β－折叠的脂质小体脂肪氧化酶的制作方法

专利名称：β－折叠的脂质小体脂肪氧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种将有关脂类或脂肪酸生物合成的蛋白质靶向进入脂质体或脂质小体的方法。本发明涉及在产油植物中生产脂肪酸或脂类的方法。
而且，本发明涉及编码一种多肽的核酸序列，它是由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列和编码定位蛋白质的核酸序列联合组成的。而且，本发明涉及包含这些序列的核酸构建体，载体，和包含这些核酸、核酸构建体和/或载体的转基因生物体。
油料作物在人类的营养中起着重要的作用。在萌发种子中，由于三酰基甘油酯-贮备植物中的内生贮藏量减少，即使在缺乏光照的情况下也可以重新生产新的组织[Rees等，生物化学生物物理学报(Biochimi.Biophys.Acta)，385，1975145-156；Kindl，H.，Biochimie，75，1993225-230]。三酰基甘油酯尤其贮备在高特异性的组织中，例如，胚乳或子叶。这类细胞包含贮备脂肪的脂质小体间隔体[Murphy，D.J.，脂类研究进展.，32，1993247-280；Huang，A.H.C.，Curr.Opinion Struct.Biol.，4.1994493-498]。开始发芽时，脂质小体及其内含物降解，并且为乙醛酸循环体提供脂肪酸，乙醛酸循环体可以使脂肪酸发生β-氧化[Kindl，H.，Z.Naturforsch.，C 52，19971-8]。在黄瓜的子叶中，磷脂酶A2(PLA)[May.C.等，生物化学生物物理学报，1393，1998267-276]和脂肪氧化酶的特异性同工型体[脂质小体脂肪酸氧化酶，LBLOX][Feussner，I.等，Planta，198，1998288-293；Hohne，M.等，欧洲生物化学杂志.，241，19966-11.]的合成是在三酰基甘油酯带动转移这一步进行，并且被运输到脂质小体中。PLA通过破坏脂质小体的磷脂单层而在引发带动转移的过程，(patatin-类蛋白)[May.C.等，Biochim.Biophys.Acta，1393，1998267-276])中起着决定性的作用[Noll，F.等，结构生物学杂志.，1999已提交]。脂肪氧化酶随后引发三酰基甘油酯中的主要以亚油基基团形式存在的酰基修饰[Feussner，I.等，FEBS Lett.，431，1998433-436]。经过还原和特异性的羟基十八碳二烯酰-(hydroxyoctadecadienoyl)-依赖型脂肪酶的作用，S-13-羟基十八碳二烯酸酯(hydroxyoctadecadienoate)最终从脂质小体释放到细胞质中[Feussner，I.等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，92，199511849-11853]然后被乙醛酸循环体分解[Kindl，H.，Biochimie，75，1993225-230；Kindl，H.，Z.Naturforsch.，C 52，19971-8]。
在脂类发生转移过程中，包括LBLOX和PLA在内的一组重新合成的蛋白被运输到脂质小体的表面[Sturm，A.等，Eur.J.Biochem.，150，1985461-468]。早期的研究工作[May.C.等，生物化学生物物理学报，1393，1998267-276；Feussner，I.等，Planta，198，1998288-293]表明LBLOX和PLA的合成是瞬时的，也就是仅在脂类转移开始的一段很短的时期内被合成。对于植物细胞内部的这些蛋白的运输过程仍完全不清楚。
本发明的目的是了解细胞内运输的信号和利用这些信号定位蛋白质。
我们已经发现可以通过将有关脂类和脂肪酸生物合成的蛋白靶向进入脂质体或脂质小体的方法来实现本发明的目的，方法包括将蛋白质-编码核酸与如下序列的其中一个序列组合得到联合蛋白-编码序列a)具有如SEQ ID NO1所示序列的核酸序列，b)从如SEQ ID NO1所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列，c)如SEQ ID NO1所示序列的衍生序列，它编码具有如SEQ ID N02所示的氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少60％的同源性，d)具有如SEQ ID NO3所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的核酸序列，并且将获得的序列引入真核生物体。
本研究工作已经提供了LBLOX和PLA在翻译后转移到脂质小体的证据。研究表明折叠成β-折叠结构的脂质小体LOX的N末端结构域，负责形成酶的膜结合特性。由本发明核酸序列编码的蛋白质的这个结构域，具有膜靶定位的结构，可以将它用于本发明的蛋白质靶向方法，使外来蛋白进入如油料种子的脂质小体中。
本发明的方法可以指导优选有关于脂肪酸和/或脂类代谢的蛋白质特异性地到达需要合成的位点。
通过将核酸序列引入真核生物体，可以以本发明方法对蛋白质进行引导。为此，在适当的培养基中对生物体进行培养。
本发明还涉及将有关脂类和脂肪酸合成脂质体和脂质小体蛋白质靶向进入的一种方法，包括按照下文描述的方法将至少本发明的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体。
生产脂肪酸的方法，包括将至少本发明的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体，培养该生物体，并从生物体中分离出油。
生产脂肪酸的方法，包括将至少本发明的一个核酸序列，或将至少一个核酸构建体引入产油生物体，培养该生物体，从生物体中分离出油并且释放出脂肪酸。
在如上所述方法中，生物体包括植物或真核微生物。
如上文描述的“培养该生物体”可以理解为既指植物的培植也指真核微生物例如酵母，真菌，纤毛虫，藻类的培养，或者动物或植物细胞或细胞联合体的培养。
所述方法中可能提及的生物体有，例如，植物如拟南芥属，大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，茶，胡萝卜，辣椒，canola，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，黑小麦，烟草，西红柿，油菜，咖啡，木薯粉，木薯，竹芋，万寿菊，紫花苜蓿，花生，蓖麻，椰子，油棕榈，红花(Carthamus species)，莴苣和各种树木，坚果和葡萄，或可可豆，微生物如Yarrowia或酿酒属酵母；如被孢霉属，水霉属，破囊壶菌属或腐霉属真菌；藻类和原生动物如腰鞭目，如Crypthecodinium。优选的生物为那些能天然合成大量油类的种类，例如微生物如酵母有Yarrowialypolytica或酿酒酵母；真菌有高山被孢霉，坐生腐霉；植物有鼠耳芥，大豆，油菜(Braccica napus)，椰子，油棕榈，canola，红花(Carthamusspecies)，蓖麻，金盏花，亚麻子(Linium usitatissimum)，琉璃苣，花生，可可豆或向日葵，其中大豆，油菜，或向日葵为最优选。
利用本发明的方法获得的生物体中，优选含有以结合脂肪酸形式存在的饱和或不饱和脂肪酸，即不饱和脂肪酸主要采取单-，双-，或三酰甘油酯，糖酯，脂蛋白或磷酸酯如油类或脂类的形式，或者作为酯或酰胺结合的脂肪酸的形式。游离脂肪酸也以游离或它的盐的形式存在于生物体中。在本发明方法中，通过培养获得的生物体，以及所包含的饱和或不饱和脂肪酸，都可以被直接利用，例如生产药品制剂，农用化学品，饲料或食品，或者首先从生物体中分离出脂肪酸。可以使用所有分离过程中的饱和或不饱和脂肪酸，即从脂肪酸的粗提取物到完全纯化的脂肪酸都适用于制备上述产品。在优选的具体实施案例中，通过，例如碱(如NaOH或KOH)水解，可以将结合脂肪酸从例如油或脂类中释放出来。对于这些游离脂肪酸，既可以直接利用所获得的混合物也可以利用经过进一步的纯化之后的产物，来生产药品制剂，农用化学品，饲料或食品。也可以利用结合或游离的脂肪酸与其它例如单-，双-或三甘油酯或甘油进行转酯或酯化反应，以提高这些化合物，如三酰基甘油酯中不饱和脂肪酸的比例。
在上述的制备方法中根据不同宿主生物，采用技术人员所熟知的不同生长和培养方法。微生物如细菌，真菌，纤毛虫，或者植物或动物细胞通常是在液体培养基中进行培养，液体培养基含有碳源，常用的是糖；氮源常用的是有机氮源如酵母膏，或盐，如硫酸铵；微量元素，如铁盐，锰盐，镁盐；如果需要还加入维生素；培养温度在0℃到100℃之间，优选温度在10℃到60℃之间，根据生物体的不同，在通氧或无氧的条件下进行培养。液体培养基的pH可以保持在一个恒定值，即在培养过程中控制pH，或者在培养过程中不控制pH而使其发生变化。培养可按分批培养、半分批培养和连续培养的方式进行。营养的供给可以在发酵开始时投入，也可以在半分批和连续培养的过程中补加。培养也可以在固体培养基上进行。
经过转化之后，植物通常是首先被再生出来，然后像通常一样进行生长或栽培。这一步可以在温室或户外进行。
生物体长成以后，就可以以常规方式获得脂类。为此，首先可以将生物体收集并破碎，或者可以直接利用。最好是利用适当的溶剂抽提脂，用于抽提的溶剂例如非极性溶剂(如己烷)，或乙醇，异丙醇，或者是混合溶剂如己烷/异丙醇，苯酚/氯仿/异戊醇，温度在0℃-80℃之间，优选温度在20℃-50℃之间。通常，以过量的溶剂对生物量进行抽提，如可采用过量溶剂与生物量的比例为1∶4，随后再采用如蒸馏的方法去除溶剂。抽提可在超临界CO2中进行。抽提之后，可以采用如过滤的方法去除生物量的残留物。
这样得到的粗制油随后可以被进一步纯化，例如通过极性溶剂如丙酮或氯仿的处理，之后进行过滤或离心去除悬浮物。也可以通过层析法，蒸馏法或结晶法进行进一步的纯化。
为了从三酰基甘油酯中获得游离脂肪酸，通常按照如上所描述的方法对三酰基甘油酯进行水解。
本发明还涉及分离的核酸序列，它编码一种多肽并且由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列和以下核酸中的一种联合组成a)具有如SEQ ID NO1所示序列的核酸序列，b)从SEQ ID NO1所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列，c)SEQ ID NO1所示序列的衍生序列，它编码具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少60％的同源性，d)具有如SEQ ID NO3所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的核酸序列。
本发明的这些核酸序列按照本发明的方法能够实现蛋白质的靶定位。
衍生序列可以理解为，例如，由SEQ ID NO1所示序列编码的蛋白质或其生物活性的功能同系物，也就是说这类蛋白质与SEQ ID NO1所示序列编码的蛋白质具有相同的生物反应。这些基因也可以实现蛋白质的优选靶定位。生物活性可以理解为在细胞内引导蛋白质，优选的是有关脂肪酸和/或脂类代谢的蛋白质。
利用本发明中的核酸序列或其片断，采用同源筛选的方法，可以进一步对基因组序列进行分离。
上述衍生序列还可以从其他一些真核生物，例如，真菌，酵母或植物如，具体来说，苔藓中分离得到。
此外，SEQ ID NO1所示序列的衍生序列或功能性的衍生序列也可以指等位基因的变异体，其在衍生的氨基酸的水平上具有至少60％的同源性，优选70％以上，更优选80％以上，特别优选85％以上，更特别优选90％的同源性。同源性的计算是在整个氨基酸范围内进行的，采用的程序是PileUp，BESTFIT，GAP，TRANSLATE和BACKTRANSLATE(＝程序包UWGCG的部分，Wisconsin Package，版本10.0-UNIX，January 1999，遗传学计算机小组(Genetics Computer Group)，Inc.，Deverux等，Nucleic.Acid Res.，12，1984387-395)(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgins等，CABIOS，5 1989151-153)。由上述核酸序列衍生的氨基酸序列参见SEQ ID NO2所示的序列。同源性的含义是同一性，即氨基酸序列具有至少60％同一性。本发明的这些序列在核的水平上具有至少50％，优选至少60％，特别优选至少70％，更特别优选80％的同源性。
等位基因的变异体，具体的来说，包括功能性的变异体，它可以通过对SEQ ID NO1所示序列中核苷酸进行缺失、插入、取代而获得，并且仍保持了所合成的衍生蛋白的生物活性，即这些蛋白仍然具有定位蛋白的能力。
从SEQ ID NO1所示序列或此序列的某一部分开始的DNA序列，可以利用如常规的杂交方法或PCR技术，从如上文所述的其他的真核生物中分离得到。在标准的条件下这些DNA序列可以与上文所述的序列杂交。最好选用短的寡聚核苷酸，优选具有20至50个核苷酸长度的寡聚核苷酸进行杂交。然而也可以利用本发明核酸的较长片断或者全序列进行杂交。根据所用的核酸的不同寡聚核苷酸，较长的片断，还是全序列，或者根据所用的核酸类型不同RNA或DNA，杂交的标准条件是变化的。因此，例如DNADNA杂交体的熔点温度比相同长度的DNARNA杂交体的熔点温度大约低10℃。
根据核酸的不同，标准条件的含义是指例如温度在42-58℃之间，浓度为0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)缓冲的水性，此外还可以加入50％甲酰胺，例如42℃，5×SSC，50％甲酰胺。DNADNA杂交体的杂交条件0.1×SSC，温度大约在20-45℃之间有利优选温度在大约30-45℃之间。DNARNA杂交体的杂交条件在选0.1×SSC，温度大约在30-55℃之间，有利优选温度大约在45-55℃之间。以上所述的杂交温度，是在没有甲酰胺存在的条件下，以长度约为100个核苷酸，G+C含量为50％的核酸，计算所得的熔点温度的实例。在有关的遗传学的专家教科书对DNA杂交的实验条件都有描述，如由Sambrook等编写的“分子克隆(Molecular Cloning)”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，DNA杂交的实验条件还可以利用技术人员所知道的，例如以核酸长度，杂交类型及G+C含量为函数的公式计算得到。技术人员可以在以下教科书中查询到有关杂交的更多信息Ausubel等，(eds)，1985，分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork)；Hams and Higgins(eds)，1985，核酸杂交一种实用方法(NucleicAcids HybridizationA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford)；Brown(ed)，1991，Essential MolecularBiology基础分子生物学一种实用方法(A Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press，Oxford).
此外，衍生序列的含义也是指SEQ ID NO1所示序列的同源序列，例如，真核生物的同源序列，被截短的序列，编码或非编码DNA序列的单链DNA或编码或非编码DNA序列的RNA。
序列SEQ ID NO1的同源序列还可以是如启动子变异体等衍生序列。可以通过一个或几个核苷酸的替换，插入和/或缺失对启动子进行修改，而不会对启动子的功能或活性产生不利影响。而且可以通过修改启动子序列，或者被效率更大的启动子取代，也可以被不同种类生物体的启动子所取代，来提高启动子的活性。
优选的衍生序列也可以是这类变异体，它的位于起始密码子上游的从-1到-2000区域核苷酸序列发生改变，并引起基因和/或蛋白质表达改变，尤其是表达增强而且，衍生序列也可以是3′末端发生修饰的变异体。
编码本发明蛋白质的核酸序列可以通过合成方法进行制备，或者从天然获得，或者由合成的或天然的DNA组分形成的混合物组成，同时核酸序列中也可以包含多种生物体的各种异源的基因片断。通常，合成的核苷酸序列是按照所研究的宿主生物体如植物优选的密码子进行制备。通常，这一点可使得异源基因得到最优化的表达。这类被植物优选的密码子可以通过在大多数所研究的植物种类中具有最高表达频率的蛋白质所对应的密码子来确定。在Wada等，(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)中给出了谷氨酸棒杆菌的一个实施例。这样的实验可以借助标准的方法进行并且是专业技术人员所熟知的。
编码本发明中蛋白质的功能等同序列是本发明中序列的那些衍生序列，它们尽管在核苷酸序列上有偏差但保持了所需要的功能，即蛋白质的生物活性。因此功能等同序列包含自然发生的此处描述序列的变异体，而且还包括人工构建的核苷酸序列，例如通过化学合成得到的并且与植物中的密码子用法相适合的那些核苷酸序列。
只要它们具有所需要的性质，如上文所述的，如在脂肪酸和/或脂类代谢中进行靶定位，人工构建DNA序列也可以适用。这样的人工DNA序列，可以通过例如由分子模型构建的并且具有生物活性的蛋白回译进行确定，或者通过体外筛选进行确定。Patten，P.A.等，Current Opinion inBiotechology 8，724-733(1997)或Moore，J.C.等，Journal of molecularBiology 272，336-347(1997)已经对有关用于修饰和改进DNA序列的DNA体外演变的技术进行了描述。通过回译一段与植物宿主特异性密码子用法一致的多肽获得的DNA编码序列尤其适用。
可提到的本发明核酸的成分是指脂肪酸和/或脂类代谢的生物合成基因，例如优选能够编码选自以下一组蛋白的序列酰基-CoA脱氢酶，酰基-ACP(＝酰基载体蛋白)去饱和酶，酰基-ACP硫酯酶，脂肪酸酰基转移酶，脂肪酸合成酶，脂肪酸羟化酶，乙酰辅酶A羧化酶，酰基辅酶A氧化酶，脂肪酸去饱和酶，脂肪酸乙炔化酶，脂肪氧化酶，三酰甘油脂肪酶，allenoxide合成酶，氢过氧化物裂解酶和/或脂肪酸延长酶。优选的核酸是能够编码下列蛋白质的一种脂肪酸酰基转移酶，Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶和/或脂肪酸延长酶。
提到的核酸序列编码所谓的融合蛋白，融合蛋白的组分是具有如SEQID NO2所示序列的多肽，或者是此多肽的一功能等同部分。融合蛋白的第二部分可以是例如其它具有酶活力的多肽，例如上述的蛋白质。
在本发明的方法中，核酸能够优选与脂肪酸生物合成的其它基因结合这样基因的实例如在WO 00/12720描述的不饱和或饱和脂肪酸的乙酰转移酶，其它去饱和酶或延长酶。这种与，例如能够接受或提供还原作用等同物的NADH细胞色素B5还原酶的结合，有利于体内的合成，尤其更有利于体外的合成。
本发明方法中所用的蛋白质是指这样的蛋白质，它含有一段如SEQ IDNO2所示的氨基酸序列；或者含有将此序列中的一个或几个氨基酸残基经取代、转化、插入、或删除而得到的序列，同时SEQ ID NO2所示的蛋白质的酶活性仍被保持或者没有明显被减小。术语“没有明显被减小”意思是说所有的蛋白仍保持了至少10％，优选保持了20％，特别优选保持了30％的原始蛋白生物活性。例如，特定氨基酸可能被其他在此情形下具有相似物理化学性质(空间结构、酸碱性、疏水性等)的氨基酸所取代，如精氨酸残基被换成赖氨酸残基，缬氨酸残基被换成异亮氨酸残基，天冬氨酸残基被换成谷氨酸残基。另外，一个或几个氨基酸还可以被反过来交换，加入或去除，或几种方式相结合。
衍生体是指功能性等同物，具体来说同时包含了最初被分离出来的编码本发明蛋白序列的天然的和人工的突变体，这些等同物保持了所需要的功能，也就是说它们的生物活性没有明显被减小。突变包括取代、加入、删除、交换或插入一个或几个核苷酸残基。因此本发明可以扩展到那些通过对编码该蛋白质的核苷酸序列进行修饰所获得的核苷酸序列。这样修饰的目的可以是例如进一步界定其中所包含的编码序列，或者，例如，插入其它的限制内切酶的酶切位点。
功能性等同物可以是那些变异体，与原始基因或基因片断相比，它们的功能的功能被弱化(＝没有明显被减小)或被强化(＝生物活性大于原蛋白的活性，即活性高于100％，优选高于110％，特别优选高于130％)。
为了转入宿主生物体，优选将本发明方法中所用的上述核酸序列插入一个表达序列盒(＝核酸构建体)。然而，也可以将核酸序列直接转入宿主生物。核酸序列优选的是，如DNA或cDNA序列。适于插入表达序列盒的编码序列是，例如那些能够实现本发明的蛋白质寻靶作用的序列这些序列可以是原始序列的同源或异源体。
表达序列盒(＝核酸构建体或核酸片断)是指与一个或多个调节信号有效连接的SEQ ID NO1所示的序列，由遗传密码的简并产生的序列和/或它们的功能性或非功能性的衍生序列，优选有利于增大基因表达的调节信号，该表达盒控制编码序列在宿主细胞中的表达。调节序列能够使得基因和蛋白质的表达进行定位表达。根据宿主生物的不同，意味着，例如，基因仅在诱导之后被表达和/或过表达，或者立即被表达和/或过表达。例如，这些调节序列是诱导子或抑制子结合的序列，因此能够调节核酸的表达。除这些新的调节序列之外或者替代这些序列，位于实际的结构基因之前序列的天然调节可能仍然存在，而且如果适当的话，还可以从遗传上进行修饰，从而使这些序列的自然调节作用关闭，进而增强基因表达。然而，基因构建体也可以具有较简单的结构，即在核酸序列或其衍生序列之前没有附加的调节信号插入，而具有调节作用的天然启动子仍保留。相反，天然的调节序列可以发生变异，从而不再起调节作用和/或增加基因的表达。这些经过改造的启动子，也可以以部分-序列(＝启动子加上部分本发明的核酸序列)的形式存在于天然基因之前以增加活性。此外，基因构建体最好还包括一个或几个与启动子有效连接的所谓的增强子序列，从而增加核酸序列的表达。在DNA序列的3′也可以插入一些附加的有利序列，如其它调节元件或终止子。本发明的核酸序列还可以以单拷贝或多拷贝形式存在于表达序列盒(＝基因构建体)中。如果需要的话，可以被共表达并且最好能够参与脂肪酸合成的任何其它的基因，也可以以单拷贝或多拷贝形式存在于表达序列盒中。
如上所述，调节序列或调节因子优选对引入基因的基因表达具有正效应，并因此增加基因的表达。因此，通过利用强的转录信号如启动子和/或增强子，调节元件的增强作用优选在转录水平上发生。另外，也可以通过如提高mRNA的稳定性的方法来加强转译作用。
适合作为核酸构建体的启动子，原则上，是所有那些能够调控外源基因在生物体，优选在植物或真菌中进行表达的启动子。具体来说，植物启动子例如来源于植物病毒的植物启动子被优先选用。用于本发明方法的优选调节序列存在于如下启动子如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL，以上这些启动子优选在革兰氏阴性菌中使用。其他的优选调节序列如位于革兰氏阳性菌中的启动子amy和SP02，位于酵母或真菌中的启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH，或位于植物中的启动子如CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]，SSU，OCS，lib4，STLS1，B33，nos(胭脂碱合成酶启动子)，或位于泛蛋白中的启动子。表达序列盒也可以包含一个化学诱导启动子，通过它，外源基因在生物体，优选在植物中的表达，被控制在一个特定的时间点进行。这些优选的植物启动子有，例如，PRP1启动子[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366]，苯磺酰胺-诱导的启动子(EP 388186)，四环素-诱导的启动子(Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404)，水杨酸-诱导的启动子(WO 95/19443)，脱落酸-诱导的启动子(EP 335528)，或乙醇-或环己酮-诱导的启动子(WO93/21334)。其他的植物启动子有，例如马铃薯胞液果糖二磷酸酶启动子，马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)，甘氨酸磷酸核糖苷焦磷酸酰胺转移酶启动子(参见Gene Bank接受号U87999)或如在EP 249676中所述的节点特异性的启动子都可以优先选用。优选的启动子具体是指能够确保在合成脂肪或其前体的组织或植物部位/器官，包括例如在胚乳或在生长中的胚芽中表达的植物启动子。需要强调的是那些具有种子特异性表达的优选启动子如USP启动子或其衍生体，LEB4启动子，云扁豆蛋白(phaseolin)启动子，napin启动子。特别优选的USP启动子或其衍生体，与本发明中提及的一致，能够介导种子发育中的最早的基因表达(Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)459-67)。可以用于单子叶和双子叶植物的其它优选的种子特异性启动子的实例有适用于双子叶植物的油菜napin基因启动子(US 5,608,152)，拟南芥属的油质蛋白启动子(WO 98/45461)，Phaseolus vulgaris云扁豆蛋白(phaseolin)启动子(US 5,504,200)，甘蓝(Brassica)Bce4启动子(WO 91/13980)或者豆荚B4启动子(LeB4，Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992233-239)，或者适用于单子叶的大麦lpt2或lpt1基因的启动子(WO95/15389和WO 95/23230)或大麦醇溶蛋白基因，水稻谷蛋白基因，水稻oryzin基因，水稻醇溶谷蛋白基因，小麦醇溶朊基因，小麦谷蛋白基因，玉米醇溶蛋白基因，燕麦谷蛋白基因，高梁kasirin基因或黑麦secalin基因的启动子，这些在WO 99/16890中有述。
此外，优选的启动子是能够确保在例如发生脂肪酸，油脂和脂质或其前体生物合成的组织或植物部位进行表达的启动子。需要强调的是那些具有种子特异性表达的启动子，这类启动子有油菜napin基因启动子(US 5,608,152)，蚕豆USP启动子(USP＝未知种子蛋白，Baeumlein等，Mol GenGenet，1991，225(3)459-67)，拟南芥属的油质蛋白基因启动子(WO98/45461)，云扁豆蛋白(phaseolin)启动子(US 5,504,200)，或豆荚B4基因启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，，2(2)233-9)。此外可提到的启动子有在单子叶植物中介导种子-特异性表达的启动子，如大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)。
如上文所述，在表达序列盒(＝基因构建体，核酸构建体)中还可以存在其它的被转入生物体的基因。这些基因可以受到单独调节，或处在与本发明核酸相同的调节区域。例如，这些基因采取生物合成基因优选脂肪酸生物合成的基因的形式，能够提高生物合成。可列举的例子是用于Δ15，Δ12，Δ9，Δ6，Δ5，Δ4去饱和酶，各种羟化酶，酰基-ACP硫酯酶，β-酮酰基合成酶或β-酮酰基还原酶的基因。在核酸构建体中优选去饱和酶基因。
原则上，所有天然启动子与它们的调节序列一起，如上文所述，都可以用于本发明的表达序列盒和本发明的方法，如在上文所述的。另外，也可以优选合成启动子。
可以利用各种DNA片断以获得能够以正确的方向进行便利地阅读并且具有正确的阅读框的核苷酸序列。为使DNA片断(＝本发明的核酸)彼此连接，可以将接合体或接头接到片断上。
沿转录方向，可以方便地给启动子或终止子区提供一个接头或多聚接头，其中含有插入该序列的一个或多个限制性位点。通常，接头具有1到10个，大多数情况1到8个，优选2到6个限制性位点。一般来说，调节区域内的接头小于100bp，经常情况小于60bp，但至少5bp。对宿主生物，例如宿主植物来说，启动子既可以是天然的或同源的，也可以是外来的或异源的。沿着5′-3′转录方向，表达序列盒含有启动子，编码本发明方法中使用的基因的一段DNA序列，以及一个转录终止区，各种终止区可以根据需要彼此进行交换。
另外，可以进行提供适当的限制性酶切位点，或者除去多余的DNA或限制性酶切位点的操作。在适于进行插入、删除、取代，包括例如转换和颠换的情况下，也可以进行体外的致突变，引物修复，限制性作用或连接作用。在进行如限制性作用、chewing back、或粘末端补平这些操作时，可利用片断的互补性末端来进行连接。
粘上特异性的内质网滞留信号SEKDEL(Schouten，A.等，PlantMol.Biol.30(1996)，781-792)可能对优化高表达水平具有重要作用；因而平均表达水平可以提高到3至4倍。在植物和动物蛋白质天然产生的位于内质网中的其它滞留信号也可以被用来构建序列盒。
优选的聚腺苷酰化作用信号是植物聚腺苷酰化作用信号，优选那些实质上与根癌土壤杆菌T-DNA聚腺苷酰化作用信号相关的信号，具体包括Ti质粒p TiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)835 et seq.)中T-DNA(章鱼肉碱合成酶)的基因3，或者它的功能等同基因。
核酸构建体是通过将适当的启动子与本发明中的适当的核酸序列和聚腺苷酰化作用的信号融合在一起得到的，采用的技术是常规的重组和克隆技术，如见T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学现行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene PublishingAssoc.And Wiley-Interscience(1987)。
编码黄瓜脂质小体脂肪氧化酶的DNA序列包含所有那些使脂肪酸，脂类或油类的生物合成定位于正确的位点所必须的序列的特征，因此实际上不需要其它的寻靶作用序列。然而，还是需要和优选这样的定位作用，并因此对其进行人工地修饰或增强，从而使这样的融合构建体也是本发明优选的具体实施案例。
特别优选的序列是那些能够确保靶向进入质体中的序列。在特定的条件下，也可以靶向进入其它的间隔体中(Kermode的综述，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)，285-423)，例如靶向进入液泡，线粒体，内质网(ER)，过氧化物酶体，脂质小体或，由于缺少适当的有效序列，而保留在产物合成的间隔体，即细胞溶质中。
编码本发明蛋白质的核酸序列与至少一个报告基因，优先克隆到表达序列盒中，然后经过载体被转入生物体中，或者直接进入基因组中。报告基因应该具有易探测性，可以通过生长，荧光，化学发光，生物发光或抗性试验，或者通过光度测定进行检测。可提到的报告基因的例子有抗抗生素或除草剂的基因，水解酶基因，荧光蛋白基因，生物发光基因，糖或核苷酸代谢基因，或生物合成基因如Ura3基因，Ilv2基因，荧光素酶基因，β-半乳糖苷酶基因，gfp基因，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶基因，β-葡糖醛酸酶基因，β-内酰胺酶基因，新霉素磷酸转移酶基因，潮霉素磷酸转移酶基因，或BASTA(＝gluphosinate抗性)基因。这些基因的存在可以很容易地对转录活性及其基因表达进行检测和量化，这样可以鉴定具有不同生产力的基因组位点。
在一个优选的具体实施方案中，表达序列盒包括上游，即编码序列的5′-末端，启动子，和下游即3′-末端，聚腺苷酰化作用信号，以及适当情况下，还包括与被插入的编码序列DNA序列有效连接的其它调节元件。有效连接的含义是指启动子、编码序列、终止子，以及适当情况下，其它的调节元件，按照一定的顺序排列，以便在编码序列进行表达时，每一个调节元件能够各尽其能。优选的有效连接的序列是能够确保亚细胞定位的寻靶作用序列。
表达序列盒可以只包含，如一个组成型启动子(优选USP或napin启动子)和被表达的基因。
为了在原核或真核宿主生物，例如微生物如真菌，或植物中进行表达，优选将表达序列盒插入到一个载体，如质粒，噬菌体或者可以使基因在宿主内得到最优的表达的其它类型的DNA。适合的质粒有，例如在E.coli中的pLG338，pACYC184，pBR系列如pBR322，pUC系列如pUC18或pUC19，M113mp系列，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11，或pBdCI，在链霉菌中的pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽胞杆菌中和pUB110，pC194或pBD214，在棒状杆菌中的pSA77或pAJ667，在真菌中的pALS1，pIL2或pBB116；其它优选真菌载体的描述参见Romans，M.A.等，[(1992)“外来基因在酵母中的表达综述”，Yeast 8423-488]和van den Hondel，C.A.M.J.J.等，[(1991)“异源基因在丝状真菌中的表达”]以及真菌中的更多基因操作(More Gene Manipulations in Fungi)[J.W.Bennet & L.L.Lasure，eds.，p.396-428Academic PressSan Diego]和“用于丝状真菌的基因转移系统和载体的形成”[van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)在真菌的应用分子遗传学，Peberdy，J.F.等，eds.，p.1-28，CambridgeUniversity PressCambridge]。优选的酵母载体是，如，2μM，pAG-1，YEp6，YEp13，pEMBLYe23。藻类载体或植物载体的例子是pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004，pVKH或pDH51(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.，1998)。上述的载体及其衍生体仅占可以用作载体的质粒的小部分，其它的质粒为技术人员所熟知的并且可以在如Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一书中查到。适用的植物载体在“植物分子生物学和生物技术方法”(CRCPress)，Chapter 6/7，pp.71-119一书中有描述。众所周知的优选载体是可以在E.coli和土壤杆菌进行复制的穿梭载体和二元载体。
除了以质粒作为载体之外，所有为技术人员所熟知的其它载体都可以在本发明中作为载体，例如，噬菌体，病毒如SV40，CMV，杆状病毒，腺病毒，转座子，插入序列元件，质粒，噬菌粒，粘粒，线状或环状DNA。这些载体能够在宿主中实行自主复制，或通过染色体复制；其中染色体复制为优选。
在载体的另一个实施方案中，本发明的表达序列盒可以优选以线性DNA的形式引入宿主，并且通过异源或同源重组的方式整合到宿主的基因组中。线状DNA可以由一个线性化的质粒组成，或仅由作为载体的表达序列盒组成，或由本发明中的核酸序列组成。
在另一优选实施方案中，本发明中的核酸序列也可以单独地被引入宿主生物。
如果要将本发明中的核酸序列之外的其他基因引入宿主生物，可将所有基因与一个报告基因一起置于一个单一载体上，或者将各个基因分别与一个报告基因一起置于一载体上，或者将几个基因一起置于不同的载体上，然后引入生物体。各个载体可以同时或相继被引入宿主。
载体优选包含至少一个拷贝的本发明的核酸序列和/或表达序列盒。
举例来说，可以将植物表达序列盒结合到转化载体pRT上((a)Toepfer等，1993，Methods Enzymol.，21766-78；(b)Toepfer等，1987，Nucl.Acids.Res.155890 et seq.)或者，也可以在体外，例如利用T7启动子和T7RNA聚合酶，对重组载体(＝表达载体)进行转录和翻译。
应用于原核生物中的表达载体通常要使用具有和不具有融合蛋白或融合寡聚肽的诱导系统，这些融合体起作用的位点可能在蛋白质的N端或C端或其它可利用的区域。通常，使用这样的融合载体的目的是i.)提高RNA的表达率，ii.)提高可得到的蛋白的合成率，iii.)提高蛋白的溶解性，或iv.)利用能够应用于亲和层析的结合序列简化提纯步骤。另外，还经常通过融合蛋白引入蛋白水解的酶切位点，利用酶切位点可除去融合蛋白的一部分，也可用于提纯。这样的蛋白酶识别的识别序列有，如因子Xa，凝血酶和肠激酶。
典型优选的融合和表达载体是pGEX[Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1998)Gene 6731-40]，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其含有谷胱甘肽S转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白，或蛋白A。
E.coli表达载体的其它例子有pTrc[Amann等，(1998)Gene 69301-315]和pET载体[Studier等，基因表达技术酶学方法185，AcademicPress，San Diego，California(1990)60-69；Stratagene，Amsterdam，Netherlands]。
用于酵母中的其它优选载体有pYepSecl(Baldari，等，(1987)EmboJ.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)，pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)，以及pYES的衍生体(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。有关应用于丝状真菌中的载体的描述见van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“用于丝状真菌的基因转移系统和载体的形成”在真菌的应用分子遗传学，Peberdy，J.F.等，eds.，p.1-28，Cambridge University PressCambridge.
或者，也可以优选利用昆虫细胞的表达载体，例如在Sf9细胞中进行表达。这些例子有pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)的载体。
而且，也可以优选植物细胞或藻类细胞进行基因表达。植物表达载体的例子参见Becker，D.，等(1992)“具有最接近左侧边界的选择性标记的新型二元植物载体”，Plant Mol.Biol.201195-1197或在Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的二元土壤杆菌载体”，Nucl.Acid.Res.128711-8721。
另外，本发明的核酸序列可以在哺乳动物细胞中表达。适当表达载体的例子有pCDM8和pMT2PC，它们在Seed，B.(1987)Nature 329840或Kaufman等(1987)EMBO J.6187-195)中被提到。优选使用的启动子是病毒来源的启动子，包括，如，多形瘤的启动子，腺病毒2，巨细胞病毒，或猿猴病毒40。可提到的其它原核和真核表达系统在Sambrook，(1989)等，分子克隆实验手册.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，第16和17章中被提及。
原则上，可以通过技术人员所熟悉的所有方法，将本发明的核酸，表达序列盒或载体引入生物体，如植物中。
对于微生物而言，技术人员可从以下教科书中找到适宜的方法Sambrook，J(1989)等人分子克隆实验手册(Cold Spring HarborLaboratory Press)；F.M.Ausubel等(1994)，分子生物学的现行方法(John Wiley and Sons)；D.M.Glover等，DNA克隆(Vol.1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9))；Kaiser等(1994)，酵母遗传学方法(Cold Spring Harbor Laboratoty Press)；或Guthrie等，酵母遗传学和分子生物学指南(Methods in Enzymology，1994，Academic Press)。
将外来基因转入植物的基因组称转化作用。它利用上述从植物组织或植物细胞转化和再生植株的方法，形成暂时的或稳定的转化体。适用的方法有通过聚乙烯-乙二醇-诱导DNA吸收的，原生质体转化，它可利用基因枪的生物弹射学方法-即粒子轰击方法-，电穿孔，含DNA溶液的干胚胎培育，显微注射和土壤杆菌介导的基因转移。这些方法的描述见B.Jenes等，基因转移技术，在转基因植物，Vol.1，工程和应用，S.D.Kung和R.Wu编写，Academic Press(1993)128-143；Potrykus，植物生理和植物分子生物学年鉴42(1991)205-225)。优选将要表达的构建体优先克隆到一个适于转化根癌土壤杆菌的载体上，如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。经过这样的载体转化的土壤杆菌可以被用于转化植物具体如农植物如烟草植株例如将切割下的叶片或叶片的一部分浸泡在土壤杆菌溶液中，随后在适当的培养基中培养。利用根癌土壤杆菌转化植物的方法见Hofen和Willmitzer的Nucl.Acid Res.16(1988)9877或者F.F.White，用于高等植物基因转移的载体；在转基因植物，Vol.1，工程和应用，S.D.Kung和R.Wu编写，Academic Press，1993，pp.15-38。
利用上述表达载体转化后的土壤杆菌，也可以用已知的方式去转化植物如试验植物如拟南芥属，或者农作物如谷类，玉米，燕麦，黑麦，大麦，小麦，大豆，水稻，棉花，甜菜，canola，黑小麦，水稻，向日葵，亚麻，大麻，马铃薯，烟草，西红柿，咖啡，可可，茶，胡萝卜，辣椒，油菜，木薯粉，木薯，竹芋，万寿菊，紫花苜蓿，莴苣和各种树木，坚果和葡萄，尤其是油料作物如大豆，花生，蓖麻，琉璃苣，亚麻子，向日葵、canola，棉花，亚麻，油菜，椰子，油棕榈树，红花(carthemus tinctorius)或可可豆，转化的方法如将切割下来的叶子或部分叶片在土壤杆菌溶液浸泡，再转入适当的培养基培养。
遗传上发生了改变的植物细胞可以采用技术人员都熟悉的方法得到再生，比较适用的方法可从上文提到的S.D.Kunghe和R.Wu，Potrykus或者Hofgen和Willmitzer等人编写的出版物中找到。
原则上，能够合成脂肪酸尤其是不饱和脂肪酸，并且适于重组基因表达的所有的生物体，都适合用作的本发明方法中的核酸，核酸构建体或载体的宿主生物体。可例举的植物如拟南芥属，菊科有金盏花或农作物植物如油菜属，亚麻属，大豆，花生，蓖麻，向日葵，玉米，棉花，亚麻，油菜，椰子树，油棕榈，红花(Carthamus tinctorius)，或可可豆；微生物如Yarrowia或Saccharomyces属酵母，真菌如被孢酶属，水霉属或腐霉属；细菌如埃希氏属，蓝细菌属，纤毛虫，藻类或原生动物如腰鞭目如Crypthecodinium。优选的宿主生物是能够天然的大量合成油类的生物体，如酵母中酿酒酵母或Yarrowia lypolytica，真菌如被孢酶属，破囊壶菌属或腐霉属如高山被孢霉，坐生腐霉；或植物如Brassica napus，亚麻，大豆，油菜，椰子，油棕榈，红花，蓖麻，金盏花，花生，可可豆，或向日葵；其中大豆，油菜，向日葵，蓖麻，被孢酶属或腐霉属为特别优选。原则上，转基因动物如新小杆线虫(C.elegans)也是适于作为宿主生物的。
其它有用的宿主细胞在Goeddel，基因表达技术酶学方法185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有述。
可利用的表达菌株，例如那些具有较低蛋白酶活性的菌株，在Gottesman，S.，基因表达技术酶学方法185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128中有述。
根据选择的启动子的不同，本发明核酸序列的表达可特异性地在叶片，种子，块茎或植物的其它部分进行。本发明还涉及，能够过量产生这样的脂肪酸，油类或脂类的转基因植物，它们的繁殖材料和植物细胞，植物组织或部分植物。本发明优选涉及的转基因植物，例如农作物如玉米，燕麦，黑麦，小麦，大麦，玉米，水稻，大豆，甜菜，canola，黑小麦，向日葵，亚麻，大麻，烟草，西红柿，咖啡，可可，茶，胡萝卜，辣椒，油菜，木薯粉，木薯，竹芋，万寿菊，紫花苜蓿，莴苣和各种树木，坚果和葡萄，马铃薯，尤其是油料农作物如大豆，花生，蓖麻，琉璃苣，亚麻子，向日葵、canola，棉花，亚麻，油菜，椰子，油棕榈树，红花(Carthemustinctorius)或可可豆，试验植物如拟南芥属或其它植物如包含有本发明的功能性核酸序列和功能性表达序列盒的苔藓或藻类。此处的功能性是指可形成具成生物活性的蛋白。
通过实施例中的方法，包含有本发明核酸序列的表达序列盒或核酸序列也可以用来转化上述的生物体，如细菌，蓝细菌，丝状真菌，纤毛虫，动物或藻类，以提高脂肪酸，油类或脂类的含量。优选的转基因生物体是酵母，真菌或植物，特别优选的是植物。
转基因生物体是指含有一个，它来自其它生物体，并且能够编码一种本发明方法中所用蛋白质的外源核酸的生物体。转基因生物体也可指含有一个来自同种生物体的核酸的生物体，此核酸是以附加的基因拷贝存在，或者不处于本发明核酸序列的天然核酸环境中。转基因生物体也可是，利用定向重组修饰技术在起始生物体中对本发明核酸天然的3′和/或5′区域进行修饰后获得的生物体。优选的是已经引入外源DNA的生物体。特别优选的是转基因植物，转基因植物是指单个的植物细胞及其培养物，例如，在固体和液体培养基中的愈伤组织培养物，以及植物部分和完整植株。
在恒光(2 000lux)22℃下的洋红培养箱培植烟草植株。对培植转化株的培养基的描述参见[Horsch，R.B.等人，Science 227，19851229-1231；Jefferson，R.A.等，EMBO J.，6，19873901-3907]。质粒的构建和蛋白质的制备利用载体pSport-1中的CSLBLOX-221[Hohne，M.等，Eur.J.Biochem.，241，19966-11]产生LBLOX的缺陷形。先用SmaI/NdeI，随后用HaeIII对CSLBLOX-221进行酶切得到N-末端的缺失将其连接到pSport-1(生命技术)之后，CSLBLOX-221中前80个核苷酸被缺失[Hohne，M.等，Eur.J.Biochem.，241，19966-11]，的构建体被命名为LBLOXΔ80N。经过体外转录产生mRNA，然后从对应于pCSLBLOX-221第192位核苷酸的甲硫氨酸残基开始，进行相应蛋白质的翻译，因此此蛋白质缺少野生型LBLOX中N-末端的48个氨基酸残基。LBLOXΔ51和LBLOXΔ96都缺失了在第696位氨基酸残基下游的C-末端区域。LBLOXΔ51和LBLOXΔ96分别缺失了位于696之后的51个和96个氨基酸残基，但保持了原有的C-末端。对这些制备过程来说，利用p-CSLBLOX-221中位于核苷2128的MscI位点进行酶切，将上游片断与通过PCR获得的相应C-末端片断相连。为构建LBLOXΔ504，pCSLBLOX-221 1450位的NdeI位点和其翻译终点下游的AatII位点被用来删除LBLOX的整个末端部分。这些位点被平末端化并进行再连接之后，通过构建体体外的转录/翻译产生了缺失LBLOX分子C-末端的相应蛋白质。
为了克隆融合蛋白GST-LBLOX244，利用从Schistosoma japonicum的26kDa谷胱甘肽-S转移酶结构域衍生的片断作为N-末端部分，而利用LBLOX的244个氨基酸残基组成的N-末端片断作为C-末端部分。利用BamHI/XhoI-酶切的基因融合载体pGEX-4T-3(Pharmacia)和对应于LBLOX的1-244氨基酸残基的长度为732个核苷酸的片断进行克隆，并作为蛋白质纯化的亲和标记，通过在谷胱甘肽-琼脂糖4B(Pharmacia)上的层析对融合蛋白GST-LBLOX244进行分离。
将pCSLBLOX-221中的插入子克隆到pQE载体中(Quiagen)，以在细菌中表达LBLOX。为了利用体外转录的方法产生LBLOX，以AatII酶切存在于载体pSport-1中的LBLOX序列，即pCSLBLOX-221[Hohne，M.等，Eur.J.Biochem.，241.19966-11]，然后以T7聚合酶转录并在网织红细胞裂解物中进行翻译。同样，可通过利用pCSPAT-291的体外转录/翻译系统获得类patatin蛋白(与磷脂酶A2相同)，并且该PLA cDNA受到T7启动子的调控[May.C.等，Biochim.Biophys.Acta 1393，1998267-276]。烟草的转染利用包含花椰菜花叶病毒35S RNA启动子，β-葡糖醛酸酶基因的编码区和NOS终止子的载体pBI121(Clontech)，通过SmaI和SstI切除GUS序列盒并利用T4 DNA聚合酶获得平末端得到构建体pBI121ΔGUS。利用Sma I/BamHI将存在于载体pSpor t-1中的LBLOX序列[Hohne，M.等，Eur.J.Biochem.，241.19966-11]切下，与一个BamHI接头相连，并将其连入带有BamHI-切口的去磷酸化载体pBI121ΔGUS中。产物pBI121ΔGUS-LBLOX，既可被转化进入根癌土壤杆菌，也可被进一步修饰得到pBI121ΔGUS-LBLOX-HA3。后面提到的质粒是利用位于pCSLBLOX-221中核苷酸252位之后的单个SacI位点构建的，用SacI酶切并去磷酸化之后，将具有一个SacI位点的三联体的血凝素标记(HA标记)插入到质粒中。考虑到3-YPYDVPDYA-序列和接头，插入序列的全长是30个氨基酸。
利用冻融法以pBI121ΔGUS-LBLOX或pBI121ΔGUS-LBLOX-HA3转化根癌土壤杆菌LB-A4404。按照Horsch等人[Science 227，19851229-1231]建立的方法，这些转化的细菌可被用于转化烟草Nicotiana tabacumcv.Petit Havanna SR-1的叶子圆盘。在补充0.5mg/l的N-苄氨基嘌呤，500mg/l的头孢噻肟和75mg/l卡那霉素的Linsmaier和Skoog培养基上筛选芽体，对于LOX含量提高的卡那霉素-抗性植株倾向于进行植物性繁殖。通过在烟草内的表达制备HA-标记的LBLOX将包含pBI121ΔGUS-LBLOX-HA3构建体的纯合卡那霉素-抗性烟草品系的叶子，在50mM Hepes-NaOH，pH7.4，5mM MgCl2，0.5mM EDTA，50mMKCl，2.5mM二硫苏糖醇2mM苯甲基硫酰氟，和15％(w/w)蔗糖(缓冲液A)中以及聚乙烯吡咯烷酮(25 000)(Merck)存在时，进行均质化。离心之后，将100 000×g离心得到的上清液去除矿物质，然后在大型生物凝胶柱Biogel A-1.5柱上进行浓缩和分离。收集相当于100kDa，并利用抗-HA血清通过蛋白质印迹进行分析的组分。这个突变的LBLOX蛋白包含一个具有30个氨基酸残基的插入体，此插入体与一个位于野生型酶68位氨基酸残基之后的三联体HA标记对应，分子量的理论值为104kDa。利用SDS-PAGE，野生型蛋白和重组蛋白之间在大小上的差异无疑被毫无疑问地检测到。通过体外合成对蛋白质进行放射性标记在具有或缺乏狗胰腺微粒体的情况下，使用纯mRNAs，网织红细胞裂解液和[35S]L-甲硫氨酸实现了翻译过程。或者，利用从黄瓜子叶中制备的微粒体进行协同翻译或翻译后转运试验。通过体内合成对蛋白质进行标记利用培养4天的秧苗子叶进行短脉冲体内放射性标记试验。将5g的子叶切成2mm的碎片，并与8MBq[35S]L-甲硫氨酸(40TBq/mmol)培养15分钟。按照上述方法，进行仔细的均质化并制备出次级分离物。
45Ca2+流加，及脂质小体组分的分析从在暗处26℃生长2.5天(＝d)的黄瓜秧苗上收集2g子叶，将其切成碎片，并在暗处与6MBq45Ca2+(8GBq/mmol)培养3小时。在缓冲液A中使用手术刀片将子叶切碎使其均质化，然后将匀浆以2 000×g离心25分钟。去除上面含有脂质小体的相，然后将提取物从沉积物中轻轻倒出来，并以100 000×g离心1小时。
将包含脂质小体的组分重新悬浮于缓冲液A，使其中的蔗糖浓度为30％(w/w)，并且以一层缓冲液A封面。在100 000×g离心1小时之后，收集漂浮的脂质小体并以不同的洗涤方法进行漂洗。脂质体的制备按Woodle，M C.& Papahadjopoulos，D.[酶学方法，171，1989193-217]描述的方法，从粗制的大豆卵磷脂混合物(Sigma)或者从确定的二亚油基磷酯酰胆碱，在加或不加丝氨酸衍生物，做为单层囊泡的条件下制备脂质体利用去污剂的溶解作用将前者除去，二亚油基磷酯酰胆碱与胆酸钠的摩尔比一般是0.6∶1.0。在配有PM10膜的Amicon室中对去污剂进行透析，并且监测其效果[Yamazaki，N.等，酶学方法，242，199456-65]。在显微镜下通过与MonoQ珠的大小(10±0.5μm)进行比较来测定脂质体囊泡的大小。在具体的试验中，将三酰甘油酯与脂质体结合得到可与“黑色”的脂质小体相对比的磷脂包被的脂质小滴，。开始制备时，先将200mg大豆卵磷脂和500mg甘油三亚麻酸酯溶于10ml的甲醇/氯仿(1∶1)混合溶剂中。然后在真空中去除溶剂，将残留物重新悬浮于透析缓冲液中，如[Yamazaki，N.等，酶学方法，242，199456-65]所述。每一次试验，利用TLC对浮集法获得的脂质体囊泡进行分析。脂质体的直径为1μm。与浮集法试验联合的结合试验将对应于1mg卵磷脂的脂质体于150mM NaCl，50mMTris-HCl，pH8.0中的悬浮液，与4μg未标记的蛋白质或者网织红细胞裂解液翻译混合物的上清液，一起培养10分钟。使悬浮液中的蔗糖浓度达到42％(w/w)，然后转入12ml的离心管。样品上覆盖一层线性密度梯度为37-26％(w/w)的蔗糖。通过100 000g离心6小时，对蛋白质覆盖的脂质体进行浮选。分离之后，通过SDS-PAGE和免疫标记进行蛋白质分析。
脂质小体或微粒体结合试验的操作与上述方法相似。蔗糖梯度中的所有密度与蔗糖的浓度(w/w)相关。免疫学方法由兔子产生抗LBLOX[Sturm，A.等Eur.J.Biochem.，150，1985462-468]，PLA[May.C.等，Biochim.Biophys.Acta1393，1998267-276]，和异柠檬酸裂合酶[Frevert，J.& Kindl，H.Eur.J.Biochem.，92，197835-43]的抗血清。而且，还要使用抗GST(Phamacia)的单克隆抗体和来自人类流感病毒的红血球凝集素的抗原决定簇。在与20μg抗血清沉淀之前，向混合物中加入1μg相应的纯化蛋白，然后在标准条件下(方法1)进行放射性标记酶的免疫沉淀。将反应混合物在20℃反应12小时，再在4℃下反应20小时，然后以3 000×g进行离心，沉淀出沉淀物。对沉淀物至少漂洗5次然后溶解在SDS中。对于其它蛋白质的直接沉淀(方法2)来说，不需要稀释抗原，只需将抗原与2μl的抗血清反应6小时，再与蛋白A琼脂糖(Sepharose)混合。然后将混合物移入小容器中，彻底进行漂洗，再利用100mM乙酸将抗原和IgG一起洗出。其它分析对凝胶进行限制性蛋白水解，以比较蛋白质的结构[Hohne，M.等，Eur.J.Biochem.24，19966-11]。利用甲醇/氯仿/水65∶25∶4作为溶剂系统，在Sillica-Gel G(Merck)上对脂类进行TLC分析。结果为了研究将LBLOX从核糖体转移到终细胞的位，所需的一系列步骤先要研究细胞中能够与LBLOX蛋白进行杂交的库。其次，对用于转移的寻靶作用的结构、序列或结构域进行定位。对LBLOX通过协同翻译转运到内质网和翻译后转移到脂质小体的差别在体内和体外进行了研究。
经试验观察，体外翻译的LBLOX和结合在内质网或脂质小体膜上的细胞形式的LBLOX在分子量上没有差别(附


图1A)。这表明将LBLOX运输到膜的过程没有发生明显的化学修饰。LBLOX到达细胞中的最终位点的可能的机制，既可以是先经过协同翻译转运到内质网，然后再转运到脂质小体，也可以是通过胞质库翻译后转运到脂质小体。首先，LBLOX mRNA的体外翻译在协同翻译条件下，在狗胰腺微粒体或黄瓜子叶微粒体中进行。其次，利用相似的操作步骤检验放射性标记的翻译产物是否能够在翻译的同时转运到膜上，以及加入微粒体是否会相继发挥作用(附
图1B)。在后一种情形中，加入微粒体之前，先进行离心将核糖体从重新合成的蛋白质中去除。利用浮集法对富含内质网的膜进行再次分离，只有一部分翻译出来的蛋白质保留在，已引入悬浮液的梯度位置(附图编号12)。一些LBLOX迁移到相当于33％蔗糖梯度(附图编号11)或30％蔗糖梯度(附图编号9)中，少量LBLOX被发现位于光滑内质网上(附图编号5-7)。
对位于膜上的LBLOX放射活性的量进行比较，其中在一系列的试验中已经对膜利用梯度离心的方法进行了再次分离，比较结果说明通过翻译后转运到微粒体的形式获得的膜结合蛋白量与协同翻译转运的方式获得的膜结合蛋白量相同，或稍高(没有给出数据)。对LBLOX初级翻译产物与经过浮集法从膜上再分离出来的LBLOX的迁移行为进行了详细的比较，表明二者的分子量没有明显差别。
对通过体外转录pPAT291获得的PLA-mRNA进行翻译，将翻译产物，即放射性标记的磷脂酸与微粒体一起培养。经过蔗糖梯度的浮集之后，利用SDS-PAGE和荧光自显影对次级组分进行分析(附
图1C)。荧光自显影表明许多翻译产物已结合在微粒体的膜上。
通过对体内情况，即监测LBLOX转运到脂质小体发生事件的顺序进行分析，证实了LBLOX转移到微粒体的体外研究所获得的结果(附
图1B)。利用脉冲追踪试验，我们测定了被在运往脂质小体途径中重新合成的LBLOX杂交的蛋白库，此试验是为了找出最先探测到被标记LBLOX的细胞库是内质网的组分还是细胞质的组分。
附图2A(电泳泳道2)显示大多数脉冲-标记LBLOX是在包含细胞质的组分中获得的。在微粒体和利用蔗糖梯度的浮选法进一步纯化的微粒体组分中连续发现了少量但却是明显量的放射性标记的LBLOX。为了排除少量百分率的重新合成蛋白污染了含内质网组分，我们在微粒体组分中分析了的蛋白质的量，这些蛋白质或者是胞质中的蛋白，或者是由于人为因素被释放到100 000g离心所得的含胞质上清液。以异柠檬酸裂合酶作为此发育水平上强表达的黄瓜蛋白，利用免疫沉淀测定微粒体组分和可溶的上清液中此蛋白质的存在。附图2B表明，与LBLOX相反，在ER制备物中实际缺乏异柠檬酸裂合酶。
附图2A中的数据表明，LBLOX与胞质杂交作为向脂质小体的转运的第一个库。很明显，LBLOX具有膜结合的性质并且当它结合到ER膜上以后可以部分免受蛋白酶解作用。虽然LBLOX分子具有膜的亲和性的区域，但是LBLOX的主要部位在体外还是易受化学修饰，并因此可以设计在体内进入胞质。附图2C显示出结合于微粒体膜的LBLOX部分的易受蛋白酶解作用降解的程度。
根据我们的发现，从子叶中分离出来的可以通过蛋白质印迹分析在微粒体中探测到的LOX同工型，与结合于脂质小体的LOX同工型相同。这一点可通过对经过限制性蛋白酶解所得到片断模式进行比较得到证实(没有给出数据)。LBLOX结合于微粒体膜的途径与外周结合膜蛋白结合于膜上的途径一致。用100mmMgCl2漂洗去除90％的标记LBLOX蛋白，然而需要强调的是，LBLOX在低盐的缓冲液中与微粒体结合，并且在重复梯度离心的条件下是相当稳定的。通过试验观察，膜上的LOX只有部分易受蛋白酶解的作用，也证实结合是稳定的这一事实(附图2，C部分)。
其它的体内情况也证实了LBLOX结合于微粒体膜的能力。在杂合的体系中，即表达黄瓜子叶LBLOX的绿色烟草叶片，LBLOX的高表达导致大量的LBLOX结合于微粒体。利用蔗糖密度梯度浮选方法，并通过100 000×g离心沉降所得的次级分部分离物，证实实际上在100 000×g离心沉降之前，所有LBLOX都保持与漂浮的膜结合。膜-结合LBLOX的峰与ER膜上的标记蛋白一致。
为了扩充有关LBLOX翻译后直接转移到脂质小体膜的证据，我们在体外研究了可溶性LBLOX对于微粒体膜的亲和性。在混合试验中，将从脉冲标记的子叶中分离出来的具有放射性活性的胞质蛋白混合物(制备物A)加入从未标记的子叶中制备的并经过2 000×g离心获得的提取物的上清液(制备物B)中。这一步骤应该使得以前体形式存在于胞质和无膜的制备物(制备物A)中的放射性活性的LBLOX，在翻译后结合到微粒体膜，脂质小体和其它不存在于非放射性活性提取物(制备物B)中的膜。经过短时的培养，我们分离出微粒体，以它作为放射性活性LBLOX的可能的受体膜(附图3A)并以乙醛酸循环体作为对照(附图3B)。电泳分析证实胞质中的LBLOX甚至能够在与体内情况相似的条件下结合到微粒体。在乙醛酸循环体组分中没有探测到LBLOX，利用蔗糖梯度浮集法对之进行最后的纯化。因此，可溶性LBLOX能够结合到膜上，但是对所有的膜来说情况是不一样的。例如，LBLOX对于乙醛酸循环体膜的亲和性(附图3B)比检测到的对于微粒体的亲和性低至少一个数量级(附图3A，泳道3)。因此LBLOX在黄瓜子叶中的结合需要高度的选择性，既然其它细胞器没有用LBLOX进行标记并且没有对其进行降解的修饰。
黄瓜LBLOX和大豆LOX-1在有关对脂质体的亲和性上表现出差异。
为了检验不依赖于特异性的蛋白质-蛋白质相互作用的LBLOX是否具有对于膜脂的内在亲和性，对结合研究进行扩展并以脂质体作为受体膜。实验首先利用粗制的大豆卵磷脂作为磷脂酰胆碱的来源。然后，不同纯度的磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸结合使用以产生脂质体。脂质体的大小通过与标准的MonoQ珠比较来进行测定。
脂质体实验的结果(附图4)证明黄瓜LBLOX蛋白的膜亲和性和大豆LOX-1蛋白的膜亲和性之间显著不同。以前被靶向进入黄瓜脂质小体的两种蛋白，即LBLOX和PLA，几乎都定量地结合到脂质体上，而黄瓜胞质中的LOX蛋白和大豆LOX-1对于脂类相不具有亲和性。在以典型的胞质蛋白或从黄瓜子叶中制备的含LBLOX和胞质蛋白的混合物，为对照的试验中，可以证明LBLOX的膜亲和性是独特的(没有给出数据)。
包含β-折叠结构的N-末端区域对于LBLOX结合于脂质小体是必要的。
考虑到缺少蛋白酶解的过程和结合研究的数据，可以假设折叠蛋白的结构域决定了蛋白质向膜的转运。LBLOX的氨基酸序列与根据分辨率为1.4A大豆LOX-1晶体结构数据所获得的结构相匹配因此，这样的结构域有可能存在[Frevert，J.& Kindl，H.Eur.J.Biochem.92，199835-43]。与大豆LOX-1不同，黄瓜LBLOX在紧接N-末端的下游不仅具有β-折叠结构，而且在这个结构域还具有一个独特的谷氨酰残基的排列，它可能是用于Ca2+的配位(附图5)。反过来可能暗示LBLOX的β-折叠结构和Ca2+依赖性的膜结合结构域之间具有相关性。
为了研究作为蛋白质靶定位方法的单结构域的概念，构建了一个cDNA，它能够编码一种由谷胱甘肽-S转移酶和N末端LBLOXβ-折叠作为C-末端片断形成的融合蛋白。在细菌中进行表达，然后分离出一个51KDa的蛋白质，它含有谷胱甘肽-S转移酶的220个氨基酸残基(建立谷胱甘肽结合部位)和LBLOX的224个N-末端氨基酸残基。
利用1μg的该GST-LBLOX24融合蛋白和相当于20μg蛋白的脂质小体悬浮液，我们观察到除了已经存在于脂质小体中的脂质小体之外，相当大量的融合蛋白转移至脂质小体。大量的β-折叠融合蛋白结合到脂质小体表面表明要么融合蛋白能够与原先结合于脂质小体的LBLOX进行完全的竞争，要么脂质小体表面结合的LBLOX没有完全饱和。附图6表明仅有N末端的LBLOXβ-折叠对于有效的结合到脂质小体已经足够。泳道5显示脂质小体对51KDa融合蛋白的吸收。
首先产生两种cDNA构建体，LBLOXΔ51和LBLOXΔ96，然后进行体外的转录/翻译，研究每种蛋白质与被分离的脂质小体的结合。两种重组蛋白被有效地运输到脂质小体(没有给出数据)。实验如此设计是由于对氨基酸序列亲水性图的分析表明如果位于710位点周围的氨基酸残基片断包含一个疏水区，它可以足够进行可能的膜结合。然而，结合实验都呈阳性，表明缺少710位点周围的区域，如在构建体LBLOXΔ51和LBLOXΔ96中产生的情况那样，没有明显减少LBLOX结合于脂质小体的效率。利用体外试验如附
图1B所示，我们也发现放射性标记的翻译产物从LBLOXΔ504被转运到脂质小体。LBLOXΔ504仅由LBLOX分子的N-末端半部分组成。这一点进一步证明这个概念，即包含活性中心的LBLOX C-末端不是靶定位必须的部分。没有N-末端的突出端，但具有β-折叠的LBLOXΔ80N被转运到脂质小体的效率要明显低于LBLOXΔ504。
通过对这种类型的体外实验的扩充，还发现向脂质小体的转运是不依赖于Ca2+的(没有给出数据)。尽管得到这个结论，还是对蛋白质对于脂质小体表面的Ca2+依赖性的结合可能最终导致在脂质小体周围形成富含Ca2+蛋白层的可能性进行了研究。为了研究与如LBLOX和PLA蛋白一起的Ca2+的吸收，我们通过将45CaCl2流加到子叶，然后分离出细胞结构，对Ca2+覆盖的脂质小体的形成进行了研究。经过再次浮集，漂洗和用100mM Na2CO3的处理之后，脂质小体组分中包含相当于约1nmol的50kBq的45Ca2+。在同样的制备中，得到2nmol的LBLOX。用100mM未标记CaCl2进行进一步处理，从脂质小体中去除90％的放射性，但大部分LBLOX仍结合在脂质小体上。这些数据与Ca2+是LBLOX结合于脂质小体表面的先决条件的假设是不一致的。
对LBLOX β-折叠的根本修饰消除了它结合到脂质体的能力为了对有关脂质小体表面和LBLOXN-末端β折叠结构之间的相互作用的性质进行更深入的研究，首先对经过修饰的β折叠结构是否还能够结合于脂质体这一问题进行研究。为此，产生了一种重组蛋白(LBLOX-HA3)，与野生型LBLOX相比，它含有一个嵌入LBLOX氨基酸残基的70和71之间的三联体的红血球凝聚素标记。这种结构通过一个30个氨基酸残基的片断将β-折叠中断。
脂质体实验如附图7所示，对单独的N-末端LOXβ-折叠足以使其结合到膜的证据和破坏β-折叠的结构阻止转移活性的证据进行总结。实际上，野生型LBLOX和β-折叠融合蛋白(GST-LOX)能够大量地结合于脂质体，而在折叠结构中间插入一条多肽能够消除蛋白质对膜的亲和性。讨论只有少数的脂肪氧化酶的同工型结合或整合到各种细胞器的膜上。在这些情况下，脂肪氧化酶的功能是针对于对所研究的膜进行修饰。紧接着在细胞器降解之前，网状细胞中的15-LOX的表达到达最大值[Kuhn，H.，等，生物化学杂志.265，199018351-18361]，在脂肪-降解的子叶的情况下这一特征也可适用于脂质小体中的LOX蛋白[Feussner，I.等，Planta 198，1998288-293；Matsui，K.等，植物生理.119，19991279-1257]。因此，在几种真核细胞中的LOX的功能是与程序化的细胞器降解有关[vanLeyen，K.等，自然395，1998392-395]。对于LBLOX来说，磷酯单层和多数三酰甘油酯都被进行了修饰，产生出13-S-hydro-peroxyoctadecadienoyl单体[Feussner，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，199511849-11853；Sturm，A.等，Eur.J.Biochem，150，19985461-468]，反过来引起贮藏脂类的转移，LBLOX结合于靶膜可能是此活性的先决条件。
进行记述了体内的情形的体外结合实验和细胞分级分离研究，以便研究LBLOX在细胞内直接转运到脂质小体所需要的步骤。两种实验方法的结果支持了初级翻译产物的胞质库确实存在以及后来的转移至脂质小体是在翻译后进行的这一概念。由于在种子发芽时期靶细胞器已经存在，脂类-降解酶，即LBLOX和PLA结合于细胞器主要取决于编码特殊的LOX和PLA同工型基因的暂时表达。早期发现的子叶中LOX表达[Feussner，I.等，Planta 198，1998288-293]和PLA表达[May.C.等，生物化学生物物理学报1393，1998267-276]的临时模式符合它们在脂质小体结构的降解中的发育阶段依赖性角色。
值得指出的是所观察到的LBLOX的结合不是暂时的，而是稳定的结合于微粒体和脂质小体。利用浮集法对过量的配体和受体膜进行严格分离，所获得的与脂质小体或脂质体结合的LBLOX可以作为这种结合的强度大小的证据。然而，这种结合不能与具有一段疏水氨基酸残基的蛋白质的整合作用相比，这类蛋白如所示的油质蛋白，是另一种脂质小体蛋白[Hills，MJ.等，Planta 189，199324-29]；但是它与周边膜蛋白的行为一致。在后一种情况下，研究发生LBLOX的结合是否是由于与作为配偶体的完整膜蛋白(如此油质蛋白做为锚和和)相互作用的结果，或者研究LBLOXβ-折叠的功能是否与结合于磷脂膜上的C2结构域的功能相似，如所示的突触结合蛋白[Rizo，J.& Sudhof，T.C.J.Biol.Chem.273，199815879-15882]和胞质磷脂酶C-delta[Perisic，O.等，生物化学杂志273，19981596-1604]或磷脂酶A2[Xu，G.Y.等，分子生物学杂志.280，1998485-500]也许是十分有用的。与C2结构域相似的这种结构类型还需要深入研究Ca2+对LBLOX膜结合性质或对LBLOX结构的可能影响，如所发现的5-脂肪氧化酶[Hammarberg，T.& Radmark，O.，生物化学38，19994441-4447]。当脂质小体的实验表明脂质小体覆盖有45Ca2+时，没有观察到Ca2+依赖性的LBLOX结合的结构。如果要明确建立存在或不存在Ca2+介导的结合，那么必须在许多方面对进行深入研究的实验步骤加以修正。利用能量过滤电子显微镜进行的根组织的早期实验[Busch，从B.等，欧洲细胞生物学杂志60，199388-100]已经证实脂质小体的表面是被具有高含量Ca2+的区带所覆盖。
我们应该记得LOX形式的氨基酸序列的初级结构和假设的二级结构的比较，表明LBLOX的独特性不仅表现在配有谷氨酰残基的β-折叠结构的形成，还表现在胞质中的LOX同工型不存在的30个氨基酸残基的N-末端延伸，[Hohne，M.等，欧洲生物化学杂志.，241，19966-11；Rosahl，S.，Z.Naturforsh.C 51，1996123-138]。因此可能的情况是两种类型的相互作用都起着决定性的作用，即N-末端的延伸序列作为特异性的基元，位于N-末端的延伸序列之后氨基酸序列的β-折叠结构，作为提高膜亲和性的一般方法。
利用突变的LBLOX蛋白进行实验，这种蛋白质与野生型蛋白质的不同仅在于对β-折叠结构作了较大的修饰，即在β-折叠中插入三个重复的HA标记，表明失去了对脂质小体或膜的结合能力。这意味着完整的β-折叠是结合到脂质小体所必须的结构，不论大部分N-末端区域是否有助于提高选择性。
当蛋白质被运输到线粒体，叶绿体或内质网时，对作为氨基酸残基的非折叠区的靶定位信号进行了鉴定。此时，蛋白质结合于先前存在的脂质小体上，即已经折叠成特异性形状的结构域，可以使膜结合发生。必须假定还存在介导LBLOX结合于脂质小体的选择性的其它部分。如果大量的LBLOX存在，那么不仅脂质小体，而且内质网和高尔基体也会被LBLOX所覆盖。然而，如果细胞内的LBLOX量减少，LBLOX分子优先占据脂质小体的表面。
附图2.子叶中脉冲标记蛋白的结果，表明LBLOX对微粒体的微弱结合，但是在胞质中含有巨量的LBLOX库。
经过一个短的时期(15分钟)之后，这段时间是用来将作为前体的放射活性的氨基酸流加到子叶中，然后对细胞进行分部分离，通过免疫沉淀从细胞亚组分中分离出两种蛋白。在溶解的亚细胞组分中加入1μg相应不带放射性的蛋白(LBLOX或者异柠檬酸裂合酶，ICL)作为载体，然后加入抗血清进行直接沉淀(参见方法)，分离出放射活性的蛋白质。经过电泳和蛋白质染色(泳道3微粒体；泳道4细胞质)之后，A部分的荧光光谱(泳道1和2)表明，胞质中的LOX标记程度高(泳道2)而微粒体中的蛋白标记程度相当低(泳道1)。B部分对异柠檬酸裂合酶在这两种组织间的分布进行测定以比作为对照。泳道1(微粒体)和泳道2(“细胞质”)显示出荧光光谱，而泳道3和4代表蛋白质的染色。泳道1(相对应的蛋白质染色在泳道3)表明在微粒体中没有异柠檬酸裂合酶的污染。C部分用蛋白激酶K处理被标记的微粒体(如对A部分，泳道1的分析)。经过蛋白裂解之后，加入苄甲基硫酰氟和1μg相应不带放射性的蛋白，再进行免疫沉淀。泳道1至4为荧光光谱泳道1是未处理的微粒体；泳道2是未处理的细胞质；泳道3是处理后的微粒体；泳道4是处理后的细胞质。D部分黄瓜LBLOX在转基因烟草的微粒体中的定位。对位于线性蔗糖密度梯度中的膜进行浮集之后，利用免疫印迹分析次级分离物。泳道1对应于离心管的最上层(23％蔗糖)，泳道3(32％蔗糖)，泳道5(39％蔗糖)，泳道6(41％蔗糖)以及泳道7(适用于43％蔗糖的样品)。
附图3体外实验表明，放射性标记的胞质LBLOX微弱地结合在微粒体膜上(A部分)，但是根本无法结合到乙醛酸循环体上(B部分)。
A部分将1g子叶与9MBq[35S]L-甲硫氨酸一起培养3个小时。然后10000g离心制备包含放射性标记的胞质LBLOX的上清液。将此制备物与未处理子叶的组织匀浆混合。然后经过随后的梯度离心分离出ER/高尔基体组分。对一份(1/20)ER/高尔基体组分(泳道1)，重新分离的胞质1/20的等分试样(泳道2)和大量(1/2)ER/高尔基体组分(泳道3)进行SDS-PAGE和荧光自显影分析。B部分在相似的混合实验中，将分离出的未标记的乙醛酸循环体与从体内标记的子叶中制备得到的放射性活性的胞质一起培养。然后在蔗糖梯度中利用浮集法对乙醛酸循环体和乙醛酸循环体膜进行再分离。为此，培养混合物被调至60％(w/w)的蔗糖梯度。将样品使用56至38％的蔗糖梯度。以Bechman SW-28转头27000rpm离心15小时，对分离组分进行SDS-PAGE和荧光自显影分析。在荧光图谱中标记LBLOX的位点如箭头所示。各个泳道与如下的分离组分(括弧中是平衡密度)相对应泳道4(48％蔗糖)，泳道5(48.5％蔗糖)，泳道6(49％蔗糖)，泳道7(50.5％蔗糖)，泳道8(52.5％蔗糖)，泳道24(56％蔗糖)，泳道25(56.5％蔗糖)，泳道26(58％蔗糖)，泳道27(59％蔗糖)以及泳道28(59％蔗糖)。分离组分25-28中的数字与离心之前使用的悬浮液在梯度中的位点相对应。根据蛋白质的轮廓来看，泳道4-5含有乙醛酸循环体膜，泳道8含有乙醛酸循环体。
附图4.经细菌表达的LBLOX和PLA对于脂质体的亲和性将1μg的有关蛋白质和相当于1mg磷酯酰胆碱的脂质体在200μl的缓冲液中一起培养。30分钟之后，将混合物调节为42％蔗糖密度，并作为蔗糖梯度中的一层。通过100 000g离心6个小时进行浮集，并对从梯度中获得的次级组分的蛋白质进行SDS-PAGE和免疫标记的分析。利用抗LBLOX或抗类-patain蛋白质的抗血清进行免疫标记。最右边的泳道总是代表底部，即离心之前培养混合物在梯度之下形成的一层。因此，浮集是从右至左进行的。
附图5.图形表示LBLOX的结构及其具有β-折叠的N-末端部分(氨基酸残基48-244)根据大豆LOX-1[21]所得的晶体结构数据，利用LBLOX初级序列计算得到的LBLOX结构。附图的最上部分表示N-末端，离开左下角一点的地方显示β-折叠，(由β-折叠片唯一组成，)。LOX的主要部分(含有位于C末端的活性中心)，主要由α-螺旋构成。附图的底部是N-末端β-折叠结构的放大图，其中没有显示出N末端最外面的40个氨基酸残基，这个延伸序列没有在其它LOX结构中发现。在左下角，箭头指示的中断结构表示一个位点，LBLOX在此位点的氨基酸序列与大豆LOX-1在此位点的氨基酸序列显著不同。利用程序(Swiss 3D model，Expasy server)研究发现一个高柔性的环，它是尚未被确定的结构，与LOX-1中的情形相似。在LOX-1中，这个环是由14个氨基酸残基组成；在LBLOX中，这个环是由20个氨基酸残基组成。两个谷氨酰残基E59和E70都是独立存在，并且只在LBLOX中发现而没有在大豆LOX-1中发现。这个区域可能在Ca2+-协调的膜结合中起作用。
附图6.GST-LBLOX244融合蛋白与分离脂质小体的体外结合将亲和纯化的融合蛋白GST-LBLOX244加入到富集细胞质的脂质小体悬浮液中。经过培养之后，利用浮集法从溶解蛋白中分离出脂质小体。利用SDS-PAGE，然后利用抗LBLOX抗血清的免疫印迹方法对两种分离组分和原初粗脂质小体组伤(泳道3和6)的等分试样进行分析。泳道2和5利用浮集法获得的脂质小体；泳道1和4重新分离的蛋白质。箭头指向51KDa带的箭头它表示除了内生LBLOX之外的结合到脂质小体的融合蛋白。泳道1-3蛋白质染色；泳道4-6免疫标记。
附图7.LBLOX构建体和由野生型和修饰的β-折叠组成的重组蛋白与脂质体的结合将纯化的重组蛋白和脂质体一起进行培养之后，利用蔗糖梯度的浮集法从培养混合物中重新分离出脂质体。将野生型脂质小体LOX(LBLOX)的行为与以下几种片断的行为进行比较，即包含N-末端部分的LBLOX(LBLOX-Δ504)片断，具有β-折叠(GST-LOX)的融合蛋白，以及N-末端β-折叠经过明显修饰的LBLOX(LBLOX-HA3)。附图显示3通过SDS-PAGE和利用抗LBLOX抗血清的免疫标记方法对梯度分离组分的分析结果。
缩写血凝素，HA；谷胱甘肽-S-转移酶，GST；脂质小体脂肪氧化酶，LBLOX；脂肪氧化酶，LOX；磷脂酶A2，PLA。
酶谷胱甘肽-S-转移酶(EC 2.5.1.18)；异柠檬酸裂合酶(EC4.1.3.1)；脂肪氧化酶(EC1.13.11.12)；磷脂酶A2(EC 3.1.4.3)。
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>β-折叠的脂质小体脂肪氧化酶<130>99_1235<140><141><160>4<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>732<212>DNA<213>黄瓜(Cucumis sativus)<220><221>CDS<222>(1)..(732)<400>1atg ttt gga att ggg aag aac atc att gaa ggg gcc ttg aat aca act 48Met Phe Gly Ile Gly Lys Asn Ile Ile Glu Gly Ala Leu Asn Thr Thr15 10 15gga gat ctt gca ggt tct gtt atc aat gct ggt ggt aac att tta gat 96Gly Asp Leu Ala Gly Ser Val Ile Asn Ala Gly Gly Asn Ile Leu Asp20 25 30aga gtt tcc agt ctt gga gga aac aaa atc aaa ggg aaa gtg att ctt 144Arg Val Ser Ser Leu Gly Gly Asn Lys Ile Lys Gly Lys Val Ile Leu35 40 45atg aga agc aat gtt ttg gat ttc act gaa ttt cat tcc aat ctt ctt 192Met Arg Ser Asn Val Leu Asp Phe Thr Glu Phe His Ser Asn Leu Leu50 55 60gat aac ttc act gag ctc ttg ggt ggt ggt gtt tct ttc caa ctc att 240Asp Asn Phe Thr Glu Leu Leu Gly Gly Gly Val Ser Phe Gln Leu Ile65 70 75 80agt gcc act cat act tca aat gac tca aga ggg aaa gtt ggg aac aag 288Ser Ala Thr His Thr Ser Asn Asp Ser Arg Gly Lys Val Gly Asn Lys85 90 95gca tat ttg gag agg tgg cta act tca atc cca cca ctg ttt gct gga 336Ala Tyr Leu Glu Arg Trp Leu Thr Ser Ile Pro Pro Leu Phe Ala Gly100 105 110gaa tca gtg ttc caa atc aac ttt caa tgg gat gaa aat ttt gga ttt 384Glu Ser Val Phe Gln Ile Asn Phe Gln Trp Asp Glu Asn Phe Gly Phe115 120 125cca gga gct ttc ttc ata aaa aat gga cat aca agt gaa ttc ttt ctc 432Pro Gly Ala Phe Phe Ile Lys Asn Gly His Thr Ser Glu Phe Phe Leu130 135 140aaa tct ctc act ctt gat gat gtt cct ggc tat ggc aga gtc cat ttt 480Lys Ser Leu Thr Leu Asp Asp Val Pro Gly Tyr Gly Arg Val His Phe145 150 155 160gat tgc aat tct tgg gtt tac cct tct gga aga tac aag aaa gat cgc 528Asp Cys Asn Ser Trp Val Tyr Pro Ser Gly Arg Tyr Lys Lys Asp Arg165 170 175att ttc ttt gcc aat cat gtt tat ctt cca agt caa aca cca aac cct 576Ile Phe Phe Ala Asn His Val Tyr Leu Pro Ser Gln Thr Pro Asn Pro180 185 190ctt cgt aag tat aga gag gaa gaa ttg tgg aat ttg aga gga gat gga 624Leu Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Glu Leu Trp Asn Leu Arg Gly Asp Gly195 200 205aca gga gaa aga aag gaa tgg gat aga att tat gac tat gat gtt tat 672Thr Gly Glu Arg Lys Glu Trp Asp Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr210 215 220aat gac att gct gac cct gat gtt ggt gat cat cgt cct att ctc ggt 720Asn Asp Ile Ala Asp Pro Asp Val Gly Asp His Arg Pro Ile Leu Gly225 230 235 240ggg acg acc gaa 732Gly Thr Thr Glu<210>2<211>244<212>PRT<213>黄瓜(Cucumis sativus)<400>2Met Phe Gly Ile Gly Lys Asn Ile Ile Glu Gly Ala Leu Asn Thr Thr15 10 15Gly Asp Leu Ala Gly Ser Val Ile Asn Ala Gly Gly Asn Ile Leu Asp
20 25 30Arg Val Ser Ser Leu Gly Gly Asn Lys Ile Lys Gly Lys Val Ile Leu3540 45Met Arg Ser Asn Val Leu Asp Phe Thr Glu Phe His Ser Asn Leu Leu50 55 60Asp Asn Phe Thr Glu Leu Leu Gly Gly Gly Val Ser Phe Gln Leu Ile65 70 75 80Ser Ala Thr His Thr Ser Asn Asp Ser Arg Gly Lys Val Gly Asn Lys85 90 95Ala Tyr Leu Glu Arg Trp Leu Thr Ser Ile Pro Pro Leu Phe Ala Gly100 105 110Glu Ser Val Phe Gln Ile Asn Phe Gln Trp Asp Glu Asn Phe Gly Phe115 120 125Pro Gly Ala Phe Phe Ile Lys Asn Gly His Thr Ser Glu Phe Phe Leu130 135 140Lys Ser Leu Thr Leu Asp Asp Val Pro Gly Tyr Gly Arg Val His Phe145 150 155 160Asp Cys Asn Ser Trp Val Tyr Pro Ser Gly Arg Tyr Lys Lys Asp Arg165 170 175Ile Phe Phe Ala Asn His Val Tyr Leu Pro Ser Gln Thr Pro Asn Pro180 185 190Leu Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Glu Leu Trp Asn Leu Arg Gly Asp Gly195 200 205Thr Gly Glu Arg Lys Glu Trp Asp Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr210 215 220Asn Asp Ile Ala Asp Pro Asp Val Gly Asp His Arg Pro Ile Leu Gly225 230 235 240Gly Thr Thr Glu<210>3<211>2964<212>DNA<213>黄瓜(Cucumis sativus)<220><221>CDS<222>(48)..(2684)<400>3gttccaaaca cacagtgagc aaaaaagaaa agtaaaaaag agtgaaa atg ttt gga 56Met Phe Gly1att ggg aag aac atc att gaa ggg gcc ttg aat aca act gga gat ctt 104Ile Gly Lys Asn Ile Ile Glu Gly Ala Leu Asn Thr Thr Gly Asp Leu5 10 15gca ggt tct gtt atc aat gct ggt ggt aac att tta gat aga gtt tcc 152Ala Gly Ser Val Ile Asn Ala Gly Gly Asn Ile Leu Asp Arg Val Ser20 25 30 35agt ctt gga gga aac aaa atc aaa ggg aaa gtg att ctt atg aga agc 200Ser Leu Gly Gly Asn Lys Ile Lys Gly Lys Val Ile Leu Met Arg Ser40 45 50aat gtt ttg gat ttc act gaa ttt cat tcc aat ctt ctt gat aac ttc 248Asn Val Leu Asp Phe Thr Glu Phe His Ser Asn Leu Leu Asp Asn Phe55 60 65act gag ctc ttg ggt ggt ggt gtt tct ttc caa ctc att agt gcc act 296Thr Glu Leu Leu Gly Gly Gly Val Ser Phe Gln Leu Ile Ser Ala Thr7075 80cat act tca aat gac tca aga ggg aaa gtt ggg aac aag gca tat ttg 344His Thr Ser Asn Asp Ser Arg Gly Lys Val Gly Asn Lys Ala Tyr Leu85 90 95gag agg tgg cta act tca atc cca cca ctg ttt gct gga gaa tca gtg 392Glu Arg Trp Leu Thr Ser Ile Pro Pro Leu Phe Ala Gly Glu Ser Val100 105 110 115ttc caa atc aac ttt caa tgg gat gaa aat ttt gga ttt cca gga gct 440Phe Gln Ile Asn Phe Gln Trp Asp Glu Asn Phe Gly Phe Pro Gly Ala120 125 130ttc ttc ata aaa aat gga cat aca agt gaa ttc ttt ctc aaa tct ctc 488Phe Phe Ile Lys Asn Gly His Thr Ser Glu Phe Phe Leu Lys Ser Leu135 140 145act ctt gat gat gtt cct ggc tat ggc aga gtc cat ttt gat tgc aat 536Thr Leu Asp Asp Val Pro Gly Tyr Gly Arg Val His Phe Asp Cys Asn150 155 160tct tgg gtt tac cct tct gga aga tac aag aaa gat cgc att ttc ttt 584Ser Trp Val Tyr Pro Ser Gly Arg Tyr Lys Lys Asp Arg Ile Phe Phe165 170 175gcc aat cat gtt tat ctt cca agt caa aca cca aac cct ctt cgt aag 632Ala Asn His Val Tyr Leu Pro Ser Gln Thr Pro Asn Pro Leu Arg Lys180 185 190 195tat aga gag gaa gaa ttg tgg aat ttg aga gga gat gga aca gga gaa 680Tyr Arg Glu Glu Glu Leu Trp Asn Leu Arg Gly Asp Gly Thr Gly Glu200 205 210aga aag gaa tgg gat aga att tat gac tat gat gtt tat aat gac att 728Arg Lys Glu Trp Asp Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr Asn Asp Ile215 220 225gct gac cct gat gtt ggt gat cat cgt cct att ctc ggt ggg acg acc 776Ala Asp Pro Asp Val Gly Asp His Arg Pro Ile Leu Gly Gly Thr Thr230 235 240gaa tat cct tac cct cgt agg gga aga aca gga cga cca cga tca aga 824Glu Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Pro Arg Ser Arg245 250 255aga gac cac aat tat gag agc aga ttg tca cca ata atg agc tta gac 872Arg Asp His Asn Tyr Glu Ser Arg Leu Ser Pro Ile Met Ser Leu Asp260 265 270 275atc tat gta cca aaa gat gaa aac ttt ggg cat ttg aag atg tca gat 920Ile Tyr Val Pro Lys Asp Glu Asn Phe Gly His Leu Lys Met Ser Asp280 285 290ttc ctt ggt tat aca tta aaa gca ctt tcg ata tca atc aaa cca gga 968Phe Leu Gly Tyr Thr Leu Lys Ala Leu Ser Ile Ser Ile Lys Pro Gly295 300 305ctt caa tcc ata ttt gat gta act cca aat gaa ttt gac aat ttt aaa 1016Leu Gln Ser Ile Phe Asp Val Thr Pro Asn Glu Phe Asp Asn Phe Lys310 315 320gaa gtt gat aat ctc 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atg aag caa aac agg ctc tac ata gtg gat ttc cat 1400Val Asp Glu Ala Met Lys Gln Asn Arg Leu Tyr Ile Val Asp Phe His440 445 450gat gca tta atg ccc tat ctt aca agg atg aat gca aca tca aca aaa 1448Asp Ala Leu Met Pro Tyr Leu Thr Arg Met Asn Ala Thr Ser Thr Lys455 460 465aca tat gcc aca aga aca ttg ctt ctt ttg aaa gat gat ggg act ttg 1496Thr Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Lys Asp Asp Gly Thr Leu470 475 480aag cca ttg gtt att gag tta gcc ttg cca cat cct caa gga gat caa 1544Lys Pro Leu Val Ile Glu Leu Ala Leu Pro His Pro Gln Gly Asp Gln485 490 495ctt ggt gcc att agc aaa cta tac ttt cca gct gaa aat gga gtt caa 1592Leu Gly Ala Ile Ser Lys Leu Tyr Phe Pro Ala Glu Asn Gly Val Gln500 505 510 515aaa tcc att tgg caa ttg gct aaa gct tat gta act gtt aat gat gtt 1640Lys Ser Ile Trp Gln Leu Ala Lys Ala Tyr Val Thr Val Asn Asp Val520 525 530ggc tac cat caa ctt att agt cat tgg ttg cat act cat gct gta ctt 1688Gly Tyr His Gln Leu Ile Ser His Trp Leu His Thr His Ala Val Leu535 540 545gag cca ttt gtg 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tgg gta cag gat tat tgc tgt ctc tac tac aaa gat 2072Ala Ile Lys Thr Trp Val Gln Asp Tyr Cys Cys Leu Tyr Tyr Lys Asp660 665 670 675gac aat gca gta caa aat gac ttt gaa ctc caa tct tgg tgg aat gag 2120Asp Asn Ala Val Gln Asn Asp Phe Glu Leu Gln Ser Trp Trp Asn Glu680 685 690cta aga gag aaa ggc cac gct gac aag aaa cat gaa cca tgg tgg cca 2168Leu Arg Glu Lys Gly His Ala Asp Lys Lys His Glu Pro Trp Trp Pro695 700 705aaa atg caa act tta agt gaa tta atc gaa tcc tgc act aca att ata 2216Lys Met Gln Thr Leu Ser Glu Leu Ile Glu Ser Cys Thr Thr Ile Ile710 715 720tgg att gct tca gct ctt cat gcc gca gtt aac ttt gga caa tat ccc 2264Trp Ile Ala Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gln Tyr Pro725 730 735tac gga ggc tat att ctc aat cga cca act aca agt cgt agg ttc atg 2312Tyr Gly Gly Tyr Ile Leu Asn Arg Pro Thr Thr Ser Arg Arg Phe Met740 745 750 755cct gaa gtt ggc acg gct gag tac aaa gaa ctg gaa tcg aat ccc gaa 2360Pro Glu Val Gly Thr Ala Glu Tyr Lys Glu Leu Glu Ser Asn Pro Glu760 765 770aaa gct ttc 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aaggtcacaa attacatttt 2754aagttgccca cattattatt atgaaggaaa taaatgacca tatttttagt ttaatttaaa 2814ttaggtagct atagccaact ttaggctctg ttggatttgg aactatctcc aacttatata 2874tgtactttgt actactattt gatgaataaa agttgtgtgt cttaagaata aaaaaaaaaa 2934aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2964<210>4<211>878<212>PRT<213>黄瓜(Cucumis sativus)<400>4Met Phe Gly Ile Gly Lys Asn Ile Ile Glu Gly Ala Leu Asn Thr Thr15 10 15Gly Asp Leu Ala Gly Ser Val Ile Asn Ala Gly Gly Asn Ile Leu Asp
20 25 30Arg Val Ser Ser Leu Gly Gly Asn Lys Ile Lys Gly Lys Val Ile Leu3540 45Met Arg Ser Asn Val Leu Asp Phe Thr Glu Phe His Ser Asn Leu Leu50 55 60Asp Asn Phe Thr Glu Leu Leu Gly Gly Gly Val Ser Phe Gln Leu Ile65 70 7580Ser Ala Thr His Thr Ser Asn Asp Ser Arg Gly Lys Val Gly Asn Lys85 90 95Ala Tyr Leu Glu Arg Trp Leu Thr Ser Ile Pro Pro Leu Phe Ala Gly100 105 110Glu Ser Val Phe Gln Ile Asn Phe Gln Trp Asp Glu Asn Phe Gly Phe115 120 125Pro Gly Ala Phe Phe Ile Lys Asn Gly His Thr Ser Glu Phe Phe Leu130 135 140Lys Ser Leu Thr Leu Asp Asp Val Pro Gly Tyr Gly Arg Val His Phe145 150 155 160Asp Cys Asn Ser Trp Val Tyr Pro Ser Gly Arg Tyr Lys Lys Asp Arg165 170 175Ile Phe Phe Ala Asn His Val Tyr Leu Pro Ser Gln Thr Pro Asn Pro180 185 190Leu Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Glu Leu Trp Asn Leu Arg Gly Asp Gly195 200 205Thr Gly Glu Arg Lys Glu Trp Asp Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr210 215 220Asn Asp Ile Ala Asp Pro Asp Val Gly Asp His Arg Pro Ile Leu Gly225 230 235 240Gly Thr Thr Glu Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Pro245 250 255Arg Ser Arg Arg Asp His Asn Tyr Glu Ser Arg Leu Ser Pro Ile Met260 265 270Ser Leu Asp Ile Tyr Val Pro Lys Asp Glu Asn Phe Gly His Leu Lys275 280 285Met Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Thr Leu Lys Ala Leu Ser Ile Ser Ile290 295 300Lys Pro Gly Leu Gln Ser Ile Phe Asp Val Thr Pro Asn Glu Phe Asp305 310 315 320Asn Phe Lys Glu Val Asp Asn Leu Phe Glu Arg Gly Phe Pro Ile Pro325 330 335Phe Asn Ala Phe Lys Thr Leu Thr Glu Asp Leu Thr Pro Pro Leu Phe340 345 350Lys Ala Leu Val Arg Asn Asp Gly Glu Lys Phe Leu Lys Phe Pro Thr355 360 365Pro Glu Val Val Lys Asp Asn Lys Ile Gly Trp Ser Thr Asp Glu Glu370 375 380Phe Ala Arg Glu Met Leu Ala Gly Pro Asn Pro Leu Leu Ile Arg Arg385 390 395 400Leu Glu Ala Phe Pro Pro Thr Ser Lys Leu Asp Pro Asn Val Tyr Gly405 410 415Asn Gln Asn Ser Thr Ile Thr Glu Glu His Ile Lys His Gly Leu Asp420 425 430Gly Leu Thr Val Asp Glu Ala Met Lys Gln Asn Arg Leu Tyr Ile Val435 440 445Asp Phe His Asp Ala Leu Met Pro Tyr Leu Thr Arg Met Asn Ala Thr450 455 460Ser Thr Lys Thr Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Lys Asp Asp465 470 475 480Gly Thr Leu Lys Pro Leu Val Ile Glu Leu Ala Leu Pro His Pro Gln485 490 495Gly Asp Gln Leu Gly Ala Ile Ser Lys Leu Tyr Phe Pro Ala Glu Asn500 505 510Gly Val Gln Lys Ser Ile Trp Gln Leu Ala Lys Ala Tyr Val Thr Val515 520 525Asn Asp Val Gly Tyr His Gln Leu Ile Ser His Trp Leu His Thr His530 535 540Ala Val Leu Glu Pro Phe Val Ile Ala Thr His Arg Gln Leu Ser Val545 550 555 560Leu His Pro Ile His Lys Leu Leu Val Pro His Tyr Lys Asp Thr Met565 570 575Phe Ile Asn Ala Ser Ala Arg Gln Val Leu Ile Asn Ala Asn Gly Leu580 585 590Ile Glu Thr Thr His Tyr Pro Ser Lys Tyr Ser Met Glu Leu Ser Ser595 600 605Ile Leu Tyr Lys Asp Trp Thr Phe Pro Asp Gln Ala Leu Pro Asn Asn610 615 620Leu Met Lys Arg Gly Leu Ala Val Glu Asp Ser Ser Ala Pro His Gly625 630 635 640Leu Arg Leu Leu Ile Asn Asp Tyr Pro Phe Ala Val Asp Gly Leu Asp645 650 655Ile Trp Ser Ala Ile Lys Thr Trp Val Gln Asp Tyr Cys Cys Leu Tyr660 665 670Tyr Lys Asp Asp Asn Ala Val Gln Asn Asp Phe Glu Leu Gln Ser Trp675 680 685Trp Asn Glu Leu Arg Glu Lys Gly His Ala Asp Lys Lys His Glu Pro690 695 700Trp Trp Pro Lys Met Gln Thr Leu Ser Glu Leu Ile Glu Ser Cys Thr705 710 715 720Thr Ile Ile Trp Ile Ala Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly725 730 735Gln Tyr Pro Tyr Gly Gly Tyr Ile Leu Asn Arg Pro Thr Thr Ser Arg740 745 750Arg Phe Met Pro Glu Val Gly Thr Ala Glu Tyr Lys Glu Leu Glu Ser755 760 765Asn Pro Glu Lys Ala Phe Leu Arg Thr Ile Cys Ser Glu Leu Gln Ala770 775 780Leu Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Ile Leu Ser Lys His Ala Ser Asp785 790 795 800Glu Val Tyr Leu Gly Gln Arg Ala Ser Ile Asp Trp Thr Ser Asp Lys805 810 815Ile Ala Leu Glu Ala Phe Glu Lys Phe Gly Lys Asn Leu Phe Glu Val
820 825 830Glu Asn Arg Ile Met Glu Arg Asn Lys Glu Val Asn Leu Lys Asn Arg835 840 845Ser Gly Pro Val Asn Leu Pro Tyr Thr Leu Leu Val Pro Ser Ser Asn850 855 860Glu Gly Leu Thr Gly Arg Gly Ile Pro Asn Ser Ile Ser Ile865 870 87权利要求
1一段分离的核酸序列，它编码一条多肽并且由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列的核酸序列与选自下列的一种核酸联合组成a)具有如SEQ ID NO1所示序列的一段核酸序列，b)从如SEQ ID NO1所示序列经过遗传密码的简并衍生得到的核酸序列，c)如SEQ ID NO1所示核酸序列的衍生序列，它编码具有如SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽并且在氨基酸水平上具有至少60％的同源性，d)具有如SEQ ID NO3所示序列或者具有此序列编码区的氨基-末端部分的核酸序列。
2如权利要求1所述的一段分离的核酸序列，其中下列蛋白质组的一段序列用来作为脂肪酸或脂类代谢的生物合成基因核酸序列乙酰-CoA脱氢酶，乙酰-ACP(＝乙酰载体蛋白)去饱和酶，乙酰-ACP硫酯酶，脂肪酸乙酰转移酶，脂肪酸合成酶，脂肪酸羟化酶，乙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A氧化酶，脂肪酸去饱和酶，脂肪酸乙炔化酶，脂肪氧化酶，三酰甘油脂肪酶，allenoxide合成酶，氢过氧化物裂解酶和/或脂肪酸延长酶。
3如权利要求1或2所述的一段分离的核酸序列，其中利用下列蛋白质组的一段序列用来作为脂肪酸或脂类代谢的生物合成基因核酸序列脂肪酸乙酰转移酶，Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶或脂肪酸延长酶。
4如权利要求1至3任一要求所述的一段分离的核酸序列，其中在(c)中提到的衍生序列中，在如SEQ ID NO2所示序列的整个区域内具有70％，优选80％，特别优选90％的氨基酸水平上的同源性(Program PileUp，分子进化杂志.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989151-153)。
5由如权利要求1所述的一段核酸序列编码的一种氨基酸序列。
6含有如权利要求1所述的一段核酸序列的核酸构建体，其中核酸序列与一个或几个调节信号相连接。
7如权利要求1所述的核酸序列或如权利要求6所述的核酸构建体用于产生转基因植物。
8一种含有如权利要求1所述的核酸序列或如权利要求6所述的核酸构建体的载体。
9如权利要求8所述的一种载体，它是线状或环状DNA，噬菌体，病毒，转座子，插入序列元件，噬菌粒，粘粒或质粒。
10含有至少一种如权利要求1所述的核酸序列，至少一种如 6所述的核酸构建体，或者至少一种如权利要求8所述的载体的生物体。
11如权利要求10所述的生物体，它是真核生物体。
12如权利要求10或11所述的生物体，它是植物，真核微生物或动物。
13如权利要求10至12中任一项所述的生物体，它是植物，真菌或酵母菌。
14如权利要求10至13中任一项所述的生物体，它是Yarrowialypolytica，酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)，Traustochytrium，鼠耳芥(Arabidops is thaliana)，Brassica napus或者亚麻(Liniumusitatissimus)。
15含有如权利要求1所述的核酸序列或如权利要求6所述的核酸构建体的转基因植物。
16一种将有关脂类和脂肪酸生物合成的蛋白靶向进入脂质体或脂质小体的方法，包括蛋白-编码核酸和如下序列中的一个序列组合，得到一种联合蛋白-编码序列a)具有如SEQ ID NO1所示序列的核酸序列，b)从如SEQ ID NO1所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列，c)如SEQ ID NO1所示序列的衍生序列，它编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，并且在氨基酸水平上具有至少60％的同源性，d)具有如SEQ ID NO3所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的核酸序列，并且将获得的序列引入真核生物体。
17一种将有关脂类和脂肪酸生物合成的蛋白靶向进入脂质体或脂质小体的方法，包括将至少一种如权利要求1所述的核酸序列或至少一种如权利要求6所述的核酸构建体引入产油生物体。
18生产脂肪酸或脂类的一种方法，包括将至少一种如权利要求1所述的核酸序列或至少一种如权利要求6所述的核酸构建体引入产油生物体，培养此生物体，并分离出包含在此生物体中的油类。
19一种生产脂肪酸的方法，包括将至少一种如权利要求1所述的核酸序列或至少一种如权利要求6所述的核酸构建体引入产油生物体，培养该生物体，分离出包含在该生物体中的油类，并释放出脂肪酸。
20如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中生物体是植物或真核微生物。
全文摘要
本发明涉及编码一种多肽的分离的核酸序列,它是由脂肪酸或脂类代谢的生物合成核酸序列与下列核酸中的一种核酸序列联合组成:a)具有如SEQ ID NO:1所示序列的核酸序列,b)从如SEQ ID NO:1所示序列中通过遗传密码子的简并衍生出的核酸序列,c)如SEQ ID NO:1所示序列的衍生序列,它编码具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽,并且在氨基酸水平上具有至少60%的同源性,d)具有如SEQ IDNO:3所示序列或者具有此序列编码区的氨基末端部分的一种核酸序列。
文档编号C12R1/865GK1382217SQ00814596
公开日2002年11月27日 申请日期2000年10月10日 优先权日1999年10月21日
发明者H·金德勒, C·迈, I·福斯纳 申请人:巴斯福股份公司