专利名称：α－糖化氨基酸释放酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型酶，具体地说，本发明涉及促使α-氨基糖化的氨基酸释放的新型酶。
这种利用蛋白酶的糖化蛋白质的测定方法，可如以下所示来进行。例如，用蛋白酶分解糖化蛋白质，该分解物与果糖基氨基酸氧化酶(以下，略作FAOD)进行反应，通过测定生成的过氧化氢量或消耗的氧量得知上述糖化蛋白质的量。作为上述蛋白酶使用了特开平5-192193号公报、特开平7-289253号公报等报道的蛋白酶。
类似与此，预先用蛋白酶处理糖化蛋白质是由于上述FAOD等易作用于糖化氨基酸或糖化肽，而难作用于糖化蛋白质本身。尤其是糖化血红蛋白(以下，略作HbAlc)，由于其糖化部分是β链N末端的氨基酸残基，所以为使FAOD易作用于这一部分，需要一种可处理HbAlc的蛋白酶。
首先，本发明人等在各种FAOD中，尤其对作用于糖结合在α-氨基的糖化蛋白质、糖化肽及糖化氨基酸等的FAOD，研究了其作用机制。由其结果可知，上述FAOD，例如虽可有效作用于α-氨基结合糖的糖化氨基酸，但难作用于上述糖化蛋白质或糖化肽。因此，本发明人等在这一认识的基础上，分离培养了自然界的多种菌体，并对这些菌体产生的酶进行了研究。其结果为，成功地分离出一系列菌体，这一系列菌体可产生促使糖结合在α-氨基(N末端氨基)的糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸(α-糖化氨基酸，以下略作α-GA)的新型酶，进而完成了本发明。根据本发明的新型酶(α-糖化氨基酸释放酶，以下略作α-GARE)，例如可使上述糖化蛋白质或糖化肽释放α-GA，因此可利用有效地作用于α-GA的上述FAOD来进行HbAlc的测定，并且在临床检验等方面可将该测定方法实用化。而且，除了HbAlc的测定以外，在其他糖化蛋白质的测定等多个领域也可广泛应用。此外，本发明的α-GARE除了具有促使α-GA释放的酶促功能以外，还可具有其他酶促功能，例如可具有切断其他肽键的功能等。作为本发明人等分离的新菌体，如鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)等的菌体。此外，本发明的α-GARE并不受限于这些菌体来源。
对于本发明的α-GARE，释放的糖化氨基酸只要是其α-氨基被糖化的话，就没有特殊的限制。但如上所述，因HbAlc的N末端缬氨酸残基被糖化，优选上述释放的α-GA为糖化缬氨酸(以下，略作α-GV)的α-GARE。
作为本发明的α-GARE，例如以下所示的、5种类型的α-GARE。
首先，第一种α-GARE来源于鞘氨醇杆菌属的菌体，特别优选来源于水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(Sphingobacterium mizutaeKDK1003)的α-GARE。该水氏鞘氨醇杆菌KDK1003是本发明人等从土壤中筛选、分离到的新型的菌体，并保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国 305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏编号FERM P-17348(保藏日期1999年3月29)。本菌体的细菌学特性如下所示。(形态上的特性)本菌体的形状是大小为0.5×1.2μm的杆菌，并且是非运动性的。(培养的性质)在常规的琼脂培养基上培养本菌体时，其菌落形态为低矮的、凸起状的边缘光滑的圆形，上述菌落的颜色为黄色。(生理学性质)革兰氏染色性 阴性需氧性 兼性厌氧型硝酸盐还原试验 -吲哚生成试验 -葡萄糖酸性化 -精氨酸二氢化酶 -脲酶 -七叶苷水解 -明胶水解 -β-半乳糖苷酶-基质利用能力葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-甘露糖 +D-甘露醇 -N-乙酰-D-葡糖胺 -麦芽糖 +葡糖酸钾 -正癸酸 -已二酸 -DL-苹果酸-柠檬酸钠 -乙酸苯酯 -其次，第二种α-GARE来源于鞘氨醇单胞菌属的菌体，特别优选来源于尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(Sphingomonasparapaucimobilis KDK1004)的α-GARE。上述尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004也是本发明人等从土壤中筛选、分离到的新型的菌体，并保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国 305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏编号FERM P-17347(原保藏日期1999年3月29日)。根据布达佩斯条约，原有保藏的微生物移交于具有国际保藏单位资格的上述通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所保藏，保藏编号FERM BP-7041(移交接收日期2000年2月21日)。本菌体的细菌学特性如下所示。(形态上的特性)本菌体的形状是大小为0.8×2.0μm的杆菌，并具有运动性。(培养的性质)在常规的琼脂培养基上培养本菌体时，其菌落形态为低矮的、凸起状的边缘光滑的圆形。上述菌落的颜色可由透明变为淡黄色。本菌体在麦氏(Mac Conkey)培养基上无法生长。此外，培养温度为42℃时，虽缓慢但可以生长。(生理学性质)革兰氏染色性阴性需氧性 兼性厌氧型菌硝酸盐还原试验-吲哚生成试验 -葡萄糖酸性化 -精氨酸二氢化酶-脲酶 -七叶苷水解+明胶水解 -β-半乳糖苷酶 +葡萄糖产气试验 -基质利用能力葡萄糖+L-阿拉伯糖+D-甘露糖 -D-甘露醇 +N-乙酰-D-葡糖胺 +麦芽糖+葡糖酸钾 -
正癸酸-己二酸-DL-苹果酸 -柠檬酸钠 -乙酸苯酯 +其次，第三种α-GARE来源于丛毛单胞茵属的菌体，特别优选来源于食酸丛毛单胞菌KDK1005(Comamonas acidovorans KDK1005)的α-GARE。上述食酸丛毛单胞菌KDK1005也是本发明人等从土壤中筛选、分离到的新型的菌体，并保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国 305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏编号FERM P-17346(保藏日期1999年3月29日)．本菌体的细菌学特性如下所示。(形态上的特性)本菌体的形状是大小为0.6×1.5μm的杆菌，并具有运动性。(培养的性质)在常规的琼脂培养基上培养本菌体时，其菌落形态为凸起状的圆形，并具有根足。上述菌落的颜色为黄色，并具有光泽。(生理学性质)革兰氏染色性阴性需氧性 好氧型菌硝酸盐还原试验 -吲哚生成试验 -葡萄糖酸性化 -精氨酸二氢化酶 -脲酶 -七叶苷水解 -明胶水解 -β-半乳糖苷酶-基质利用能力葡萄糖 -
L-阿拉伯糖+D-甘露糖 -D-甘露醇 +N-乙酰-D-葡糖胺 -麦芽糖-葡糖酸钾 +正癸酸+己二酸-DL-苹果酸 +柠檬酸钠 -乙酸苯酯 -其次，第四种α-GARE来源于毛霉属的菌体，特别优选来源于卷枝毛霉菌KDK3004(Mucor circinelloides f．jansseniiKDK3004)的α-GARE。上述卷枝毛霉菌KDK3004也是本发明人等从土壤中筛选、分离到的新型的菌体，并保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国 305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏编号FERM P-17345(保藏日期1999年3月29日)。本菌体的细菌学特性如下所示。(形态上的特性)本菌体形成球形的孢子囊孢子，其直径为4～6μm．孢子囊直径70μm左右并呈黑色，在基底部可看到囊领．菌丝宽为10-12μm，并且不形成假根。(培养的性质)在常规的琼脂培养基上培养本菌体时，只有通过配子囊的融合才可形成接合孢子。气生菌丝体为绵毛状、呈白色，并且色调可逐渐变为灰色．菌落的里面呈白色。而且，在37℃生长不良，40℃则不能生长。
再其次，第五种α-GARE来源于青霉属的菌体，特别优选来源于威克曼纳什青霉菌KDK3005(Penicillium waksmanii KDK3005)的α-GARE。上述威克曼纳什青霉菌KDK3005也是本发明人等从土壤中筛选、分离到的新型的菌体，并保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)(日本国 305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏编号FERM P-17344(保藏日期1999年3月29日)。本茵体的细菌学特性如下所示。(形态上的特性)由基底层直立的分生孢子梗被薄细胞壁所包裹，光滑且不形成顶囊。分生孢子梗无分枝。梗基为轮生并生成2-5个．在梗基的远端生成一个9μm的瓶梗。瓶梗的形状为具有短小、梢细状颈的烧瓶形。分生孢子直径为3μm、接近球状，并被光滑的细胞壁所包裹，彼此之间不呈连锁状。(培养的性质)在常规的琼脂培养基上培养本菌体时，生长速度为25℃、7天直径成30mm。菌落表面为毡毛状、呈绿色．菌丝为无色。菌落的里面为淡青色。不产生浸出液。37℃时的生长为阴性。
其次，本发明的糖化蛋白质或糖化肽的测定方法为，将糖化蛋白质或糖化肽用酶分解后，该分解物与FAOD进行反应，通过测定该氧化还原反应来测定上述糖化蛋白质或糖化肽的方法．这一方法特征是，作为上述酶使用了本发明的新型酶(α-GARE)。根据测定的糖化蛋白质或糖化肽的种类及它们的浓度等，可适宜选定本发明的测定方法中使用的α-GARE，既可以是一种、也可以是两种以上并用．此外，为使上述α-GARE更有效地发挥作用，也可预先用其他酶(例如蛋白酶)降解糖化蛋白质。
本发明的测定方法中，上述氧化还原反应的测定优选测定上述氧化还原反应生成的过氧化氢量或测定消耗的氧量。在测定上述过氧化氢量时，优选使用过氧化物酶与氧化后生色的底物(以下，略作生色性底物)进行测定。此外，上述过氧化氢量，除采用上述蛋白酶等的酶方法进行测定以外，例如可通过电化学的方法等进行测定。
作为上述生色性底物，例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠(例如，商品名DA-64；和光纯药社制等)、邻苯二胺(OPD)、特林达(トリン卜ダ一)试剂与4-氨基安替比林组合的底物等。作为上述特林达试剂，例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等．此外，除上述氨基安替比林以外，也可使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这些生色底物中，特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠。
本发明的测定方法中，如上所述，血细胞中的HbAlc的测定对于糖尿病的诊断十分有用，因此测定对象试样优选血细胞。但是，糖化蛋白质例如也存在于上述血细胞以外的血液成分(全血、血浆、血清等)、尿和髓液等活体试样、果汁等饮料、酱油、和味料等食物佐料中，因此测定对象并不局限于上述血细胞。而且，测定对象物也不局限于上述HbAlc，其外如明胶、酪蛋白等糖化蛋白质和糖化肽也可作为测定对象物。
其次，本发明的糖化蛋白质或糖化肽的测定试剂盒的特征在于是具备蛋白酶、FAOD、过氧化物酶及可由过氧化物酶的作用而氧化的底物等的试剂盒，并且上述蛋白酶中含有本发明的α-GARE。通过这一测定试剂盒可使本发明的测定方法变得快速而简便易行。如前所述，上述α-GARE既可以是一种，也可以是两种以上并用。
本发明的测定试剂盒中，作为上述可被氧化的底物，优选如前所述的生色性底物，测定对象物及测定对象试样同样如前所述。
其次，本发明的α-GARE的制备方法为包含培养本发明的新菌体的步骤的方法。由此，也可有效地制备出本发明的α-GARE。
本发明的α-GARE的制备方法更优选包含以下所示的(a)～(c)纯化步骤。
(a)从培养液中除去菌体，制备上清的步骤。
(b)上述上清中的蛋白质进行乙醇沉淀的步骤。
(c)上述蛋白质通过色谱方法进行分离的步骤。
上述纯化工程没有特殊的限定，也可与其他纯化步骤相组合。并且，例如也可以是只进行(a)步骤，也可以是进行两个以上的步骤，更可以是反复进行同一步骤。
通过如前所述的菌体培养得到的本发明的α-GARE，既可以是包含在培养液中的状态，也可以是被纯化的状态，只要可促使糖化蛋白质释放α-GARE，就可不受其纯化程度的制约而使用。但是，通过纯化可去除培养液中的α-GARE以外的成分，进而可提高上述α-GARE的比活性。而实际使用这类比活性高的α-GARE时，其使用量为少量并且操作简便。此外，应用于各种反应时，也可避免α-GARE以外成分的影响。
其次，对于通过如上所述的纯化步骤制备的α-GARE，优选进行其氨基酸序列的测定及基因序列的测定，并制备出编码本发明α-GARE的基因。另外，该基因并不局限于表达α-GARE所必要的基因，例如可包含作为探针和引物使用的DNA片断和RNA，此外也可包含根据α-GARE的基因序列制备的化学合成片断等。利用这类的基因，例如可制备重组体，并也可由此制备α-GARE。本发明的α-GARE的基因，例如可通过如下所示的方法来制备。
首先，本发明的α-GARE，例如通过后述的纯化步骤进行纯化，并用Edman降解等常规方法测定氨基酸序列，随后根据氨基酸序列推测出基因序列。在此基础上，通过一些常规方法、如化学合成等制备DNA片断和RNA片断，以此作为探针和引物使用，并从本发明的新型菌体克隆编码α-GARE的基因，进而得到本发明的α-GARE的基因。
图2为上述一实施例中，用鞘氨醇单胞菌属的菌体的培养上清液降解糖化肽，并通过TLC对其降解产物进行分析的另一色谱图。
图3为本发明的其他实施例中，用丛毛单胞菌属的菌体的培养上清液降解糖化肽，并通过TLC对其降解产物进行分析的色谱图。
图4为上述一实施例中，用毛霉属的菌体的培养上清液降解糖化肽，并通过TLC对其降解产物进行分析的另一色谱图。
图5为本发明的其他实施例中，用青霉属的菌体的培养上清液降解糖化肽，并通过TLC对其降解产物进行分析的色谱图。
图6为本发明的另外其他的实施例中，表示来源于鞘氨醇单胞菌属的菌体的α-GARE量与吸光度之间的关系的图。
图7为本发明的另外其他的实施例中，表示来源于鞘氨醇单胞菌属的菌体的α-GARE的热稳定性的图。
图8为本发明的另外其他的实施例中，表示来源于鞘氨醇单胞菌属的菌体的α-GARE的最适温度的图。
实施发明的最佳方案本发明的生成α-GARE的菌体的筛选，其过程如下所示，先分离培养土壤中的菌体，然后用其培养液进行糖化肽的降解反应，得到的降解产物可通过薄层色谱-(TLC)进行分析。另外，以下的筛选方法是为了分离α-GARE生成菌，本发明人等反复进行细致的研究的结果最终得到的。因此可以毫不过分地说，正是通过建立这一筛选方法，使本发明的α-GARE生成菌的分离的获得了成功。(1)培养方法将以下所示的营养液体培养基预先用高压灭菌，121℃灭菌20分钟。随后，将土壤样品悬浮于灭菌水中，并添加到上述灭过菌的营养液体培养基中，30℃振荡培养(111rpm)48小时。得到的培养液进行离心(12,000G，15分钟，4℃)，并回收上清。(营养液体培养基)麦芽浸出汁(商品名Malt extractDIFCO公司制) 2.0gD-葡萄糖(Nakalai Tesque公司制) 2.0g蛋白胨(商品名Bacto peptoneDIFCO公司制)0.1g蒸馏水 100ml(2)糖化肽的降解反应(糖化肽及糖化氨基酸的制备方法)用以下的肽、缬氨酸及葡萄糖，通过常规方法制备其氨基酸序列与HbAlcβ链的N末端侧氨基酸序列相同的α-氨基糖化肽及α-果糖基缬氨酸(以下，略作FV)。
(肽)Val-His(肽研究所社制以下，将此糖化物略作F2P)Val-His-Leu(肽研究所社制以下，将此糖化物略作F3P)Val-His-Leu-Thr(バイオリ ンク社制以下，将此糖化物略作F4P)Val-His-Leu-Thr-Pro(SIGMA公司制以下，将此糖化物略作F5P)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser(バイオリ ンク社制以下，将此糖化物略作F9P)(L-氨基酸)Val、Leu及His(和光纯药工业社制)(降解方法)上述各糖化肽预先用蒸馏水溶解，并使其终浓度为0.01M，进而分别制备成糖化肽水溶液。随后，分别混合上述各糖化肽水溶液50μl与上述培养液上清100μl，37℃反应一夜后，将这些反应液冷冻干燥。(3)TLC分析通过TLC分析上述糖化肽的降解物，并确认是否存在上述糖化肽释放的α-GA，以此来判定α-GARE活性的有无。此外，使用的试剂与方法如以下所示。
(薄层板)商品名Pre-Coated TLC Plate SILICA GEL 60(メルク社制)(检测试剂)将水合茚三酮(フナコシ社制)按0.5体积％的浓度，用75体积％的乙醇进行溶解。
(展开剂)丁醇(Nakalai Tesque公司制)、醋酸(Nakalai Tesque公司制)及蒸馏水按2∶1∶1的体积比混合。
(分析方法)准备一块可使展开距离达到8cm的上述薄层板，将距离上述平板下端1cm的位置作为样品点的原线。然后，在进行TLC分析之前，将上述冷冻干燥的各反应液分别溶解于50体积％的乙醇15μl中，并将这些样品用注射器(容量25μl)点样于上述原线上。另外，作为对照上述FV及各种氨基酸也进行同样的点样。将此平板放入预先用上述展开剂饱和的展开槽中，并使上述展开剂爬升到距上述原线约8cm的距离。加入的上述展开剂要使上述平板浸到距其下端约0.5cm的距离。
上述展开过程结束后，在通风橱内将上述检测试剂(水合茚三酮溶液)喷雾到已完全风干的上述平板上，随后用热搅动器(ホットスタ-ラ-)(100℃)加热并进行生色试验。其结果为，与对照的FV表现出相同迁移率的样品为α-GARE活性阳性，其培养液的菌体为α-GARE生成菌体。
上述TLC分析并不局限于如上述的水合茚三酮检测，除此以外，例如可采用利用荧光胺、乙二胺硫酸盐等试剂的荧光检测法。
作为上述对照，例如优选使用作为底物的糖化蛋白质或糖化肽的α-GA。
通过这种筛选方法，发明人等分离纯化的新菌体，如上述水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(FERMP-17348)、尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)、食酸丛毛单胞菌KDK1005(FERMP-17346)、卷枝毛霉菌KDK3004(FERMP-17345)、威克曼纳什青霉菌KDK3005(FERM P-17344)等。
作为本发明的α-GARE的检测及活性测定过程中可以使用的底物，并不局限于上述糖化肽，例如N末端的α-氨基糖化的蛋白质及糖化肽均可以使用。使用此类底物时，例如对于释放的α-GA可利用后述的FAOD进行氧化还原反应(例如生色反应等)，并由此来进行α-GARE的检测及测定。
作为上述糖化蛋白质，例如HbAlc、糖化珠蛋白等。此类糖化蛋白质，例如即可以是天然产物，也可以是通过糖与蛋白质之间的阿马多利(Amadori)重排反应合成的产物。上述糖化珠蛋白，例如将利用HPLC等纯化的HbAlc，通过Teale的方法(Teale，F.W.J.Biochem，Biophys，Acta，35，543，1959)进行珠蛋白化来制备。通过合成糖化各种蛋白质时，使用的糖并无特殊的限定，例如可以是葡萄糖等的醛糖、酮糖等。
上述糖化肽，例如可通过将上述的糖化蛋白质用蛋白酶进行降解来制备，也可通过糖与合成肽之间的阿马多利重排来合成。糖化肽的长度并无特殊的限定，例如氨基酸残基数可以是2～20的范围，优选2～8的范围。
与糖进行阿马多利重排反应的上述肽，例如既可以是天然产物，也可以是合成肽。其氨基酸组成虽没有特殊的限定，但优选不含精氨酸和赖氨酸的肽。将此类肽进行糖化，可制备只有肽的α-氨基被糖化的糖化肽，因此通过使用该糖化肽可以有选择性地只检测α-GARE的活性。
具体地说，将α-GARE用于HbAlc的测定、并以此为使用目的时，上述糖化肽，例如优选与HbAlcβ链中的N末端侧氨基酸序列相同的糖化肽，如上述“糖化肽的降解反应”中记载的N末端Val的α-氨基糖化的糖化肽。另外，例如用胰蛋白酶降解HbAlc，可得到N末端缬氨酸的α-氨基糖化的氨基酸残基数为8个的糖化肽。
作为α-GARE的底物使用N末端的α-氨基糖化的糖化肽等时，既可以检测释放的α-GA，也可以通过检测α-GA释放后的残存肽来检测或测定α-GARE。
这种糖化肽并没有特殊的限定，例如可以是FV-Leu(以下略作FVL)、FV-Gln(以下略作FVQ)、FV-Ala(以下略作FVA)、FV-Asn(以下略作FVN)等二肽。这些均可以通过α-GARE的作用而释放FV，同时分别生成Leu、Gln、Ala、Asn。分别将生成的Leu用亮氨酸脱氢酶、Gln用谷氨酸脱氢酶、Ala用丙氨酸转氨酶和α-酮戊二酸和乳酸脱氢酶、Asn用天冬酰胺转氨酶和α-酮戊二酸和苹果酸脱氢酶等进行反应，并通过吸光度测定(波长340nm)检测出NADH生成或NAD生成。
作为糖化三肽，例如FV-Leu-Ser(以下略作FVLS)等。FVLS在α-GARE的作用下释放FV，同时生成Leu-Ser。将此用氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K等水解酶进行降解，由此生成的亮氨酸可如前述进行测定。另外，上述肽的长度没有特殊的限定。
再者，作为α-GARE的底物可以含有氨基酸和检测基团，其中上述氨基酸的α-氨基被糖化，并且上述检测基团和上述氨基酸的α-羧基形成酰胺键或酯键，上述检测基团为结合状态时无法进行检测，释放后方可检测出的底物。
α-GARE作用于上述底物时，可切断α-GA和上述检测基团之间的酰胺键或酯键，并释放出α-GA和检测基团。通过这种切断被释放的上述检测基团，例如可生色或发光，因此可通过这种生色或发光现象检测或测定α-GARE。
上述检测基团物没有特殊的限制，优选如前所述的、通过生色或荧光可检测出的基团。作为可通过上述生色现象检测出的检测基团，如对硝基酰替苯胺(パラニトロアニリド，以下略作p-NA)、对硝基苯酚、吲哚、β-萘酰胺、4-甲氧基-β-萘酰胺(4Mβ NA)等；作为可通过上述荧光检测出的检测基团，例如4-甲基-香豆基-7-酰胺等。具体地说，对于p-NA和对硝基苯酚，例如将波长405～410nm附近的吸光度通过分光光度计进行测定为好；对于4-甲基-香豆基-7-酰胺，在波长380nm激发、在波长460nm进行检测为好。
上述检测基团和α-羧基之间的键无论是酰胺键或是酯键，α-GARE皆可促使α-GA的释放，因此推测α-GARE可识别α-氨基的糖化部分并促使α-GA的释放。
这种α-羧基上结合有检测基团的α-GARE的底物，例如可用市售的结合有检测基团的氨基酸和糖按常规方法进行制备。
本发明的α-GARE，例如可通过遵循上述培养方法的方法培养本发明的α-GARE生成菌体，并以此来制备α-GARE。对于水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(FERMP-17348)，例如培养温度为20～37℃的范围、培养时间为12～120小时的范围、培养基的pH为6.0～9.5的范围；对于尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)，例如培养温度为20～37℃的范围、培养时间为12～120小时的范围、培养基的pH为6.0～9.5的范围；对于食酸丛毛单胞菌KDK1005(FERM P-17346)、卷枝毛霉菌KDK3004(FERM P-17345)及威克曼纳什青霉菌KDK3005(FERM P-17344)，例如培养温度为20～37℃的范围、培养时间为12～120小时的范围、培养基的pH为5.0～9.0的范围。
上述培养液中含有的α-GARE可通过常规方法的分离纯化，并得到α-GARE的酶标准品。α-GARE的纯化，例如可通过已知的方法、如硫酸铵等的盐析法、等电点沉淀法、乙醇沉淀法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、亲和色谱法、疏水性色谱法等的组合来进行纯化。下面举一个源自水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(FERM P-17348)的α-GARE的纯化方法的例子。
首先，将上述培养液进行离心(12,000G，15分钟，4℃)，除去菌体并得到上清。随后，上述上清用超滤膜(商品名MICROZA，分级分子量大小3kDa旭化成社制)浓缩40倍(体积)。在上述浓缩液中加入1/3倍体积量的阴离子交换树脂(商品名DEAE Sepharose FFPharmacia公司制)，并通过间歇式离子交换法进行α-GARE的吸附及洗脱。其过程为，先用10mM磷酸氢二钾水溶液，随后用含有0.05MNaCl的10mM磷酸氢二钾水溶液洗净以除去非吸附性蛋白质，然后用含有0.15M NaCl的10mM磷酸氢二钾水溶液洗脱α-GARE，并回收α-GARE活性组分。
其次，将上述活性组分上样到用20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡化的阴离子交换柱(商品名Q-Sepharose FFpharmacia公司制)，使α-GARE吸附于柱上，并用上述缓冲液洗净柱子。随后，用含NaCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，通过NaCl浓度0.2M-0.26M的梯度洗脱法洗脱α-GARE。此时，α-GARE可通过含有0.26M NaCl的20mM磷酸钾缓冲液洗脱出来。
例如，通过以上的纯化方法可得到部分纯化的本发明的α-GARE酶溶液。此外，源自本发明的其他新菌体的α-GARE也可同样地进行纯化。
本发明的新型菌体培养使用的培养基，并不局限于上述营养液体培养基，除此以外，例如可使用以下所示的血红蛋白(Hb)培养基。此外，Hb溶液例如可通过以下所示的方法进行配制。
(Hb培养基pH6.0)Hb溶液 0.2重量％K2HPO40.2重量％MgSO4·7H2O 0.02重量％微量金属盐溶液 1.0重量％微量维生素类溶液 0.2重量％(Hb溶液)新鲜血液经离心后(2,000G，10分钟，室温)回收红细胞，向其中加入等量(体积)的蒸馏水进行溶血。该溶血液进行离心(2,000G，15分钟，室温)，将除去红细胞膜等的溶液作为Hb溶液。(微量金属盐溶液)CaCl2·2H2O 200mgH3BO350mgCuSO4·5H2O 20mgKI 50mgFeSO4·7H2O 100mgMnSO4·5H2O 200mgZnSO4·7H2O 200mgNa2MoO4·2H2O50mg其他水(总量500ml)(微量维生素类溶液)Ca-泛酸 40mg肌醇20mg烟酸40mgρ-氨基苯甲酸 20mg吡哆醇盐酸盐40mg硫胺素盐酸盐40mg生物素 0.2mg维生素B120.05mg其他水(总量100ml)以下，将血细胞作为试样、并以利用α-GARE及FAOD测定上述血细胞中的糖化蛋白质(例如HbAlc)作为例子，对于本发明的糖化蛋白质或糖化肽的测定方法进行说明。
首先，从全血中通过离心等常规方法分离血细胞组分，并将此组分进行溶血。该溶血方法并无特殊的限定，例如可采用利用表面活性剂的方法、利用超声波的方法、利用渗透压差的方法等。而出于操作简便性等理由，优选利用表面活性剂的方法。
作为上述表面活性剂，例如可使用商品名Triton X-100等的聚环氧乙烷-对叔辛基苯基醚类、商品名Tween-20等的聚环氧乙烷山梨糖醇酐烷基酯类、商品名Brij35等的聚(环氧乙烷)烷基醚类等。上述表面活性剂的处理条件，例如处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％时，按上述处理溶液中的浓度为0.1～1重量％添加上述表面活性剂，并在室温搅拌5秒～1分钟程度即可。
然后，用本发明的α-GARE对上述溶血试样进行酶处理。由此，可促使上述溶血试样中的糖化蛋白质释放α-GA。上述利用α-GARE的酶处理，例如可在缓冲液中进行，其处理条件可根据使用的α-GARE的种类(例如来源等的不同)、糖化蛋白质和糖化肽的种类及它们的浓度等适宜选定。
例如，测定对象物为HbAlc、并使用源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERMBP-7041)时，其处理条件例如为反应液中的α-GARE浓度0.01U～1KU/升、温度15～60℃、反应时间3分钟～6小时、pH5.0～10.0的范围。并且，优选分别为温度30～37℃、反应时间5～60分钟、pH6～8的范围。此时，作为上述缓冲液可使用Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、良好缓冲液(EPPS缓冲液、PIPES缓冲液)等。另外，源自本发明的其他新菌体的α-GARE也可同样地使用。
然后，用FAOD处理通过上述α-GARE处理得到的降解物(α-GA)。下述式(1)表示FAOD催化的α-GA的降解反应。
(式1)
如上述式(1)所示，通过用FAOD处理经上述α-GARE处理的降解物(α-GAR1-CO-CH2-NH-R2)，生成了糖(R1-CO-CHO)、氨基酸(NH2-R2)和过氧化氢(H2O2)。
上述式(1)中，R1表示糖化反应前的来源于糖的残基(糖残基)。在反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R1)为醛糖残基；反应前的糖为酮糖时，上述糖残基(R1)为酮糖残基。例如反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排，反应后的结构为果糖结构，而此时，糖残基(R1)成为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)例如可用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，并且n取0～6的整数。
上述式(1)中，R2为α-氨基糖化的氨基酸残基，并可用下述式(2)表示。下述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基团。
(式2)-CHR3-CO-OH上述FAOD只要可酶促上述反应，就没有特殊的限定，例如也可进一步具有其他酶促功能。这种FAOD处理，与利用上述α-GARE的酶处理同样，优选在缓冲液中进行。上述缓冲液并无特殊的限定，例如可使用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。
上述FAOD的处理条件，例如反应液中的FAOD浓度0.1～10KU/升、温度15～50℃、反应时间1～60分钟、pH6～9的范围，优选分别为FAOD浓度0.5～2KU/升、温度30～37℃、反应时间5～20分钟、pH7～8的范围。
由上述FAOD处理而产生的过氧化氢可利用上述POD及因氧化而生色的底物，并通过氧化还原反应进行测定。
上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据反应液中的过氧化氢浓度等适宜选定。例如反应液中的POD浓度10U～400KU/升、反应温度15～40℃、反应时间0.1～5分钟、pH5～10，更优选POD浓度50U～20KU/升、反应温度30～37℃、反应时间0.1～1分钟、pH5～8。并且，上述缓冲液并无特殊的限制，可使用与上述FAOD处理同样的缓冲液等。
作为上述底物使用上述生色性底物时，可通过用分光光度计测定其生色强度(反应液的吸光度)来测定过氧化氢的浓度，并可由此得知试样中的糖化蛋白质浓度。
该测定中各处理步骤可如前述分别进行，但根据具体情况既可同时进行若干个步骤，也可同时进行所有步骤。例如通过向试样中同时添加α-GARE和FAOD来进行反应，可同时进行α-GARE处理步骤和FAOD处理步骤。并且，通过向α-GARE降解物中同时添加FAOD、POD和生色性底物来进行反应，可同时进行FAOD处理步骤和利用POD的生色步骤。此外，也可同时进行利用上述表面活性剂的溶血处理步骤和α-GARE处理步骤。(实施例)(实施例1)这一实施例为将本发明的生成α-GARE的新菌体的培养上清和具有α-GA的糖化肽进行反应，并促使上述糖化肽释放α-GA的例子。另外，如没有特殊的说明，菌体的培养、糖化肽的降解及TLC分析将和上述筛选方法同样地进行。
首先，以下所示的本发明的各新型菌体分别接种于5ml上述营养液体培养基(pH8.0)中，并在30℃振荡培养48小时。得到的各培养液进行离心，除去菌体，其上清作为粗酶液。
(使用菌体)水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(FERM P-17348)尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)食酸丛毛单胞菌KDK1005(FERM P-17346)卷枝毛霉菌KDK3004(FERM P-17345)威克曼纳什青霉菌KDK3005(FERM P-17344)分别混合上述粗酶液100μl和上述各0.01M糖化肽(F2P、F3P)水溶液50μl，30℃反应一晚后，通过TLC分析这些反应液。这些TLC的分析结果示于
图1～图5。
图1～图5分别为水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(FERM P-17348)、尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)、食酸丛毛单胞菌KDK1005(FERM P-17346)、卷枝毛霉菌KDK3004(FERM P-17345)和威克曼纳什青霉菌KDK3005(FERM P-17344)的TLC分析的色谱图。
图1～图5中第1行为对照(FV)、第2行为对照(Leu、Val、Hi s)，
图1及图2中第3行为F3P降解物，图3～图5中第3行为F2P降解物、第4行为F3P降解物。各图中箭头所指点的迁移率示于表1。(表1)图号 样品名 迁移率
图1 对照FV 0.43F3P降解物0.44图2 对照FV 0.43F3P降解物0.44图3 对照FV 0.40F2P降解物0.42F3P降解物0.40图4 对照FV 0.40F2P降解物0.40F3P降解物0.42图5 对照FV 0.40F2P降解物0.40F3P降解物0.42如
图1～图5及上述表1所示，经上述各粗酶处理液处理的糖化肽降解物中，可确认有和对照FV相同迁移率的点(箭头所指的点)。由以上可知，本发明的α-GARE可促使糖化肽释放α-GA。由上述降解物的点与Val的迁移率有别，可知糖并没有从经α-GARE作用而释放的FV上脱离。如图3～图5所示，F2P降解物中看到了FV和His的点。而之所以在F3P降解物中看不到FV以外的降解物(二肽)的点，可推测是由于用这种TLC方法难以检测出的缘故。(实施例2)这一实施例为用源自本发明的新型菌体的粗酶处理糖化肽，并确认α-GA(FV)释放的例子。
尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)于上述Hb培养基(pH6.0)中，28℃往复振荡培养5天。随后，离心培养液(12,000G，15分钟，4℃)，得到的上清作为粗酶液。
0.01M F4P水溶液50μl与上述粗酶液100μl及0.2M磷酸钾缓冲液(pH8.0)50μl进行混合，37℃反应一晚。随后，该反应液用超滤膜(分级分子量大小5kDa商品名Ultra free MC filter(ウルトラフリ一MCフイルタ一)Millipore公司制，以下相同)除去蛋白质等高分子量物质，得到的溶液进行冷冻干燥。
上述各冷冻干燥品溶解于20μl下述洗脱液A中，并在下述条件，将此溶液上样到反相色谱，从分析开始后每15秒(250μl/l组分)收集一组分。此外，作为对照将FV在同样条件进行洗脱，并确认其洗脱时间。
(反相色谱)色谱柱商品名Hypercard(Gel Science公司制)尺寸100mm×4.6mm进样阀体积1000μl洗脱液A三氟醋酸∶蒸馏水＝0.1∶100(体积比)洗脱液B三氟醋酸∶蒸馏水∶乙腈＝0.1∶80∶20(体积比)梯度条件0分钟～25分钟0-20体积％洗脱液B25分钟以后20体积％洗脱液B流速1ml/分钟柱温37℃检测波长210nm、230nm然后，经上述反相色谱得到的各分离组分，通过以下所示的方法检测FV。
(FV的检测方法)20μl各分离组分溶液中添加10μmol/l过氧化氢水溶液20μl后，再加入下述氧化还原反应液A 60μl，37℃反应15分钟。上述反应是用生化自动分析仪(商品名JCA-BM8日本电子社制，以下相同)进行的，其检测过程是在主波长694nm及副波长884nm下，通过上述反应液的吸光度的测定来完成的。
(氧化还原反应液A的组成)商品名DA64(和光纯药工业社制，以下相同)33μmol/lPOD(TypeIII东洋纺纱社制，以下相同) 33KU/lFAOD(旭化成社制) 3.3KU/l磷酸钾缓冲液(pH8.0) 0.17mol/l
其结果是，可确认反相色谱的洗脱时间为5～6分钟的分离组分中具有生色现象。这一洗脱时间与对照FV的洗脱时间一致，并说明F4P的降解物中存在着FV。(实施例3)这一实施例为改变α-GARE浓度后，确认各浓度条件下α-GARE活性的例子。(1)部分纯化酶的制备和实施例2同样，分别培养尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERMBP-7041)，并从其培养液回收上清作为粗酶液。用上述超滤膜(分级分子量大小5kDa)将50ml该粗酶液浓缩成5ml后，用以下所示条件的凝胶色谱进行部分纯化。
(凝胶色谱)色谱柱商品名Superdex 200pg(Pharmacia公司制)柱尺寸内径260mm、长度600mm流速5.2ml/分钟检测波长280nm、230nm洗脱液20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)1组分7ml(2)α-GARE活性的测定(降解方法)将一定量(25、50、75、100、125μl)的上述部分纯化α-GARE及1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)添加到50μl的10mM F3P水溶液中，37℃反应一晚。上述反应溶液总量为200μl，上述缓冲液的终浓度为50mM。
(测定方法)用蒸馏水将上述反应溶液稀释3倍(体积)，并向25μl该稀释液中依次先加入10μM过氧化氢水溶液15μl后，再加入下述氧化还原反应液B 70ml，37℃反应15分钟。然后，和实施例2同样进行吸光度的测定。以未添加α-GARE时为空白对照，以每隔5分钟的吸光度增加量作为α-GARE活性的指标进行测定。这一结果如图6所示。图6为表示源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的α-GARE的酶量与生色量(吸光度)之间关系的图。
(氧化还原反应液B的组成)DA64 31μmol/lPOD31KU/lFAOD 0.8KU/l磷酸钾缓冲液(pH8.0)0.16mol/l如图6所示，上述α-GARE在酶量约为20～100μl的范围时，酶活性随酶量增加而提高。(实施例4)这一实施例为确认本发明的α-GARE热稳定性的例子。
上述实施例3中制备的、源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERMBP-7041)的α-GARE的部分纯化酶预先在各温度(30、37、50、60、70℃)温育20分钟。然后，和实施例3同样的F3P水溶液50μl与上述热处理后的部分纯化酶100μl及50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)50μl混合，37℃反应18小时。同上述实施例3一样，20μl的该反应溶液用FAOD进行氧化还原反应，并测定吸光度。以每隔5分钟的吸光度增加量作为α-GARE活性的指标，并求得以未处理的α-GARE活性为100％时的残存活性(％)。其结果如图7所示。图7为表示源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的α-GARE热稳定性的图。
如图7所示，上述α-GARE经30～50℃的热处理时表现出100％的残存活性，但经70℃热处理时则完全失活。(实施例5)这一实施例为确认本发明的α-GARE的最适温度的例子。
将上述实施例3中制备的、源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的α-GARE的部分纯化酶100μl及200mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)50μl与和实施例3同样的F3P水溶液50μl混合，在各温度(10、30、37、50、60、70℃)反应8小时。用蒸馏水将该反应液稀释3倍(体积)，并和实施例3同样，25μl该稀释液用FAOD进行氧化还原反应，并测定吸光度。而且，以每隔5分钟的吸光度增加量作为α-GARE活性的指标。其结果如图8所示。图8为表示源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的α-GARE最适温度的图。
由图示可知，上述α-GARE的最适温度约为37℃左右。(实施例7)这一实施例为确认本发明的α-GARE分子量的例子。
和上述实施例3同样，将尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的培养液上清用同样条件的凝胶色谱进行分离。然后，和实施例3同样，各组分用FAOD进行氧化还原反应，并测定α-GARE活性。另一方面，将分子量标准(商品名MW标准(HPLC)东方酵母社制)在同样的条件进行上述凝胶色谱分析。对照由其结果得到的分子量的标准曲线及α-GARE洗脱结果，可推算源自尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(FERM BP-7041)的α-GARE分子量约为40,000～60,000。
产业上的实用性正如前面说明的那样，本发明的新型酶α-GARE可促使糖化蛋白质释放α-氨基糖化的氨基酸残基。因此，例如将上述α-GARE应用于采用FAOD的糖化蛋白质等的测定方法中的话，由于可使糖尿病诊断的指标HbAlc的测定既准确又简便易行，进而可将HbAlc的测定在临床检验上实用化。
权利要求
1.一种新型酶，其特征在于该酶可促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸，并且是来源于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)菌体的酶。
2.根据权利要求1记载的酶，其中鞘氨醇杆菌属菌体为水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(Sphingobacterium mizutae KDK1003)(FERM P-17348)。
3.一种新型酶，其特征在于该酶可促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸，并且是来源于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌体的酶。
4.根据权利要求3记载的酶，其中鞘氨醇单胞菌属菌体为尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(Sphingomonas parapaucimobilisKDK1004)(FERM BP-7041)。
5.一种新型酶，其特征在于该酶可促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸，并且是来源于丛毛单胞菌属(Comamonas)菌体的酶。
6.根据权利要求5记载的酶，其中丛毛单胞菌属菌体为食酸丛毛单胞菌KDK1005(Comamonas acidovorans KDK1005)(FERM P-17346)。
7.一种新型酶，其特征在于该酶可促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸，并且是来源于毛霉属(Mucor)菌体的酶。
8.根据权利要求7记载的酶，其中毛霉属菌体为卷枝毛霉菌KDK3004(Mucor circinelloides f.janssenii KDK3004)(FERM P-17345).
9.一种新型酶，其特征在于该酶可促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸，并且是来源于青霉属(Penicillium)菌体的酶。
10.根据权利要求9记载的酶，其中青霉属菌体为威克曼纳什青霉菌KDK3005(Penicillium waksmanii KDK3005)(FERM P-17344)。
11.根据权利要求1～10任一项记载的酶，其中释放的氨基酸为α-氨基糖化的缬氨酸。
12.一种测定方法，其特征在于利用权利要求1～10任一项记载的酶降解糖化蛋白质或糖化肽后，其降解产物和果糖基氨基酸氧化酶进行反应，并由测定该氧化还原反应来测定上述糖化蛋白质或糖化肽的量。
13.根据权利要求12记载的测定方法，其中作为测定对象物的糖化蛋白质为糖化血红蛋白。
14.一种测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是具备蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶及可由过氧化物酶的作用而氧化的底物的糖化蛋白质或糖化肽的测定试剂盒，并且上述蛋白酶中含有权利要求1～10任一项记载的酶。
15.一种菌体，该菌体为鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)菌体，并可生成促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸的酶。
16.根据权利要求15记载的菌体，其中鞘氨醇杆菌属菌体为水氏鞘氨醇杆菌KDK1003(Sphingobacterium mizutae KDK1003)(FERMP-17348)。
17.一种菌体，该菌体为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌体，并可生成促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸的酶。
18.根据权利要求17记载的菌体，其中鞘氨醇单胞菌属菌体为尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(Sphingomonas parapaucimobilisKDK1004)(FERM BP-7041)。
19.一种菌体，该菌体为丛毛单胞菌属(Comamonas)菌体，并可生成促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸的酶。
20.根据权利要求19记载的菌体，其中丛毛单胞菌属菌体为食酸丛毛单胞菌KDK1005(Comamonas acidovorans KDK1005)(FERMP-17346)。
21.一种菌体，该菌体为毛霉属(Mucor)菌体，并可生成促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸的酶。
22.根据权利要求21记载的菌体，其中毛霉属菌体为卷枝毛霉菌KDK3004(Mucor circinelloides f.janssenii KDK3004)(FERMP-17345)。
23.一种菌体，该菌体为青霉属(Penicillium)菌体，并可生成促使糖化蛋白质或糖化肽释放α-氨基糖化的氨基酸的酶。
24.根据权利要求23记载的菌体，其中青霉属菌体为威克曼纳什青霉菌KDK3005(Penicillium waksmanii KDK3005)(FERM P-17344)。
25.根据权利要求15～24任一项记载的菌体，其中释放的糖化氨基酸为α-氨基糖化的缬氨酸。
全文摘要
本发明涉及促使糖化蛋白质等释放α－氨基糖化的氨基酸残基(α－GA)的新型酶(α－GARE)及生成此酶的新菌体。作为上述生成菌,例如尖少动鞘氨醇单胞菌KDK1004(Sphingomoansparapaucimobilis KDK1004)(FERM BP－7041)。如
图1所示,由于该菌体的培养液上清中含有上述α－GARE,使用此酶可促使糖化肽释放α－GA。
文档编号C12N9/48GK1355841SQ00808856
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月11日 优先权日1999年4月12日
发明者石丸香, 八木雅之, 米原聪 申请人:阿克雷株式会社