动子调节基因的表达。对于基因组DNA所编码的基因，在原核细胞和真核细胞中，启动子区都通常发现于编码序列上游的侧翼DNA中。启动子序列可供用于调节下游基因序列的转录，通常包括约50至约2,000个核苷酸碱基对。启动子序列也含有可以影响基因表达水平的调节序列，例如增强子序列。某些分离的启动子序列可供用于异源DNA的基因表达，异源DNA是一种不同于天然DNA或同源DNA的DNA。
也已知启动子序列有强启动子序列或弱启动子序列、或诱导型启动子序列。强启动子提供高水平的基因表达，而弱启动子提供非常低水平的基因表达。诱导型启动子是一种提供对外部加入的因子或对环境刺激或发育刺激应答的基因表达开关的启动子。根据加入转化细菌细胞的异丙基硫代半乳糖苷的水平，例如Ptac启动子的细菌启动子可以被诱导至不同的基因表达水平。启动子也可以提供组织特异性或发育调节。对于异源核酸为强启动子的分离的启动子序列是有利的，因为它提供足够的基因表达水平，以使得易于检测和选择转化细胞，并且当需要时提供高水平的基因表达。
优选的植物启动子包括但不限于例如以下的启动子CaMV 35S启动子(Odell等，1985)、增强的35S启动子(Kay等，1987)或其它启动子例如CaMV 19S(Lawton等，1987)、nos、Adhl(Walker等，1987)、蔗糖合酶(Yang等，1990)、α-微管蛋白、遍在蛋白、肌动蛋白(Wang等，1992)、cab(Sullivan等，1989)、PEPCase(Hudspeth等，1989)或与R基因复合体相关的那些启动子(Chandler等，1989)。其它合适的启动子包括来自编码Z4 22kDα-玉米醇溶蛋白的基因的Z4启动子、来自编码10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10启动子、来自编码27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27启动子、来自编码19kDα-玉米醇溶蛋白的基因的A20启动子；诱导型启动子，例如得自豌豆rbcS基因的光诱导型启动子(Coruzzi等，1971)和水稻的肌动蛋白启动子(McElroy等，1990)；也可以使用种子特异性启动子，例如得自菜豆的菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan，1985)。可用于实施本发明的其它启动子是本领域技术人员已知的。
可以用标准方法，例如Sambrook等所述的方法(参见上文)，将预选核酸例如一种DNA序列与所述启动子结合，产生一种表达盒。简而言之，可以如Jefferson(1987)中所述，构建含有启动子例如35SCaMV启动子的质粒，或者可以从加州Palo Alto的Clontech Lab获得所述质粒(例如pBI121或pBI221)。通常，构建这些质粒，使其具有对启动子下游的不同限制性酶具有特异性的多克隆位点。可以用限制性酶将所述预选DNA序列亚克隆在所述启动子下游，并将其定位，以确保所述DNA以相对于所述启动子的正确方向插入，使得所述DNA可以作为有义或反义RNA表达。一旦将所述预选DNA序列有效连接于一个启动子，则可以将如此形成的表达盒亚克隆到本发明的载体中。
一旦获得所述预选的有义DNA序列，则可以将全部或部分所述序列以相反方向(即3’至5’)亚克隆到一个表达载体(参见下文)中。同样，可以将全部或部分所述预选DNA序列以有义方向(即5’至3’)亚克隆。将所述预选DNA序列亚克隆到启动子下游，以形成表达盒。
需要时，可以还包括调节元件，例如Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)或TMVΩ元件(Gallie等，1989)以及病毒亚基因组序列，例如病毒亚基因组RNA序列。
由于转录起始位点和编码序列起始之间的DNA序列(即非翻译前导序列)可以影响基因表达，因此人们也可能希望使用特定的前导序列。优选的前导序列设计包括那些序列，所述序列包括预测指导所连接的基因最佳表达的序列，即包括可以增加或保持mRNA稳定性并防止不当起始翻译的优选的共有前导序列。根据本说明书，这类序列的选择是本领域技术人员已知的。最优选得自在植物中高表达基因的序列。
设想了可以构建包括ocs增强子元件的按照本发明使用的载体。该元件最早鉴定为来自农杆菌章鱼碱合酶(ocs)基因的16bp回文增强子，并且存在于至少10个其它启动子中(Bouchez等，1989)。提出应用增强子元件例如ocs元件、特别是多拷贝的该元件，将用来提高来自相邻启动子的转录水平。
最后，用于导入植物的最理想的核酸区段可以是编码所需性状(例如提高每公顷产量)的同源基因或基因家族，这类基因或基因家族被引入置于新型启动子或增强子等、或也许甚至是同源组织特异性(例如根特异性、根颈/鞘特异性、轮生体特异性、茎(stalk)特异性、耳柄(earshank)特异性、籽粒特异性或叶特异性)启动子或控制元件的控制之下。实际上，设计了本发明的一个具体应用是以组织特异性方式引导基因。例如，可以在分别为第一窝和第二窝ECB的靶的轮生体和根颈/鞘组织中特异性地表达抗虫基因。同样，可以将具有特定抗根虫活性的蛋白的编码基因直接导向根组织。
用于将基因在转基因植物中组织特异性导向的载体，通常包括组织特异性启动子，也可以包括其它组织特异性控制元件，例如增强子序列。根据本发明的公开内容，在某些植物组织中指导特异性的或增强的表达的启动子是本领域技术人员已知的。这些包括例如rbcS启动子，它为绿色组织特异性的；ocs、nos和mas启动子，它们在根组织或受伤叶片组织中的活性较高；截短的(-90至+8)35S启动子，它指导根中增强的表达；指导在根中表达的α-微管蛋白基因和得自玉米醇溶蛋白贮藏蛋白基因的指导在胚乳中表达的启动子。特别考虑到，人们可以方便地利用得自章鱼碱合酶(ocs)基因(Bonchez等，1989)的16bp ocs增强子元件，特别是当以多拷贝存在时，以达到增强根中的表达。
也考虑了，通过导入与仅在不需要所述基因产物的组织中表达的反义基因结合的组成型表达的基因(所有组织)，可以功能性地完成组织特异性表达。例如，可以导入编码苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)(Bt)晶体毒素的基因，使得利用花椰菜花叶病毒的35S启动子将其在所有组织中表达。利用例如玉米醇溶蛋白启动子使所述Bt基因的反义转录物在玉米籽粒中表达，可能防止该Bt蛋白在种子中积累。因此，由所导入基因编码的蛋白可以存在于除籽粒之外的所有组织中。
另一方面，人们可能希望获得按照本发明使用的新型组织特异性启动子序列。为此，人们可以首先从所涉及的组织中分离cDNA克隆，并且例如应用RNA印迹法鉴定在该组织中特异性表达的那些克隆。最好是，人们想要鉴定不以高拷贝数存在、但基因产物在特定组织中相对丰富的基因。然后可以用本领域技术人员已知的技术，将相应的基因组克隆的启动子和控制元件定位。
设想了仅需要在特定条件下在转基因植物中表达某些基因。例如，提出赋予对环境胁迫因素(例如干旱)抗性的某些基因仅需要在真正的胁迫条件下表达。设想了这类基因在植物的整个发育期间的表达可能具有有害效应。已知存在着大量对环境应答的基因。例如，由光通过植物光敏素介导调节某些基因、例如编码核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的rbcS的表达。其它基因由次级刺激物诱导。例如，脱落酸(ABA)的合成由某些环境因素诱导，包括但不限于水胁迫。已经表明许多基因由ABA诱导(Skriver和Mundy，1990)。也考虑了可以仅需要在实际遭受虫害的条件下表达赋予对昆虫捕食的抗性基因。因此，对于某些所需性状，将需要在转基因植物中诱导型地表达基因。
在本发明的某些实施方案中，提出仅需要在植物发育的某个时期在转基因植物中表达基因。发育的定时通常与组织特异性基因表达相关。例如，在传粉后约15天在胚乳中启动玉米醇溶蛋白贮藏蛋白的表达。
2.胞内或胞外导向序列另外，可以构建表达盒，并用其将所述预选核酸序列或区段的产物导向植物细胞内的胞内区室，或将蛋白导向胞外环境。这通常可以通过将编码转运肽或信号肽序列的DNA序列连接至所述预选DNA序列的编码序列上来完成。所产生的转运肽或信号肽分别将所述蛋白运转至特定的胞内或胞外目的地，然后可以翻译后除去所述转运肽或信号肽。转运肽通过促进蛋白穿过胞内膜转运(例如液泡、囊泡、质体和线粒体膜)而起作用，而信号肽引导蛋白穿过胞外膜。这些序列通过促进所述蛋白转运到细胞内或细胞外的区室中，可以在特定位点增加特定基因产物的积累。例如，参见美国专利第5,258,300号。
这种应用的一个具体实例涉及将除草剂抗性基因(例如EPSPS基因)导向特定的细胞器，例如导向叶绿体，而不是导向胞质。其实例是应用提供蛋白质体特异性导向的rbcS转运肽。另外，提出可能希望将负责雄性不育的某些基因导向线粒体，或将抗致植物病有机体抗性的基因导向胞外间隙，或将蛋白导向液泡。
也设想了将细胞内的DNA本身定向可能是有用的。例如，将所导入的DNA导向细胞核可能是有用的，因为这可以提高转化频率。在细胞核本身中，使基因定向以便达到定点整合可能是有用的。例如，用通过转化导入的基因取代细胞中的现有基因可能是有用。
3.3’序列当要将表达盒导入植物细胞中时，所述表达盒也可以可选地包括作为终止转录的信号并且使得所产生的mRNA聚腺苷酸化的3’非翻译调节DNA序列。所述3’非翻译调节DNA序列优选包括约50个至约1,000个、更优选约100个至约1,000个核苷酸碱基对，并且含有植物转录和翻译终止序列。优选的3’元件衍生自得自根癌农杆菌的胭脂碱合酶基因的那些元件(Bevan等，1983)、得自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子、和得自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’端，虽然也可以使用本领域技术人员已知的其它3’元件。这些3’非翻译调节序列可以如An(1987)所述获得，或已经存在于可得自商业来源例如Clontech，Palo Alto，Califomia的质粒。可以用标准方法，将所述3’非翻译调节序列有效连接于所述预选DNA序列的3’末端。
4.选择标记或可筛选标记为了提高鉴定转化子的能力，人们可能希望应用选择标记基因或可筛选标记基因，或者除所述预选核酸序列或区段以外，应用选择标记基因或可筛选标记基因。“标记基因”是赋予表达所述标记基因的细胞特定表型、并因此使得这类转化细胞区别于不具有所述标记的细胞的基因。根据所述标记是否赋予一种可以通过化学方法(即通过应用选择剂(例如除草剂、抗生素等))“选择”的性状、或者它是否是仅仅通过观察或测试即通过“筛选”而鉴定的性状(例如R基因座性状)，这类基因可以编码或者选择标记或者可筛选标记。当然，合适的标记基因的许多实例是本领域已知的，并且可以用于实施本发明。
在术语选择标记基因或可筛选标记基因中也包括编码“可分泌标记”的基因，可以检测所述可分泌标记的分泌，作为鉴定或选择转化细胞的手段。实例包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原的标记、或甚至可以通过其催化活性检测的可分泌的酶。可分泌蛋白属于许多类别，包括可例如通过ELISA检测的小的可扩散蛋白；可在胞外溶液检测的小的活性酶(例如α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素、乙酰转移酶)；和插入或陷入细胞壁中的蛋白(例如包括例如在伸展蛋白的表达单位或烟草PR-S中发现的前导序列的蛋白)。
关于可分泌的选择标记，考虑到将汇集在细胞壁中的多肽的编码基因的应用特别有利，所述多肽包括独特表位(unique epitope)。这种分泌的抗原标记理想的是应用在植物组织中提供低背景的表位序列、将赋予有效表达和引导跨越质膜的启动子前导序列，并且将产生在细胞壁中结合的蛋白且不为抗体所及。经修饰以包括一个独特表位的正常分泌的胞壁蛋白，将满足所有上述要求。
适合于以这种方式修饰的蛋白的一个实例是伸展蛋白或富羟脯氨酸糖蛋白(HPRG)。最好应用玉米HipRG(Stiewfel等，1990)，因为该分子已经在分子生物学、表达和蛋白结构方面进行了很好的表征。然而，可以通过加入抗原性位点以产生可筛选标记，修饰多种伸展蛋白和/或富甘氨酸胞壁蛋白(Keller等，1989)中的任何一种。
通过应用特定的标记基因，详细地例举了本发明公开内容的元件。然而，根据本说明书，除下文所提出的选择标记基因和/或可筛选标记基因外，许多其它可能的选择标记基因和/或可筛选标记基因对于本领域技术人员是显而易见的。因此，人们会理解，以下讨论是示例性的，而不是详尽的。根据本文公开的技术和本领域已知的一般重组技术，本发明使得有可能将任何基因(包括标记基因)导入受体细胞中，以产生转化植物细胞，例如单子叶植物细胞。
可能的结合本发明使用的选择标记包括但不限于neo基因(Potrykus等，1985)，它编码卡那霉素抗性，并且可以根据应用卡那霉素、G418进行选择；编码博来霉素抗性的基因等等；bar基因，它编码双丙氨膦抗性；编码改变的EPSP合酶蛋白(Hinchee等，1988)并因此赋予草甘膦抗性的基因；腈水解酶基因，例如来自鼻臭克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，它赋予溴苯腈抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化学物质的抗性(欧洲专利申请154,204,1985)；氨甲蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)；茅草枯脱卤素酶基因，它赋予除草剂茅草枯的抗性；或突变的邻氨基苯甲酸合酶基因，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性。当使用突变的EPSP合酶基因时，通过加入合适的叶绿体转运肽CTP(欧洲专利申请0 218 571,1987)，可以获得额外的益处。
能够用于筛选转化子的系统中的选择标记基因的一个说明性实施方案，是编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因，例如来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因或来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因(美国专利第5,550,3 18号，该专利通过引用结合到本文中)。膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)将除草剂双丙氨膦、膦丝菌素(PPT)中的有效成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami等，1986；Twell等，1989)，引起氨的快速积累并引起细胞死亡。这种选择系统在单子叶植物中成功的应用尤其令人惊讶，因为据报道在谷类作物转化中有很大困难(Potrykus，1989)。
可以使用的可筛选标记包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它编码已知有各种生色底物的酶；R基因座基因，它编码的产物调节植物组织中花色素苷色素(红色)的产生(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)，它编码的酶已知有各种生色底物(例如PADAC，一种生色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，它编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它编码的酶能够将酪氨酸氧化为DOPA和dopaquinone，dopaquinone进而缩合，形成易于检测到的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，它编码的酶有生色底物；荧光素酶(lux)基因(Ow等，1986)，它使得可以进行生物发光检测；或水母发光蛋白基因(Prasher等，1985)，它可以用于钙敏感性生物发光检测；或绿色荧光蛋白基因(Niedz等，1995)。
考虑到来自玉米R基因复合体的基因作为可筛选标记特别有用。玉米中的R基因复合体编码一种蛋白，该蛋白的作用是在大多数种子和植物组织中调节花色素苷色素的产生。玉米品系可以具有一个或多达4个R等位基因，它们结合在以发育和组织特异性方式调节色素形成。将来自R基因复合体的一个基因应用于玉米转化，因为该基因在转化细胞中的表达不伤害所述细胞。因此，导入这种细胞中的一个R基因将引起红色色素的表达，并且如果该基因稳定掺入，则可以显示记录为红色区域。如果一个玉米系带有编码花色素苷生物合成途径中酶中间体的基因的显性等位基因(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)，但在该R基因座带有一个隐性等位基因，则来自该系的任何细胞用R转化都将导致红色色素的形成。典型的系包括含有rg-Stadler等位基因的Wisconsin 22和一种K55衍生物TR112，TR112为r-g，b，P1。另一方面，如果将C1和R等位基因一起导入，则可以利用玉米的任何表型。
还提出，R基因调节区可以用于嵌合构建体中，以便提供控制嵌合基因表达的机制。该R基因座的表型表达已知比任何其它基因座都更为多样化(Coe等，1988)。设想了从该结构R基因5’的区域获得的调节区在指导例如抗虫性、抗旱性、除草剂耐性或其它蛋白编码区的基因表达方面可能有价值。为了本发明的目的，认为所述各个R基因家族成员中的任一个都可以成功地使用(例如P、S、Lc等)。然而，最优选的一般是Sn(特别是Snbo13)。Sn是R基因复合体中的一个显性成员，在功能上与所述R和B基因座相似，因为Sn控制花色素苷色素在某些幼苗和植物细胞中特异性沉积，因此其表型与R相似。
设想用于本发明中的再一个可筛选标记是由lux基因编码的萤火虫荧光素酶。可以采用例如X光胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、低光视频照相机、相片计数照相机或多孔发光法检测转化细胞中lux基因的存在。也设想了该系统可以开发用于例如组织培养板上生物发光的群体筛选，或甚至用于全株筛选。
5.质粒和非病毒载体序列本发明的载体也可以还包含质粒DNA。质粒载体包括可供用于使所表达盒在原核细胞和真核细胞中易于选择、扩增和转化的额外的DNA序列，质粒载体例如为pUC衍生载体，例如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pUC23、pUC119和pUC120、pSK衍生载体、pGEM衍生载体、pSP衍生载体或pBS衍生载体。所述额外的DNA序列包括复制起点，提供所述载体自主复制；额外的选择标记基因，最好是编码抗生素或除草剂抗性的基因；特有的多克隆位点，提供多个位点以插入表达盒中编码的DNA序列或基因；和增强原核细胞和真核细胞转化的序列。
可用于在植物细胞和原核细胞两者中表达的另一种载体是双元Ti质粒(如Schilperoort等公开的，美国专利第4,940,838号)，实例为载体pGA582。该双元Ti质粒载体先前已经由An进行了表征(参见上文)，并且可从An博士获得。该双元Ti载体可以在原核细菌例如大肠杆菌(E.coli)和农杆菌属中复制。农杆菌质粒载体可以用来将表达盒转移至双子叶植物细胞，并且在某些条件下可以转移至单子叶植物细胞，例如水稻细胞中。双元Ti载体最好包括提供有效植物细胞转化的胭脂碱T DNA右边界和左边界、一个选择标记基因、T边界区中特有的多克隆位点、colE1复制起点和一个广宿主范围复制子。带有本发明表达盒的双元Ti载体既可以用来转化原核细胞，又可以用来转化真核细胞，但最好用来转化双子叶植物细胞。
最后，任何DNA都可以用来传递至受体细胞，以最后产生按照本发明的能育转基因植物。例如，可以使用载体和质粒形式的DNA区段或线性DNA片段，所述DNA区段或片段在某些情况下仅含待在所述植物中表达的DNA元件。
当然，用于转化这类细胞的载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)和DNA区段通常将包含人们希望导入所述细胞的cDNA或一种或多种基因。根据需要，这些DNA构建体还可以包括例如启动子、增强子、多接头或甚至调节基因的结构。选择用于细胞导入的DNA区段或基因常常编码将在所得的重组细胞中表达的蛋白，例如将产生可筛选或可选择的性状和/或将赋予所再生的植株改进的表型。然而，情况可能不总是如此，本发明也包括掺入非表达的转基因的转基因植物。
6.其它预选核酸区段本发明的一个优选实施方案提供一种载体方法，用于为植物编码所需农艺特性，例如用于作物产量相关性状改良的单基因。例如，在例如Lundquist等(美国专利第5,484,956号)、Lundquist等(美国专利第5,508,468号)、Dobres(国际申请PCT/US95/11231)和K.Weising等((1988)，参见表1、2和3)中公开了这类核酸区段或“基因”，所有所述文献通过引用结合到本文中。然而，本发明不限于编码所需农艺特性的预选核酸区段的范围，因为编码赋予植物所需特性的蛋白或RNA转录物的许多其它预选核酸区段属于本发明的范围。
待传递至受体细胞的特定核酸区段的选择，通常将取决于转化目的。作物转化的一个主要目的是给所述植物加入某些商业上需要的农艺上重要的性状。人们可能需要掺入赋予任何一种或多种这种所需性状(例如编码除草剂抗性的一种或多种基因)的一种或多种基因。由所述预选DNA区段编码的优选农艺特性包括但不限于抗虫性或耐虫性、除草剂抗性或耐性(Christou，1997)、抗病性或耐病性(例如烟草或马铃薯中的病原体抗性用例如Bt内毒素基因抗病毒、真菌或细菌病原体(Schell，1997；Vaeck等，1987；和Lundquist等，美国专利第5,484,956号)、由发光光杆状菌(Photorhadbus luminescens)分泌的Pht毒素或病毒抗性的病毒衍生蛋白(Reimann-Phillip等，1993)、环境胁迫(包括但不限于干旱、过度潮湿、寒冷、严寒、高温、盐和氧化胁迫)、产量增加、食品含量和组成、物理外观、雄性不育性、干化(drydown)、抗倒伏性(standability)、丰产性、淀粉特性、含油量(oil quantity)和油品质等。例如，遗传研究已经表明，对于抗特定植物病原体侵染的植物而言，该植物一定具有一个抗病(R)基因，所述抗病基因直接或间接地与所述病原体基因组中存在的一个无毒(avr)基因相互作用。因此，将包含一个R基因的预选DNA区段导入缺乏该R基因的植物中，可以赋予所述植物对表达相应的avr基因的病原体的抗性。
通过将编码致病相关(PR)蛋白的预选DNA区段导入植物中，可以获得对真菌侵染的增强的抗性。PR蛋白是由谷类作物对某些致病真菌侵染应答而合成的蛋白(Scott，1994)。其它抗真菌基因包括但不限于壳多糖酶(例如外壳多糖酶和壳多糖酶G)；葡聚糖酶；蛋白质合成抑制剂(PSI)或抗真菌蛋白(AFP)。
通过将编码病毒外壳蛋白的预选DNA区段导致植物中，可以获得对病毒感染的增强的抗性。例如，Nelson等(1988)公开了烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白在番茄植株中的表达，赋予该植株对TMV的耐性以及对与TMV相关的病毒番茄花叶病毒(ToMV)的耐性。Clark等(国际申请PCT/EP92/03001)公开了玉米矮花叶病毒外壳蛋白在玉米中的表达，产生当接触该病毒时表现出病症减轻的植物。
此外，设想了可以将一种以上的预选核酸区段导入植物中。例如，可以将含有一个选择标记基因和赋予对特定病毒(例如大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒或烟草花叶病毒)抗性的基因的载体导入植物细胞中。
在某些实施方案中，本发明考虑了用一种以上的优势转基因转化受体细胞。两种或两种以上的转基因可以用或者不同的转基因编码载体、或者用掺入两种或两种以上基因编码序列的单一载体，在一个转化事件中供应。例如，认为带有趋同、趋异或共线性定向的bar和aroA表达单位的质粒特别有用。其它优选的组合是一种抗虫性基因(例如Bt基因)和一种蛋白酶抑制剂基因(例如pinII)或应用bar与上述任一种基因的组合。当然，根据需要，可以使用任何描述的任何两种或两种以上的转基因，所述转基因例如赋予除草剂抗性、抗虫性、抗病性(病毒、细菌、真菌、线虫)或抗旱性、雄性不育、干化、抗倒伏性、丰产性、淀粉特性、含油量或油品质的那些基因或那些提高产量或营养品质的基因。
a.除草剂抗性编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因(bar和pat)、草甘膦耐性EPSP合酶基因、编码草甘膦氧化还原酶的草甘膦降解酶基因gox、deh(编码使茅草枯失活的脱卤素酶)、除草剂抗性(例如磺酰脲和咪唑啉酮)乙酰乳酸合酶、和bxn基因(编码降解溴苯腈的腈水解酶)是用于转化的除草剂抗性基因的良好的实例。bar和pat基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，该酶使所述除草剂膦丝菌素失活，并且防止该化合物抑制谷氨酰胺合成酶。5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSP合酶)通常受除草剂N-(膦酰基甲基)甘氨酸(草甘膦)抑制。然而，已知编码草甘膦抗性EPSP合酶的基因。特别考虑了将这些基因用于单子叶植物转化。deh基因编码茅草枯脱卤素酶，并赋予对除草剂茅草枯的抗性。bxn基因编码一种特异性的腈水解酶，该酶将溴苯腈转化为非除草剂降解产物。
b.抗虫性本发明的一个重要方面涉及将赋予抗虫性的基因导入单子叶植物例如玉米中。可以导入的潜在的抗虫性基因包括苏云金芽孢杆菌晶体毒素基因或Bt基因(Watrud等，1985)。Bt基因可以提供对鳞翅目或鞘翅目害虫例如欧洲玉米螟(ECB)的抗性。用于这类实施方案的优选Bt基因包括CrylA(b)和CrylA(c)基因。在该方面也可以使用来自苏云金芽孢杆菌的其它菌种影响昆虫生长或发育的内毒素基因。
原核Bt毒素基因在植物中的表达差，这是一种广泛记录的现象，并且应用不同启动子、融合蛋白和前导序列并不导致Bt蛋白表达的显著增加(Barton等，1987)。因此，设想了本文公开的用于转化方案的最有利的Bt基因将是所述编码序列已经被修饰以实现在植物中表达增加的那些Bt基因，更特别是其中已经使用玉米优选密码子的那些Bt基因。这类修饰过的Bt毒素基因的实例包括称为IAb6的变异BtCrylA(b)基因(Perlak等，1991)和称为1800a和1800b的合成CrylA(v)基因。
蛋白酶抑制剂也提供抗虫性(Johnson等，1989)，因此在玉米转化中具有实用性。设想了来自番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂II基因pinII的应用特别有用。甚至更优选的是结合一种Bt毒素基因应用pinII基因，本发明人已经发现产生协同杀虫活性的其联合效应。编码昆虫消化系统抑制剂的其它基因或者编码促进抑制剂产生的酶或辅因子的那些基因也可能是有用。这种类别可以例举的是oryzacystatin和淀粉酶抑制剂，例如来自小麦和大麦的oryzacystatin和淀粉酶抑制剂。
此外，编码凝集素的基因可以赋予额外的或替代的杀虫剂特性。凝集素(最初称为植物凝集素)是多价糖结合蛋白，它们能够凝集来自多种物种的红细胞。凝集素最近已经被鉴定为具有抗象甲、ECB和根虫活性的杀虫剂(Murdock等，1990；Czapla和Lang，1990)。设想有用的凝集素基因包括例如大麦和小麦麦胚凝集素(WGA)和水稻凝集素(Gatehouse等，1984)，优选WGA。
导入害虫时具抗虫活性的大多肽或小多肽例如为裂解性肽、肽类激素以及毒素和毒物，控制所述具抗虫活性的大多肽或小多肽产生的基因构成本发明的另一个方面。例如，设想了针对特定害虫的保幼激素酯酶的表达也可能产生杀虫活性，或也许引起停止变态(Hammock等，1990)。
表达影响昆虫角质层完整性的酶的编码基因的转基因玉米，构成了本发明的再一个方面。这类基因包括编码例如壳多糖酶、蛋白酶、脂酶的基因以及产生三国霉素(nikkomycin)的基因，三国霉素是一种抑制壳多糖合成的化合物，设想任何上述基因的导入将产生抗虫玉米植株。编码影响昆虫蜕皮的活性的基因，例如影响蜕皮甾类UDP-糖基转移酶产生的那些基因，也属于本发明的有用转基因范围内。
本发明也包括编码多种酶的基因，所述酶促进降低宿主植物对害虫营养质量的化合物的产生。例如，通过改变植物的甾醇组成赋予植物杀虫活性是可能的。昆虫通过摄食获得甾醇，并且将甾醇用于激素合成和膜稳定。因此，通过表达新基因例如直接促进产生不希望有的甾醇或将所需甾醇转化为不希望有的形式的基因，改变植物甾醇组成，可能对昆虫生长和/或发育有负面影响，因此赋予植物杀虫活性。脂氧化酶是天然存在的植物酶，已经表明所述酶表现出对昆虫的抗营养效应，并且降低其饮食的营养质量。因此，本发明的其它实施方案涉及脂氧化酶活性增强、可以抗昆虫摄食的转基因植物。
本发明也提供了达到在性质或数量上改变植物次级代谢物的方法和组合物。一个实例涉及转化玉米，使其产生DIMBOA，设想这将提供对欧洲玉米螟、根虫和几种其它玉米害虫的抗性。具体考虑用于该方面的候选基因包括bx基因座上已知参与合成DIMBOA途径的那些基因。也考虑将可以调节maysin产生的基因以及参与高粱蜀黍苷产生的基因的导入分别用于促进对穗虫(earworm)和根虫的抗性。
鸭茅状磨擦禾(Tripsacum dactyloides)是一种抗包括根虫在内的某些昆虫的草种。预期将从磨擦禾属(Tripsacum)分离出编码对昆虫有毒的蛋白或参与对昆虫有毒化合物生物合成的蛋白的基因，并且这些新基因将可用于赋予抗虫性。已知磨擦禾属抗虫性的基础是遗传的，因为已经将所述抗性通过有性杂交转移至玉蜀黍(Zea mays)(Branson和Guss，1972)。
编码鉴定为具有潜在杀虫活性的蛋白的其它基因也可以用作按照本发明的转基因。这类基因包括例如豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI；Hilder等，1987)，它可以用作根虫拒食剂；编码除虫菌素(AvermectinandAbamectin.，Campbell，W.C.编著，1989；Ikeda等，1987)，可以证明它作为南瓜十二星叶甲(com rootworm)拒食剂特别有用；核糖体失活蛋白基因；和甚至调节植物结构的基因。也设想了转基因玉米，所述转基因玉米包含抗虫抗体基因以及可以将应用于植物外部的无毒杀虫剂(原杀虫剂)转化为所述植物体内的杀虫剂的酶的编码基因。
c.环境或胁迫抗性玉米耐受各种环境胁迫(例如但不限于干旱、过度潮湿、寒冷、严寒、高温、盐和氧化胁迫)能力的改进也可以通过新基因的表达而实现。提出通过导入“抗冻”蛋白例如Winter Flounder的抗冻蛋白(Cutler等，1989)或其合成基因衍生物，可以在提高抗冷冻温度方面获益。通过提高叶绿体中甘油-3-磷酸乙酰转移酶的表达，也可以使得耐寒性提高(Wolter等，1992)。通过表达超氧化物歧化酶，可以赋予对氧化胁迫(通常由于例如寒冷温度结合高光强的条件而加剧)的抗性(Gupta等，1993)，并且所述抗性可以通过谷胱甘肽还原酶而得到改进(Bowler等，1992)。这种策略可以为新出苗的大田提供耐冻力以及将晚熟高产品种扩大至相对早熟的地区。
设想了有利地影响植物含水量、总水势、渗透势和充盈的新基因的表达，将增强植物的耐旱能力。本文所用的术语“抗旱性”和“耐旱性”用来指与正常环境相比植物对水分有效性降低所诱导胁迫的增强的抗性或耐力，以及植物在较少水(lower-water)环境中行使功能和存活的能力。在本发明的该方面，提出例如渗透活性溶质生物合成的编码基因的表达可以赋予抗干旱的保护作用。在该类中有编码甘露醇脱氢酶(Lee和Saier，1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen等，1992)的基因。通过细胞中天然磷酸酶的后续作用或通过导入和共表达特定的磷酸酶，这些导入的基因将分别导致或者甘露醇或者海藻糖的积累，这两种化合物已经被大量记载为能够减轻胁迫效应的保护性化合物。已经证实了转基因烟草中甘露醇的积累，并且初步结果表明，表达高水平这种代谢物的植物能够耐受所施加的渗透胁迫(Tarczynski等，1992，1993)。
同样，已经记载了其它代谢物保护任一种酶功能(例如alanopine或丙酸)或膜完整性(例如alanopine)的功效(Loomis等，1989)，因此这些化合物生物合成的编码基因的表达可能以类似于甘露醇或补充甘露醇而赋予抗旱性。天然存在的具有渗透活性和/或在干旱和/或干燥期间提供某些直接保护性效应的代谢物的其它实例，包括果糖、赤藓糖醇(Coxson等，1992)、山梨糖醇、半乳糖醇(Karsten等，1992)、葡糖基甘油(Reed等，1984；Erdmann等，1992)、蔗糖、水苏糖(Koster和Leopold，1988；Blackman等，1992)、棉子糖(Bemal-Lugo和Leopold，1992)、脯氨酸(Rensburg等，1993)和甜菜碱(Wyn-Jones和Storey，1982)、ononitol和右旋肌醇甲醚(Vemon和Bohnert，1992)。通过例如控制上述渗透活性化合物和其它这类化合物的基因的导入和表达，将增强逆境期间持续的株冠生长和增加的生殖适度，其中所述这类化合物在一个典型实施方案中以肌醇0-甲基转移酶为代表。
设想了特定蛋白质的表达也可以提高耐旱性。根据结构相似性，已经确定了三类晚期胚胎发生蛋白(参见Dure等，1989)。在成熟(即干化)种子中已经证实有所有三类LEA。在这三种类型的LEA蛋白中，II型(dehydrin型)通常涉及植物营养部分中的耐旱性和/或耐燥性(即Mundy和Chua，1988；Piatkowski等，1990；Yamaguchi-Shinozaki等，1992)。最近，发现III型LEA(HVA-1)在烟草中的表达影响植物的株高、成熟度和耐旱性(Fitzpatrick，1993)。来自所有三类LEA的结构基因的表达因此可以赋予耐旱性。在缺水期间诱导的其它类型的蛋白质包括巯基蛋白酶、醛缩酶和跨膜转运蛋白(Guerrero等，1990)，它们在干旱胁迫期间可以赋予各种保护性功能和/或修复型功能。也设想了影响脂质生物合成并因此影响膜组成的基因也可以用于赋予植物抗旱性。
这些基因中的许多基因也改善耐冻力(或抗冻性)；在严寒和干旱期间发生的物理胁迫(physical stress)在性质上相似，并且可以以相似方式减轻。通过组成型表达这些基因可以提供益处，但表达这些新基因的优选方式可以是通过应用充盈诱导的启动子(例如Guerrero等，1987和Shagan等，1993描述的充盈诱导基因的启动子，所述文献通过引用结合到本文中)。这些基因的时空表达模式可以使得玉米能够更好地抵抗逆境。
一般认为，涉及使从干燥土壤中提取的水分增加的特定形态性状的基因的表达将是有益的。例如，改变根特征的基因的导入和表达可以增强水分吸收。也考虑了，在逆境期间增强生殖适度的基因的表达将具有重大价值。例如，提高花粉脱落和雌花部分(即花丝)受精同步的基因的表达将是有益的。另外，一般认为在逆境期间使籽粒败育最少的基因的表达，将增加收获的谷粒量，因此也是有价值的。
已知水分在决定产量方面的总体作用，因此设想了通过导入并表达新基因使玉米能够更加有效地利用水分，甚至当土壤水分有效性无限制时也将改进综合性能。通过导入提高玉米在各种各样的与水分相关的逆境中最大利用水分能力的基因，可以实现产量的稳定性或产量性能的一致性。
d.抗病性一般认为，通过将基因导入单子叶植物例如玉米中，可以实现抗病性的增强。有可能产生对病毒、细菌、真菌和线虫所致病害的抗性。也设想了，通过表达所导入的基因，可以实现对产生真菌毒素的有机体的防治。
可以通过表达新基因产生对病毒的抗性。例如，已经证明，病毒外壳蛋白在转基因植物中的表达，可以赋予对该病毒以及也许其它密切相关的病毒感染所述植物的抗性(Cuozzo等，1988，Hemenway等，1988，Abel等，1986)。设想了，靶向病毒必需功能的反义基因的表达，可以赋予对所述病毒的抗性。例如，靶向负责病毒核酸复制的基因的反义基因，可以抑制所述复制，并导致对该病毒的抗性。人们相信，通过利用反义基因干扰其它病毒功能，也可以增强对病毒的抗性。此外，人们认为，有可能通过其它途径，包括但不限于利用卫星病毒，达到对病毒的抗性。
人们认为，通过导入新基因可以实现对细菌和真菌所致病害的增强的抗性。设想了，编码所谓“肽抗生素”、致病相关(PR)蛋白、毒素抗性和影响宿主-病原体相互作用(例如形态特征)的蛋白的基因将是有用的。肽抗生素是抑制细菌和其它微生物生长的多肽序列。例如，称为杀菌肽和爪蟾抗菌肽的肽类抑制许多细菌和真菌菌种的生长。人们认为，PR蛋白在单子叶植物(例如玉米)中的表达可以用于提供对细菌病害的抗性。在病原体对寄主植物攻击后这些基因被诱导，这些基因分为至少5类蛋白(Bol，Linthorst，和Comelissen，1990)。PR蛋白中包括β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶和渗透蛋白以及据信在植物致病有机体抗性方面起作用的其它蛋白。已经鉴定出具有抗真菌特性的其它基因，例如UDA(异株荨麻凝集素)和橡胶蛋白(Broakaert等，1989；Barkai-Golan等，1978)。已知某些植物病害是由于产生毒植物素引起的。人们认为，对这些病害的抗性可以通过表达编码能够使毒植物素降解或者失活的酶的新基因而获得。也设想了。改变寄主植物和病原体之间相互作用的新基因的表达，可以用来降低致病有机体侵入寄主植物组织的能力，例如增强叶片角质层的蜡质或其它形态特征。
植物寄生线虫是包括玉米在内的许多植物的病因。人们认为，有可能通过表达新基因而产生抗这些有机体的玉米植株。我们设想了，通过改变线虫识别或附着到寄主植物和/或使植物能够产生杀线虫化合物(包括但不限于蛋白)，可以实现对线虫侵袭的防治。
e.真菌毒素的减小/消除与单子叶植物例如玉米相关的真菌产生真菌毒素(包括黄曲霉毒素和串珠镰孢菌素)是使谷粒不能使用的重要因素。这些真菌有机体不引起病症和/或干扰植物的生长，但它们产生对动物有毒的化学物质(真菌毒素)。我们设想了，抑制这些真菌的生长将减少这些有毒物质的合成，并因此减少了由于真菌毒素污染引起的谷物损失。也提出有可能将新基因导入单子叶植物例如玉米中，抑制真菌毒素合成而不干扰真菌生长。此外，设想了为了达到减少真菌毒素对谷物的污染，表达编码能够使真菌毒素无毒的酶的新基因将是有用的。任何上述机制的结果都将是减少谷物上真菌毒素的存在。
f.谷粒组成或品质可以将基因导入单子叶植物中，特别是导入商业上重要的谷类作物例如玉米中，以改良主要培育的谷类作物的谷粒。根据所述谷粒特定的最终用途，可以设计以这种方式产生的各种各样的新转基因植物。
玉米谷粒的最大用途是用于饲料或食品。导入改变谷粒组成的基因，可以大大增加饲料或食品的价值。玉米谷粒的主要组成是淀粉、蛋白质和油。玉米谷粒的每种这些主要组分都可以通过改变其含量或组成而可以改进。可以提及几个实例用于说明，但决不是提供详尽的所有可能性一览表。
包括玉米在内的谷物谷粒的蛋白对于饲料和食品目的是亚适的，尤其是当给予猪、家禽和人类时。这种蛋白缺乏几种这些物种饮食中必需的氨基酸，需要在这种谷粒中添加增补剂。限制性的必需氨基酸可以包括赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸和组氨酸。某些氨基酸仅在玉米补充其它添加物用于饲料配制后成为限制性的。例如，当玉米补充大豆饼粕以满足赖氨酸需求时，甲硫氨酸成为限制性的。通过包括但不限于导入基因以增加所述这些必需氨基酸的生物合成、减少所述氨基酸的降解、增强所述氨基酸在蛋白中的贮藏或增加所述氨基酸转运到种子或谷粒中的机制，可以提高这些必需氨基酸在种子和谷粒中的含量。
增加所述氨基酸生物合成的一种机制是导入去调节所述氨基酸生物合成途径的基因，使得所述植物不再充分控制所产生的水平。通过去调节或绕过所述氨基酸生物合成途径中通常受该途径的氨基酸终产物调节的步骤，可以做到这一点。实例包括导入去调节形式的天冬氨酸激酶或二氢吡啶二羧酸(DHDP)合酶的编码基因，以增加赖氨酸和苏氨酸的产生，以及导入去调节形式的邻氨基苯甲酸合酶的编码基因以增加色氨酸的产生。通过导入降低或消除分解代谢途径中催化步骤的酶(例如赖氨酸-α-酮戊二酸还原酶)编码基因的表达的DNA序列，可以达到所述氨基酸分解代谢的减少。
可以改变谷粒的蛋白组成，以多种方式改善氨基酸的平衡，所述方式包括提高天然蛋白的表达、降低组成不好的蛋白的表达、改变天然蛋白的组成或导入具有优良组成的全新蛋白的编码基因。实例可以包括导入降低贮藏蛋白玉米醇溶蛋白家族成员表达的DNA。这种DNA可以编码针对削弱的玉米醇溶蛋白的表达或玉米醇溶蛋白表达调节剂(例如不透明二号基因产物)的表达的核酶或反义序列。也提出，可以通过共抑制现象，即通过表达经转化导入的相同结构基因或基因片段而抑制内源基因的表达(Goring等，1991)，可以改变谷粒的蛋白组成。另外，所导入的DNA可以编码降解玉米醇溶蛋白的酶。达到的玉米醇溶蛋白表达的降低可能伴随着含更需要的氨基酸组成的蛋白的增加或者其它种子组分例如淀粉的增加。另一方面，可以导入嵌合基因，所述嵌合基因包含具有合适氨基酸组成的天然蛋白编码序列和启动子或设计用以提高所述蛋白表达的其它调节序列，其中所述蛋白例如为球蛋白之一或者玉米的10kD玉米醇溶蛋白。所述基因的编码序列可以包括必需氨基酸的其外的密码子或替代的密码子。此外，可以使用得自另一物种的编码序列或编码完全独特的肽序列、设计用以增强种子氨基酸组成的部分合成或全合成的序列。
导入改变谷粒含油量的基因可能是有价值的。含油量的增加可能导致用于饲料和食品的种子的可代谢-能量含量或密度的增加。所导入的基因可以编码去除或减少脂肪酸或脂质生物合成中限速步骤或调节步骤的酶。这类基因可以包括但不限于编码乙酰CoA羧化酶、ACP酰基转移酶、β-酮酰基-ACP合酶、加其它熟知的脂肪酸生物合成活性的基因。其它可能的是编码不具酶活性的蛋白(例如酰基载体蛋白)的基因。可以导入改变油中存在的脂肪酸平衡的基因，提供更为健康或更具营养的饲料。所导入的DNA也可以编码阻断参与脂肪酸生物合成的酶表达、例如下述的改变谷粒中存在的脂肪酸比例的序列。
可以导入增强谷粒淀粉组分营养价值的基因，例如通过提高分支程度，由于延迟淀粉代谢而导致改善奶牛对淀粉的利用。
除影响谷粒的主要组分以外，可以导入影响多种其它营养、加工或其它谷粒用作饲料或食品的品质方面的基因。例如，可以增强或减少谷粒的色素形成。在某些动物饲料中希望黄色色素形成的增强和稳定性，这可以通过导入基因而实现，所述基因通过消除叶黄素和胡萝卜素产生中的限速步骤，导致增强的叶黄素和胡萝卜素产生。这类基因可以编码改变形式的八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶或番茄红素合酶。另一方面，对于许多食品的生产而言，需要无色素形成的白玉米，可以通过导入阻断或消除色素产生途径中的步骤的DNA，产生所述白玉米。
主要包含玉米或其它谷粒的饲料或食品的维生素量不足，必须进行添加以提供合适的营养价值。可以设想导入增强种子中维生素生物合成的基因，包括例如维生素A、E、B12、胆碱等。对于最佳营养价值而言，玉米谷粒也不具有对于最佳营养价值足够的矿物质含量。影响含尤其是磷、硫、钙、锰、锌和铁的化合物的积累和有效性的基因可能是有价值的。一个实例是可以导入减少植酸产生或编码增强植酸分解的植酸酶的基因。这些基因可能提高饮食中可利用的磷酸盐的水平、减少补充矿物质磷酸盐的需求。
可以描述用于饲料和食品的玉米或其它谷物改良的许多其它实例。所述改良甚至不必涉及谷粒，但可以利用提高青贮饲料用玉米的价值。导入DNA以实现这一点，可以包括改变木质素产生的序列，例如产生与优良牛用饲料价值有关的“褐色中脉(brown midrib)”表型的那些序列。
除直接提高饲料或食品价值外，也可以导入改进玉米加工和提高由所述加工产生的产品价值的基因。玉米的主要加工方法是通过湿磨法。可以通过表达例如通过减少浸渍时间提高加工效率和降低加工成本的新基因，改良玉米。
提高湿磨制品的价值可以包括改变淀粉、油、玉米面筋粉或玉米黄浆饲料组分的量和品质。通过鉴定并消除淀粉生物合成中的限速步骤，或通过降低谷粒其它组分含量而导致淀粉比例增加，可以达到改进淀粉。前者的一个实例可以是导入编码具有改变调节活性或以较高水平表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因。后者的实例可以包括例如籽粒发育较晚期表达的蛋白或油生物合成的选择性抑制剂。
通过改变直链淀粉与支链淀粉之比、淀粉分子的大小或其分支模式，可以有益地改变淀粉特性。通过这些改变，可以对各种各样的特性进行修饰，包括但不限于糊化温度、糊化热、膜和糊料的澄清、流变学特性等的改变等。为了达到这些特性的改变，可以单独或组合导入编码颗粒结合的或可溶性淀粉合酶活性或分支酶活性的基因。例如反义构建体的DNA也可以用来降低这些酶的内源活性水平。所导入的基因或构建体可以具有将其表达定时到淀粉生物合成中特定间隔和淀粉粒发育的调节序列。此外，导入并表达导致淀粉分子的葡萄糖部分体内衍生化或其它修饰的基因，可能是有价值的。可以设想任何分子的共价连接，这仅受催化衍生化的酶的存在以及淀粉粒中合适底物的可及性的限制。重要的衍生化的实例可以包括加入提供用于随后体外衍生化或通过引入离子电荷影响淀粉特性的功能团，例如胺、羧基或磷酸酯基团。其它修饰的实例可以包括直接改变葡萄糖单位，例如失去羟基或将其氧化为醛基或羧基。
油是玉米湿磨的另一种制品，其价值可以通过导入并表达基因而得到提高。通过以上描述的用于饲料和食品的方法，可以提高通过湿磨提取的油量。也可以改变油的特性，以改进其在生产和应用烹饪用油、起酥油、润滑油或其它油衍生制品方面或用于食品相关应用时其健康特性改进方面的性能。也可以合成在提取时可以用作化学合成原材料的新型脂肪酸。通过改变油中存在的脂肪酸的类型、含量或脂质分布(lipid arrangement)，可以达到油特性的改变。这进而可以通过加入编码催化新脂肪酸和具有所述新脂肪酸的脂质的合成的酶的基因、或通过增加天然脂肪酸含量而同时可能降低前体水平而达到。另一方面，可以导入减慢或阻断脂肪酸生物合成中的步骤而导致前体脂肪酸中间体增加的DNA序列。可以加入的基因包括去饱和酶、环氧酶、水合酶、脱水酶和催化涉及脂肪酸中间体的反应的其它酶。可以阻断的催化步骤的典型实例包括将硬脂酸去饱和为油酸以及将油酸去饱和为亚麻酸，导致相应的硬脂酸和油酸的积累。另一实例是阻断延伸步骤，导致C8-C12饱和脂肪酸的积累。
通过导入基因以获得新型玉米植株，也可以达到其它主要玉米湿磨制品、玉米面筋粉和玉米黄浆饲料方面的改进。代表性的可能改进包括但不限于上述关于食品和饲料价值提高的那些改进。
另外，还可以考虑使用玉米植株生产先前在玉米植株中根本不产生或不是以同一水平产生的有用生物学化合物。通过用玉米转化法导入并表达基因，有可能创造产生这些化合物的新型玉米植株。多种多样的可能性包括但不限于目前用任何有机体生产的任何生物学化合物，例如蛋白质、核酸、初级代谢物和中间代谢物、糖聚合物等。所述化合物可以用植物生产，在收获和/或加工时进行提取，并且可以用于任何目前认为有用的目的，例如药物、香料、工业用酶，这仅提及了几个目的。
例举在转基因植物中可能由所导入基因编码的谷粒性状或特性范围的其它可能性包括通过导入增强γ-玉米醇溶蛋白合成的基因而碎粒敏感性较低以用于出口目的或当干磨加工时粗谷粉大小较大的谷粒；通过增加粒壳(pericarp)厚度的基因而具有改进爆花质量和膨胀体积的爆花用玉米；通过导入有效阻断参与色素产生途径的酶表达的基因而具有较白谷粒的食品用玉米；和通过导入影响甜玉米香味的基因例如皱缩基因(编码蔗糖合酶)而改良的酒精饮料或甜玉米的品质。
g.植物农艺特性决定是否可以种植玉米的两个因素是生长季节的日平均温度和霜冻之间的时间长度。在可能种植玉米的地区内，允许生长至成熟和收获的最大时间限制是不同的。根据玉米在获得最大可能产量所需的时间内成熟和干化至可收获含水量的能力，选择在特定地区种植的玉米。因此，对于不同的产区，开发不同成熟度的玉米。除需要足够干化以允许收获之外，客观上需要在田间发生最大干化，以最大限度地减少收获后额外干化所需的精力。此外，谷粒越快干化，则可用于生长和籽粒灌浆的时间则越多。考虑到，可以鉴定影响成熟度和/或干化的基因，并且用转化技术将其导入玉米系中，以创造适于不同产区或同一产区但在收获时具有改进的产量与水分比的新玉米品种。参与调节植物发育的基因的表达可能尤其有用，例如已经在玉米中鉴定的无叶舌和糙鞘(rough sheath)基因。
设想了可以将能够提高抗倒伏性和其它植物生长特性的基因导入玉米中。赋予更强壮茎杆、改善的根系或者防止或减少果穗脱落的新基因的表达，对于农民将具有重大价值。人们认为，通过例如增加光的配给(light distribution)和/或截留(interception)而增强有效光同化作用总量的基因的导入和表达将是有利的。另外，提高光合效率和/或叶冠的基因的表达，将进一步提高谷粒的生产率。这类方法将使得能够在田间增加植物群体。
延迟晚熟营养体的老化(late season vegetative senescence)将增加同化物流到谷粒中，并因此提高产量。人们认为，在玉米中与“保青(stay green)”有关的基因的超量表达或延迟老化的任何基因的表达将是有利的。例如，在牛尾草(Festuca pratensis)中已经鉴定出非黄化突变体(Davies等，1990)。该基因以及其它基因的表达可以防止叶绿素的早熟分解，并因此可以保持林冠功能。
h.养分利用利用有效养分的能力在单子叶植物例如玉米的生长中是一个限制因素。人们认为，有可能通过导入新基因，改变养分的吸收、耐受极限pH、改变整个植株的养分流动、养分贮库以及代谢活性的有效性。这些修饰将允许植物例如玉米更有效地利用土壤有效养分。设想了，提高例如植物中正常存在并且参与养分利用的酶的活性，将提高养分的有效性。这种酶的一个实例是植酸酶。也设想了，新基因的表达可以创造先前不可利用的有效营养源，例如是从更复杂的分子(也许是大分子)中释放一种有营养价值的组分的酶。
i.雄性不育性雄性不育性可用于生产杂交种子。认为可以通过表达新基因产生雄性不育性。例如，已经表明，干扰雄性花序和/或配子体发育的蛋白的编码基因的表达，导致雄性不育性。在转基因烟草和油料种子用油菜(oilseed rape)的花药中表达的嵌合核糖核酸酶基因，已经证明导致雄性不育性(Mariani等，1990)。
在玉米中发现了许多赋予细胞质雄性不育性的突变。特别是，一个称为T细胞质的突变也与对玉米小斑病的感病性有关。鉴定出与T细胞质有关的名为TURF-13(Levings，1990)的DNA序列。人们认为，有可能通过经转化导入TURF-13将感病性与雄性不育性分离。因为对于育种目的和谷物生产而言，能够恢复雄性能育性是必不可少的，因此认为也可以导入恢复雄性能育性的编码基因。
i.负选择标记导入可以选择抵抗的性状的编码基因，可以用来消除不希望有的连锁基因。设想了，当通过共转化一起导入两个或两个以上基因时，所述基因将在宿主染色体上连接在一起。例如，可以将赋予植物抗虫性的Bt基因的编码基因与可用作选择标记并赋予植物对除草剂Ignite抗性的bar基因一起导入植物。然而，可能不希望有也抗除草剂Ignite的抗虫植物。认为人们也可以导入在不需要bar基因表达的那些组织中(例如在整株植株部分中)表达的反义bar基因。因此，虽然bar基因表达并且可用作选择标记，但它对于赋予整株植株除草剂抗性是无用的。bar反义基因是一种负选择标记。
也设想了，为了在转化体群体中筛选通过基因打靶产生稀有同源重组体，负选择是必不可少的。例如，通过使先前在该细胞中表达的基因失活，可以鉴定同源重组体。在烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥中已经将新霉素磷酸转移酶II(nptII)的反义基因作为负选择标记进行了研究(Xiang C.和Guerra，D.J.1993)。在该实例中，将有义和反义nptII基因通过转化都导入一个植株中，所产生的植株对抗生素卡那霉素敏感。在反义nptII基因位点整合到宿主细胞染色体中并且使所述反义基因失活的所导入基因，将使得植物抗卡那霉素和其它氨基糖苷类抗生素。因此，通过筛选抗生素抗性，可以鉴定出稀有的定点重组体。同样，将对植物天然的或通过转化导入的失活时赋予对一种化合物抗性的任何基因，可以用作负选择标记。
设想了，负选择标记也可以以其它方式应用。一种应用是构建人们可以根据转座至非连锁位点而选择的转基因系。在标记过程中，最常见的是转座因子转移至同一染色体上的遗传上连锁的位点。用于回收已经发生转座至非连锁基因座的稀有植物的选择标记将是有用的。例如，胞嘧啶脱氨酶可用于该目的(Stouggard，J.，1993)。在该酶存在时，化合物5-氟胞嘧啶转化为对植物和动物细胞有毒的5-氟尿嘧啶。如果将转座因子与胞嘧啶脱氨酶的基因连接，人们则可以通过选择所产生的植株现在抗5-氟胞嘧啶的转座事件来筛选到非连锁位点的转座。亲本植株和含有转座至连锁位点的植株将仍对5-氟胞嘧啶敏感。对5-氟胞嘧啶的抗性是由于通过转座因子和胞嘧啶脱氨酶基因的遗传分离而丧失了胞嘧啶脱氨酶基因所致。其它使植物对某种化合物敏感的蛋白的编码基因也可用于该方面。例如，来自根癌农杆菌的T-DNA基因2编码一种蛋白，该蛋白催化α-萘乙酰胺(NAM)转化为α-萘乙酸(NAA)，使植物细胞对高浓度的NAM敏感。
也设想了，负选择标记可以用于转座子标记系的构建。例如，通过用负选择标记来标记一种自主转座因子例如Ac、Master Mu或En/Spn，人们则可以选择其中所述自主元件不稳定整合到基因组中的转化体。认为，例如，在需要瞬时表达所述自主元件以反式激活一种缺陷型转座因子例如Ds转座，但不需要所述自主元件稳定整合时，这可能是需要的。为了稳定所述缺陷型元件，即防止它进一步转座，可能不希望所述自主元件的存在。然而，认为如果在植物中需要自主转座因子的稳定整合，则负选择标记的存在则可以使得有可能在育种过程中消除所述自主元件。
k.非蛋白质表达序列1.RNA表达可以将核酸导入玉米和其它单子叶植物中，以表达不被翻译为蛋白质的、影响植物表型的RNA转录物。两个实例是反义RNA和具有核酶活性的RNA。这两种RNA在降低或消除天然或所导入的植物基因表达方面都可能起作用。
可以构建或分离在转录时产生与整个或部分靶信使RNA互补的反义RNA的基因。反义RNA减少信使RNA多肽产物的产生。多肽产物可以是由植物基因组编码的任何蛋白质。将上述基因称为反义基因。因此可以将反义基因通过转化法导入植物中，以产生所选目的蛋白表达减少的新型转基因植物。例如，所述蛋白质可以是催化植物中一个反应的酶。所述酶活性的降低可以减少或消除该反应产物，所述反应产物包括所述植物中酶促合成的化合物，例如脂肪酸、氨基酸、糖类、核酸等。另一方面，所述蛋白质可以是贮藏蛋白例如玉米醇溶蛋白或结构蛋白，其表达的减少可以分别导致种子氨基酸组成或植物形态的改变。提供上述可能性仅作为实例，并不代表所有应用范围。
也可以构建或分离当转录时产生RNA酶或核酶的基因，所述RNA或核酶可以用作内切核糖核酸酶，并催化具有选定序列的RNA分子的切割。选定信使RNA的切割可以导致其编码的多肽产物的产生减少。这些基因可以用来制备具有所述核酶的新型转基因植物。转基因植物可以具有水平降低的多肽，所述多肽包括但不限于可以受反义RNA影响的上述多肽。
也有可能将基因导入，以产生由于共抑制机制使天然基因产物表达降低的新型转基因植物。在烟草、番茄和矮牵牛(Goring等，1991；Smith等，1990；Napoli，C.等，1990；van der Krol等，1990)中已经证明，天然基因有义转录物的表达将以类似于反义基因观察到的方式减少或消除所述天然基因的表达。所导入的基因可以编码全部或部分的靶天然蛋白，但其翻译可能不是该天然蛋白水平降低所需的。
2.非RNA表达例如，可以将DNA元件插入基因中并引起突变，所述DNA元件包括转座因子，例如Ds、Ac或Mu。可以插入这些DNA元件，以使基因失活(或激活)，并由此“标记”一种特定性状。在这种情况下，转座因子不引起所标记突变的不稳定性，因为所述因子的实用性不依赖于其在基因组中的移动能力。一旦所需性状被标记，则可以例如用所导入的DNA序列作为PCR引物，并且采用PCR基因克隆技术因，用所导入的DNA序列来克隆相应的基因(Shapiro，1983；Dellaporta等，1988)。所述特定性状的完整基因(需要时包括控制区或调节区)一经鉴定，则可以将其分离、克隆并根据需要进行操作。导入有机体中以进行基因标记的DNA元件的实用性与所述DNA序列无关，并且不依赖于所述DNA序列的任何生物活性，即转录为RNA或翻译为蛋白质。所述DNA元件的唯一功能是破坏所述基因的DNA序列。
设想了，非表达的DNA序列，包括新合成的序列，可以导入细胞中作为那些细胞和植物及其种子的专有“标记”。对于一个标记DNA元件而言，破坏宿主有机体内源基因的功能可能不是必需的，因为该DNA的唯一功能是鉴定出所述有机体的起源。例如，人们可以将一种独特DNA序列导入植物中，该DNA元件将所有细胞、植物和这些细胞的后代鉴定为是由该标记来源产生的。认为包括标记DNA，将使得人们能够辨别专有种质或者来源于这类专有种质的种质、来源于非标记种质的种质。
可以导入的另一种可能的元件是基质附着区元件(MAR)，例如鸡溶菌酶A元件(Stief，1989)，该元件可以定位在可表达目的基因周围，以实现该基因总体表达的增加，并且在掺入植物基因组中时减少依赖于位置的效应(Stief，1989；Phi-Van等，1990)。
有利地影响植物含水量、总水势、渗透势和充盈的新型预选DNA区段的表达，可以增强植物的耐旱能力。本文所用的术语“抗旱性”和“耐旱性”用来指与正常环境相比植物对水分有效性降低所诱导的胁迫的增强抗性或耐力，以及植物在少水(lower-water)环境中行使功能和存活以及以相对优越的方式表现的能力。在本发明的该方面，提出例如编码渗透活性溶质生物合成的预选DNA区段的表达可以赋予抗干旱的保护作用。在该类预选DNA区段中有编码甘露醇脱氢酶(Lee和Saier，1982)和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen等，1992)的DNA。通过细胞中天然磷酸酶的后续作用或通过导入和共表达特定的磷酸酶，这些导入的预选DNA将分别导致或者甘露醇或者海藻糖的积累，这两种化合物已经被大量记载为能够减轻胁迫效应的保护性化合物。已经证实了转基因烟草中甘露醇的积累，并且初步结果表明，表达高水平这种代谢物的植物能够耐受所施加的渗透胁迫(Tarczynski等，参见上文(1992)，(1993))。
同样，已经记载了其它代谢物保护任一种酶功能(例如alanopine或丙酸)或膜完整性(例如alanopine)的功效(Loomis等，1989)，因此表达编码这些化合物生物合成的预选DNA区段可能以类似于甘露醇或补充甘露醇而赋予抗旱性。天然存在的具有渗透活性和/或在干旱和/或干燥期间提供某些直接保护性效应的代谢物的其它实例，包括糖和糖衍生物，例如果糖、赤藓糖醇(Coxson等，1992)；山梨糖醇、半乳糖醇(Karsten等，1992)；葡糖基甘油(Reed等，1984；Erdmann等，1992)；蔗糖、水苏糖(Koster和Leopold，1988)；(Blackman等，1992)；ononitol和右旋肌醇甲醚(Vemon和Bohnert，1992)；和棉子糖(Bemal-Lugo和Leopold，1992)。不是糖的其它渗透活性溶质包括但不限于脯氨酸(Rensburg等，1993)和甜菜碱(Wyn-Jones和Storey，1981)。通过例如控制上述渗透活性化合物和其它这类化合物的预选DNA区段的导入和表达，将增强逆境期间持续的株冠生长和增加的生殖适度，其中所述这类化合物在一个典型实施方案中以肌醇0-甲基转移酶为代表。
设想了特定蛋白质的表达也可以提高耐旱性。根据结构相似性，已经确定了三类晚期胚胎发生蛋白(参见Dure等，1989)。在成熟(即干化)种子中已经证实有所有三类这些蛋白质。在这三种类型的蛋白中，II型(dehydrin型)通常涉及植物营养部分的耐旱性和/或耐燥性(即Mundy和Chua，(1988)；Piatkowski等，(1990)；Yamaguchi-Shinozaki等，(1992))。最近，发现III型LEA(HVA-1)在烟草中的表达影响植物的株高、成熟度和耐旱性(Fitzpatrick，(1993))。来自所有三类的结构基因的表达因此可以赋予耐旱性。在缺水期间诱导的其它类型的蛋白质包括巯基蛋白酶、醛缩酶和跨膜转运蛋白(Guerrero等，1990)，它们在干旱胁迫期间可以赋予各种保护性功能和/或修复型功能。影响脂质生物合成并因此影响膜组成的预选DNA区段的表达也可以用于赋予植物抗旱性。
改善抗旱性的许多基因具有互补的作用方式。因此，这些基因的组合在改善玉米抗旱性方面可能具有相加效应和/或协同效应。这些基因中的许多基因也改善耐冻性(或抗冻性)；在严寒和干旱期间发生的物理胁迫在性质上相似，并且可以以相似方式减轻。通过组成型表达这些基因可以提供益处，但表达这些新基因的优选方式可以是通过应用充盈诱导的启动子(例如Guerrero等(1990)和Shagan等(1993)描述的充盈诱导基因的启动子，所述文献通过引用结合到本文中)。这些基因的时空表达模式可以使得玉米能够更好地抵抗逆境。
一般认为，涉及使从干燥土壤中提取的水分增加的特定形态性状的基因的表达将是有益的。例如，改变根特征的基因的导入和表达可以增强水分吸收。也考虑了，在逆境期间增强生殖适度的DNA的表达将具有重大价值。例如，提高花粉脱落和雌花部分(即花丝)受精同步的DNA的表达将是有益的。另外，一般认为在逆境期间使籽粒败育最少的基因的表达，将增加收获的谷粒量，因此也是有价值的。还设想了，通过导入和表达具有合适调节序列的异戊烯基转移酶基因，调节单子叶植物(例如玉米)中的细胞因子水平，可以改善单子叶植物抗逆性和提高产量(Gan等Science，270，1986(1995))。
已知水分在决定产量方面的总体作用，因此设想了通过导入并表达新基因，使玉米能够更加有效地利用水分，甚至当土壤水分有效性无限制时也将改进综合性能。通过导入提高玉米在各种各样的与水分有效性相关的逆境中最大利用水分能力的基因，可以实现产量的稳定性或产量性能的一致性。
III.将本发明载体导入宿主细胞本发明一般包括涉及将预选核酸序列导入受体细胞(例如植物细胞)以产生转化细胞的步骤。虽然最好是通过喷洒或摩擦使本发明的载体或组合物与植物、植物部分或植物组织接触，但是可以将所述载体或组合物通过其它方法体外导入植物细胞中。为此，所述植物组织源的细胞最好是可以再生能育转基因植株和/或种子的胚胎发生细胞或细胞系。所述细胞可以得自或者单子叶植物或者双子叶植物。植物种的合适实例包括小麦、水稻、拟南芥属、烟草、玉米、大豆等。优选的细胞类型是单子叶植物细胞，例如玉米细胞，所述细胞可以在悬浮细胞培养物中，或者可以在完整的植物部分中，例如未成熟胚，或在特化的植物组织中，例如愈伤组织，例如I型或II型愈伤组织。
所述植物组织源的细胞的转化可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种进行。实例是经电穿孔直接将DNA转移到植物细胞中的转化(美国专利第5,384,253号和美国专利第5,472,869号，所述文献通过引用结合到本文中；Dekeyser等，1990)；通过PEG沉淀直接将DNA转移至植物细胞(Hayashimoto等，1990)；通过微弹轰击直接将DNA转移至植物细胞(McCabe等，1988；Gordon-Kamm等1990；美国专利第5,489,520号；美国专利第5,538,877号；和美国专利第5,538,880号，所述文献通过引用结合到本文中)；脂质体；和通过用农杆菌感染将DNA转移至植物细胞。可以用其中仅仅在大肠杆菌衍生质粒克隆载体上携带表达盒的“裸露”的DNA，进行例如微弹轰击或电穿孔的方法。在病毒载体的情况下，理想的是所述系统保留复制功能，但缺乏诱导病害的功能。
双子叶植物转化的优选方法是通过采用叶圆片方案(Horsch等，1985)用根癌农杆菌感染植物细胞。单子叶植物例如玉蜀黍(Zea mays)可以通过微弹轰击胚发生愈伤组织或未成熟胚，或通过在用含果胶酶的酶部分酶降解细胞壁后进行电穿孔(美国专利第5,384,253号和美国专利第5,472,869号)进行转化。例如，按照以下文献所述的方法，进行加速离子处理，可以转化得自玉蜀黍未成熟胚的胚发生细胞系，所述文献为上述Gordon-Kamm等(1990)或美国专利第5,489,520号；美国专利第5,538,877号和美国专利第5,538,880号。切下的未成熟胚也可以用作转化的靶，然后进行组织培养物诱导、选择和再生，如美国申请序号08/112,245和PCR公布号WO 95/06128所描述的方法。此外，利用根癌农杆菌转化单子叶植物的方法已经由Hiei等(欧洲专利0604 662，1994)和Saito等(欧洲专利0 672 752，1995)描述。
用其中所述表达盒可以单独地载于任何大肠杆菌衍生质粒克隆载体的“裸露”DNA，进行例如微弹轰击或电穿孔的方法。在病毒载体的情况下，理想的是所述系统保留复制功能，但缺乏诱导病害的功能。
为了实现通过电穿孔进行转化，人们可以利用易碎的组织，例如悬浮细胞培养物或胚发生愈伤组织，或者，人们可以直接转化未成熟胚或其它组构的组织。可以通过将预选细胞或器官的细胞壁暴露于果胶降解酶(果胶酶或果胶溶酶)或以控制方式对其进行机械损伤，部分降解预选细胞或器官的细胞壁。这类细胞则为感受态，易于经电穿孔吸收DNA，电穿孔可以在该阶段进行，然后根据新掺入的DNA的性质，通过合适的选择或筛选方案鉴定转化细胞。
将转化DNA区段传递至植物细胞的再一个优选方法是微弹轰击。在该方法中，可以用DNA包被微粒，并通过推进力将微粒传递到细胞中。典型的粒子包括由钨、金、铂等构成的粒子。
设想了，在某些情况下，对于用微弹轰击将DNA传递至受体细胞而言，将DNA沉淀在金属粒子上可能是必不可少的。也设想了所述粒子可以含有DNA，而不是包被有DNA。因此提出，粒子可以提高DNA传递的水平，但粒子本身却不是将DNA导入植物细胞所必需的。
微弹轰击除了是可重现的稳定转化单子叶植物的有效方法外，微弹轰击的一个优点是需要分离原生质体(Christou等，1988)、形成部分降解的细胞或对农杆菌感染的敏感性。用于通过加速将DNA传递到玉米细胞中的方法的一个说明性实施方案是基因枪粒子(BiolisticsParticle)传递系统，该系统可以用来将包有DNA或细胞的粒子通过筛网例如不锈钢筛网或Nytex筛网发射到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的滤纸表面上(Gordon-Kamm等，1990)。筛网将粒子分散，使得它们不会以大的聚集体传递至受体细胞。人们认为，间插在发射装置和待轰击细胞之间的筛网，减少轰击粒子聚集体的大小，并且可能通过减少聚集的轰击粒子对受体细胞施加的损伤，而导致更高的转化频率。
关于所述轰击，最好是将悬浮液中的细胞在滤膜或固体培养基上浓缩。或者，可以在固体培养基上布置未成熟胚或其它靶细胞。待轰击的细胞位于macroprojectile阻挡板之下适当的距离处。如有需要，还可在加速装置和待轰击细胞之间放置一个或多个筛网。通过利用本文叙述的技术，人们可以获得高达1000个或更多的瞬时表达标记基因的细胞转化灶。在轰击后48小时在转化灶中表达所述外源基因产物的细胞数范围通常为约1-10个，平均约1-3个。
在轰击转化中，人们可以优化轰击前培养条件和轰击参数，以产生最大数目的稳定转化体。轰击的物理参数和生物学参数在该技术中均是重要的。物理因素是涉及操作所述DNA/微弹沉淀或影响大弹(macroprojectile)或微弹射程和速度的因素。生物学因素包括涉及在轰击之前以及紧随轰击后的细胞操作的所有步骤、有助于减轻与轰击相关创伤的靶细胞的渗透调节以及转化DNA的性质，例如线性化DNA或完整的超螺旋质粒DNA。人们认为轰击前操作对于成功转化未成熟胚尤为重要。
因此，设想了人们可能需要在小规模研究中调节各种轰击参数，以全面优化所述条件。人们可能特别希望调节诸如间距(gap)距离、飞行距离、组织距离和氦气压之类的物理参数。人们也可以通过修改影响受体细胞生理状态和可能因此影响转化和整合效率的条件，使创伤减少因素(TRF)最小化。例如，可以调节渗透状态、组织水合作用和受体细胞的传代培养阶段或细胞周期，以使转化最佳。本文公开的这类小规模优化研究结果，根据本说明书，其它常规调节的实施是本领域技术人员已知的。
用于转化的植物组织来源的选择将取决于宿主植物的性质和转化方案。有用的组织来源包括愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶段、茎段、穗、花粉、胚、下胚轴、块茎段、分生组织区等。选择并转化组织来源，使得它在转化后保留再生能育全株的能力，即含有全能细胞。I型或II型胚性玉米愈伤组织和未成熟胚是优选的玉蜀黍组织来源。在美国申请序号08/112,245和PCT公布号WO 95/06128中详细描述了用于单子叶植物转化的组织来源的选择(所述文献通过引用结合到本文中)。
在针对选择的植物组织的条件下进行转化。将植物细胞或组织暴露于带有预选DNA序列的DNA一段有效的时间。这可以从不足1秒的用于电穿孔的电脉冲至2-3天的在含质粒的农杆菌细胞存在下的共培养。所用缓冲液和培养基也随植物组织来源和转化方案而变化。许多转化方案利用固体培养基平板表面上由无菌滤纸圆片与从待转化植物细胞或组织分离的悬浮培养细胞的饲养层(例如，烟草或黑墨西哥甜玉米)。
将预选核酸序列转移至植物的一个优选方法是用本发明的组合物喷洒或摩擦植物或植物部分。优选的单子叶植物包括甜玉米、燕麦、水稻、玉米、小麦、苜蓿、三叶草、羊茅、高粱、小米、大麦、黑麦或梯牧草。优选的双子叶植物包括芸苔属、黄瓜、烟草、马铃薯、番茄、欧洲油菜、草莓、大豆、向日葵、拟南芥、矮牵牛、豌豆、canola、菜豆、莴苣、芹菜、苜蓿、棉花、羽扇豆和胡萝卜。
IV.预选核酸区段的检测为了确证再生植物中预选核酸区段或“转基因”的存在，可以进行多种测定。这类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、原位杂交和基于核酸的扩增法，例如PCR或RT-PCR；“生化”测定，例如检测蛋白产物的存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹法)或通过酶功能检测；植物部分测定，例如叶测定或根测定；以及通过分析再生全株的表型，例如分析抗病性或抗虫性。
可以从细胞系或任何植物部分分离出DNA，以通过应用本领域技术人员熟知的技术确定预选核酸区段的存在。请注意，不总是存在完整的序列，推测是由于序列在细胞中的重排或缺失引起的。
通过聚合酶链式反应(PCR)确定通过本发明方法导入的核酸元件的存在。用该技术，扩增预估核酸片段，并通过凝胶电泳检测。该类型的分析使得人们可以确定预选核酸区段是否存在于稳定的转化体中，但不证明所导入的预选核酸区段整合到宿主细胞的基因组中。另外，用PCR技术不可能确定转化体是否具有导入基因组中不同位点的外源基因，即转化体是否具有独立的来源。设想了。用PCR技术，有可能克隆与所引入的预选DNA区段相邻的宿主基因组DNA片段。
采用DNA印迹杂交技术，可以确定DNA整合到宿主基因组的阳性证明以及转化体的独立身份。用该技术，可以鉴定出导入宿主基因组中的特定DNA序列以及侧翼宿主DNA序列。因此，给定转化体的DNA印迹杂交模式用作该转化体的鉴别特征。另外，有可能通过DNA印迹杂交，证实在高分子量DNA中存在所导入的预选DNA区段，即证实所导入的预选DNA区段已经整合到宿主细胞基因组中。DNA印迹杂交技术提供了用PCR获得的信息，例如预选DNA区段的存在，但也证明整合到基因组中，并且特征鉴定了每个个别的转化体。
设想了，用DNA印迹杂交技术的改进技术-斑点印迹杂交或狭线印迹杂交，人们可以获得得自PCR的同样的信息，例如预选DNA区段的存在。
PCR和DNA印迹杂交技术都可以用来证实预选DNA区段传播至后代。在大多数情况下，给定转化体的特征性DNA印迹杂交模式将如一种或多种孟德尔基因一样在子代中分离(Spencer等，1992)；Laursen等，1994)，表明该基因的稳定遗传。种系传播和同样的DNA印迹杂交模式和转化DNA在愈伤组织、R0植株和该转化基因分离的R1子代中的强度，表明愈伤组织和亲代转化体(R0)的非嵌合性质。
鉴于可以用从植物任何部分分离出的DNA进行DNA分析技术，RNA可以仅在特定细胞或组织类型中表达，因此，有必要从这些组织中制备RNA用于分析。PCR技术也可以用来对由所导入的预选DNA区段产生的RNA进行检测和定量。在PCR的这种应用中，首先有必要用例如反转录酶将RNA反转录为DNA，然后通过应用常规的PCR技术扩增所述DNA。在大多数情况下，PCR技术虽然是有用的，但不证明所述RNA产物的完整性。关于所述RNA产物性质的进一步的信息可以通过RNA印迹法获得。该技术将证明一种RNA的存在并且给出关于该RNA完整性的信息。一种RNA的存在与否也可以通过斑点或狭线RNA印迹杂交得以证实。这些技术是RNA印迹法的改进技术，并且将仅证明一种RNA的存在是否。
虽然可以用DNA印迹法和PCR检测上述预选DNA区段，但它们不提供关于所述预选DNA区段是否表达的信息。通过具体鉴定所导入的预选DNA区段的蛋白产物或评估由所述DNA区段的表达产生的表型变化，可以评估表达。
关于特定蛋白质的产生和鉴定的测定可以利用所述蛋白质的物理化学特性、结构特性、功能特性或其它特性。独特的物理化学特性或结构特性可使得所述蛋白质得以分离，并通过电泳法(例如非变性或变性凝胶电泳或等电聚焦)鉴定，或通过层析技术(例如离子交换或凝胶排阻层析)鉴定。个别蛋白质的特有结构提供在例如ELISA测定的形式中利用特异性抗体检测其存在的可能。可以使用多种方法的组合，而特异性甚至更强，其中用抗体定位已经用电泳技术分离的个别基因产物的蛋白质印迹法。可以用其它技术来绝对证实目的产物的身份，例如在纯化后通过氨基酸测序进行评价。虽然这些是其中最常用的技术，但还可以使用其它方法。
也可以用多种测定法，根据蛋白质的功能性、特别是酶催化涉及特定底物和产物的特定化学反应的能力，鉴定蛋白质的表达。在这些反应后可以用物理方法或化学方法提供并定量测定底物的损失或反应产物的生成。实例随待分析的酶的变化而变化，可以包括根据由膦丝菌素和14C-乙酰CoA产生放射标记的乙酰化膦丝菌素测定PAT酶活性，或根据邻氨基苯甲酸荧光的损失测定邻氨基苯甲酸合酶活性，以上仅例举了两个实例。
通常通过评价基因产物表达的表型结果，来确定基因产物的表达。这些测定也可以采用许多形式，包括但不限于分析所述植物的化学组成、形态或生理特性的改变。由于编码酶或贮藏蛋白预选DNA区段的表达，改变了氨基酸组成，因此可以改变化学组成，通过氨基酸分析，或通过可以用近红外反射光谱法分析改变淀粉量的酶，改变所述化学组成。形态改变可以包括体型更大或茎杆更粗。在称为生物测定的小心控制的条件下，评估植物或植物部分对所施加处理应答的最常见的变化。
预期此中产生的转基因植物对于多种商业和研究目的是有用的。可以创造转基因植物以用于传统农业，以具有对载培者有益的性状(例如农艺性状，例如对缺水的抗性、抗虫性、除草剂抗性或产量提高)、对从所述植物收获的谷物的消费者有益的性状(例如人类食品或动物饲料营养物含量提高)、或对食品加工者有益的性状(例如加工性状的改进)。在这类应用中，通常培育所述植物，以将其谷粒用于人类或动物食品中。然而，植物的其它部分包括茎杆、外壳、营养体部分等也具有实用性，包括用作动物青贮饲料或用于观赏目的。通常，提取玉米和其它作物的化学组分(例如油或淀粉)以用于食品或工业应用，并且可以创造这类组分含量提高或改进的转基因植物。
转基因植物也可以应用于蛋白质或其它分子的商业生产，其中从植物部分、种子等中提取目的分子并将其纯化。也可以在体外培养来自所述植物的细胞或组织，或让所述细胞或组织进行发酵，以生产这类分子。
所述转基因植物也可以用于商业育种程序，或可以与相关物种作物的植株杂交或配种。由所述预选DNA区段编码的改进可以例如从玉米细胞传递至其它物种的细胞，例如通过原生质体融合进行传递。
所述转基因植物在研究或育种方面有许多应用，包括通过插入诱变创造新的突变植物，以便鉴定随后可能通过传统突变和选择产生的有益突变体。一个实例将是导入编码转座因子、可以用来产生遗传变异的重组DNA序列。本发明的方法也可以用来创造具有特有“标记(signature)序列”或可以用来鉴定专有系或品种的其它标记序列的植物。
本发明将通过以下实施例进一步描述，所述实施例并不限制本发明的范围。
实施例1用于在植物中局部或系统传播的基于FHV的表达载体为了解决与现有的基于植物病毒的载体相关的问题，并且开发用于植物基因表达的高度有效的病毒载体系统，制备了一种基于罗达病毒的载体。所述载体(图8)包括FHVRNA-2序列，其中将称为绿色荧光蛋白(GFP；Epel等，1996；Casper等，1996)的标记基因导入衣壳前体的切割位点(β/γ，
图1)中，使得通过在不同的时间间隔测定接种叶片中的绿色荧光，可以监测FHV或者FHV RNAsFHV外壳蛋白GFP核蛋白复合体的表达和移动。GFP是一种最初从水母-维多利亚水母(Aequorea victoria)(Av)中分离的具有238个氨基酸残基的蛋白质。它吸收蓝光，在395nm有最大吸收，并且发射发射峰在509nm的绿光。当GFP在或者原核细胞或者真核细胞中表达时，它能够在用蓝光(紫外线)激发时产生强绿色荧光，并且这种荧光不需要来自其宿主的额外基因产物。
为了构建载体pF2G3(图8)，使用一种Bluescript噬菌粒载体(Stratagene，Califomia)中的FHV RNA-2的cDNA克隆(pBWD2)。用限制性酶NsiI将该质粒在切割位点打开。用含有NsiI位点的特异性引物从TMV cDNA克隆p30BGFPC3(在pUC19噬菌粒载体中含有TMVRNA序列加GFP序列)中经PCR扩增GFP序列(cycle 3 GFP，707bp，对于在植物中表达优化的)。将该PCR产物纯化，并插入pBWD2的NsiI位点中(图8)。
用100μl的10ng/μl FHV RNA或100μl的50ng/μl从pF2G3制备的RNA转录物加10ng/μl FHV RNA-1作为FHV复制酶来源，接种2周龄的野生型(TRS1)和表达TMV MP(H3NB3)或RCNMV MP的转基因Nicotiana benthamiana植株。用T3或T7RNA聚合酶，由所述载体DNA制备体外转录的RNA。使用TMV MP转基因N.benthamiana植株，是因为已经确定用FHV RNA接种表达TMV MP的转基因N.benthamiana植物，导致与对照相比，转基因N.benthamiana叶片中FHV积累水平高100倍(
图17)。该结果表明，TMVMP促进FHV的细胞至细胞的移动。总RNA的RT-PCR证实了这一结果。
在23-25℃、12小时光照期的生长室中培育植物。平行进行一个对照实验，其中用由p30BGFPC3制备的RNA转录物接种叶片。通过(1)从叶片提取的总RNA的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，和(2)以不同时间间隔通过手持UV灯在叶片上照射测量绿色荧光，监测叶片的FHV RNA以及GFP的合成。
接种后15天收获叶片，并且通过匀浆从100mg叶片(在液氮中冷冻)，然后通过热苯酚抽提，提取总RNA(Verwoerd等，1989)。用SuperscriptII(Gibco/BRL，Bethesda，MD)和Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)，分别将其反转录(RT)为cDNA和通过PCR进行扩增。RT反应在42℃进行1小时。PCR的循环参数为94℃1分钟，然后进行35个循环94℃30秒、55℃1分钟、72℃1.5分钟，然后进行一个循环72℃2分钟。所用引物是FHV2R1400 (SEQ ID NO1ACCTTAGTCTGTTGAC)和FHV2F1(SEQ ID NO2；GTAAACAATTCCAAG)。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳(
图12)。
如上所述，已经观察到FHV在TMV MP转基因植株中的滴度增加100倍。通过对来自接种的TMV MP转基因植株和RCNMV MP转基因植株的RNA进行的RT-PCR分析，证实了这一结果。TMV MP和RCNMV MP均使FHV移动至未接种的第二片叶片(
图12，5-8道)。在非转基因植株中，FHV序列仅在接种叶片中检测到，没有在未接种的第二片叶片中检测到(
图12，3道和4道)。当在接种后的不同时间监测FHVRNA合成时，野生型植物中FHV序列的存在在7dpi时达到高峰，但在14dpi和12dpi时实际上检测不到。这可能是由于在缺乏细胞至细胞移动时病毒或病毒核蛋白的失活所致。然而，在转基因植物中，由于FHV通过接种叶片移动，合成从10dpi持续至21dpi。用FHV RNA接种一半的叶片，然后通过RT-PCR监测，也表明FHV序列在转基因植物中移动至未接种的一半叶片，但与野生型植物相比移动非常差。用FHV RNA-1特异性引物和FHV RNA-2特异性引物，通过RT-PCR确定植物中存在FHV序列。
也用RT-RCR分析来检测NOV在N.benthamiana细胞中以及第一片(感染的)叶片中的复制。用NOV RNA接种野生型植株和表达RCNMV MP的转基因植株，并且在7-10天后收集第一片、第二片和第三片叶片。在第二片或第三片叶片中没有检测到病毒，虽然来自转基因植株的第一片叶片相对于非转基因植株表现出较高量的病毒(比非转基因植株高约5-10倍)。
通过绿色荧光测量GFP，从10dpi开始在用由F2G3(参见图8)制备的RNA转录物接种的叶片中显示出斑驳绿色荧光的小区。相比之下，未接种的植株没有表现出任何这类荧光。已经构建了能够高表达GFP的载体，例如基于FHVDI 634的载体(图7和图9)。用这些构建体显示出绿色荧光(如
图13中所示，来自用30BGFPC3的RNA转录物接种的植株的叶片；与
图14中未接种的叶片进行比较)证明FHV序列以及MP和GFP在这种植株中表达。
已经表明植物病毒通过该植物的长距离移动依赖于外壳蛋白。因此，基于FHV的载体的系统传播可以通过将植物病毒的外壳蛋白(CP)导入所述载体中而得到增强。因此，可以将基因组策略与FHV相似的一种植物病毒-红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)的CP导入pF2TmG3中，产生pFdTmRcG3(
图10)。RCNMV是一种球状植物病毒，其基因组分为两个信使RNA(Xiong等，1993)。RCNMV RNA-1(3.9kb)编码外壳蛋白(CP，37kDa)，而RNA-2(1.5kb)编码RCNMV移动蛋白(35kDa)。
在所述基于FHV的载体中TMV MP、RCNMV CP和GFP序列可以作为融合蛋白表达。或者，可以将蛋白酶解切割序列导入这些基因之间，使得所表达蛋白在翻译后加工各个蛋白。最初，将GFP序列置于3’端，使得GFP的表达作为上游序列(即TMV MP和RCNMV CP)完全表达的指示。然而，本发明不限于所导入基因的任何特定顺序。
实施例2应用基于FHV的载体将抗病性导入植物系统获得性抗性(SAR)是植物用来抗病原体感染的许多机制中的一种。在烟草中，编码致病相关(PR)蛋白的9个基因家族在SAR期间被协同诱导(关于综述，参见Ryals等，1996)。已经表明某些SAR相关蛋白(PR1a和SAR 8.2)抑制烟草中由卵菌纲寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)(Alexander等，1992；Alexander等，1993，Alexander等，1993)和簇囊腐霉(Pythium torulosum)所致的植物病害。因此，通过本发明的载体将SAR相关蛋白导入烟草或导入马铃薯中，可能对于抑制或防治烟草或马铃薯的所述卵菌纲所致植物病害(例如由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病)有作用。
为了将SAR基因导入本发明的载体中，可以使用在有已知序列和限制位点(
图15)的质粒(pCGN1788A)中的SAR 8.2基因的cDNA克隆。从该质粒中经PCR扩增含SAR 8.2基因的BamHI-SstI片段(529bp)，并将该PCR产物连接到基于FHV的载体中。3-6周龄植株的烟草叶片或马铃薯叶片用得自该载体的RNA和FHV RNA-1共转染。以规定的间隔，通过荧光测量和RT-PCR监测CPMPSAR8.2GFP融合蛋白的表达。在SAR开始表达时，通过用蒸馏水中的腐霉属或疫霉属游动孢子(300个孢子/ml)浇灌土壤或喷洒叶片，接种植物(Alexander等，1993；Chen等，1996)。不用FHV-SAR8.2嵌合体转染的对照植株以相似方式也用游动孢子接种。感染的植株保持在温室中7-9天，温度为23-25℃，光照期为12小时，并且比较对例如猝倒、枯萎或矮化的病症的抑制。
实施例3应用FHV衍生载体对杀虫蛋白进行结构域作图出现的功能基因组学领域要求用于测试编码序列和基因调节序列的推定生物学功能的高通量系统。基因组学对其特别有用的三种技术包括反义失效(knockout)、RNA干扰(共抑制)和大基因的结构域作图(Briggs等，1997；McKusick，1997；Evans等，1997)。四种长7-10kb的Pht(由细菌发光光杆状菌分泌的一种杀虫蛋白)基因与毒素特性相关，但毒性必需的最小序列尚未鉴定出。已知四种毒素复合位点tca、tcb、tcc和tcd的遗传图谱(
图16)。为了确定这些基因的哪些区域是毒性必需的，将所述Pht基因的特定序列及其组合导入基于FHV的载体中，以筛选Pht的功能区(Bowen等，1998)。特别是，由于已经表明tca和tcd的缺失消除了毒性(Bowen，1998)，因此将这些基因亚克隆到FHV衍生的载体中。最初，将通过部分或完全限制性消化产生的tca和tcd基因的约500-1500bp片段导入该载体中。用由这些构建体制备的RNA转录物接种N.Benthamiana植株，并且通过将植物部分饲喂昆虫(烟草天蛾(Manduca sexta))，然后测量所述昆虫在48小时内的体重降低，监测所述毒素基因的表达。
实施例4本发明的载体应用于昆虫功能基因组学为了用昆虫细胞系或昆虫作为本发明载体的宿主，根据对感染或转染后细胞病效应即裂解的抗性，选择修饰的病毒、修饰的昆虫细胞系或非天然昆虫宿主，例如果蝇。一个途径是通过突变或通过多次传代将病毒减毒。另一种途径是选择经受住裂解的细胞系。约1％的果蝇属细胞在FHV感染后经受住裂解，成为持续感染。存活的细胞带有FHV，抗罗达病毒的超感染，并且能够在新鲜细胞中繁殖(Dasgupta等，1994)。对FHV基因组RNA的序列分析表明，在持续感染建立期间在病毒基因组中没有突变，表明不是病毒基因组的修饰，而可能果蝇属细胞中的修饰(总群体的1％)导致持续感染。一种替代途径是用来自FHV和NOV的外壳蛋白序列构建杂种病毒。NOV RNA可以在转染的昆虫细胞中繁殖，而不产生细胞病效应(Ball等，1992)。由RNA-1编码的聚合酶识别来自或者FHV或者NOV的序列。
对于这些途径中的任一途径而言，通过感染/转染将具有目的基因或基因文库的基于FHV的载体导入宿主细胞中，并且检测表型的变化。因此，可以在短时间内鉴定和分析例如蛋白产物导致病害增强或抑制、眼形状和颜色改变、发育改变、生长改变和体重改变等的基因。
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所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。虽然在上述详细描述中在本发明的某些优选实施方案方面已经描述了本发明，而且已经叙述许多细节用于说明，本领域技术人员显而易见的是，本发明可以容许其它实施方案，并且在不偏离本发明的基本原理的情况下，可以对本文描述的某些细节作相当大的改变。
权利要求
1.一种生物活性基因转移载体，所述载体包含连接的核酸序列，所述核酸序列包含(a) 一段来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的5’端的核酸序列；(b) 一段包含至少一个目的核酸区段的核酸序列；和(c) 一段来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的3’端的核酸序列。
2.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个具有多克隆位点的核酸区段。
3.权利要求2的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个编码植物病毒移动蛋白的第二核酸区段。
4.权利要求2的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个编码植物病毒外壳蛋白的第二核酸区段。
5.权利要求2的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个含标记基因或选择标记的第二核酸区段。
6.权利要求3或4的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个含标记基因或选择标记的第三核酸区段。
7.权利要求3或5的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个编码植物病毒外壳蛋白的第三核酸区段。
8.权利要求4或5的载体，其中所述(b)的核酸序列还包含一个编码植物病毒移动蛋白的第三核酸区段。
9.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个编码植物病毒移动蛋白的核酸区段。
10.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个含标记基因或选择标记的核酸区段。
11.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个编码植物病毒外壳蛋白的核酸区段。
12.权利要求6的载体，其中将所述核酸区段连接，以产生一种融合多肽。
13.权利要求7的载体，其中将所述核酸区段连接，以产生一种融合多肽。
14.权利要求8的载体，其中将所述核酸区段连接，以产生一种融合多肽。
15.权利要求1的载体，所述载体是RNA。
16.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个反义核酸区段。
17.权利要求3的载体，其中所述核酸区段编码烟草花叶病毒的移动蛋白。
18.权利要求8的载体，其中所述核酸区段编码烟草花叶病毒的移动蛋白。
19.权利要求9的载体，其中所述核酸区段编码烟草花叶病毒的移动蛋白。
20.权利要求1的载体，其中所述(b)的核酸序列包含一个编码毒素的核酸区段。
21.权利要求20的载体，其中所述核酸区段编码发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)毒素、致病杆菌属(Xenorhabdus)毒素、肉毒杆菌(Botulinum)毒素或霍乱毒素。
22.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含(a) 一定量的罗达病毒RNA-1；和(b) 一定量的权利要求15的载体。
23.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含(a) 一定量的罗达病毒RNA-1；和(b) 一定量的包含连接的RNA序列的重组RNA分子，所述RNA序列包含来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的5’端的RNA；编码植物病毒移动蛋白的RNA；和来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的3’端的RNA。
24.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含(a) 一定量的罗达病毒RNA-1；和(b) 一定量的包含连接的RNA序列的重组RNA分子，所述RNA序列包含来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的5’端的RNA；编码植物病毒外壳蛋白的RNA；和来源于罗达病毒RNA-1或罗达病毒RNA-2的3’端的RNA。
25.一种在宿主细胞中表达由重组RNA分子编码的蛋白质的方法，所述方法包括(a) 使宿主细胞与一定量的权利要求23或24的组合物接触；和(b) 检测或测定所述蛋白质是否表达。
26.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞是双子叶植物细胞。
27.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞是单子叶植物细胞。
28.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
29.权利要求25的方法，其中所述宿主细胞是动物细胞。
30.一种在宿主细胞中表达包含核酸区段的核酸序列的方法，所述方法包括(a) 使宿主细胞与一定量的权利要求1的载体接触；和(b) 检测或测定所述核酸区段是否表达。
31.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是双子叶植物细胞。
32.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是单子叶植物细胞。
33.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
34.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是动物细胞。
35.一种将包含核酸区段的核酸序列导入植物的方法，所述方法包括使植物接触一定量的权利要求1的载体接触，以便产生其细胞包含权利要求1的载体的植物。
36.权利要求35的方法，其中所述核酸区段编码生长激素、毒素、细胞因子、抗病性、抗虫性、雄性不育性或杀虫剂抗性。
37.权利要求35的方法，其中所述植物通过喷洒或摩擦进行接触。
38.一种将重组RNA分子导入植物的方法，所述方法包括使植物与一定量的权利要求23或24的组合物接触，以便产生其细胞包含所述重组RNA分子的植物。
39.权利要求38的方法，其中所述重组RNA分子编码生长激素、毒素、细胞因子、抗病性、抗虫性、雄性不育性或杀虫剂抗性。
40.权利要求38的方法，其中所述植物通过喷洒或摩擦进行接触。
41.一种将核酸区段导入动物细胞的方法，所述方法包括(a) 使动物细胞与一定量的权利要求1的载体接触；和(b) 检测或测定在所述动物细胞中所述核酸区段的存在。
42.一种将核酸区段导入昆虫细胞的方法，所述方法包括(a) 使昆虫细胞与一定量的权利要求1的载体接触；和(b) 检测或测定在所述昆虫细胞中所述核酸区段的存在。
43.权利要求41或42的方法，其中所述核酸区段编码生长激素、毒素或细胞因子。
44.一种重组罗达病毒，所述重组罗达病毒包含一个感染性的第一RNA分子；和一个第二重组RNA分子，所述第二重组RNA分子编码病毒外壳蛋白、病毒移动蛋白或其组合。
45.一种转基因植物，所述转基因植物的基因组增加了权利要求1的载体。
46.一种植物部分，所述植物部分来自权利要求45的植物。
47.权利要求46的植物部分，所述植物部分是种子。
48.一种植物，所述植物由权利要求47的种子产生。
49.一种植物，所述植物用权利要求35的方法产生。
50.一种植物部分，所述植物部分用权利要求49的植物产生。
51.权利要求50的植物部分，所述植物部分是种子。
52.一种植物，所述植物由权利要求51的种子产生。
53.一种植物，所述植物用权利要求36的方法产生。
54.一种植物部分，所述植物部分用权利要求53的植物产生。
55.权利要求54的植物部分，所述植物部分是种子。
56.一种植物，所述植物由权利要求55的种子产生。
57.权利要求3的载体，其中所述核酸区段编码红三叶草坏死花叶病毒的外壳蛋白。
58.权利要求8的载体，其中所述核酸区段编码红三叶草坏死花叶病毒的外壳蛋白。
59.权利要求9的载体，其中所述核酸区段编码红三叶草坏死花叶病毒的外壳蛋白。
60.接触了罗达病毒的转基因植物，其中所述植物的基因组增加了编码烟草花叶病毒外壳蛋白的DNA。
61.接触了权利要求1的载体的转基因植物，其中所述植物的基因组增加了编码烟草花叶病毒外壳蛋白的DNA。
62.接触了罗达病毒的转基因植物，其中所述植物的基因组增加了编码红三叶草坏死花叶病毒外壳蛋白的DNA。
63.接触了权利要求1的载体的转基因植物，其中所述植物的基因组增加了编码烟草花叶病毒外壳蛋白的DNA。
64.权利要求60、61、62或63的转基因植物，所述转基因植物是Nicotiana benthamiana。
65.权利要求61或63的转基因植物，所述转基因植物接触了罗达病毒。
全文摘要
本发明提供可用于将基因转移至植物、昆虫和其它宿主的昆虫病毒载体。
文档编号C12N15/86GK1352693SQ00808087
公开日2002年6月5日 申请日期2000年3月29日 优先权日1999年3月31日
发明者R·K·达斯古普塔, R·古德曼 申请人:威斯康星旧生研究基金会