专利名称：用酵母分泌表达重组水蛭素的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的低分子量的单链多肽，在医用水蛭的唾液腺体中合成。研究表明，水蛭素是作用很强的凝血酶特异性抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。对多种具有高凝状态的疾病疗效良好。药理学及临床研究表明，水蛭素能有效地预防和治疗静、动脉血栓的形成及弥散性内血管凝结，是一种很有前途的溶栓药物。但由于医用水蛭来源有限，直接从中大量分离水蛭素供给治疗需要是不可能的。随着分子生物学和基因工程技术的发展，使用基因工程方法合成大量重组水蛭素得以实现。
由于水蛭素分子量较小，且包含多对二硫键，用大肠杆菌进行表达其产量受限制。为了提高重组水蛭素的表达产率，我们用甲醇营养酵母Pichia methanolica来分泌表达重组水蛭素。
本发明的原理是甲醇营养酵母可以高效地表达酵母表达质粒上的外源基因并将表达的外源蛋白分泌至细胞壁外的培养基中。这样的表达产物具天然蛋白结构和生物学活性。
本发明的目的使用甲醇营养酵母高效表达重组水蛭素并使表达产物分泌至培养基中，以产生结构正确、活性高的重组水蛭素产品，提高产率，降低生产成本。
技术方案水蛭素基因人工合成→表达质粒构建→转化Pichiamethanolica→发酵表达→培养液分离→粗产物分离→二步层析纯化→超滤浓缩→除菌过滤→制剂分装→成品冻干。经上述步骤，即可制备得到纯度大于99％，比活性高于6800ATU/mg蛋白的重组水蛭素。
最佳实施例先用化学合成的方法合成全长的水蛭素基因HV2。经DNA序列测定证实其序列正确后，插入酵母表达质粒pMETA。所构建成的表达质粒经酶切分析正确后，转化入甲醇营养酵母，即得到水蛭素的酵母工程菌。该工程菌在酵母培养基中生长、诱导、表达，再将发酵液离心后，取上清液，加入(NH4)2SO4至50-80％饱和度，使分泌的重组水蛭素沉淀下来，将沉淀离心后溶于50mM PB，经S-200分子筛柱层析和DEAE-Sepharose离子交换层析二步层析纯化，即得到纯度＞99％，比活性高于6800ATU/mg的重组水蛭素纯品。
本发明的优点本发明提供了一种用酵母分泌表达具天然结构和生物活性的重组水蛭素的新型工艺方法。它与传统的大肠杆菌表达体系相比具有以下优点①表达产率高②热源性物质减少③培养基简单、价廉④产物具天然结构和生物活性，无需破菌或裂解。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，产率提高，成本降低，较适合于工业化生产重组水蛭素。
权利要求
1.用酵母分泌表达重组水蛭素。其特征在于表达用酵母为甲醇营养酵母Pichia methanolica。
2.如权利要求1所述的重组水蛭素表达工程酵母的构建。其特征在于水蛭素基因插入酵母表达载体如pMETA，B，C，将此表达质粒转化甲醇营养酵母，即构建成重组水蛭素表达工程酵母。
3.如权利要求1所述的重组水蛭素的分泌表达。其特征在于重组水蛭素在酵母中表达后可以有效地分泌至培养基中。
4.重组水蛭素的分离和纯化。其特征在于经过培养液分离、硫酸铵沉淀、分子筛层析、阴离子交换层析等步骤，获得高纯度、高比活的重组水蛭素。
全文摘要
本发明公开了一种用甲醇营养酵母分泌表达重组水蛭素的新型工艺方法。将合成的水蛭素基因放入酵母的表达质粒中,转化酵母后经分泌表达和一系列纯化步骤,可以制备得到高纯度、高比活性的重组水蛭素。
文档编号C12P21/02GK1371994SQ0110780
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者王革 申请人:王革