专利名称：蛙皮抗菌肽衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗菌肽衍生物，具体地说涉及一类有抗菌作用的蛙皮抗菌肽衍生物。
许多生物，如昆虫、微生物、两栖类动物和人类都会产生保卫机体的抗菌肽物质。这些抗菌肽能将细胞膜脂质体穿孔使之失活，并且对原虫类、精子、甚至病毒也有作用，因而被称为超级抗生素。抗菌肽类物质都带有不同数量的正电荷，其抗菌作用的机制在于，它所带的正电荷与细菌细胞壁膜的磷脂质的负电荷相结合，在细胞膜上形成离子通道，扩大通透性，使细菌细胞溶解、死亡，因此其抗菌作用与特异受体的结合无关。
抗菌肽的抗菌范围很广，对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、好氧菌以及厌氧菌都有抑制作用，并且与抗菌素不同，不产生抗药性，即使对多种抗菌素产生抗药性的细菌也可被抑制。另外，抗菌肽也可以抑制原虫和病毒。抗菌肽的代谢产物为氨基酸，因此对宿主细胞的毒性低。综上所述抗菌肽是一类有广阔的抗菌药用前景的化合物。
蛙皮抗菌肽Magainin是一类天然的从蛙皮中提取的有抗菌作用而又得到广泛研究的抗菌肽。它具有易合成，成本低，溶血性低等特点。
美国专利USP 5589364公开了如何利用基因工程技术制备天然蛙皮抗菌肽Magainin II(23个氨基酸)的方法。蛙皮抗菌肽Magainin II是天然蛙皮抗菌肽Magainin的一种，其氨基酸序列如下Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-OH式中的Gly为甘氨酸，Ile为异亮氨酸，Lys为赖氨酸，Phe为苯丙氨酸，Leu为亮氨酸，His为组氨酸，Ser为丝氨酸，Ala为丙氨酸，Val为缬氨酸，Glu为谷氨酸，Met为甲硫氨酸，Asn为天冬酰胺。
美国专利USP 6183992公开了利用基因工程技术制备蛙皮抗菌肽衍生物MSI-78(22个氨基酸)的方法，MSI-78的氨基酸序列如下Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-NH2美国HarrietM.lamb等人在《ADIS NEW DRUG PROFILE》杂志上报导蛙皮抗菌肽衍生物MSI-78应用在治疗外伤感染及糖尿病下肢溃疡等方面有明显疗效。
本发明的目的是提供一类蛙皮抗菌肽衍生物，扩大了蛙皮抗菌肽衍生物的种类，它们易于用固相化学制备，尤其易于用基因工程技术制备，从而为降低生产成本提供了可能。它们具有与天然蛙皮抗菌肽相同或者更强抗菌作用。
本发明的内容涉及一种如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。
本发明中所述结构的蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸是L型或者D型异构体。
本发明中所述蛙皮抗菌肽衍生物结构中的X为亮氨酸(Leu)，Y为丝氨酸-精氨酸(Ser-Arg)。
本发明中所述的蛙皮抗菌肽衍生物结构中的X为亮氨酸(Leu)，Y为丝氨酸-赖氨酸(Ser-Lys)。
本发明中所述如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物的制备方法，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。
该制备方法是基因工程方法，其步骤包括按蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段，基因片段连接，质粒构建，克隆，发酵，分离纯化及冻干得产品。
本发明中所述如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物的制备方法，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。
该制备方法是固相化学合成法，其步骤包括以HMP树脂为固相载体，氨基酸的α-氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团保护，用固相多肽合成仪合成，经分离提纯及冻干得产品。
本发明所述如下结构的蛙皮抗菌肽及其适用于药用的盐用作抗菌的药物。
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。
该抗菌药物中含有蛙皮抗菌肽衍生物及其适于药用的盐，或其组合物。
本发明提供了一类蛙皮抗菌肽衍生物，扩大了蛙皮抗菌肽衍生物的种类，所提供的该类蛙皮抗菌肽易于用固相化学合成法制备，尤其易于用基因工程技术制备，从而为降低生产成本提供了可能。它们具有与天然蛙皮抗菌肽相同或者更强抗菌作用。对本发明所述结构的蛙皮抗菌肽衍生物进行的杀菌效果和杀菌时间实验，以及溶血和急性毒性实验表明本发明的蛙皮抗菌肽衍生物与天然蛙皮抗菌肽Magainin II对大肠杆菌的杀菌效果相当，对金黄葡萄球菌亦有抑制作用。使用本发明蛙皮抗菌肽衍生物对50μl的菌液(106菌/ml)进行杀菌实验，用量为0.5μg，3小时可杀死90％以上的细菌，用量为1μg，3小时几乎杀死全部细菌。溶血实验表明本发明的蛙皮抗菌肽衍生物溶血50％有效浓度(HC50)与抑制50％有效浓度(IC50)比值约为50，而天然蛙皮抗菌肽Magainin II的HC50/IC50约为24，这说明本发明的产品安全性优于天然蛙皮抗菌肽Magainin II。急性毒性实验表明本发明的蛙皮抗菌肽衍生物的急性毒性较低。
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。
附
图1是本发明实施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物对大肠杆菌的杀菌时间图。
下面实施例是对本发明的进一步阐述而不是对本发明的限制。
实施例1基因工程法制备本发明结构的蛙皮抗菌肽衍生物，其中X为Leu，Y为Ser-Arg。
(1)按该蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段如下(a)5’AAT TCC ATG GGT ATC GGT AAA TTT CTG CAC AGC GCG AAA AAA(b)5’TTT GGT AAA GCG TTT GTG GGT GAA ATC CTG AAC AGC CGT TAG A(c)5’AG CTT CTA ACG GCT GTT CAG GAT TTC ACC CAC AAA CGC TTT(d)5’ACC AAA TTT TTT CGC GCT GTG CAG AAA TTT ACC GAT ACC CAT GG(2)DNA片段的连接取光密度为0.1(A260nm)的上述四个片段，二个试管中分别加片段a与d和b与c，再加聚核苷酸激酶缓冲液(Polynucleotide Kinase Buffer)和聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)。37℃保温60分钟后，在95℃水浴中保温10分钟，随后徐徐自然冷却至室温，再加T4连接酶缓冲液(T4 Ligase Buffer)及三磷酸腺苷(ATP)溶液，最后加T4连接酶(T4 Ligase)，于15℃保温过夜，使片段完成连接。
(3)克隆质粒含启动子为温控启动子PL(或乳糖启动子Lac，色氨酸-乳糖混合启动子Tac)，用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切之后，经过酚/氯仿抽提，再以氯仿洗涤3次，然后以异丙醇沉淀，经离心得质粒。将质粒与该蛙皮抗菌肽衍生物基因片段连接，即得含有该蛙皮抗菌肽衍生物基因片段的质粒。转化大肠杆菌JM103或JM109，平板培养筛选菌落。
(4)验证从单菌落中抽提含该蛙皮抗菌肽衍生物基因片段的质粒，经过EcoR I+HindIII双酶切之后，进行1％琼脂糖电泳，以溴化乙锭(EthidumBromide)染色，与标准样品对照检查克隆的基因片段，再经DNA序列分析、检测完成克隆。
(5)发酵在1L含300ml组成为蛋白胨10g、酵母抽提粉5g、氯化钠5g/L的培养液(LB培养液)摇瓶(10瓶)中接种，37℃0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，振荡培养过夜，离心收集菌体。利用温控PL启动子质粒时，于30℃培养8小时，然后将培养液升温至42℃，维持4小时使基因表达。
(6)经溶菌酶37℃、1小时破碎细胞壁后离心，将沉淀加6M盐酸胍抽提，离心透析，再离心，得蛋白质包涵体。将包涵体洗涤3次，洗涤溶液为1％氯化钠，0.1％曲拉通x-100(TrifoX-100)，Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8)，以十二烷基磺酸钠(SDS)-12％聚丙烯酰凝胶(PAGE)电泳对融合蛋白进行鉴定。
(7)将包涵体溶于8M尿素溶液中，50mM HCl条件下，加溴化氰裂解，避光通氮气条件下，搅拌反应2小时。反应完毕，用琼脂糖凝胶分子筛G-25/快速蛋白分离系统(FPLC)分离，得该蛙皮抗菌肽衍生物粗品，再经高效液相层析仪(HPLC，C18柱)，以乙氰/0.1％三氟乙酸梯度洗脱。结果得该蛙皮抗菌肽衍生物产品，该产品HPLC图谱与化学合成品完全一致。
实施例2基因工程法制备本发明结构的蛙皮抗菌肽衍生物，其中X为Leu，Y为Ser-Lys。
(1)按该蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段如下(a)5’AAT TCC ATG GGT ATC GGT AAA TTT CTG CAC AGC GCG AAA AAA(b)5’TTT GGT AAA GCG TTT GTG GGT GAA ATC CTG AAC AGC AAG TAG A(c)5’AG CTT CTA CTT GCT GTT CAG GAT TTC ACC CAC AAA CGC TTT(d)5’ACC AAA TTT TTT CGC GCT GTG CAG AAA TTT ACC GAT ACC CAT GG本实施例以下步骤(2)～(7)均同实施例1。结果得该蛙皮抗菌肽衍生物产品，该产品HPLC图谱与化学合成品完全一致。
实例3固相化学合成法制备本发明结构的蛙皮抗菌肽衍生物，其中X为Leu，Y为Lys-Arg。(1)所采用的氨基酸单体
上式中缩写表示Fmoc9-芴基甲氧羰基BOC叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)Trt三苯甲基(trityl)OtBu叔丁基酯TBu叔丁基(tert-butyl)(2)合成所采用的仪器设备及试剂仪器为Applied Biosystem多肽合成仪，433A型，美国试剂有N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMF N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU 100mmole/0.5M HOBT inDMF，N，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP其中DMF为N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide)NMP为N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone)HOBT为1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole)HBTU为2-(1氢-苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzotriazole-yl-1，1，3，3-tetramethyl-Uroniumhexafluorophosphate)(3)操作a、合成以0.25mmol规模为例，称取HMP树脂0.25g，置入多肽合成仪上的反应器中，将各种带保护基氨基酸称取1mmol装瓶，按该促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列从C-端向N-端排列在合成仪中，于25℃室温条件下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连结，然后再进行下一轮循环，如此完成合成。合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂在多肽合成仪上吹干后称重即可。
b、脱保护基及切断树脂将带保护基的该促胰岛素分泌肽衍生物多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入裂解试剂如下表试剂 用量水 0.50ml苯甲醚 0.50ml苯酚 0.75g巯基乙醇 0.20ml三氟乙酸 10.0ml然后在恒温30℃条件下，电磁搅拌反应6小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤；合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用少量乙醚洗涤后放入干燥器中干燥，得到粗品。
c、HPLC分离纯化、冻干将得到的粗品用制备型HPLC进行分离、提纯，最后经冷冻干燥后得到产品。经色质联用，该衍生物分子量实测值与理论值相符。
权利要求
1.一种如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。
2.根据权利要求1所述的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐，其特征在于组成上述结构的蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸是L型或者D型异构体。
3.根据权利要求1所述的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐，其特征在于所述蛙皮抗菌肽衍生物结构式中的X为Leu，Y为Ser-Arg。
4.根据权利要求1所述的蛙皮抗菌肽衍生物，其特征在于所述蛙皮抗菌肽衍生物结构式中的X为Leu，Y为Ser-Lys。
5.一种如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物的制备方法，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。该制备方法是基因工程方法，其步骤包括按蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段，基因片段连接，质粒构建，克隆，发酵，分离纯化及冻干得产品。
6.一种如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物的制备方法，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。该制备方法是固相化学合成法，其步骤包括以HMP树脂为固相载体，氨基酸的α-氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团保护，用固相多肽合成仪合成，经分离提纯及冻干得产品。
7.一种如下结构的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐用作抗菌的药物。Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-IIe-X-Asn-Y-OH其中X为选自Met，Ile或Leu的氨基酸残基，Y为选自Ser，Lys，Ile，Arg，Leu的两个氨基酸残基的组合。该抗菌药物中含有蛙皮抗菌肽衍生物及其适于药用的盐，或其组合物。
全文摘要
本发明涉及一类有抗菌作用的蛙皮抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐,其结构式如下:Gly－Ile－Gly－Lys－Phe－Leu－His－Ser－Ala－Lys－Lys－Phe－Gly－Lys－Ala－Phe－Val－Gly－Glu－Ile－X－Asn－Y－OH。其中:X为选自Met,Ile或Leu的氨基酸残基,Y为选自Ser,Lys,Ile,Arg,Leu的两个氨基酸残基的组合。该衍生物具有与天然蛙皮抗菌肽相同或更强的抗菌作用,且易于固相化学合成法制备,尤其易于用基因工程技术制备。
文档编号C12N15/12GK1363558SQ0111285
公开日2002年8月14日 申请日期2001年5月10日 优先权日2001年5月10日
发明者孙玉昆, 伍登熙, 朱志勇, 余刚, 沈春娟, 赵少凌, 魏云静 申请人:上海华谊生物技术有限公司