专利名称：来自谷氨酸棒状杆菌的叶酸生物合成基因及其在叶酸微生物生产方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用经遗传操作的生物通过发酵产生叶酸的方法。本发明包括四种来自谷氨酸棒状杆菌(Cory nebacterium glutamicum)的叶酸生物合成基因(folE、folP、folB和folK)的核苷酸序列及其在叶酸微生物生产方面的应用。这四种基因组成一种操纵子，并以下序列转录folE、folP、folB和folK。
叶酸是动物体的必需成分。其衍生物四氢叶酸是动物细胞内一种用途极为广泛的活性单碳元载体(Carrier von aktivierten Einkohlenstoffeinheiten)。叶酸含有三种基团取代的蝶啶环、p-氨基苯甲酸酯基团和谷氨酸酯基团。哺乳动物不能合成蝶啶环。但能够由饮食及其肠道微生物吸收叶酸。叶酸缺乏主要导致粘膜病损。
叶酸的商业价值在于动物饲料及人类食品市场领域。叶酸主要可作为一种食品添加剂。
叶酸的发酵生产可使用微生物。通过对叶酸生物合成途径的遗传操作可优化微生物的叶酸生物合成效率。此处的遗传操作是指提高叶酸生物合成途径相关基因的拷贝数和/或转录速率。其结果是提高基因产物的比率，从而提高胞内的酶活性。酶活性的提高可导致食物(如葡萄糖)向叶酸的转化率提高，从而还导致产物浓度的提高。为了进行遗传操作，必须鉴定叶酸生物合成途径相关基因的核苷酸序列。本发明涉及来自谷氨酸棒状杆菌并用于叶酸生物合成的四种新基因序列及其在叶酸微生物生产方面的应用。
一方面，本发明包括folE基因产物。序列编号2显示一种多肽序列。folE基因产物编码一种由202个氨基酸组成的分子量为22029Da的多肽。本发明还涉及此多肽的功能性衍生物，这些衍生物可通过利用缺失、插入或取代或缺失、插入与取代的某种组合将序列编号2的一个或多个氨基酸，优选的是多达25％的氨基酸，最适当的则是多达15％的氨基酸，加以替换的方法来获得。术语“功能性衍生物”是指酶活性与含有序列编号2所示序列的多肽仍处于相同数量级的衍生物。
另一方面，本发明包括folP基因产物。序列编号4显示一种多肽序列。folP基因产物编码一种由285个氨基酸组成的分子量为29520Da的多肽。本发明还涉及此多肽的功能性衍生物，这些衍生物可通过利用缺失、插入或取代或缺失、插入与取代的某种组合将序列编号4的一个或多个氨基酸，优选的是多达40％的氨基酸，最适当的则是多达25％的氨基酸，加以替换的方法来获得。术语“功能性衍生物”是指酶活性与含有序列编号4所示序列的多肽仍处于相同数量级的衍生物。
另一方面，本发明包括folB基因产物。序列编号6显示一种多肽序列。folB基因产物编码一种由131个氨基酸组成的分子量为14020Da的多肽。本发明还涉及此多肽的功能性衍生物，这些衍生物可通过利用缺失、插入或取代或缺失、插入与取代的某种组合将序列编号6的一个或多个氨基酸，优选的是多达30％的氨基酸，最适当的则是多达20％的氨基酸，加以替换的方法来获得。术语“功能性衍生物”是指酶活性与含有序列编号6所示序列的多肽仍处于相同数量级的衍生物。
另一方面，本发明包括folK基因产物。序列编号8显示一种多肽序列。folk基因产物编码一种由160个氨基酸组成的分子量为18043Da的多肽。本发明还涉及此多肽的功能性衍生物，这些衍生物可通过利用缺失、插入或取代或缺失、插入与取代的某种组合将序列编号8的一个或多个氨基酸，优选的是多达40％的氨基酸，最适当的则是多达30％的氨基酸，加以替换的方法来获得。术语“功能性衍生物”是指酶活性与含有序列编号8所示序列的多肽仍处于相同数量级的衍生物。
另一方面，本发明包括可编码上述多肽的多核苷酸序列。这些多核苷酸序列的产生可由分离自谷氨酸棒状杆菌的序列(即序列编号1、3、5和7)开始，通过定点诱变将这些序列加以修饰，或利用遗传密码对相应多肽进行翻译并在此基础上完全采用化学合成的方法。
优选地，这些多核苷酸序列可用来转化宿主生物，在此优选的为微生物，特别是采用基因构建体的形式，此类构建体至少含有这些多核苷酸之一的一个拷贝，并至少含有一种调节序列。调节序列中包括启动子、终止子、增强子以及核糖体结合位点。
利用这些基因构建体进行转化的优选宿主生物为棒状杆菌属(Corynebacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)物种。也可采用任一种真核微生物，优选的为阿什比酵母属(Ashbya)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Sac charomyces)及汉森酵母属(Hansenula)的酵母菌株。
另一方面，本发明包括叶酸的生产方法，该方法包括将以上述方式转化的宿主生物加以培养，然后分离叶酸。
培养微生物以及由微生物产品中分离叶酸的方法和过程已为熟练技术人员所了解。
以下实施例将对本发明用于微生物遗传操作以提高叶酸合成效率的应用做更详细地描述。
序列列表(I)一般信息(1)申请人(A)名称BASF-LYNX Bioscience AG(B)街道Im Neuenheimer Feld 515(C)城市Heidelberg(D)国家德国(E)邮政编码69120(F)电话06221/4546(G)传真06221/454770(2)标题 用于生物合成叶酸的来源于谷氨酸棒状杆菌的基因及其用于微生物生产叶酸的用途(3)序列号8SEQ ID NO.1DNA(folE)ATGAAGGAGACAACCGTGGATAACCACGCTGCAGTTCGCGAGTTCGATGAGGAGCGCGCAACAGCTGCGATTCGTGAGTTGCTCATCGCTGTGGGTGAGGATCCAGATCGCGAAGGCCTGTTGGAAACCCCAGCTCGAGTGGCTAGGGCGTACAAGGAAACTTTCGCGGGTCTGCATGAGGATCCCACCACTGTGCTGGAGAAGACGTTCTCTGAGGGCCATGAAGAGTTGGTTCTGGTTCGTGAGATCCCGATTTACTCCATGTGTGAGCACCACTTGGTGCCGTTCTTTGGCGTGGCGCACATTGGTTACATTCCGGGTAAGTCCGGCAAGGTGACTGGCCTGTCCAAGCTGGCGCGTTTAGCGGATATGTTTGCTAAGCGACCTCAGGTTCAGGAGCGCTTGACCTCCCAAATTGCGGATGCTCTCGTCGAAAAGCTTGATGCCCAGGCCGTGGCCGTGGTGATTGAAGCTGAGCACCTGTGCATGGCCATGCGCGGAATCCGTAAGCCTGGTGCTGTGACCACGACGTCTGCGGTGCGCGGCGGTTTTAAGAACAACGCTGCCTCCCGCGCTGAGGTGTTCTCCCTGATTCGGGGGCACTAASEQ ID NO.2氨基酸(FolE)MKETTVDNHAAVREFDEERATAAIRELLIAVGEDPDREGLLETPARVARAYKETFAGLHEDPTTVLEKTFSEGHEELVLVREIPIYSMCEHHLVPFFGVAHIGYIPGKSGKVTGLSKLARLADMFAKRPQVQERLTSQIADALVEKLDAQAVAVVIEAEHLCMAMRGIRKPGAVTTTSAVRGGFKNNAASRAEVFSLIRGHSEQ ID NO.3DNA(folP)ATGAACGTATCCTCTTTGACCATCCCGGGACGCTGTTTGGTCATGGGAATTGTCAATGTCACTGAGGATTCCTTTTCGGACGGTGGCAAGTACATTGACGTTGATCAGGCGATCGCGCATGCCAAGGAATTGGTGGCTGCTGGCGCCGACATGATTGATGTCGGCGGCGAGTCCACCCGGCCTGGGGCAGTGCGCGTCGACGCGTCCGTGGAACGGGACCGGGTTGTGCCGGTCATTAAGGCGCTTCACGACGCCGGCATCCACACTTCCGTAGACACCATGCGGGCCTCCGTGGCGCAGGCTGCCGCGGGCGCTGGCGTCTCCATGATCAACGACGTCTCTGGCGGTTTGGCTGATCCTGAGATGTTTTCTGTCATGGCGGAAGCGCAAATTCCCGTGTGTTTGATGCACTGGCGCACCCTCCAATTCGGTGATGCCGCAGGTCAGGCAGATCACGGTGGAGACGTTGTAGCCGATGTGCACGCAGTGCTTGATGATCTTGTCGCCCGCGCCACCGCTGCTGGTGTGGCCGAAAACCAGATCGTGCTTGATCCAGGTTTGGGTTTTGCCAAATCACGTGAAGACAACTGGCGTTtGCTGCAAGCACTGCCCGAGTTTATTTCTGGACCTTTCCCCATCCTGGTGGGAGCATCCCGGAAGCGATTCCTGGCTGGCGTGCGCAAAGACCGTGGCCTAGATGTCACCCCCATTGATGCCGACCCAGCAACCGCAGCGGTGACCGCAGTGTCTGCACATATGGGAGCATGGGGTGTGCGCGTGCACGATGTCCCAGTATCAAGGGACGCTGTTGATGTTGCCGCATTGTGGCGAAGTGGAGGAACTCACCATGGCTGASEQ ID NO.4氨基酸(FolP)MNVSSLTIPGRCLVMGIVNVTEDSFSDGGKYIDVDQAIAHAKELVAAGADMIDVGGESTRPGAVRVDASVERDRVVPVIKALHDAGIHTSVDTMRASVAQAAAGAGVSMINDVSGGLADPEMFSVMAEAQIPVCLMHWRTLQFGDAAGQADHGGDVVADVHAVLDDLVARATAAGVAENQIVLDPGLGFAKSREDNWRLLQALPEFISGPFPILVGASRKRFLAGVRKDRGLDVTPIDADPATAAVTAVSAHMGAWGVRVHDVPVSRDAVDVAALWRSGGTHHGSEQ ID NO.5DNA(folB)ATGGCTGATCGTATTGAACTTAAAGGCCTTGAATGCTTCGGACACCACGGTGTGTTCGACTTTGAAAAAGAGCAAGGCCAGCCCTTCATTGTGGATGTCACCTGCTGGATGGATTTCGATGCCGCAGGTGCCAGCGATGACCTTTCCGACACCGTAGATTACGGCGCGTTGGCATTGTTGGTTGCTGAAATCGTGGAAGGCCCATCCAGGGATTTGATCGAGACGGTGGCCACGGAATCTGCGGATGCTGTGATGGCTAAATTTGATGCGCTTCATGCGGTGGAAGTAACCATCCATAAGCCCAAAGCACCGATCCCACGTACTTTTGCTGACGTCGCGGTGGTTGCCCGACGTTCCAGGAAATCCATGGCTGCTGGAAGGAGCAACGCCTAASEQ ID NO.6氨基酸(FolB)MADRIELKGLECFGHHGVFDFEKEQGQPFIVDVTCWMDFDAAGASDDLSDTVDYGALALLVAEIVEGPSRDLIETVATESADAVMAKFDALHAVEVTIHKPKAPIPRTFADVAVVARRSRKSMAAGRSNASEQ ID NO.7DNA(folK)ATGCATGCAGTTTTGTCCATCGGTTCCAACATGGATGATCGCTACGCGCTGCTCAACACAGTGATCGAGGAATTCAAAGATGAGATCGTGGCGCAGTCTGCGATCTACTCAACCCCACCGTGGGGCATTGAGGATCAGGATGAATTCCTCAACGCAGTGCTCGTTGTTGAGGTTGAAGAAACCCCCATCGAGTTGCTGCGCCGTgGCCAAAAACTCGAAGAAGCCGCCGAGCGGGTCCGCGTCCGCAAATGGGGGCCACGCACCCTCGATGTGGATATCGTGCAGATCATTAAAGATGGGGAAGAGATCCTTTCTGAGGATCCCGAACTGACCTTGCCACACCCTTGGGCTTGGCAGCGTGCCTTCGTGTTGATCCCTTGGTTGGAAGCAGAACCTGATGCCGTCCTGCACGGCACGACCATTGCAGAACATGTGGATAATCTTGATCCCACAGACATTGAAGGTGTCACCAAGATTTAASEQ ID NO.8氨基酸(FolK)MHAVLSIGSNMDDRYALLNTVIEEFKDEIVAQSAIYSTPPWGIEDQDEFLNAVLVVEVEETPIELLRRGQKLEEAAERVRVRKWGPRTLDVDIVQIIKDGEEILSEDPELTLPHPWAWQRAFVLIPWLEAEPDAVLHGTTIAEHVDNLDPTDIEGVTKI
权利要求
1.一种具有GTP环化水解酶I活性的多肽，该多肽选自(a)一种具有如序列编号2所述氨基酸序列的多肽；(b)一种与(a)的多肽相比经一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代而被修饰的多肽。
2.一种具有二氢蝶呤酯合酶活性的多肽，该多肽选自(a)一种具有如序列编号4所述氨基酸序列的多肽；(b)一种与(a)的多肽相比经一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代而被修饰的多肽。
3.一种具有二氢新蝶呤醛缩酶活性的多肽，该多肽选自(a)一种具有如序列编号6所述氨基酸序列的多肽；(b)一种与(a)的多肽相比经一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代而被修饰的多肽。
4.一种2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢蝶啶焦磷酸激酶活性的多肽，该多肽选自(a)一种具有如序列编号8所述氨基酸序列的多肽；(b)一种与(a)的多肽相比经一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代而被修饰的多肽。
5.一种多核苷酸，其编码相应于权利要求1，2，3，或4多肽。
6.一种基因构建物，它含有至少一个拷贝的权利要求5的多核苷酸以及至少一个调节序列。
7.一种宿主生物体，它被用权利要求6的基因构建物转化。
8.用于制备叶酸的方法，通过培养权利要求7的宿主生物体并随后分离叶酸。
全文摘要
本发明涉及利用经遗传操作的生物通过发酵产生叶酸的方法。本发明包括四种来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的叶酸生物合成基因(folE、folP、folB和folK)的核苷酸序列及其在叶酸微生物生产方面的应用。
文档编号C12N9/12GK1371418SQ00812014
公开日2002年9月25日 申请日期2000年6月23日 优先权日1999年6月25日
发明者M·马克, K·赫尔布斯特 申请人:阿克萨隆生物科学股份公司