专利名称：显示广谱病原体抗性的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及经过遗传工程改造的表达属于杀菌肽-蜂毒素(mellitin)杂合体家族的一个或多个肽的植物。发明背景植物中的疾病
植物是各种感染性疾病(数以千计)的受体，这些疾病是由大量植物致病性真菌、细菌、病毒和线虫引起的，这些病原体例如由于感染了生长中的植物和破坏已收获的作物而导致世界范围内庄稼损失惨重。为减少由这些病原体所引起的损失，应用最广泛的方法包括利用能够杀死或降低各个病原体作用的各种化学试剂。不幸的是，许多植物病原体具有了对这些化学品的抗性，并且，一些植物病原体(特别是病毒)对用化学方法控制是不敏感的。另外，利用的许多化学试剂是广谱毒素，可以引起严重的环境破坏，和毒害人及动物。
为对付植物病原体已经利用了植物育种，并且最近还采用了遗传工程技术。在某些情况中，育种家和分子生物学家已经在植物中成功地改造了对一些病原体的抗性。在过去的几年中，已经从植物中分离了许多植物R(抗性)基因。当导入敏感作物中时，这些R基因产生对一些病原体的增强的抗性。例如，美国专利5,571,706公开了对烟草花叶病毒给予增强抗性的烟草N基因的分离。但是，虽然目前报道的常规育种和遗传工程方法可以成功地在植物中增强病原体抗性，但这些途径通常论述的只是一个靶病原体引起的问题，或少量密切相关的病原体引起的问题。结果是，当利用这些方法产生的作物对靶病原体可能已增强保护时，传统的化学试剂仍然必须用于控制其它病原体。抗微生物的肽
在过去的二十年中，已经发现具有大范围的抗微生物活性的大量天然多肽(“肽”)(综述参见，Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998；Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994，和Nicholas和Mor，Ann.Rev.Microbiol.，49277-304，1995)。植物和动物的内源抗微生物肽通常由12-45个氨基酸组成，并且是在生理pH时具有静正电荷(阳离子)的两亲性分子。虽然阳离子抗微生物肽(CAPs)在结构上是多种多样的，但他们主要有两大类结构螺旋肽，如杀菌肽和爪澹(虫詹)抗菌肽，和分子内二硫键稳定的片层(折叠)肽，如防卫素，protegrins，和tachyplesins。Hancock和Lehrer，TrendsBiotechnol.，1622-28，1998；Zasloff，Curr.Opin.Immunol.，43-7，1992；Cociancich等，Biochem.J.，300567-575，1994；和Piers和Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994。天然CAP在各自的生物活性范围变化很大，包括杀死细菌(革兰氏阳性和阴性)、真菌和原生动物，甚至病毒。CAP通常在0.25g/mL到4g/mL的浓度范围内体外杀死敏感微生物(Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998)，面对常规抗生素效率下降的情况下，提供了令人激动的可能性。另外，在植物中表达CAP可以引入对植物致病性微生物广谱抗性。Jaynes，Plant Science，8943-53，1993；和Misra和Zhang，Plant Physiol.，106977-981，1994。
昆虫杀菌肽代表了在昆虫免疫应答中形成重要组分的小的高度碱性的□螺旋抗微生物肽的家族。Bohman和Hultmark，Annu.Rev.Microbiol.，41103-126，1987。从大的蚕蛾中分离的杀菌肽Hyalophoraceropia约含有具有两亲性N末端和亲水的C末端的35个氨基酸残基(van Hofsten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822240-2243，1985)。所有杀菌肽在体外是有潜力的抗菌剂，并且这一家族的几个成员在体外抗许多植物致病性细菌特别强烈。Hultmark等，Eur.J.Biochem.127207-217，1982；Jaynes等，BioEssays，6263-270，1987；和Nordeen等，Plant Sci，82101-107，1992。
另一个抗菌肽蜂毒素(mellitin)含有26个氨基酸，是蜂毒的主要成分。与杀菌肽相反，蜂毒素具有明显的有两亲性C末端的疏水N末端。Habermann，Science，177314-322，1972。虽然蜂毒素具有强有力的抗微生物活性，但它的强力溶血活性(Tosteson等，J.Membr.Biol.8735-44，1985)使它不适用于治疗用途，可能不是好的转基因学的候选物。
从上面可见，存在着对具有比普通病原体，包括细菌和真菌病原体更广谱的增强抗性的植物需求。发明概要
本发明人已经发现，在转基因植物中表达一些阳离子抗微生物肽(CAP)给予了对普通病原体更广谱的抗性，包括对真菌和细菌病原体的增强的抗性。另外，本发明人已经发现这样的CAP可以通过在N末端或C末端(末端延伸)添加氨基酸残基来修饰，使CAP与植物生理更相容。实验对象CAP是与属于杀菌肽-蜂毒素(CEMA)的杂合体家族的小的带正电的(阳离子)肽相关的，其含有部分天然存在的肽杀菌肽A和蜂毒素。Piers和Hancock，Mol.Microbiol.，12951-958，1994；和Hancock和Lehrer，Trends Biotechnol.，1622-28，1998。
本发明所述的转基因植物可以用于常规的农业用途，如粮食作物。或者如下所述，可以收获植物，并加工提取表达的CEMA，或与CEMA相关的肽，如ECEMA。在这些方法中，可以将分离的肽用于医药用途。另外，这些植物可以直接或间接用作食物添加的药物植物，以对抗动物如人中的微生物感染。
所以，本发明包括表达至少一个CEMA和/或至少一个与CEMA相关肽的转基因植物和生产这些植物的方法。这些植物的各部分，包括种子、果实、茎、叶和根通常可以用作食物来源，或用作CEMA和/或CEMA相关肽的来源。因为所有植物类型对一个或多个植物病原体是敏感的，本发明可以用于各种植物任意类型中产生广谱抗性。所以，本发明可以用于单子叶、双子叶和裸子植物，包括，但不限于玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、豆、油菜/卡诺拉(canola)、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、白菜、棉花、亚麻、花生和三叶草；蔬菜如莴苣、西红柿、葫芦、木薯、土豆、胡萝卜、小萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、椰菜、花茎甘蓝、汤菜和椒；树果实如柠檬、苹果、梨、桃、杏和胡桃；和花如兰花、康乃馨和玫瑰；咖啡；可可豆；针叶树如花旗松(Douglas fir)、云杉和松；和木本落叶树如白杨和榆木。
本发明的一个方面提供了表达一个或多个CEMA肽和/或一个或多个CEMA相关肽的转基因植物。可以利用的CEMA肽的例子包括但不限于Hancock等，美国专利5,707,855所述的CEMA肽。
本发明的另一方面提供了修饰后含有其它氨基酸的CEMA相关肽，从而形式“融合”肽。转基因植物中融合肽的表达可以提供比这些植物中CEMA的表达更有效的广谱病原体抗性，或可以增强表达的CEMA相关肽的稳定性，以便提供更高的表达水平。所以，加强了从植物组织中纯化该肽。在其它实施方案中，本发明提供了表达融合肽的转基因植物，包括
(1)CEMA相关肽的第一个肽序列；和
(2)与第一个肽序列可操作连接的第二个肽序列。
第二个肽序列通常但不一定与第一个肽序列的氨基(N-)端连接。
在有些实施方案中，第二个肽序列含有阴离子(带负电荷)“原区”(Pro-region)肽序列。这样的原区序列的作用是中和CEMA或CEMA相关肽的阳离子特性，并因此可以在细胞环境中提供增强的稳定性，或降低CEMA或CEMA相关肽对宿主生物体的毒性。因此，原区通常包括大量的带负电的氨基酸，如谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。例如，适当的原区通常是在天然存在的未加工的(全长)dermaseptin和temporin肽中发现的。也可以从其它肽，包括哺乳动物起源的肽中获得阴离子原区，如羊cathelin蛋白质的原区。包括这样的原区的融合肽可以表示为P-C。
原区肽可以直接与CEMA或CEMA相关肽的N末端连接。但是，原区和阳离子肽也可以用间隔肽连接。连接两个肽区的间隔肽的用途是本领域熟知。适当的间隔肽通常是2到25个氨基酸长，并且提供了柔性铰合部，连接第一个肽序列和第二个肽序列。已经用于提供连接两个肽序列的柔性铰合部的间隔序列包括文献Chaudhary等，Nature，339394-397，1989所述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔区(GGGGSx3)。
本发明也提供含有N端延伸的CEMA相关肽。一个这样的肽是ECEMA(SEQ ID NO4)。这样的N端延伸的作用是降低或增加CEMA肽的抗微生物效果，所以使肽与植物生理更相容(指植物可以与它的非转基因植物相对等的方式生长和繁茂)。N端延伸可能的作用是提供间隔肽功能。含有原区肽、间隔肽和CEMA肽的融合肽可以表示为P-S-C，其中S表示间隔肽。
间隔序列也可以包括切割位点，如蛋白酶识别和裂解的肽序列。切割位点使得在从植物组织纯化CEMA肽后有助于从CEMA肽中除去原区。
最后，本发明也提供了保存期和储藏期增长的植物。将本发明的转基因植物和对照非转化植物比较，可以观察到保存期增长。对于水果和蔬菜的长期储藏以及切花和药用植物的保存，特别需要增长保存期。本发明的这些和其它方面在下面进一步详细叙述。序列表
附加的序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用标准的核苷酸碱基的字母缩写和氨基酸的三字母密码表示的。每个核酸序列只表示了一条链，但应当理解，互补链通过参考所显示的链也包括在内。
SEQ ID NO1是编码CEMA的核酸序列。
SEQ ID N2是CEMA肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是编码ECEMA肽的核酸序列。
SEQ ID NO4是ECEMA肽代表性的氨基酸序列。
SEQ ID NO5-7是各种N端延伸序列的各个氨基酸序列。
SEQ ID NO8是temporin G原区的氨基酸序列。
SEQ ID NO9和10是用于扩增ECEMA编码序列各自的PCR核苷酸引物。
SEQ ID NO11是用于ECEMA肽的N端延伸序列。附图的简要说明
图1A和1B表示了ECEMA的结构和表达构建体。
图1A表示了阳离子肽CEMA和N端延伸版本ECEMA的氨基酸序列。
图1B表示了ECEMA的pSAI4质粒表达载体。图中的缩写如下RB，Ti质粒的右边的边缘区，LB，Ti质粒左边的边缘区，NOS-pro，启动子，和NOS-ter，胭脂碱合酶基因的终止子；NPT II，新霉素磷酸转移酶II；2×35S，双倍增强子CaMV 35S启动子；AMV，来自苜蓿花叶病毒RNA4的引导序列；ECEMA，ECEMA的蛋白质编码序列。
图2A-2D包括各个凝胶的数码图象，表示ECEMA基因整合和mRNA表达。图2A表示了从对照(非转化)和转基因Russet Burbank土豆植物分离的总基因组DNA的PCR扩增的结果。PCR引物与pSAI4构建中利用的相同。道1，来自质粒pSAI4的PCR产物(阳性对照)；道2-4，从pSAI4转化的Russet Burbank分离的基因组DNA得到的PCR产物；道5，从对照Russet Burbank分离的基因组DNA得到的PCR产物；道6，无模板的PCR(阴性对照)；道7，分子大小标准(□X174RFDNA/HaeIII)。图2B表示了含有ECEMA mRNA表达产物的凝胶的数码图象，所述mRNA来自对照和转基因Russet Burbank的总RNA通过RT-PCR测试。PCR的引物与pSAI4构建中利用的相同。道1，从对照Russet Burbank分离的RNA的PCR产物，没有逆转录；道2-4，从转基因Russet Burbank分离的RNA的PCR产物，没有逆转录(质控)；道5，来自对照Russet Burbank的RT-PCR产物；道6-8，来自转基因Russet Burbank的RT-PCR产物。图2C表示了从对照(非转化)和转基因Desiree土豆植物分离的总基因组DNA径PCR扩增的ECEMA编码序列的数码图象。PCR引物与pSAI4构建中的相同。道1，无模板的PCR(阴性对照)；道2，从非转化的Desiree分离的基因组DNA的PCR产物；道3，质粒pSAI4的PCR产物(阳性对照)；道4-11，从用pSAI4转化的Desiree分离的基因组DNA的PCR产物；道12，代表100，200，300个碱基的100碱基梯度(Parmacia)带。图2D表示了从ECEMA mRNA表达试验结果的数码图象。利用从对照和转基因Desiree分离的总RNA的RT-PCR进行这些实验。PCR的引物与pSAI4构建中利用的相同。道1，从对照Desiree分离的RNA的PCR产物，没有逆转录；道2-5，从转基因Desiree分离的RNA的PCR产物，没有逆转录(质控)；道6，来自对照Desiree的RT-PCR产物；道7-10，来自转基因Desiree的RT-PCR产物；道11，来自质粒pSAI4的PCR产物(阳性对照)；道12，代表100，200和300碱基的100碱基阶梯(Parmacia)带。
图3A-3F包括数码图象，表示转基因土豆植物和块茎的形态学特征。在转移到温室的土壤中后，将Desiree对照(图3A)和ECEMA转基因植物(图3B)拍照。来自对照(图3，CI)和转基因(图3，CII，III，IV，V)植物的块茎在收获后拍照。在转移到土壤后，将RussetBurbank对照(图3D)和ECEMA转基因植物(图3E)拍照。在收获后，将来自对照(图3，FI)和转基因(图3，FII，III，IV)的植物的块茎拍照。
图4A和图4B表示转基因土豆对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的抗性。图4A是表达ECEMA的转基因Desiree土豆块茎的软腐抗性研究的结果。用胡萝卜软腐欧文氏菌感染从对照(C)和转基因植物ME1、ME2和ME3的块茎中所制备的复盘。室温6天后，从复盘中轻轻除去软腐的组织，并将对胡萝卜软腐欧文氏菌的敏感度/抗性表示为块茎组织的重量损失。图4B描述从离子交换层析得到的级分对胡萝卜软腐欧文氏菌的杀菌效果。下面叙述了蛋白质分离技术。S加到柱上的过滤上清液；FT穿透E11-E13用0.2M NaCl洗脱得到的级分；E21-E23用0.3M NaCl洗脱得到的级分；E31-E33用0.5M NaCl洗脱得到的级分。各种级分中的蛋白用Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离并银染。级分E22、E23和E31含有与对照相同的能迁移到凝胶中相对位置的带(对照是200ng化学合成ECEMA蛋白质(3.8kDa))。正如预期，级分E22、E23和E31显示了最高的杀菌活性水平。
图5A-5C中的数码图象表示在用蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)(US-8分离物)感染后的转基因对照植物(2×35S GUS；图5A)，对照非转基因植物(图5B)和表达ECEMA的植物(2×35SECEMA；图5C)。
图6A-6D是受到真菌病原体仙人掌疫霉(Phytophthora cactorum)攻击的各个转基因土豆植株的数码图象。在MS培养基上生根后，用真菌仙人掌疫霉对对照(图6A)Russet Burbank植物和ECEMA转基因(图6B)Russet Burbank植物以及对照(图6C)Desiree植物和ECEMA转基因(图6D)Desiree植物进行攻击。感染后11天(图6A和6B)或19天(图6C和6D)拍照。对照植物严重感染，而转基因植物仍然是绿色并生长。
图7A-7D是受到真菌病原体茄病镰孢(Fusarium solani)攻击的各个转基因土豆植株的数码图象。在MS培养基上生根后，用茄病镰孢对对照(图7A)Russet Burbank植物和ECEM转基因(图7B)RussetBurbank植物以及对照(图7C)Desiree植物和ECEMA转基因(图7D)Desiree植物进行攻击。感染后11天(图7A和7B)或19天(图7C和7D)拍照。对照植物严重感染，而转基因植物仍然是绿色并生长。本发明的详细说明I.定义
除非特别说明，根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可在下列工具书中找到Lewin，Genes VII，OxfordUniversity Press，1999(ISBN 0-19-879276-X)；Kendrew等，TheEncyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers(主编)，Molecular Biology and Biotechnologya Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
“CEMA和CEMA-相关肽。”短语“CEMA和CEMA相关肽”指CEMA肽，其含有杀菌肽AN端的8个氨基酸和在C端修饰的蜂毒素序列(Hancock等，美国专利5,707,855)，以及指如上所述的CEMA肽的变体。CEMA肽的变体可以含有与CEMA氨基酸序列(SEQ IDNO1)可操作连接的其它氨基酸序列或CEMA氨基酸序列的片段。其它氨基酸序列可以是如下所述的原区、间隔序列、N端延伸或C端延伸。CEMA变体也可以含有如下所述的一个或多个保守氨基酸取代。然而，本发明所包含的CEMA和CEMA相关肽特征是在植物各个肽表达后，至少部分给予疾病抗性的能力，而基本上不影响植物的生长和健康。如本文所述，当与非转基因植物比较时，一些转基因植物可能显示了各种形态学上的差异。但是，这些植物将保持对广谱病原体的抗性，并且能够生长。
CEMA相关肽的例子是命名为“ECEMA”的肽(SEQ ID NO4)。ECEMA由34个氨基酸组成，包括来自杀菌肽A的8个氨基酸和来自蜂毒素的16个氨基酸，并在N端(6个残基)和C端(4个残基)有延伸。6个氨基酸的N端延伸含有序列MALEHM(SEQ ID NO11)。
除了利用如上所述的CEMA和CEMA相关肽外，本领域普通技术人员明白利用与天然存在的抗菌肽有些变化的肽可实施本发明，而在植物中表达时所述肽仍然给予增强的广谱病原体抗性。
“CEMA和CEMA相关肽生物活性。”短语“CEMA和CEMA相关肽生物活性”指CEMA或CEMA相关肽如ECEMA抑制细菌生长和/或真菌生长的能力。利用下面给出的方案可以容易地确定CEMA和CEMA相关肽生物活性。
通过确定肽抑制果胶分解菌株如胡萝卜软腐欧文氏菌或者甚至是大肠杆菌DH5的生长能力可以方便地评估给定的CEMA和/或CEMA相关肽的抗菌活性。用Luria-Bertaini(LB)培养基系列稀释该肽，并将100-L所得效价的等份试样加入到96孔的微滴平板的孔中可以测定给定肽的活性。然后使新鲜细菌培养物(～0.3A550)在LB培养基(1％w/v胰蛋白胨和0.5％w/v酵母粉)上生长，并且用LB稀释到10-2，以表示约104-105菌落形成单位(CFU)mL-1。然后在含有肽的每个孔中接种10L细菌培养物，并将样品在37C温育4小时。然后用LB稀释孔中的内容物，铺在LB琼脂板上，适当温度下温育过夜。每个平板上生长的细菌菌落数与CEMA和/或CEMA相关肽的各个稀释液相对应(对照平板中没有加入肽)。将菌落计数，通过比较对照平板测定受检肽的抗菌活性。
如果在该试验条件下，浓度7g/mL的肽至少能够抑制10％(比较对照)的细菌生长(即在这一浓度下，细菌菌落数没超过对照平板的90％)，则确定CEMA或CEMA相关肽具有生物活性。
利用真菌菌株仙人掌疫霉、蔓延疫霉和/或茄病镰孢可以评估给定的CEMA或CEMA相关肽的抗真菌活性。将选定的真菌菌株在含有20gL-1的五谷婴儿食品“速溶”麦片和8gL-1琼脂的五谷琼脂(FCA)培养基上生长(Terras等，Plant Cell 7573-588，1995)。室温生长5天后，去除菌丝体孢塞并倒置于新鲜FCA平板的中央。然后在距离平板边缘3厘米的孔中接入测试肽的无菌溶液(10∶1)，并在同一平板上建立含有无菌水的对照孔。在同一平板或其它平板上可以测试各种浓度的试验肽。室温温育分析平板5天，然后测量各个孔周围的生长抑制圈。
如果在该分析条件下，与对照比较，在高达10μg/mL的浓度下能够抑制真菌生长(即在含有这一浓度肽的孔周围具有明显的抑制真菌生长圈)，则确定CEMA或CEMA相关肽具有生物活性。
“末端延伸。”如本文所用，术语“末端延伸”指在肽的N端或C端添加的序列，如SEQ ID NO5-7和11所示的那些。例如，序列MALEHM叙述了一个N端延伸(SEQ ID NO11)，它加在阳离子肽如CEMA(SEQ ID NO2)的N端。在下面的讨论中，当提及的是N端延伸时，应该理解指的是N-或C-端延伸。
N端延伸的特征是它们能够调节阳离子肽的抗微生物活性，即增强或降低抗微生物的活性。本发明内容提供了能用于测试延伸的阳离子肽抗微生物活性的分析方法。如果与非延伸肽比较，N端延伸增强或降低肽的抗微生物活性，那么就发现N端延伸调节阳离子肽的抗微生物活性。然而，例如通过改变给定肽的抗微生物活性，与肽的非延伸肽比较至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，将发现一些N端延伸基本上改变了抗微生物活性。
例如，利用下面所述的抗菌分析，CEMA(SEQ ID NO2)在4.5μg/mL时杀死了50％的细菌细胞(大肠杆菌)，而ECEMA(SEQ IDNO4)在36μg/mL时杀死了50％的细菌细胞(大肠杆菌)。所以，ECEMA(SEQ ID NO4)比CEMA(SEQ ID NO2)毒性小8-10倍。相类似，当对胡萝卜软腐欧文氏菌测试时，ECEMA比CEMA(SEQ IDNO2)毒性小15-20倍。
除了他们的活性特征外，N端延伸的特征是长度。通常N端延伸长度不超过25个氨基酸残基，实际在许多情况下，N端延伸长度不超过20、15、10或5个氨基酸。特定延伸的长度将部分依赖于所需的抗微生物活性的水平，本文所述的抗真菌和抗细菌分析能用于分析N端延伸的阳离子肽。
“转基因植物。”如本文所用，“转基因植物”指含有同种野生型植物中通常未发现的重组遗传物质(“转基因”)的植物。所以，从借助转化导入重组DNA的植物细胞生长成的植物就是转基因植物，含有导入转基因植物的所有子代(不管是有性或无性产生的)同样是转基因植物。“转基因植物”也指转基因保留在质体中的植物，如叶绿体、造粉体、黄化质体、色质体等等。这样的质体丰富且母系遗传。
“阳离子肽。”术语“阳离子肽”指长度约5到约50个氨基酸，优选长度约15到约35个氨基酸的氨基酸序列。如果肽具有足够的正电荷氨基酸，并且其pKa大于9.0，那么这个肽就是“阳离子的”。通常，至少四个阳离子肽的氨基酸残基可以是带正电荷的，例如赖氨酸或精氨酸。“正电荷”是指pH7.0时具有净正电荷的氨基酸残基的侧链。可以根据本发明重组产生的天然存在的阳离子肽的例子包括防卫素、爪澹抗菌素、melittin和杀菌肽、dermaseptins、temporins和其类似物。
“序列同一性。”将两个核酸序列或两个氨基酸序列间的相似性按照序列间共享的序列同一性水平来表示。序列同一性通常依据同一性百分数表示；百分数越高，两个序列越相似。
为比较目的，序列比对的方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法在下面的文献中有叙述Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；Higgins和Sharp，Gene 73237-244，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5151-153，1989；Corpet等，Nucleic Acid Research 1610881-10890，1988；Huang等，Computer Application in the Biosciences 8155-165，1992；和Pearson等，Methods in Molecular Biology 24307-331，1994。文献Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410，1990提呈了一个序列比对方法和同源性计算的详细论述。
为了与序列分析程序BLASTP、BLSATN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX结合使用，可以从几个来源，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网获得NCBI基本局部比对检索工具(BLASTTM，Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410，1990)。BLASTTM可以在互联网上存取。
为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，利用系统设定参数的默认BLOSUM62距阵，使用BLASTTM程序中的“Blast 2序列”函数，(间隙存在值(gap existence cost)11，每个残基间隙值(gap cost)1)。当比对短肽时(少于约30个氨基酸)，应该利用Blast 2序列函数，利用系统设定参数的PAM30距阵进行比对(开放间隙9，延伸间隙1罚分(penalties))。甚至与参考序列具有更大相似性的蛋白质，当用这一方法评估时，将显示增加的百分比同一性，如至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性。
“重组。”“重组”核酸是一个核酸，具有非天然存在的序列，或具有通过人工组合两个分离的更短的序列而制成的序列。这种人工组合通常是通过化学合成，或更常见是通过人工操作分离的核酸区段，例如通过遗传工程技术来完成的。
“寡核苷酸(“寡”)。”“寡核苷酸”是指长度多达约100个核苷酸碱基的线性聚核苷酸序列。
“探针和引物。”核酸探针和引物可以容易地根据本发明提供的核酸序列来制备。“探针”包括附着在可检测标记或报道分子上的分离的核酸序列。典型的标记包括放射性同位素、配体、化学荧光试剂和酶。标记的方法和选择适于各种目的的标记的指南在下面文献中有讨论，例如，Sambrook等(主编)，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989；和Ausubel等(主编)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(with periodic updates)，1987。
“引物”是短核酸，优选DNA寡核苷酸长度为15个核苷酸或更多，其通过退火与互补靶DNA链核酸杂交形成引物和靶DNA链间的杂合体，然后借助DNA聚合酶沿靶DNA链延伸。引物对例如通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他核酸扩增方法能用于扩增核酸序列。
如提示，探针和引物长度优选为15个核苷酸或更多，但为增强特异性，可优选20或更多个核苷酸的探针和引物。
探针和引物制备和使用的方法在下列文献中描述，例如Sambrook等(主编)，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausubel等(主编)，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(with periodic updates)，1987；和Innis等，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic PressSan Diego，1990。PCR引物对例如可以利用针对此目的的计算机程序如PrimerTM(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)从已知序列中派生出来。本领域技术人员将意识到特定探针或引物的特异性随着探针或引物的长度而增加。例如，含有20个连续核苷酸的引物退火至靶上将可以与比只有15个核苷酸的对应引物具有更高的特异性。所以，为了获得更大的特异性，可以选择含有例如10、20、25、30、35、40、50或更多的连续核苷酸的探针和引物。
“分离。”“分离”的生物组分(如核酸或蛋白质或细胞器)已经基本上与生物体细胞中的其它生物组分分离或纯化，其中该组分是天然存在的，即其它染色体和染色体外的DNA和RNA，蛋白质和细胞器。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语也包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸。
“载体。”“载体”是导入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以含有一个或多个核酸序列，如复制起点，允许载体在宿主细胞中复制。载体也可以含有一个或多个可选择的标记基因和本领域已知的其它遗传因子。
“可操作连接。”当第一个核酸序列与第二个核酸序列无论何时存在功能性关系，第一个核酸序列与第二个核酸序列“可操作连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，启动子即与编码序列可操作连接。一般而言，可操作连接的DNA序列是相邻的，并且如需要可在同一读码框中连接两个蛋白质编码区。两个肽序列可以通过正常的肽键，或通过其它共价键可操作连接。
“转化。”“转化”细胞是已经通过分子生物学技术导入核酸分子的细胞。如本文所用，术语“转化”包括可以将核酸分子导入这种细胞的所有技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化、用叶绿体载体转化进入叶绿体，和通过电穿孔、脂转染、微注射和粒子枪加速导入裸DNA。选择CEMA肽a.CEMA和/或CEMA相关肽
上面提供了举例的CEMA和CEMA相关肽(ECEMA)的列表。通过简单应用肽序列的遗传密码可以派生编码CEMA和ECEMA肽的核酸分子。例如，在SEQ ID NO1中提供了CEMA肽的氨基酸序列，SEQ ID NO4中表示了编码ECEMA的氨基酸序列。
本领域普通技术人员将意识到各种CEMA和ECEMA肽显示不同程度的抗微生物活性，一些能够比其他类别更有效地抵抗某些病原体。所以当选择生产具有增强的病原体抗性的转基因植物的肽时，选择特定的CEMA相关肽将依赖于，在其他因子中，肽表达的植物类型以及常见的感染该植物类型的病原体类型。
在选择了待表达所需的CEMA肽或CEMA相关肽后，可以通过标准分子生物学技术生产编码该肽的核酸分子。因为CEMA和CEMA相关肽相对短，合成核酸分子的简单方法是通过在购买的寡核苷酸合成仪上合成重叠的寡核苷酸。然后，将寡核苷酸在体外合成全长的编码区。这一途径也允许选择编码特定氨基酸残基的密码子，所述密码子反映了待导入核酸分子的植物偏爱使用的密码子，从而增强表达效率。利用这一途径生产编码序列的详细实施例提供在下面的实施例中。b.加入其它肽序列
也可以在转基因植物中以融合蛋白质的形式表达CEMA和CEMA相关肽。虽然，为了在植物中表达，可以将任何所需的肽与选定的CEMA和/或CEMA相关肽融合，但是含有阴离子原区肽与CEMA或CEMA相关肽的氨基端可操作连接的融合蛋白质的表达将是特别有利的。对于这一目的，可以利用任何阴离子原区肽，包括在天然存在的全长(即未加工)抗微生物肽中发现的阴离子原区。例如，可以将含有temporin G的氨基酸23-46(SEQ ID NO8中所示)用作原区。这样的原区肽作用是中和抗微生物肽的阳离子特性，并因此可以在细胞环境中提供增强的稳定性。为达到此目的，这些原区通常包括大量的带负电的氨基酸，如谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
其它本领域已知天然存在的原区肽的例子包括下面蛋白质的原区肽人嗜中性防卫素蛋白质(Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327-7331，1988)；小牛抗微生物cathelicidin蛋白质BMAP28(Skerlavaj等，J.Biol.Chem.，27128375-28381，1996)；羊抗微生物cathelin蛋白质家族(Mahoney等，FEBS Lett.，377519-522，1995)；小牛indolicidin(Del Sal等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，187467-472，1992)；猪抗微生物肽prophenin-2和PR-39(Zhao等，FEBS Lett.，367130-134，1995)和PMAP-37(Tossi等，Eur.J.Biochem.15941-946，1995)；人抗微生物脂多糖结合蛋白质CAP18(Larrick等，FEBS Lett.，398(1)74-80，1966)；和鼠蛋白质E3(Scott和Collins，Blood，882517-2530，1996)。
由于阴离子原区肽可以直接与阳离子肽的N端连接，备选的实施方案包括利用间隔肽序列将原区肽与CEMA和/或CEMA相关肽连接。利用间隔肽连接两个肽区是本领域熟知的；这样的间隔肽通常是2到25个氨基酸长度，并且提供将第一个肽序列与第二个肽序列连接的柔性铰合部。已经用于提供连接两个肽序列的柔性铰合部的间隔序列包括文献Chaudhary等，Nature 339394-397，1989中所述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔区(GGGGSx3)。或者，如下所述的N端肽延伸可以提供间隔肽功能。间隔序列肽也可以包括切割位点，如蛋白酶如Xa因子所识别和切割的肽序列。这样的位点使得CEMA和/或CEMA相关肽从植物组织中纯化后，有助于再从CEMA和/或CEMA相关肽中除去原区。利用阴离子原区肽和间隔肽在微生物系统中表达一些阳离子肽是本领域已知的，并且在Hancock的美国专利5,707,855中有叙述。
在一些实施方案中，可以在CEMA和/或CEMA相关肽上添加N端延伸肽序列。这些N端肽延伸的作用可能是提供对蛋白酶剪切增强的抗性、增强的转录水平和/或增强或降低肽的抗微生物活性，以致表达的肽在提供适当的抗微生物活性的同时与植物物种的特殊生理相容。尽管也可以利用更长的延伸，但通常这些N端延伸是2到25个氨基酸的长度。一些实施方案中所利用的N端延伸序列的例子包括SEQ ID NO5-7和11中所示的肽序列。在每种情况中，加入N端甲硫氨酸可以保证肽的适当表达。本领域普通技术人员将意识到可以容易地用本文所述的生物活性分析方法评估添加任何特定的N端延伸的效果。
d.变体CEMA和CEMA相关肽
可以将编码CEMA或CEMA相关肽的核酸序列进行操作，从而使它编码变体CEMA或CEMA相关肽。这可以通过各种方法进行，例如通过采用定向位点诱变或聚合酶链式反应(PCR)。或者，因为这些肽是相对短的分子，可以从头简单地合成变体肽的编码区并导入适当的表达载体。
氨基酸序列最简单的修饰包括用一个或多个氨基酸取代具有相似生物化学特性的氨基酸。这些所谓的“保守取代”似乎对得到的肽的活性影响最小。所以，本发明可以利用一个或多个保守氨基酸取代而有差异的肽来代替CEMA和CEMA相关肽，如ECEMA(SEQ IDNO4)。表1表示了在蛋白质中可以取代的各个原始氨基酸，并且被认作保守取代的氨基酸。
表1
通过选择比表1更不保守的取代，即选择对维持下列结构效果区别更明显的残基可以获得主题肽的功能或任何各种其它特征的更基本的变化(a)取代区域中多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构型，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)大块侧链。一般而言，期望在蛋白质特性中产生最大变化的取代是(a)用亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰取代疏水残基，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰，或后面的取代前面的；(b)用半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基，或相反；(c)用具有正电的侧链的残基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰取代负电的侧链，例如谷氨酰或天冬氨酰，或相反；或(d)用具有大块侧链的残基，例如苯丙氨酸取代不具有侧链的残基，例如甘氨酸，或相反。假如保留了CEMA的生物活性，那么具有一个或多个更多基本变化的变体肽也可以用于本发明。
也可以将广泛的氨基酸变化改造成变体CEMA或CEMA肽。但是，如上所述，这样的变体肽的特征通常为与各个天然存在的氨基酸序列在全长比对上具有至少40％的序列同一性，序列同一性的确定利用的是如上所述的任何比对程序。另外，这些变体肽将保留生物活性。
利用如上所述的任何分析系统可以证明变体CEMA肽具有生物活性。在证实了肽具有所需的活性后，利用标准分子生物学技术可以容易地生产编码肽的核酸分子。如果合适，可读框的选择将考虑待表达肽的植物物种偏爱使用的密码子。III.在植物中导入CEMA和CEMA相关肽
在已经生产编码CEMA或CEMA相关肽如ECEMA的核酸序列后，为了给予对植物的病原体抗性，可以利用标准技术来表达转基因植物中的序列。基本途径是将核酸克隆进转化载体，以使得核酸与植物细胞中指导核酸表达的控制序列(例如启动子)可操作连接。然后，通过任何技术(例如电穿孔)在植物细胞中导入转化载体。从细胞中产生了完整的植物，选择含有导入核酸的子代植物。如愿地，所有或部分转化载体稳定地整合进了植物细胞的基因组或细胞器如线粒体和/或叶绿体的基因组中。整合进植物细胞并含有导入序列和控制表达的相关序列(导入“转基因”)的转化载体部分可以称为重组表达盒。
根据改变的表型测定可以选择含有导入转基因的子代。这样的表型可以直接从由导入序列给予的疾病抗性中产生或者由于在转化载体中掺入了显性可选择的标记基因而明显表现出对化学试剂(如抗生素)的增强的抗性。
用克隆的核酸序列转化来修饰植物特征的成功例子在技术和科学文献中有很多。选择的用于说明本技术领域知识的例子包括
美国专利5,571,706(“植物病毒抗性基因和方法”)
美国专利5,677,175(“植物病原体诱导的蛋白质”)
美国专利5,510,471(“用于转化植物的嵌合基因”)
美国专利5,750,386(“病原体抗性转基因植物”)
美国专利5,597,945(经遗传增强疾病抗性的植物“)
美国专利5,589,615(“通过表达修饰的2S储藏白蛋白生产营养价值增高的转基因植物的方法”)
美国专利5,750,871(“白菜物种中的转化和外源基因的表达”)
美国专利5,268,526(“转基因植物中的光敏色素的过量表达”)
美国专利5,780,708(“可育转基因玉米植物”)
美国专利5,538,880(“制备可育转基因玉米植物的方法”)
美国专利5,773,269(“可育转基因燕麦植物”)
美国专利5,736,369(“生产转基因谷类植物的方法”)
美国专利5,610,042(“稳定转化小麦的方法”)
美国专利5,576,198(“植物质体中的转基因构建体的控制表达”)
这些例子包括转化载体选择、转化技术和设计过量表达导入转基因的构建体构建的说明。a.植物类型
各种病原体引起的疾病能够影响许多植物种类。敏感植物包括单子叶、双子叶和裸子植物。所以，例如CEMA和/或CEMA相关的肽可导入的植物物种包括但不限于玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、荚果、油菜/卡诺拉、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、白菜、棉花、烟草、亚麻、花生、三叶草、豇豆和葡萄；蔬菜如莴苣、西红柿、葫芦、木薯、土豆、胡萝卜、小萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、椰菜、花茎甘蓝、汤菜和椒；树果实如柠檬、苹果、梨、桃、杏和胡桃；树如花旗松、火炬松木、白杨和榆木；花如兰花、康乃馨和玫瑰百合；和可可豆、咖啡和橡胶。b.载体的构建和启动子的选择
已经叙述了适于稳定转染植物细胞或适于建立转基因植物的大量重组载体，包括下面文献中叙述的那些Pouwels等，Cloning VectorALaboratory Manual，1987；Weissbach and Weissbach，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，5173-184，1989；和Gelvin等，PlantMolecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990。通常，植物转化载体包括在5’和3’调节序列的转录控制下的一个或多个克隆序列以及包括显性可选择标记。这样的植物转化载体通常也含有启动子调节区(例如，控制可诱导或构成的表达、环境调节的或发育调节的表达或细胞特异或组织特异表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
可以用于表达转基因的构成植物启动子的例子包括椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其能在大多数植物组织中给予构成的、高水平的表达(参见例如，Odel等，Nature 313810，1985；Dekeyser等，Plant Cell，2591，1990；Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220389，1990；和Benfey和Chua，Science 250959-966，1990)；胭脂碱合酶启动子(An等，Plant Physiol.88547，1998)；章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，Plant Cell 1977，1989)；具有翻译增强子序列的2xCaMV/35S启动子(Kay等，Science 2361299-1302，1987)；和叶绿体16S rRNA启动子(Daniell等，Nat.Biotech.16345-348，1998)。
在对环境、激素、化学品和/或发育信号应答中调节的各类植物基因启动子也可以用于植物细胞中转基因的表达，这些启动子包括由一种或多种下面的信号所调节的启动子(a)热(Callis等，Plant Physiol.88965，1988；Ainley等，Plant Mol.Biol.，2213-23，1993；和Gilmartin等，Plant Cell 4839-949，1992)；(b)光(例如豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等，Plant Cell 1471，1989和玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen，Plant Cell 3997，1991)；(c)激素(例如抗坏血酸，Marcotte等，Plant Cell 1471，1989)；(d)创伤(例如土豆PinII启动子，Keil等，Nucl.Acids.Res.145641-5650，1986；农杆菌mas启动子，Langridge等，Bio/Technology 10305-308，1989；和葡萄酒vst1启动子，Weise等，Plant Mol.Biol.26667-677，1994)；和(e)化学品(例如甲基茉莉酸或唾液酸，Gatz等，Plant Mol.Biol.4889-108，1997)。
或者可以将特异于组织(例如根、叶、花和种子)的启动子(Carpenter等，Plant Cell 4557-571，1992；Denis等，Plant Physiol.1011295-1304，1993；Opperman等，Science 263221-223.1993Stockhause等，Plant Cell 9479-489，1997；Roshal等，EMBO J.61155，1987；Schemthaner等，EMBO J.71249，1988；Yamamoto等，PlantCell 3371-382，1990；和Bustos等，Plant Cell 1839-1989)与编码序列融合以获得在各个器官中特异表达。
植物转化载体也可以包括RNA加工信号，例如内含子，其可以定位在转基因中可读框(ORF)序列的上游或下游。另外，表达载体也可以包括来自植物基因的3’未翻译区的其它调节序列，例如可以增强mRNA稳定性的3’终止子区，如土豆的PI-II终止子区域或章鱼氨酸或胭脂碱合酶(NOS)3’终止子区。
最后，如上所述，植物转化载体也可以包括显性可选择标记基因，从而使得容易地选择转化体。这样的基因包括编码抗生素抗性(例如对潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素的抗性)和除草剂抗性(例如膦丝菌素酰基转移酶)的那些基因。c.转化和繁殖技术
单子叶和双子叶植物细胞和细胞器的转化和再生现在已经是常规技术，适当的转化技术将由实验者来确定。方法的选择将根据待转化的植物类型而变化；本领域技术人员将能够识别对于给定植物类型特定方法的适宜性。适当的方法可以包括但不限于电穿孔植物原生质体；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；利用病毒的转化；微注射植物细胞；微发射物轰击植物细胞；真空渗透；农杆菌(AT)介导的转化和叶绿体转化。转化和再生植物的常用方法叙述在本节开头列出的专利文件中。d.选择转化植物
在用转化载体转化和再生植物后，通常利用掺入转化载体的显性可选择标记选择转化植物。通常，这样的标记将给予转化植物的幼苗抗生素抗性，并且转化体的选择可以通过将幼苗与适当浓度的抗生素接触来进行。
选择也可以通过开发经转基因给予植物的病原体抗性而完成。如下面实施例所述，这样筛选可以在转基因植物已经再生后完成，或(根据利用的转基因方法)可以在植物再生之前的绿色转基因愈伤组织上进行。IV.含有多个阳离子肽的编码区的植物
在一些情况中，导入多个拷贝的单阳离子肽基因或编码不同阳离子肽的几个基因可以增强由单个拷贝编码CEMA或CEMA相关肽的转基因所给予的抗性水平。
通过利用遗传工程，在单个载体中导入多个阳离子肽的编码区是可能的。通常(虽然不是必需的)这样的载体含有两个或多个各自与其自身5’-和3’-调节序列可操作连接的CEMA和/或CEMA相关的可读框(ORF)。当导入植物中时，这样的载体可以导致多个阳离子肽种类的表达。
利用标准育种技术还能产生含有多个转基因的植物。在第一个植物中可以导入编码第一个阳离子肽的转基因，并在第二个植物中可以导入编码第二个阳离子肽的第二个转基因。然后，将得到的这两个转基因植物杂交产生携带两个转基因的子代。V.生产和分离CEMA和CEMA相关肽
上述的组成和方法不仅可以用于生产显示增强的广谱病原体抗性的植物，而且为大范围的其它应用可以用于大规模地生产CEMA和CEMA相关肽。例如，可以纯化在植物中大量产生的CEMA和CEMA相关肽，并且用于医药用途。本发明的另一个方面提供生产CEMA和CEMA相关肽的植物，可以用作药用植物而不需要进一步纯化阳离子肽。这样的植物可以用于治疗或预防疾病，如感染性微生物疾病和/或动物如人中的癌症。
植物生产生物活性肽现在已经广泛使用，大量的表达和纯化方法是熟知的。在Goodman等的美国专利4,956,282中可以找到使植物生产生物活性蛋白质更简便的构建体的例子。这些构建体通常含有启动子区和编码后来用于纯化过程的氨基酸序列的其它核酸序列。用于使CEMA和/或CEMA相关肽分离简化的氨基酸序列随后可以切割并丢弃。
通过在细胞内细胞器如叶绿体中转化和表达可以增强植物中生物活性肽的生产。在这些情况中，细胞器的作用可能是增强表达以及包含该肽，从而通过过量表达预防植物毒性。这些细胞器将是高度浓缩的CEMA或CEMA相关肽的来源，从中可以分离肽。VI.具有N端延伸CAP的生产
如本文所述的ECEMA分子是N端延伸的CAP的例子。本领域的技术人员将意识到其它CAP可以修饰成含有N端延伸，并且意识到通过在CAP上添加其他氨基酸残基，CAP的活性得到修饰，并在一些情况下，允许待成功利用的CAP保护植物免遭广谱病原体的感染(其中“广谱抗性表示至少对一种真菌菌株的抗性和至少对一种细菌菌株的抗性)。
所以，本发明提供了在CAP上添加N端延伸和在体外测试延伸CAP所得到的活性的方法。本发明也提供植物中测试这样的N端延伸的CAP的方法。在SEQ ID NO5-7和11中提供了N端延伸的例子。另外，不改变N端延伸的能力可以制备这样的延伸变体，从而使得CAP的表达与植物生理相容，即允许植物生长。变体如上所述可以含有保守的氨基酸的取代、缺失和添加。但是，这些变体N端延伸将保持足够的抗微生物活性，从而在植物表达后上它们可以增强植物对广谱病原体的抗性。VI.给予的抗性
细胞对细胞传输蛋白质的机制还没很好了解。但是，已知从病毒分离各种运动蛋白质有利于蛋白质细胞到细胞的运动(Lucas和Wolf，Current Opinion in Plant Biology 2192-197，1999；和Lazarowitz，CurrentOpinion in Plant Biology 2332-338，1999)。另外，已经发现韧皮液含有许多蛋白质并且这些蛋白质的存在与长距离传递大分子如蛋白质有关(Thompson，Trends in Plant Science 4354-360，1999)。所以可能当将表达CEMA或CEMA相关肽的转基因植物组织嫁接到其它非转基因组织上时，转基因组织将至少给予非转基因部分一些病原体抗性。给予非转基因植物组织病原体抗性在本文中称为“给予抗性”。“给予抗性”可以通过在转基因根茎(下面的植物组织)上嫁接幼芽(上面的植物组织)，或通过在非转基因根茎上嫁接转基因幼芽来建立。这样嫁接产生的植物在本文的下面称为“嵌合植物”。
另外可预料通过将CEMA或CEMA相关蛋白质与病毒运动蛋白质或通常存在于韧皮中的其它蛋白质共表达或可操作连接，能增强非转基因组织的渗透。
利用交叉物种嫁接可以使嫁接方案更灵活。所以，来自例如杏仁(Prumus amygdalus)的嫁接体可以放置在桃(Prumus persica)的根茎上。这种灵活性增大了可利用给定转基因组织的植物范围。例如，在已经产生含有CEMA或CEMA相关肽的杏仁组织后，得到的转基因组织不仅能用作给予其他杏仁树抗性而且能用作给予桃树抗性。
利用给予抗性也降低了依据本发明制备的转基因导入环境的可能性。这是因为抗性是起源于移植体本身的，而植物的其它部分仍然无转基因。所以，植物的果实和种子仍然是非转基因，从而不传导该基因。
通过防止转基因导入植物全身，用于人消费的产品可以由非转基因的植物生产。
另外，如上所述的嵌合植物不一定必须给予非转基因组织病原体抗性。在一些情况下，嵌合植物的转基因部分仅对转基因组织提供所需的病原体抗性。实施例1.选择和产生编码CEMA和CEMA相关肽的核酸序列
设定引物(Oligo#15’-CAAGG AAAAA CGGTC TAGAG CATATGAAAT GGAAA C-3’(SEQ ID NO9)；和Oligo#25’-GAACT CGAGCAGCGA GCTCT TACTT AGTTA GCTTC-3’(SEQ ID NO10))各自在扩增片段的5’端具有XbaI识别位点，和在3’端具有BamHI识别位点。将质粒pR78hproCEMA(R.E.W.Hancock，Vancoucer，B.C.；Piers，等，Antimicrob.Agents Chemother.382311-2316，1994)用作PCR的模板。用NucleoSpinTM柱(CLONTECH，Palo Alto，CA，USA)纯化含有编码ECEMA序列的扩增DNA片段，用XbaI和BamHI消化，并且插入已经用XbaI和BamHI消化的载体(Promega Corp.，Madison，WI，USA)中。得到的载体命名为pSAI1。
切出含有CaMV 35S启动子、GUS基因和NOS-ter序列的pBI121(Clontech)的HindIII-EcoRI片段，用来自pSAI1(含有增强的35S启动子和AMV RNA4翻译增强因子、ECEMA编码序列(SEQ IDNO3)和NOS-ter序列)的HindIII-EcoRI片段替代。得到的载体指定为pSAI4。然后，将编码ECEMA的双链DNA克隆进下述的一个或多个载体。2.含有各种启动子序列的载体
将编码ECEMA和CEMA的核酸序列组装进各种植物转化载体，从而将序列置于各种不同启动子的转录控制下。
将编码ECEMA和CEMA的核酸序列克隆进一个这样的载体，并将各个序列置于含有两个拷贝的CaMV 35S启动子和AMV RNA4翻译增强元件的启动子的控制下。Kay等，Science 2361299-1302，1987。将这样的载体产生的克隆用前缀“pD”命名。所以，例如，pDECEMA命名的是含有在双CaMV 35S启动子和AMV RNA4翻译增强子控制下的ECEMA构建体的载体，pDCEMA命名的是含有在双CaMV 35S启动子和AMV RNA4翻译增强子控制下的CEMA构建体的载体。
构建了另一个载体以使ECEMA编码序列在重建的“超级启动子”的控制下。从这样的载体产生的克隆命名为pRSHECEMA。含有mas(甘露氨酸合酶)启动子/激活子区的超级启动子(Langridge等，Bio/Technology 10305-308，1989)在ocs(章鱼氨酸合酶)上游激活序列的三联体(反向)的前面。文献Ni等，The Plant J.7661-676，1995提供了这个超级启动子更详细的叙述。
将编码CEMA的核酸序列克隆进含有单拷贝的CaMV 35S启动子和来自人嗜中性防卫素蛋白质原区的另一个载体中(Daher等，Pro.Natl.Acad.Sci USA，857327-7331，1988)。得到的载体命名为“pProCEMA”。3.转化土豆和烟草
将土豆作物，“Russet Burbank”和“Desiree”，以及烟草用作转化的代表性植物物种。根据文献De Block，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988，作一些修改进行植物的转化。用文献Holster，等，Mol.Gen.Genet.163181-187，1978所述的冻融方法进行根癌农杆菌LBA4404或MP90的转化。
将转化的农杆菌细胞涂抹于选择培养基上(对LBA4404，LB+100g/mL利福霉素+50g/mL卡那霉素；对MP90，LB+10g/mL庆大霉素+50g/mL卡那霉素)。用质粒分离和限制性酶切分析证明在农杆菌细胞中存在质粒pSAI4。
用文献De Block，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988中所述的修饰的方法进行土豆作物“Desiree”和“Russet Burbank”的转化。从4周龄的幼苗中切掉叶(5毫米直径)和茎，并进一步用无菌吸管尖创伤。将约15个创伤叶和茎倒浮在9厘米直径皮氏培养皿中的15毫升“感染培养基S2”上(Murashige-Skoog(MS)培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962)，培养基中补充了30g/L蔗糖、0.5g/L MES(2-[N-吗啉]乙烷磺酸pH5.5)和20g/L甘露醇)。在皮氏培养皿中加入60L携带质粒pSAI4的农杆菌(在含有适当抗生素的LB上生长到对数后期)。在低光强度(500勒克斯)下温育3天后，用含有1g/L羧苄青霉素的S2培养基洗涤叶子，在无菌滤纸上拍干，倒置于培养基S4上(Murashige-Skoog培养基补充有200mg/L谷氨酸、0.5g/L MES pH5.5、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、5g/L琼脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L萘乙酸(NAA)、1g/L羧苄青霉素、50mg/L卡那霉素和10g/L AgNO3)，在高光强度(3000勒克斯)下室温温育。两个星期后，在叶子和茎的创伤边缘形成了许多小的愈伤组织。将愈伤组织转移到新鲜S6培养基(没有NAA的S4培养基)。另两个星期后，将愈伤组织转移到S8培养基(加0.1mg/mL赤霉素(GA3)的S6培养基)，允许长出新芽。再两个星期后，将第一个新苗(0.5cm长)转移到洋红茄子瓶中的S1培养基上(“B5”培养基，Gamborg等，Exp.Cell Res.50151-158，1968，含有20g/L蔗糖，补充150mg/LCaCl2、4g/L琼脂糖、pH5.8，并含有1g/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素)。通常一个星期后，将苗植根。将再生植物转移到含有1g/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的MS培养基上，并且用于进一步分析。4.筛选对疾病抗性的愈伤组织
对疾病抗性分析的简单早期检测方法已经开发。在S4培养基(没有蔗糖的MS培养基，并补充200mg/L谷氨酸、0.5g/L MES、pH5.7、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、0.5％琼脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L NAA、1g/L羧苄青霉素以及50g/mL卡那霉素，和10mg/L AgNO3)上生长对照和转基因愈伤组织。然后将样品于3000勒克斯光照下室温放置，允许形成愈伤组织。两个星期后，在叶和茎的创伤边缘形成许多小的愈伤组织。取除小的愈伤组织并转移到新鲜的S6培养基(没有NAA的S4)中。2-3个星期后，将愈伤组织转移到新鲜的培养基上并在存在植物病原体(镰刀菌或疫霉)下生长。将存活并保持亮绿的愈伤组织计数。在对照样品中未发现真菌抗性的愈伤组织，并且发现对真菌病原体有抗性的愈伤组织是转化的。5.转基因植物的分子特征
用下述方法，从转基因土豆和烟草植物分离DNA。在一些情况下，纯化包括了更严格的方案；而在其他情况下，进行简单粗提取过程。在更严格的抽提过程中，取10g新鲜叶组织并立即冷冻在液氮中。将冷冻组织研磨成细粉，并用20mL抽提缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液、5mM EDTA、0.35M山梨醇、0.1％BSA、0.1％巯基乙醇、10％聚乙二醇4000)抽提。将匀浆物通过几层干酪包布和一层MiraclothTM(Calbiochem，la Jolla，CA，USA)过滤。然后根据文献Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842097-2100，1987进行最后的纯化步骤。
粗提取方法主要用于制备PCR分析的样品。对这个过程，收集约200mg新鲜叶子，在液氮中研磨成粉末。在粉末中加入100L 0.5NNaOH并混合(涡旋)30秒。离心上清液5分钟，将5升上清液加入到45L 100mM Tris缓冲液(pH8.0)中。将得到的基因组DNA粗提液用作PCR扩增的模板。
检测是否存在ECEMA或CEMA构建体是利用提取的基因组DNA和SEQ ID NO9和10中所示的PCR引物进行PCR反应来实现。根据这一方法，鉴定了用pDECEMA或pRSHECEMA构建体转化的转基因烟草和土豆植物。
在一些情况中，用Northern印迹分析证实转基因的活性表达。用于这种分析的RNA底物从转基因烟草和土豆植物中分离出来并纯化。分离方案按照文献Verwoerd等，Nucl.Acids Res.172362，1989进行。
在一个说明性的实施例中，pDECEMA用于转化土豆作物。用pDECEMA通过根癌农杆菌介导转化两个土豆作物，Russet Burbank和Desiree。在抗生素选择后，再生卡那霉素抗性植株。从非转化(对照)和转基因植物分离的基因组DNA经过PCR扩增ECEMA序列(SEQID NO3)证实了ECEMA(SEQ ID NO4)整合进了植物基因组DNA。扩增的DNA片段的大小与从pDECEMA质粒DNA扩增的片段相同。同样，对于Desiree，转基因植物，在转化植物而不是非转化植物的基因组的PCR产物中检测到了一条带。因此ECEMA(SEQ ID NO4)已经成功地整合进了这些转基因土豆植物的基因组中。
用RT-PCR，在RNA水平检测ECEMA(SEQ ID NO4)的表达。在所有Russet Burbank和Desiree作物的转基因系中证实了有表达，而对照植物中没有出现RNA产物。另外，在PCR之前用脱氧核糖核酸酶处理的RNA样品中没有带证明RNA样品没有被基因组DNA污染(图2)。
将表达ECEMA(SEQ ID NO4)的转基因Desiree植物和块茎的形态学特征与对照非转化植物比较(图3A-3B)。然而当与对照植物比较时，Russet Burbank中ECEMA(SEQ ID NO4)的表达在转基因土豆植物中引起形态学变化。观察到最明显的变化是叶子变得卷曲以及块茎较小和分支。在测试的所有Russet Burbank转基因系中观察到了这一明显的“损伤-模拟”表型。
不论“损伤-模拟”，表达Russet Burbank ECEMA的转基因植物的产量(总块茎质量/植株)与对照的非转化植株的产量相当。
表达ECEMA的Desiree植株的产量(总的块茎质量/植株)(1845g)大于用GUS转化的对照(1544g)和非转化对照(1502g)。
另外，在一系列的对照实验中，用与上面的构建体相似的方式选择表达GUS、花旗松NADPH光敏色素P450还原酶或pProCEMA的转基因植物。这些转基因植物中没有一个显示疾病抗性特征。6.对细菌病原体的抗性
为了检测转基因土豆植物对细菌病原体Erwinia carotovora cvcarotovora的抗性，2mL病原体过夜培养物(LB培养基中室温生长)用无菌蒸馏水稀释5倍。将1mL稀释培养物加入试管中的2mL液体MS培养基中。将从转基因或对照土豆植物上新切下的分枝(4cm长)插入到试管中，把各个分枝的底边浸入细菌培养物中，并在室温下温育。
一星期后结果显示，对照植物严重感染并且生长抑制。随后植物死亡。相反，转基因植物未感染并继续生长，这表明ECEMA的表达增强了土豆植物对这种细菌病原体的抗性。
从表达CEMA和ECEMA的“Desiree”植株(以及对照植株)收获的块茎也被用于块茎-组织对胡萝卜软腐欧文氏菌抗性的测试。对于定性试验，在用无菌木栓穿孔器从块茎制备的复盘(2cm直径，1cm厚)表面上移液20升100x稀释的过夜细菌培养物(大约2×107CFU)。然后室温下将块茎复盘在皮氏培养皿中温育6天。对于定量试验，在每个块茎复盘(2cm直径，3cm厚)中打一小孔。在每个小孔中移入20μ1 100×稀释细菌过夜培养物，并室温温育复盘6天。然后从块茎复盘中轻柔地除去腐烂的组织，测定余下组织的质量。
结果表明，在用2×107CFU的胡萝卜软腐欧文氏菌温育6天后，对照(C；图4A)土豆块茎由于软腐已经丢失了约60％的鲜重。来源于用胡萝卜软腐欧文氏菌感染的转基因Desiree植物(ME1、ME2、ME3 图4A)的块茎复盘的重量的损失小于5％，并且是与未感染的复盘比较的(图4A)。在另一个实验中，来自对照(未转化)的土豆的复盘已经降解了大部分，而来自表达ECEMA的植株的复盘未受影响。在4℃储藏6个月后，来自未转化的土豆的块茎的约1/3自然感染并腐烂，而所有表达ECEMA的转基因株系仍然健康无疾病征兆。7.对真菌的抗性
利用下面的方法测试成熟植株对各种真菌的抗性。切下含有镰孢和疫霉的培养基块(1cm×1cm×0.5cm)，放置于9厘米皮氏培养皿的V8琼脂培养基(250ml/L V8汁，7g/L琼脂)新鲜平板的中央，并在室温下生长约1个月，或直到真菌菌丝体完全覆盖了皮氏培养皿。切下转基因植株的幼苗(约10cm)并转移到MS培养基中进一步生长。根据不同的处理，允许植株生长3天或2星期直到幼苗长根。然后，将两块(1cm×1cm×0.5cm)的真菌琼脂加到植株幼苗的两边，而不损伤幼苗。然后肉眼鉴定得到的感染程度。
在代表性实验中，将用pDECEMA或pProCEMA转化的各个转基因土豆植株(Russet Burbank和Desiree)、用pRSHECEMA、pDECEMA或pProCEMA转化的烟草植株和对照土豆和烟草植株与仙人掌疫霉接触。7天后，在MS培养基表面已经生长了仙人掌疫霉，并且渗入了对照植株的根和茎中，引起致命的植物功能损伤。显然对照植株的根严重损伤。对照植株和真菌的相互作用引起了指示腐败的黄棕色素的分泌。随后，对照植株失去水分，叶子卷曲，各个茎的底边发软，根死亡。相反，转基因植株却健康地生长，未显现疾病症状，甚至在真菌菌丝体完全覆盖了MS培养基后也一样。
在另一个实验中，用茄病镰孢攻击pDCEMA转基因土豆植株和用pProCEMA转化的对照土豆植株。6天后，镰孢生长覆盖了MS培养基的表面。对照植株的根损伤严重。对照植株的茎的基部渗入了镰孢，茎松软，感染的叶子脉明显变棕色并坏死。几天后，对照植株倒下死亡。但是，转基因植株甚至在茄病镰孢极度横行的情况下还继续生长。
用pDECEMA转化的Russet Burbank和Desiree植株和植物病原体真菌茄病镰孢进行相似的一组实验。感染6天后，在MS培养基表面长满了镰孢，并且对照植株的根和茎严重损伤。感染后11天，对照植株死亡，而转基因植株仍然生长正常，无感染的迹象。
ECEMA的表达大大地增强了Russet Burbank和Desiree植株对细菌(欧文氏杆菌)以及真菌(镰孢、疫霉)植物病原体的抗性，这使得ECEMA成为植物抗微生物中非常有前途的工具。虽然没有损伤模拟效果，但这些结果在烟草中已经得到重复。上述方案包括采用高水平的攻击性病原体共培养和以生存作为终点，对疾病抗性高度严格生物分析，而其它方案依赖于较不严格的分析，例如以对损伤形成增强的抗性作为感染性指征(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956531-6536，1999；和Heo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96776-771，1999)。
当整个植株生长在病原体中时，上述的攻击模型更接近地代表野外情况是可能的，在野外土壤和感染植株提供恒定的植物病原体储备。在这方面，本文所述的转基因植株在存在细菌和真菌病原体时已经生长了2个月以上，而仍没有疾病的迹象。进一步，在4C下储藏一年，此法生产的转基因土豆块茎保留了他们的抗微生物特征，并且保持了对欧文氏杆菌软腐的抗性。下面所述的ECEMA的提取也使得估计的ECEMA浓度约为3-4μg/g原始块茎组织，该浓度足以保护块茎不受细菌的攻击。另外，预先的一个月的喂养实验表明来自表达ECEMA的转基因土豆植株的块茎对小鼠是没有毒性的。
在如上述的转基因Russet Burbank土豆的情况下，ECEMA的构成性表达也可以引起与所谓“损伤-模拟”表型相似的形态学变化。植物中外源基因的表达能引发通常只在发病过程中试图去除病原体时所激活的植物-防卫机制的活化，已经观察到这一现象。Mittler等，TrendsMicrobiol.410-15，1996；Abad等，Mol.Plant Microbe Interact.10635-645，1997；和Dempsey等，Trends Microbiol.654-61，1997。但是，在这些前面所报道的观察中，转基因植株显示损伤-模拟应答，但植株未显示广谱的病原体抗性。与本文所报道的数据相反，表达ECEMA的Russet Burbank植株具有高水平的抗微生物活性，即使这些植株具有损伤模拟应答。所以能认为本文公开的在对转基因表达的应答中显示损伤模拟的转基因植株将保留病原体抗性。8.生物活性ECEMA的生产
将10克来自土豆块茎的组织在液氮N2中研磨成精细粉末，并用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(P9599，Sigma)的10mL抽提缓冲液(EB；50mM Bicine-NaOH，pH9.0；1mM EDTA；20mM NaCl；1％TritonX-100)在4C抽提30分钟。将匀浆物12000rpm(BeckmanJ2-21)4C离心30分钟，并将上清液通过0.45μm滤纸过滤以除去微粒物质。将得到的匀浆物加到用EB平衡的阳离子交换柱HiTrapTMSP(0.7×2.5cm；Pharmacia Biotech，Sweden)。在用6个柱体积的含有蛋白酶抑制剂的EB洗涤后，用含有蛋白酶抑制剂的EB中NaCl梯度(0.2M、0.3M和0.5M)洗脱结合的蛋白质和肽。然后在Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析各个组分(Schagger等，Anal.Biochem.166368-379，1987)，并且用于体外抗细菌分析。
利用上述的提取方法，从转基因土豆块茎中证明了ECEMA的存在并部分纯化了ECEMA。进一步，只在含有和ECEMA同样大小肽的那些级分中观察到了杀菌活性(以胡萝卜软腐欧文氏菌作为靶子)(
图1B)。在同龄的对照和非转基因的块茎中完全缺乏肽和杀菌活性。这些结果证明来自转基因植株的块茎含有生物活性ECEMA，其浓度足以在4℃延长储藏过程中保留他们的抗菌特性。9.抵抗后期枯萎(仙人掌疫霉分离株US-8和US-11)的转化植物和块茎
在黑麦琼脂上培养两个仙人掌疫霉菌株(US-11A1和US-8A11)。通过在2升蒸馏水中煮沸120g有机生长的黑麦颗粒制备黑麦琼脂。然后，将水保持沸腾煮到1000-1250mL。接着通过在干酪包布上的干滤器除去颗粒滤干得到的混合物。然后，2000rpm离心收集的上清液5分钟，用蒸馏水将体积加到2升。加入2g葡聚糖和27g BactoAgarTM，高压灭菌培养基(121℃、40分钟)，然后冷却并倾倒。
为了接种植物，用水稀释两个菌株，产生含有5000-10000个孢子囊/mL的后期枯萎孢子囊悬浮液，其在5℃冷冻产生动孢子。将得到的含孢子囊的混合物喷洒在具有已知后期枯萎抗性的5个标准土豆株系和ECEMA转基因Desiree植株。让植物生长在塑料帐篷中，并引入雾促进疾病发生。
在接种后7、14和21天进行叶子比例计算以评估后期枯萎引起的脱叶百分数。结果表明转基因土豆植株(Desiree)比测试的五个对照株系的任何一个更能抵抗后期枯萎(图5)。
进行相似的实验以评估转基因块茎(Desiree)对后期枯萎的抗性。在接种前每个土豆株系洗涤15到20个块茎，以便从块茎表面除去土壤并选择那些没有疾病症状的块茎。对于US-8和US-11的各个表型，将各个土豆株系的重复块茎在后期枯萎孢子囊悬浮液中蘸接种。研究中也包括五个已知有枯萎抗性的土豆株系。在封闭的气候控制室中12℃、95-100％湿度下温育接种的土豆块茎14-21天。结果表明转基因块茎对后期枯萎比测试的五个对照株系中的任何一个都更有抗性。
在多个实施方案和实施例中已经叙述和说明了本发明的原理，本领域的技术人员应该明白本发明可以在排列和细节上作修改而不脱离这些原理。我们要求保护在下面权利要求的精神和保护范围内的所有修改部分。
序列表
序列表<110>维多利亚大学创新和发展公司<120>显示广谱病原体抗性的转基因植物
(Transgenic Plants Exhibiting Resistance to a Spectrum of Pathogen)<130>3055-22/PAR<140><141><150>60/165,249<151>1999-11-12<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码阳离子肽的改造DNA序列<400>1aaatggaaac tgttcaagaa gatcggcatc ggcgccgtgc tgaaactgct gaccaccggt 60ctgccggcgc tgaagctaac taactaa 87<210>2<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述改造的阳离子肽<400>2Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val 1 5 10 15Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu Thr Lys
20 25<210>3<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码ECEMA的核酸序列<400>3atggctctag agcatatgaa atggaaactg ttcaagaaga tcggcatcgg cgccgtgctg 60aaagtgctga ccaccggtct gccggcgctg aagctaacta agtaa 105<210>4<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述改造的阳离子肽<400>4Met Ala Leu Glu His Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile 1 5 10 15Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Lys Leu
20 25 30Thr Lys<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>5Ala Met Trp Lys 1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>6Ala Ser Arg His 1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>7Ala Leu Trp Lys 1<210>8<211>24<212>PRT<213>Rana temporaria<400>8Glu Glu Glu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asp Glu 1 5 10 15Arg Asp Val Gln Val Glu Lys Arg
20<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>9caaggaaaaa cggtctagag catatgaaat ggaaac 36<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>10gaactcgagc agcgagctct tacttagtta gcttc 35<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述N-端延伸<400>11Met Ala Leu Glu His Met 1 权利要求
1.转基因植物，其表达选自CEMA和CEMA相关肽的阳离子肽。
2.转基因植物，其包含重组核酸分子，其中核酸分子编码选自CEMA和CEMA相关肽的肽。
3.根据权利要求2的转基因植物，其中肽包括选自在SEQ IDNO2和SEQ ID NO4中所阐述的氨基酸序列的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的转基因植物，其中肽进一步包括长度少于25个氨基酸的N端肽延伸。
5.根据权利要求3的转基因植物，其中肽进一步包括长度小于25个氨基酸的C端肽延伸。
6.根据权利要求4的转基因植物，其中N端肽选自SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO11。
7.转基因植物，其含有重组核酸分子，其中核酸分子编码具有选自P-C和P-E公式的融合肽，其中C是CEMA肽，E是CEMA相关肽和P是阴离子原区肽。
8.转基因植物，其包含编码具有选自P-S-C和P-S-E公式的融合肽的重组核酸分子，其中C是CEMA肽，E是CEMA相关肽，P是阴离子原区肽和S是间隔肽。
9.转基因植物，其包含编码包括氨基酸序列的肽的核酸分子，所述氨基酸序列选自
(a)SEQ ID NO2和SEQ ID NO4；
(b)与(a)中特定氨基酸序列相差一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和
(c)与(a)中特定氨基酸序列至少共享40％的序列同一性的氨基酸序列，其中肽具有CEMA生物活性。
10.根据权利要求9的转基因植物，其中肽进一步包括与肽的N端可操作连接的阴离子原区肽。
11.根据权利要求9的转基因植物，其中肽进一步包括N端延伸。
12.根据权利要求9的转基因植物，其中肽进一步包括C端延伸。
13.转基因植物，其包含编码包括氨基酸序列的肽的重组核酸分子，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4。
14.根据权利要求1、2、7、8、9和13任一个的转基因植物，其中转基因植物选自土豆、烟草、玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、荚果、油菜/卡诺拉、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、白菜、棉花、亚麻、花生、三叶草、莴苣、西红柿、葫芦、木薯、胡萝卜、小萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、椰菜、花茎甘蓝、汤菜、椒和其它蔬菜；柠檬、苹果、梨、桃、杏和胡桃和其它果树；兰花、康乃馨、玫瑰和其它花；可可豆、咖啡和橡胶树；花旗松、云杉、松和其它针叶树；白杨、榆木和其它落叶树；和草皮和草坪草。
15.根据权利要求14的转基因植物，其中转基因植物是土豆植物。
16.根据权利要求14的转基因植物，其中转基因植物是烟草植物。
17.生成至少一种阳离子肽的方法，该方法包括依据权利要求1、2、7、8、9、13和23的任何一个繁殖至少一种转基因植物，和分离阳离子肽，其中肽是从完整的植物、部分植物或细胞内细胞器分离的。
18.转基因植物，其表达与阳离子肽可操作连接的末端延伸序列。
19.根据权利要求18的转基因植物，其中N端延伸序列包括小于25个氨基酸的残基。
20.根据权利要求19的转基因植物，其中N端延伸选自SEQ IDNO5、6、7和11。
21.生产转基因植物的方法，所述转基因植物给予广谱病原体抗性的末端延伸的阳离子肽并且与植物生理相容，该方法包括
(a)用编码N端延伸的阳离子肽的核酸序列转化植物细胞；
(b)在植物中表达末端延伸的阳离子肽；和
(c)确定表达末端延伸肽的植物对广谱病原体具有抗性。
22.权利要求21的方法，其中N端延伸序列选自SEQ ID NO5、6、7和11。
23.转基因植物，由权利要求21的方法生产。
24.生成至少部分具有增强的保存期或储藏期的植物的方法，该方法包括
(a)根据权利要求1、2、7、8、9、13和23中的任一个种植转基因植物；和
(b)收获至少部分植物，其中收获的植物部分比非转基因对照保持更长时间的无病原体感染。
25.转基因植物部分，其中植物部分选自切花、果实、蔬菜和草。
26.嵌合植物，其包含第一部分和第二部分，其中第一部分含有来自权利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一个的转基因植物的组织，第二部分含有非转基因植物组织。
27.根据权利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一个的转基因植物，其中转基因植物显示与非转基因对应物相比增加的植株产量或植株产物的产量。
28.根据权利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一个的转基因植物，其中转基因植物对仙人掌疫霉导致的晚期枯萎显示抗性。
29.根据权利要求1、2、7、8、9、13和23中任何一个的转基因植物，其中转基因植物对胡萝卜软腐欧文氏菌导致的软腐显示抗性。
全文摘要
公开了表达抗微生物的CEMA和/或与CEMA相关肽的转基因植物。在一些实施方案中,这些植物具有增强的广谱病原体抗性,并且可用作农作物或园艺作物。在其它实施方案中,这些植物用于生产大量的CEMA和/或与CEMA相关的肽。
文档编号C12N15/82GK1390262SQ0081559
公开日2003年1月8日 申请日期2000年7月14日 优先权日1999年11月12日
发明者桑托什·米斯拉, 威廉·D·凯, 米兰·奥苏斯基 申请人:维多利亚大学创新和发展公司