专利名称：生物催化合成光学活性的α－甲基－4－溴苯乙酸或其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用微生物催化合成(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺和(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸的方法。
中枢神经系统的胆碱能状况在诸如学习、记忆等认知过程中有着极其重要的作用，因此关于胆碱能的假设一直是人们致力于治愈阿耳茨海默病，即老年性痴呆症的理论基础，也是具有相同病理学原因的其他老年性疾病的基础。
从天仙子碱[(+)-R-hyoscyamine]衍生的一系列α-莨菪基酯能够显著提高中枢神经系统前突触乙酰胆碱释放能力，从而表现出镇痛和提高认知能力的作用。因其表现出来的治疗老年性疾病的潜力，这类药物倍受关注。PG9(α-甲基-对溴苯乙酸莨菪酯)是其中最引人注目的化合物之一。
天仙子碱[(+)-R-hyoscyamine] PG91994年，Gualtier等人合成了一系列共40个托品酸(2-苯基-3-羟基丙酸)和α-苯基丙酸的衍生物。对它们的镇痛及增强乙酰胆碱释放等方面进行了研究，发现PG9是其中最有效的一个，同时还具有显著的提高认知作用。值得注意的是，很多同类药物因为可导致乙酰胆碱过度兴奋症状而无法实现临床，但PG9则没有这样的副作用。其后，他们又对PG9进行了大量研究。[(a).Gualtier,F.,etal.J.Med.Chem.1994,37,1704-1711.(b).Ghelardini,C.,et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.,1998,284,806-816]
1996年，Romanelli等人对PG9两个对映体的生理活性进行了初步研究，发现消旋的PG9在小田鼠爪实验(rat paw test)中几乎没有镇痛效果，而光活的PG9无论是何种构型在老鼠(mice)实验中均表现出很好的促进乙酰胆碱释放能力。(Romanelli,M.N.,et al.Chirality,1996,8,225-233)然而，长期以来对光活产品的合成一直是个问题，文献中结果较好的方法采用非对映体拆分，将其前体4-溴-α-甲基苯乙酸的消旋体与手性胺作用并重结晶得到ee．值约90％的两个对映体，然后酯化得到产品，方法与结果均不令人满意，尤其不适合大量生产。由于光学活性样品不容易得到，因而其生理活性方面的深入研究无法展开。而这一点对于药物通过FDA认证也是至关重要的。
本发明的目的是提供一种用微生物催化合成(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺和(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸的方法。
本发明方法可用反应式描述如下 该方法中用于催化的微生物已于2000年10月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0497，分类命名为红球菌sp.D12(Rhodococcus sp.D12)。
具体来说，本发明采用微生物催化的方法，以产氰基水解酶菌株Rhodococcus sp.GCMCC0497为催化剂，以α-甲基-4-溴苯乙腈为底物，在或不在溶剂中，20～40℃反应1-36小时，其中按产氰基水解酶湿菌体与底物的质量比计算为5～500∶1，产物为(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸或(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺。反应中还可增加菌体的用量。所述的溶剂可以是极性溶剂如甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜等，也可以是非极性溶剂如乙酸乙酯、石油醚、甲苯、乙醚或异丙醚等。
反应结束后，反应液经后处理分别可得到(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸或(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺。例如用离心处理(如8000-13000rpm,5-30min,4-20℃)，然后取上层清液，调节pH值至9-14，用乙醚萃取，分别得到水相和有机相。有机相经洗涤，干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到酰胺及回收的原料。调节水相pH值至1-5，用乙醚萃取，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、减压蒸除溶剂、纯化，得到酸。
从(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺可以进一步经过常规的水解反应得到(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酸。具体可以是在极性溶剂中，(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺与酸的摩尔比为1∶0.01～2，室温～回流温度发生水解反应，反应几分钟～20小时，产物为(R)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，上述的酸是硫酸、磷酸或浓盐酸等。
本发明方法所用产氰基水解酶菌株Rhodococcus sp.GCMCC0497既可以是休止的细胞、生长中的细胞，也可以是固定化细胞。在用于催化反应前可先将上述产氰基水解酶菌株的湿菌体或固定化细胞悬浮于水或PH为6-9的缓冲溶液中，上述缓冲溶液可以是K2HPO4-KH2PO4或Na2HPO4-NaH2PO4或Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液等。经过活化的产氰基水解酶菌株更有利于上述催化反应。反应中无论是否使用溶剂，反应都很顺利，立体选择性也很好。比较起来，以丙酮作为溶剂最佳。
本发明所用的原料可由对溴苯乙腈制得。通过本发明的反应方法拆分后得到的(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺、(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸或(R)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，再经衍生化后即可得到PG9，途径如下 本发明方法采用微生物催化，避免了通过非对映体拆分的繁杂和低效，产率高，产品光学活性好，适于工业化生产。反应仅5小时后，酰胺和羧酸的ee．值就可＞96％，因此，本发明为生产手性药物提供了条件。
实施例1底物合成 对溴苯乙腈3.96g(99％,20mmol)溶于20ml无水THF中，用干冰/乙醇冷却至-70℃，分三次加入固体叔丁醇钾2.36g(95％,20mmol)，保持体系温度＜-65℃，约半小时后缓缓滴加碘甲烷1.28ml(2.86g,20mmol)，保持体系温度＜-60℃，此时体系呈乳白色悬浊液，TLC跟踪，1小时后自然升至室温，1小时后加入氯化铵饱和溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，旋干后柱层析(石油醚)，得产物3.99g(95％)。产物为无色液体1H NMR(90MHz,CCl4):δ7.18,7.48(AB,4H,J=9Hz,Ar-H),3.88(q,1H,J=7Hz,CH),1.64(d,3H,J=7Hz,CH3)。IR(film):νmax/cm-13061,2988,2939,2243(CN),1593,1489,1456,1408,1086,1072,990,823,769。MS m/z(rel.Intensity％):211(M++2,61),209(M+,61),196(M++2-CH3,100),194(M+-CH3,99.2),131(10),130(M+-Br,98),115(19),103(32.7),77(12)。
实施例2休止细胞法催化动力学拆分取适量培养后未经保存的菌体10g，悬浮于40ml pH6.0-9.0的K2HPO4-KH2PO4或Na2HPO4-NaH2PO4或Tris-HCl缓冲液中，在20-36℃搅拌活化0.5hr。将底物100mg溶于0.1～1.5ml助溶剂中，慢慢加入。同样温度下电磁搅拌，TLC跟踪反应进程，反应1-24小时。反应结束后，反应液离心处理(8000-13000rpm,5-30min,4-20℃)，取上层清液，调节pH值至9-14，用乙醚萃取(50ml×3)，分别得到水相和有机相。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到酰胺及回收的原料。调节水相pH值至1-5，用乙醚萃取(50ml×3)，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、减压蒸除溶剂、纯化，得到酸。产物数据如下(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺 白色固体45％的产率，98.3％ee,[α]D22-53.6(c1.5,CHCl3),1H NMR(90MHz,CDCl3):δ7.1 6,7.48(AB,4H,J=9Hz,Ar-H),5.63(br s,2H,NH2),3.55(q,1H,J=7Hz,CH),1.47(d,3H,J=7Hz,CH3)。IR(KBr):νmax/cm-13395,3200(NH2),1657(C=O),1618,488,1451,1396,1075,1010,827,795.MS m/z(rel.Intensity％):229(M++2,20),228(M++1,12),227(M+,20),185(M++2-CONH2,96),184(51),183(M+-CONH2,96),148(11.4),105(54.2),104(100),103(48),77(29.7)。Anal.Calcd.for C9H10NOBr:C,47.32；H,4.42；N,6.12Br,35.03 Found:C,47.50；H,4.42；N,6.00,Br,35.20，(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸 白色固体m.p.88-90C46％的产率，96％ee,[α]D22+46.8(c1.3,MeOH)。{Lit.93.9％ee.+46(MeOH),S}1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.75(br,s,1H,COOH),7.43,7.18(AB,4H,J=8.5Hz,Ar-H),3.66(q,1H,J=7.1Hz,CH),1.49(d,3H,J=7.1Hz,CH3)。IR(KBr):νmax/Cm-13050-2870(br,OH),2984,2938,2879,1702(C=O),1489,1461,1421,1403,1294,1280,827,749。MS m/z(rel.Intensity％):230(M++2,35),228(M+,34),185(M++2-COOH,98),183(M+-COOH,100),149(M+-Br,4),104(66),103(27),81(24),77(18)。
实施例3．休止细胞法催化动力学拆分取适量培养后保存1-60天的菌体30g，悬浮于80ml pH6.0-9.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入底物100mg，反应3小时，其它反应条件同前。得到产物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺，42％的产率，99％ee；产物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，49％的产率，92％ee。
实施例4休止细胞法催化动力学拆分用2g菌体在50ml缓冲液中反应，可以顺利转化100mg底物，11小时得到酰胺产率为43％,ee值为99.5％；羧酸产率为48％,ee值为94％。
实施例5固定化细胞法催化动力学拆分细胞固定化方法称10克湿菌体，加入0.3-1.5％NaCl水溶液5-20ml,2-15％海藻酸钠溶液5-50ml，搅拌均匀。电磁搅拌下用12号针头注入200ml 0.2-5％CaCl2水溶液中。固定化2-3小时后滤出，双蒸水洗涤。将固定化的小球置于200ml 0.1-1％CaCl2水溶液中，过夜后滤出，洗涤，得固定化细胞26g，放入冰箱保存。
称取固定化细胞5.2g(相当于2g湿菌体)，加入10-80ml自来水，在20-36℃搅拌活化0.5hr。将底物100mg溶于0.1-1.5ml助溶剂中，慢慢加入。同样温度下电磁搅拌，TLC跟踪反应进程，反应10小时。反应结束后滤出菌体，滤液进行后处理，方法同上。得到产物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺，56％的产率，75％ee；产物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，34％的产率，98％ee。
实施例6固定化细胞法催化动力学拆分称取固定化细胞2.6g(相当于1g湿菌体)，加入40-80ml Tris-HCl，在20-36℃搅拌活化0.5hr。将底物100mg溶于1-1.5ml助溶剂中，慢慢加入。同样温度下电磁搅拌，TLC跟踪反应进程，反应35小时。反应结束后滤出菌体，滤液进行后处理，方法同前。得到产物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺，55％的产率，78％ee；产物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，35％的产率，98％ee。
实施例7固定化细胞法催化动力学拆分称取固定化细胞52g(相当于20g湿菌体)，加入10ml Tris-HCl，在20-36℃搅拌活化0.5hr。将底物100mg溶于0.1ml助溶剂中，慢慢加入。同样温度下电磁搅拌，TLC跟踪反应进程，反应4小时。反应结束后滤出菌体，滤液进行后处理，方法同前。得到产物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺，45％的产率，96％ee；产物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，46％的产率，96％ee。
实施例8助溶剂的影响表1．助溶剂对反应活性及立体选择性的影响a助溶剂 反应时间酰胺b羧酸c(h) yield(％) ee.(％) yield(％) ee.(％)无5 48 93.7 43 97.5乙醇 5 44 98 47 93四氢呋喃 5 49 93 43 98.5丙酮 5 45 98.3 46 96丙酮 4 53 89.3 42 99.7二甲基甲酰胺 5 42 98.6 51 90二甲亚砜 5 46 94 46 94a取湿菌体10g，溶于40ml缓冲液。
b酰胺转化成甲酯，用手性HPLC测定ee值。衍生化方法称取一定量的酰胺，溶于无水甲醇，加入几滴浓硫酸，电磁搅拌，油浴锅加热至甲醇回流。TLC跟踪反应进程。反应结束后倒入NaHCO3冰水溶液中和至弱碱性，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水MgSO4干燥，蒸去溶剂，快速柱层析纯化。c羧酸转化成甲酯，用手性HPLC测定ee值。衍生化方法称取一定量的酸，溶于二氯甲烷，加入等当量DCC、3当量甲醇、催化量的DMAP，室温下电磁搅拌。TLC跟踪反应进程。反应结束后，直接蒸去溶剂，快速柱层析纯化。
实施例9R-(-)-PG9及S-(+)-PG9的合成
(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸229mg(1mmol)，溶于2.5ml重蒸过的SOCl2中，加热至60℃，反应3小时。减压下旋去过量的SOCl2，残余物溶于环己烷中，减压下旋去溶剂，如此重复三次。将得到的酰氯溶于3ml CHCl2，加入莨菪碱282mg(2mmol)，室温搅拌12小时。除去溶剂后用6N NaOH碱化，乙醚萃取得到油状物，快速柱层析纯化(CHCl3/petroleum ether/absolute ethanol/NH4OH 340/60/65/8)得产物(S)-PG9324mg(92％)(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺228mg(1mmol)，溶于少量甲醇中，加入50％硫酸或磷酸2ml，加热回流，TLC跟踪，反应结束后用饱和NaCO3水溶液中和至弱碱性，乙酸乙酯洗涤两次，再用3NHCl中和至酸性，乙酸乙酯萃取，快速柱层析纯化(EA∶PE 3∶1)得产物羧酸225mg(98％)。以下操作同(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸。得到产物(R)-PG9318mg，总收率为90％。产物为黄色油状液体R异构体98.3％ee,[α]D17-16.5(c1.3,EtOH)，S异构体96％ee，[醈D17+15.3(c1.1,EtOH)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.45,7.17(AB,4H,J=8.4Hz,Ar-H),4.96(t,J=5.3Hz,1H,CHO),3.6l(q,1H,J=7.2Hz,CH),3.10(t,J=3.3Hz,1H,CHN),3.03(t,J=3.1Hz,1H,CHN),2.26(s,3H,NMe),2.26-2.09(m,2H,CH2),.1.86-1.62(m,4H,2CH2),1.48(d,3H,J=7.2Hz,CH3),1.36-1.53(m,2H,CH2).IR(film):νmax,cm-12937,1729(C=O),1489,1406,1377,1326,1207,1174,1077,1063,1035,1011,834,772,526。MS m/z(rel.Intensity％):353(M++2,7.6),351(M+,7.6),185(4.0),183(4.3),124(100),104(12.8),95(8.6),94(18.1),83(14.1),82(19.3),67(8.5),42(9.3).
权利要求
1．一种生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是包括步骤(1)、(2)或步骤(1)，(1)以产氰基水解酶菌株Rhodococcus sp.GCMCC0497为催化剂，以α-甲基-4-溴苯乙腈为底物，在或不在溶剂中，20～40℃反应1-36小时，产物为(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸或(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺，反应中产氰基水解酶菌株与底物的质量比计算为5～500∶1，所述的溶剂是极性或非极性溶剂；(2)在极性溶剂中，(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺与酸的摩尔比为1∶0.01～2，室温～回流温度发生水解反应，反应几分钟～20小时，产物为(R)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸，所述的酸是硫酸、磷酸或浓盐酸。
2．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的极性溶剂是乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
3．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的非极性溶剂是乙酸乙酯、石油醚、甲苯、乙醚或异丙醚。
4．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的溶剂为丙酮。
5．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述产氰基水解酶菌株Rhodococcus sp.GCMCC0497是休止细胞、生长细胞或固定化细胞。
6．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的产氰基水解酶菌株悬浮于水或缓冲溶液中。
7．如权利要求6所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的缓冲溶液的PH值为6～9。
8．如权利要求1所述的生物催化合成光学活性的α-甲基-4-溴苯乙酸或其衍生物的方法，其特征是所述的产氰基水解酶菌株经过活化。
全文摘要
本发明涉及微生物催化拆分的方法,是以产氰基水解酶菌株Rhodococcussp.GCMCC0497为催化剂,以α－甲基－4－溴苯乙腈为底物,得到产物(S)－(+)－α－甲基－4－溴苯乙酸、(R)－(－)－α－甲基－4－溴苯乙酰胺或(R)－(－)－α－甲基－4－溴苯乙酸。上述产物可用于合成药物PG
文档编号C12P7/40GK1322841SQ01112869
公开日2001年11月21日 申请日期2001年5月11日 优先权日2001年5月11日
发明者李祖义, 吴中柳 申请人:中国科学院上海有机化学研究所