专利名称：酵母菌细胞破壁新方法
技术领域：
本发明属于酵母细胞中活性物质的提取以及基因工程酵母表达系统表达产物的提取方法，尤其涉及利用无毒的食品添加剂作为破壁试剂处理酵母细胞进行破壁的方法。
当从酵母细胞中提取某种生物活性物质如蛋白、酶、多肽时，必须首先破除其细胞壁。酵母的破壁方法主要有机械方法和用化学试剂诱导细胞自溶的方法。机械方法常用珠磨法、高压匀浆等。化学方法常用甲苯、氯仿等有机溶剂。机械方法设备条件要求高，破壁过程中易产热，酶易失活，且产品中易混入细胞碎片影响产品质量。化学方法中甲苯虽然破壁效果好，但毒性大，而氯仿、乙酸乙酯破壁效果又不好。(journal of dairy science 1976,Vol.58,No.11,1620-1629；biotechnology and bioengineering,1983,VolXXV,1341-57；CN86103223)。因此，寻找一种高效无毒的酵母细胞破壁方法有效破除其细胞壁对于各种酵母细胞来源的蛋白、酶、多肽及其它活性物质的提取制备以及基因工程酵母表达系统表达产物的提取与生产甚为关键。
本发明的目的是采用一类在食品与医药工业中普遍使用的基本无毒的食品添加剂，对酵母菌进行破壁，不但可在短时间内达到较高的破壁效果，而且能较好地保持提取物质的生物活性。
本发明的目的还在于将上述基本无毒的食品添加剂作为酵母菌破壁剂，用于各种酵母细胞来源的蛋白、酶、多肽及其它活性物质的提取，以及基因工程酵母表达系统表达产物的提取与纯化，尤其适用于食品、药品类生物活性物质的制备。
本发明的技术方案是一种酵母菌细胞破壁的方法，其特征在于采用对羟基苯甲酸酯类物质处理酵母细胞。
上述酵母菌细胞破壁的方法中，所述对羟基苯甲酸酯可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和/或对羟基苯甲酸丁酯。
上述酵母菌细胞破壁的方法中，所述对羟基苯甲酸酯可按常规配成溶液后处理酵母。所用溶剂可以是乙醇、甲醇、丙酮和/或正丁醇和磷酸钾缓冲液；对羟基苯甲酸酯所配比例可以是0.01-10(W/V)。
上述酵母菌细胞破壁的方法中，所述酵母选自于以下一组属假丝酵母属、汉孙酵母属、球拟酵母属、酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属以及酒香酵母属。
所述酵母菌细胞破壁的方法，其酵母菌破壁时的温度为20-60℃,pH为5-9。
较优选的酵母菌细胞破壁的方法是将酵母菌经过0℃—-70℃的冰冻处理后再进行破壁。
酵母细胞菌体用破壁剂对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和/或对羟基苯甲酸丁酯处理后，酵母细胞中的内含物如蛋白、酶、多肽及其它活性物质即释放到胞外溶液中。
本发明的有益效果表现在该方法不但破壁效率高，而且因其条件温和，能较好地保持提取物质的生物活性，可用于各种酵母细胞来源的蛋白、酶、多肽及其它活性物质的提取，以及基因工程酵母表达系统表达产物的提取与纯化。更重要的是，由于本发明所用破壁剂对羟基苯甲酸酯类(即尼泊金)是法定的食品添加剂，安全无毒，所以本方法尤其适用于食品、药品类生物活性物质的制备。
本发明的具体方案可见于以下实施例。
实施例1将脆壁酵母菌(Kluyveromyces fragilis)Y34440菌种从平板固体培养基上接至1升液体种子培养基中(种子培养基组分为2％乳糖，0.35％酵母膏，0.35％蛋白胨，pH调至6.0),28℃摇瓶培养16-20小时。
按5％(V/V)比例将上述种子液接至20升发酵培养基中(发酵培养基组分如下2％乳糖，2％葡萄糖，2％玉米浆，0.5％酵母汁，1.5％尿素，pH调至6.0)。28℃通气发酵，期间对单位体积发酵液所含酶活进行取样测定，发酵培养约20小时总酶活达到10 ONPG单位/ml发酵液，且不再上升，即达到发酵终点。
发酵液所含酶活力测定方法(参考J of Dairy Science,1974,56(9):1123-1127)如下取4.0ml发酵液，7000rpm离心5min，倾去上清液，向沉淀加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.3，含0.15mmol/L MnCl2)至4.0ml，加入40μl甲苯，混匀2min，于40℃,150rpm摇床振荡破壁，即得到甲苯破壁的酶液。
以邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(以下简称ONPG)为底物进行测定。取0.1ml上述酶液于试管中37℃水浴预热l0min，加入4ml已在37℃水浴预热的1.25mmol/L ONPG溶液(pH6.6,0.1mol/L磷酸钾缓冲液配制，含0.1mmol/L α-巯基乙醇，0.1mmol/L MnCl2,0.5mmol/L MgSO4),37℃反应5min，加入1ml0.5mol/L Na2CO3溶液终止酶反应，测定OD420nm值。所测定的OD420nm值必须在0.15-0.65之间，否则必须用上述缓冲液对酶液进行合理稀释。在上述条件下，每分钟水解ONPG生成1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个ONPG酶活单位。
发酵液所含总酶活力计算公式如下ONPG单位/ml发酵液=[A/(ε*T)]*V*(D/E)式中A测试样品的OD420nm平均值；ε消光系数=4.60T反应时间(5分钟)；V反应体积(5.1ml)；D酶溶液稀释倍数；E取酶的量(0.1ml)；实施例2取实施例1发酵液l升，高速离心机7000转/分离心收集菌体，得到酵母干菌泥40克，-20℃冷冻处理8小时，按1∶2(W/V)比例加入80ml破壁溶液(8毫升乙醇溶解40毫克的(0.5％重量/体积比)对羟基苯甲酸乙酯毫克后，用0.1M磷酸钾缓冲液配制而成)30℃搅拌破壁，定时取1ml样7000转/分离心，测定上清酶活，并换算成0.5％的对羟基苯甲酸乙酯破壁溶液破壁后每毫升发酵液所含菌体的释放到胞外的ONPG酶活力数。
以实施例1甲苯破壁后每毫升发酵液所含菌体的总ONPG酶活力数(即10ONPG单位/ml发酵液)为100％计算，0.5％的对羟基苯甲酸乙酯破壁溶液破壁乳糖酶酶释放率见表一。
乳糖酶相对释放率(％)=(A/B)％其中A为对羟基苯甲酸酯类破壁溶液破壁后，每毫升发酵液所含菌体的释放到胞外的ONPG酶活力数。
B为甲苯破壁后每毫升发酵液所含菌体的总ONPG酶活力数。
表一 0.5％对羟基苯甲酸乙酯的破壁效果
实施例3将实施例1发酵液7000转/分离心收集菌体，分别取40g菌体各加入80ml破壁溶液液(分别为0.5％和1％的对羟基苯甲酸丙酯，用8毫升乙醇溶解后，0.1 M磷酸钾缓冲液配制)30℃搅拌破壁一定时间，定时取样测定上清酶活，并换算成0。破壁后每毫升发酵液所含菌体的释放到胞外的ONPG酶活力数酶活，计算乳糖酶相对释放率，结果见表三。
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表三 不同浓度的对羟基苯甲酸丙酯的破壁效果
权利要求
1.一种酵母菌细胞破壁的方法，其特征在于用对羟基苯甲酸酯处理酵母细胞。
2.根据权利要求1的酵母菌细胞破壁的方法，所述对羟基苯甲酸酯可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和/或对羟基苯甲酸丁酯。
3.根据权利要求1的酵母菌细胞破壁的方法，所述对羟基苯甲酸酯可按常规配成溶液后处理酵母细胞。
4.根据权利要求1的酵母菌细胞破壁的方法，所述酵母选自于以下一组属假丝酵母属、汉孙酵母属、球拟酵母属、酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属以及酒香酵母属。
5.根据权利要求1-4的酵母菌细胞破壁的方法，酵母菌破壁时的温度为20-60℃,pH为5-9。
6.根据权利要求1-5的酵母菌细胞破壁的方法，较好的方法是将酵母菌经过0℃—-70℃的冰冻处理后再进行破壁。
全文摘要
一种用对羟基苯甲酸酯进行酵母菌细胞破壁新方法,该方法条件温和,安全无毒,较好地保持提取物质的生物活性,可用于各种酵母细胞来源的蛋白、酶、多肽及其它活性物质的提取,以及基因工程酵母表达系统表达产物的提取与纯化,尤其适用于食品、药品类生物活性物质的制备。
文档编号C12N9/00GK1319654SQ0111352
公开日2001年10月31日 申请日期2001年4月13日 优先权日2001年4月13日
发明者谭树华, 吴梧桐, 高捷, 海迪乐 申请人:中国药科大学