产l－谷氨酸细菌和生产l－谷氨酸的方法

专利名称：产l－谷氨酸细菌和生产l－谷氨酸的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及L-谷氨酸产生菌和使用该细菌通过发酵方法生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的食用、医用氨基酸。
相关技术介绍迄今，L-谷氨酸一直通过发酵方法生产，主要使用产L-谷氨酸的所谓棒状细菌，它们属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属或者其突变菌株(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan Center，pp.195-215，1986)。作为这种棒状细菌，从自然界中分离的野生型菌株和其突变体被用于提高产率。
已知，发酵生产L-谷氨酸时，也产生副产物海藻糖。因此，已经开发了降解或代谢产生的海藻糖的技术。这些技术包括使用其在海藻糖上的增殖能力已被诱发的棒状细菌发酵产生氨基酸的方法(日本专利公开(Kokai)5-276935)，以及使用其中编码海藻糖代谢酶的基因已被扩增的棒状细菌发酵审查氨基酸的方法(韩国专利公开(B1)号165836)。但是，在产L-氨基酸的细菌中已知海藻糖的形成的方法是已知的。
在大肠杆菌中，海藻糖的合成是通过海藻糖-6-磷酸合酶催化的。已知该酶由otsA基因编码。此外，也有otsA基因破坏的大肠杆菌菌株几乎不在高渗培养基中生长的报导(H.M.Glaver等，细菌学杂志，170(6)，2841-1849(1998))。但是，otsA基因破坏和物质产生之间的关系尚不清楚。
另一方面，尽管在属于短杆菌属的细菌中，已知微黄短杆菌有treY基因，但尚未发现短杆菌中存在otsA基因。对于属于分支杆菌属的细菌，已知存在一种由treS基因编码产物(海藻糖合酶(TreS))催化的反应介导的途径，该基因是一种与otsS基因和treY基因不同的编码海藻糖生物合成途径的酶的基因(De Smet K.A.等，微生物学，146(1)，199-208(2000))。但是，该途径利用麦芽糖作为底物，与一般的利用葡萄糖、果糖或蔗糖作为起始原料的L-谷氨酸发酵无关。
发明概述本发明的目的是通过抑制副产物海藻糖的生成，提高使用棒状细菌发酵生产L-谷氨酸时L-谷氨酸的生产效率。
发明人进行了深入的研究以实现上述目的。结果，他们发现属于短杆菌属的细菌同结核分支杆菌一样含有otsA基因和treY基因，L-谷氨酸的生产效率通过破坏这些基因的至少一种得到提高。至此，完成了本发明。
即，本发明提供了(1)具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力降低或缺失。
(2)上述(1)中的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力通过向编码海藻糖合成途径的酶的染色体基因引入突变或破坏该基因来降低或缺失。
(3)上述(2)中的棒状细菌，其中，编码海藻糖合成途径的酶的基因由编码海藻糖-6-磷酸合酶、编码麦芽寡糖基海藻糖(maltooligosyltrehalose)合酶的基因或二者组成。
(4)上述(3)中的棒状细菌，其中，编码海藻糖-6-磷酸合酶的基因编码SEQ ID NO30的氨基酸序列，编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因编码SEQ ID NO32的氨基酸序列。
(5)生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养前述(1)到(4)中任一项的棒状细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。
(6)编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO30的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO30氨基酸序列并具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
(7)上述(6)的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列的DNA，(b)与包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有55％或更大的同源性，并编码具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
(8)编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA
(A)具有SEQ ID NO32的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO32氨基酸序列并具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
(9)上述(8)的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列的DNA，(b)与包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有60％或更大的同源性，并编码具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
海藻糖-6-磷酸合酶活性是指催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸产生α，α-海藻糖-6-磷酸和UDP的反应的活性，麦芽寡糖基海藻糖合酶活性是指催化麦芽戊糖产生麦芽寡糖基海藻糖的反应的活性。
根据本发明，使用棒状细菌发酵生产L-谷氨酸时L-谷氨酸的生产效率可以通过抑制副产物海藻糖的生成得到提高。
优选实施方案以下详述本发明。
本发明的棒状细菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中海藻糖合成能力降低或缺失。
在本发明中属于棒杆菌属的细菌是伯杰氏鉴定细菌学手册第8版599页(1974)中限定的一组微生物。这些细菌是好气，革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽胞的杆菌，包括曾被分类为短杆菌属但现在已归入棒杆菌属的细菌(国际系统细菌学杂志，41，255(1981))，并包括与棒杆菌属密切相关、属于短杆菌属或微杆菌属的细菌。这些棒状细菌的实例如下。
嗜乙酰乙酸棒杆菌醋谷棒杆菌Corynebacterium alkanolyticum美棒杆菌谷氨酸棒杆菌百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)Corynebacterium melassecolaCorynebacyerium thermoaminogenes力士棒杆菌Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)Brevibacterium immariophilum乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)玫瑰色短杆菌解糖短杆菌生硫短杆菌产氨短杆菌(产氨棒杆菌)Brevibacterium albumBrevibacterium cerium嗜氨微杆菌具体而言，可举出下列菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870醋谷棒杆菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒杆菌ATCC15991谷氨酸棒杆菌ATCC13020，13032，13060百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒杆菌ATCC13868Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13655，ATCC13869玫瑰色短杆菌ATCC13825解糖短杆菌ATCC14066生硫短杆菌ATCC19240产氨棒杆菌(产氨短杆菌)ATCC6871Brevibacterium album ATCC15111Brevibacterium cerinum ATCC15112嗜氨微杆菌ATCC15354这些棒状细菌海藻糖合成能力的上述缺失或活性降低可以通过使用诱变处理或遗传重组技术突变或破坏编码海藻糖合成途径的酶的基因来实现。这种突变可以是抑制编码海藻糖合成途径的酶的基因转录或翻译的突变，或引起海藻糖合成途径的酶消除或减少的突变。海藻糖合成途径的酶的实例如海藻糖-6-磷酸合酶、麦芽寡糖基海藻糖合酶或两者。
编码海藻糖合成途径的酶的基因可以通过利用同源重组进行基因置换来破坏。棒状细菌染色体上的基因可以通过以下方法来破坏用含有编码修饰的海藻糖合成途径的酶的基因(缺失型基因)的DNA转化棒状细菌，使缺失型基因和染色体上的正常基因之间发生重组，修饰酶中一部分序列缺失，因而功能不正常。这种利用同源重组的基因破坏技术是成熟的技术。可具体提及的有，利用在棒状细菌中不复制的线性DNA或环状DNA的方法，利用含有温度敏感型复制起点的质粒的方法。但优选利用在棒状细菌中不复制的环状DNA或含有温度敏感型复制起点的质粒的方法。
编码海藻糖合成途径的酶的基因的实例如otsA基因或treY基因，或者可以包括两者。由于本发明已经阐明了乳发酵短杆菌otsA基因和treY基因的核苷酸序列及其侧翼区，这些基因可以通过制备基于这些序列的引物并使用这些引物和作为模板的乳发酵短杆菌染色体DNA进行PCR(聚合酶链反应，见White，T.J.等，遗传学趋势，5，185(1989))方便地获得。
包括下文实施例中获得的乳发酵短杆菌的otsA基因的核苷酸序列和包括treY基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO29和31中。并且，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO30和32。
otsA基因和treY基因也可以编码在一个或多个位置上有一个或几个氨基酸置换、缺失、插入或增加的蛋白，只要由其编码的海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶未被破坏即可。尽管“几个”氨基酸的数目取决于氨基酸残基在蛋白三维结构中的位置和类型，优选1-40个，更优选1-20个，更优选1-10个。
上述编码与海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA可以通过以下方法获得利用定点突变方法修饰核苷酸序列，使得一个或多个氨基酸残基包括置换、缺失、插入、增加或倒转。如上所述修饰的DNA也可以通过常规的已知突变处理得到。突变处理包括体外用诸如羟胺处理编码海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的DNA的方法，和用紫外线或常用于诱变处理的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理属于埃希氏菌属、携带编码海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的DNA的细菌的方法。
如上所述的核苷酸置换、缺失、插入、增加或倒转也包括天然存在的突变体或变异体，它们是基于具有海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的微生物的种或属间差异或个体差异。
上述编码与海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖基本相同蛋白的DNA可以通过在合适的细胞中表达具有上述突变的DNA并检查表达产物的海藻糖-6-磷酸合酶活性或麦芽寡糖基海藻糖活性得到。
编码与海藻糖-6-磷酸合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通过以下方法获得分离在严紧条件下可以与具有相应于SEQ ID NO29所示核苷酸序列的484-1938号核苷酸的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，或可以与由与前述核苷酸序列具有55％或更高、优选65％或更高、更优选75％或更高同源性的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，所述DNA具有来自编码海藻糖-6-磷酸合酶、具有一个突变的DNA或来自携带有该DNA的细胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。类似的，编码与麦芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通过以下方法获得分离在严紧条件下可以与具有相应于SEQ ID NO29所示核苷酸序列的82-2514号核苷酸的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，或可以与由与前述核苷酸序列具有60％或更高、优选70％或更高、更优选80％或更高同源性的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，所述DNA具有来自编码麦芽寡糖基海藻糖合酶、具有一个突变的DNA或来自携带有该DNA的细胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。
在本文中，“严紧条件”是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。要使用任何数值明确地表示该条件是困难的。但是，严紧条件包括具有高同源性的DNA如不低于55％的同源性优选不低于60％的同源性的DNA彼此杂交，而低于上述水平的同源性彼此不杂交的条件。或者，严紧条件可以是DNA在相当于DNA杂交的普通洗涤条件的盐浓度下彼此杂交的条件，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
至于探针，也可使用各个基因的部分序列。这种探针也可以使用基于各个基因的核苷酸序列产生的寡核苷酸作为引物，含有各个基因的DNA片段作为模板，进行PCR制备。当长度约300 bp的DNA片段用作探针时，杂交洗涤条件可以包括50℃，2×SSC和0.1％SDS。
如上所述在上述条件下可杂交的基因包括在基因编码区具有终止密码子的基因，由于活性中心突变没有活性的基因。但是，这些突变也可以将各个基因与可商购的表达载体连接并测定海藻糖-6-磷酸合酶活性或麦芽寡糖基海藻糖合酶活性来除去。
当otsA基因或treY基因被用来破坏棒状细菌染色体上的这些基因时，编码的海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶无需具有活性。另外，用于基因破坏的otsA基因或treY基因可以是来自其它微生物的基因，只要它们可以与棒状细菌的这些基因发生同源重组即可。例如，属于埃希氏菌属或分支杆菌属细菌的otsA基因或属于节杆菌属的细菌、微黄短杆菌或属于根瘤菌属的细菌的treY基因均为实例。
缺失型otsA基因或treY基因可以通过用限制酶切除含有这些基因之一的DNA片段或其部分的一定区域，以缺失编码区或启动子等表达调控序列的一部分。
而且，缺失型基因可以通过使用特别设计的引物进行PCR以缺失基因的一部分来获得。此外，缺失型基因也可通过单核苷酸突变如移码突变获得。
以下叙述otsA基因的基因破坏。treY基因的基因破坏类似进行。
宿主染色体上的otsA基因可以如下所述用缺失型otsA基因取代。即，将缺失型otsA基因和卡那霉素、氯霉素、四环素和链霉素等药物抗性标记基因插入在棒状细菌中不能自主复制的质粒，以制备重组DNA。棒状细菌可以用重组DNA转化，转化菌株在含有药物的培养基中培养，以获得重组DNA被导入染色体DNA的转化菌株。或者，可以使用稳定敏感型质粒作为质粒，在温度敏感型质粒不能复制的温度培养转化子，从而获得转化菌株。
在如上所述重组DNA被整合进入染色体的菌株中，重组DNA引起与原来存在于染色体上的otsA基因序列的重组，将包括染色体otsA基因和缺失型otsA基因的两个融合基因插入染色体，使得染色体DNA的其它部分(载体部分和药物抗性基因)位于它们中间。
然后，为了在染色体DNA上仅留下缺失型otsA基因，通过两个otsA基因的重组，从染色体DNA上消除一个拷贝的otsA基因和载体部分(包括药物抗性基因)。这样，正常otsA基因留在染色体DNA上，缺失型otsA基因被切除，或者相反，缺失型otsA基因留在染色体DNA上，而正常otsA基因被切除。通过PCR、杂交等检查染色体DNA上的otsA基因的结构，确认染色体DNA上留下的基因类型。
用于本发明的棒状细菌除了海藻糖合成活性缺失或降低之外，也可以具有较高的催化L-谷氨酸生物合成的酶活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。
并且，在用于本发明的棒状细菌中，通过从L-谷氨酸生物合成途径分支催化产生非L-谷氨酸化合物的反应的酶可以减少或缺失。这种酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、L-谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。
此外，通过向具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌中引入生物素活性抑制物如表面活性剂的温度敏感型突变，该细菌在不存在生物素活性抑制物时在含有过量生物素的培养基中可以产生L-谷氨酸(参见WO96/06180)。作为这种棒状细菌，可以提到WO96/06180中公开的乳发酵短杆菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为独立管理法人，国立先进工业科技研究所，国际专利生物材料保藏机构，chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japen，邮政编码305-5466)，保藏号为FERMP-14501。其后在1995年8月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5189。
当具有L-谷氨酸生成能力海藻糖合成能力缺失或降低的棒状细菌在合适的培养基中培养时，培养基中可以积累L-谷氨酸。
用来生产L-谷氨酸的培养基是普通培养基，含有所需的碳源、氮源、无机盐以及其他痕量有机营养。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、blackstrap糖蜜和淀粉水解物；醇，如乙醇、肌醇；或有机酸，如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。
氮源可以是无机铵盐，如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，氨，有机氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆和大豆水解物，氨气，氨水等。
加入的无机离子(或其来源)是少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。至于微量有机营养，最好以合适的量加入所需的物质如维生素B1、酵母提取物等。
优选通过振荡、搅拌通气在好气条件下培养16到72小时。培养温度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9。可以加入无机或有机酸性或碱性物质、氨气等调节pH。
从培养液中收集L-谷氨酸可以通过例如使用离子交换树脂的方法、结晶等实现。具体来说，L-谷氨酸可以通过阴离子交换树脂吸附或分离，或通过中和结晶。
实施例以下将参照具体实施例更具体地阐明本发明。实施例1.乳发酵短杆菌otsA基因破坏菌株的构建(1)otsA基因的克隆由于乳发酵短杆菌的otsA基因是未知的，通过利用其它微生物otsA基因的核苷酸序列为参考获得该基因。埃希氏菌和分支杆菌的otsA基因已经获得了完整的核苷酸序列(Kassen I.等，基因，145(1)，9-15(1994)；De Smet K.A.等，微生物学，146(1)，199-208(2000))。因此，参考由这些核苷酸序列推导的氨基酸序列，首先合成PCR引物P1(SEQID NO1)和P2(SEQ ID NO2)。DNA引物P1和P2分别相应于大肠杆菌otsA基因核苷酸序列(GenBank入藏号X69160)的核苷酸1894-1913和2531-2549。它们也分别相应于结核分支杆菌otsA基因(GenBank入藏号Z95390)的核苷酸40499-40518和41166-41184。
然后，使用引物P1和P2以及作为模板的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，50℃0.5分钟和72℃4分钟，重复30个循环。这样，获得了约0.6 kbp的单一种类的扩增片段。该扩增片段使用Invitrogen生产的“原始TA克隆试剂盒”克隆进质粒载体pCR2.1，得到pCotsA。然后，确定克隆片段的核苷酸序列。
根据以上获得的otsA基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P10(SEQ ID NO8)和P12(SEQ ID NO10)，该部分片段侧翼的未知区域使用“反向PCR”扩增(Triglia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遗传学，120，621-623(1988))。乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA用限制酶BamHI，BglII，ClaI，HindIII，KpnI，MluI，MunL，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接。使用所得的DNA作为模板以及引物P10和P12进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃1分钟和72℃4分钟，重复30个循环。然后，使用ClaI或BglII作为限制酶，每种情况下均获得4 kbp的扩增片段。这些扩增片段的核苷酸序列使用DNA引物P5到P9(SEQ ID NO3-7)和P11到P15(SEQ ID NO9-13)直接确定。这样，确定了乳发酵短杆菌ATCC13869 otsA基因的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO29所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO29和30。
上述otsA基因相对于大肠杆菌otsA基因(GenBank入藏号X69160)和结核分支杆菌otsA基因(GenBank入藏号Z95390)的序列同源性被分别确定，核苷酸序列的同源性分别为46.3％和55.9％，氨基酸序列的同源性分别为30.9％和51.7％。同源性使用“GENETIX-WIN”(Software Development)软件根据Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))计算。(2)otsA基因破坏质粒的制备为了通过破坏棒状细菌中编码海藻糖生物合成途径的酶的基因检查L-谷氨酸产率的改进效应是否存在，制备otsA基因破坏质粒。otsA基因破坏质粒按如下所述制备。使用otsA基因克隆中构建的质粒pCotsA作为模板以及包括ClaI位点的引物P29(SEQ ID NO33)和P30(SEQ ID NO34)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃8分钟，重复30个循环。扩增的片段用ClaI消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接，以构建含有在大约中间部位有一个移码突变(SEQ ID NO29的1259-1300核苷酸缺失)的otsA基因的pCotsAC质粒。(3)制备otsA基因破坏菌株使用基因破坏质粒pCotsAC，通过电脉冲法转化L-谷氨酸产生菌乳发酵短杆菌ATCC 13869，选择可以在含有20mg/L卡那霉素的CM2B培养基中生长的转化子。由于otsA基因破坏的质粒pCotsAC没有在乳发酵短杆菌中有功能的复制起点，所得的转化子是使用经历了乳发酵短杆菌染色体和基因破坏质粒pCotsAC上的otsA基因之间的同源重组的质粒得到的。由如上所述获得的同源重组菌株中，根据获得的卡那霉素敏感性作为标记，选择出由于再次发生的同源重组消除了基因破坏质粒pCotsAC的载体部分的菌株。
由如上所述获得的菌株中，选择出引入了所需的移码突变的菌株。选择过程如下使用由卡那霉素敏感性菌株提取的染色体DNA作为模板以及引物P8(SEQ ID NO14)和P13(SEQ ID NO11)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃1分钟，重复30个循环，使用DNA引物对获得的扩增片段测序，以确证otsA基因的无功能是由于引入了移码突变。如上所述获得的菌株被称为ΔOA菌株。实施例2treY基因破坏菌株的构建(1)treY基因的克隆由于乳发酵短杆菌的treY基因是未知的，通过利用其它微生物treY基因的核苷酸序列为参考获得该基因。节杆菌、短杆菌和根瘤菌属的treY基因已经获得了完整的核苷酸序列(Maruta K.等，生物化学生物物理通报，1289(1)，10-13(1996)；Genbank入藏号AF039919；Maruta K.等，生物科学、生物技术与生物化学，60(4)，717-720(1996))。因此，参考由这些核苷酸序列推导的氨基酸序列，首先合成PCR引物P3(SEQID NO14)和P4(SEQ ID NO15)。DNA引物P3和P4分别相应于节杆菌属种treY基因核苷酸序列(GenBank入藏号D63343)的核苷酸975-992和2565-2584。它们也分别相应于微黄短杆菌treY基因(GenBank入藏号AF039919)的核苷酸893-910和2486-2505。此外，它们也分别相应于根瘤菌属种treY基因(GenBank入藏号D78001)的核苷酸862-879和2452-2471。
然后，使用引物P3和P4以及作为模板的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃4分钟，重复30个循环。这样，获得了约1.6kbp的单一种类的扩增片段。该扩增片段使用Invitrogen生产的“原始TA克隆试剂盒”克隆进质粒载体pCR2.1。然后，确定该核苷酸序列为约0.6kb。
根据以上获得的treY基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P16(SEQ ID NO16)和P26(SEQ ID NO26)，该部分片段侧翼的未知区域使用“反向PCR”扩增(Trigia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遗传学，120，621-623(1988))。乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA用限制酶BamHI，HindIII，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接。使用所得的DNA作为模板以及引物P16和P26进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃1分钟和72℃4分钟，重复30个循环。然后，使用HindIII或SalI作为限制酶，分别获得0.6或1.5kbp的扩增片段。这些扩增片段的核苷酸序列使用DNA引物P16到P28(SEQ ID NO16-28)直接确定。这样，确定了乳发酵短杆菌ATCC13869 treY基因的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO31所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO31和32。
上述treY基因相对于节杆菌属种treY基因(GenBank入藏号D63343)、微黄短杆菌treY基因(GenBank入藏号AF039919)和根瘤菌属种treY基因(GenBank入藏号D78001)的序列同源性被分别确定，核苷酸序列的同源性分别为52.0％、52.3％和51.9％，氨基酸序列的同源性分别为40.9％、38.5％和39.8％。同源性使用“GENETIX-WIN”(Software Development)软件根据Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))计算。(2)treY基因破坏质粒的制备为了通过破坏棒状细菌中编码海藻糖生物合成途径的酶的基因检查L-谷氨酸产率的改进效应是否存在，制备treY基因破坏质粒。首先，使用引物P17(SEQ ID NO17)和P25(SEQ ID NO25)以及作为模板的ATCC 13869染色体DNA进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，60℃0.5分钟和72℃2分钟，重复30个循环。扩增的片段用EcoRI消化，用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)连接至EcoRI消化的pHSG299(Takara Shuzo)，获得质粒pHtreY。然后，该pHtreY用AflII(TakaraShuzo)消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4连接酶(Takara Shuzo)自身连接，以构建含有在大约中间部位有一个移码突变(SEQ ID NO31序列中1145核苷酸后插入4个核苷酸)的treY基因的pHtreYA质粒。(3)制备treY基因破坏菌株使用基因破坏质粒pCtreYA，通过电脉冲法转化L-谷氨酸产生菌乳发酵短杆菌ATCC 13869，选择可以在含有20 mg/L卡那霉素的CM2B培养基中生长的转化子。由于treY基因破坏质粒pCtreYA没有在乳发酵短杆菌中有功能的复制起点，所得的转化子是使用经历了乳发酵短杆菌染色体和基因破坏质粒pHtreYA上的treY基因之间的同源重组的质粒得到的。由如上所述获得的同源重组菌株中，根据获得的卡那霉素敏感性作为标记，选择出由于再次发生的同源重组消除了基因破坏质粒pCtreYA的载体部分的菌株。
由如上所述获得的菌株中，选择出引入了所需的移码突变的菌株。选择过程如下使用DNA引物P19(SEQ ID NO19)和P25(SEQ IDNO25)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃1.5分钟，重复30个循环，使用DNA引物P21或P23对获得的扩增片段测序，以确证treY基因的无功能是由于引入了移码突变。如上所述获得的菌株被称为ΔTA菌株。实施例3ΔOA菌株和ΔTA菌株产生L-谷氨酸能力的评价
ATCC13869菌株、ΔOA菌株和ΔTA菌株各自如下培养以产生L-谷氨酸。这些菌株均通过培养在CM2B平板培养基上而更新，更新的菌株于31.5℃培养在每升纯水中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氢钾、0.4克硫酸镁、30克硫酸铵、0.01克七水硫酸亚铁、0.01克七水硫酸锰、15毫升大豆水解物溶液、200微克盐酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸钙的培养基(用KOH调节pH为8.0)中。培养后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的量和培养液稀释51倍后在620纳米的吸收值。结果示于表1。
otsA或treY基因破坏的乳发酵短杆菌菌株与亲本菌株的生长情况类似，但与亲本菌株相比，L-谷氨酸产生增加。
表1
序列表说明SEQ ID NO1otsA扩增引物P1SEQ ID NO2otsA扩增引物P2SEQ ID NO3引物P5SEQ ID NO4引物P6SEQ ID NO5引物P7SEQ ID NO6引物P8SEQ ID NO7引物P9SEQ ID NO8引物P10SEQ ID NO9引物P11SEQ ID NO10引物P12SEQ ID NO11引物P13SEQ ID NO12引物P14SEQ ID NO13引物P15SEQ ID NO14treY扩增引物P3SEQ ID NO15treY扩增引物P4SEQ ID NO16引物P16SEQ ID NO17引物P17SEQ ID NO18引物P18SEQ ID NO19引物P19SEQ ID NO20引物P20SEQ ID NO21引物P21SEQ ID NO22引物P22SEQ ID NO23引物P23SEQ ID NO24引物P24SEQ ID NO25引物P25SEQ ID NO26引物P26SEQ ID NO27引物P27SEQ ID NO28引物P28SEQ ID NO29otsA基因核苷酸序列SEQ ID NO30OtsA氨基酸序列SEQ ID NO31TreY基因核苷酸序列SEQ ID NO32treY氨基酸序列SEQ ID NO33引物P29SEQ ID NO34引物P30序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>产L-谷氨酸细菌和生产L-谷氨酸的方法<130>0P1195<140><141>2000-07-<150>JP 2000-204256<151>2000-07-05<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<21 3>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<220><221>misc_特征<222>(3，9，18)<22 3>n＝a或g或c或t<400>1canathggnt tyttyytnca 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<220><221>misc-特征<222>(3，11，19)<223>n＝a或g或c或t<400>2canarrttca tnccrtcnc 19<210>3<211>23<212>DNA<21 3>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>3gaatcatcca tataagatcc ggc 23<210>4<211>24<212>DNA<21 3>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>4tagctttgta gttgttgcta accg24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>5agcgaacttg aggtttactt cccg24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>6tgctggttcc tggcattttg cgcc24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>7tcgaacaatc tcttcacgcc 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>8gaatcccacc aaatctgcgc c 21<210>9<211>20<212>DNA<21 3>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>9tgatgttgaa atgtttgggg 20<210>10<211>20<212>DNA<21 3>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>10gatgtcatgc tggttacgcc 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>11caaagcacca gtgccgtcgc gg 22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>12tgttcgtttt cattcgcgtt gccg 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>13atagtttcct ggattgtttg gcgc 24<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<220><221>misc_特征<222>(9)<223>n＝a或g或c或t<400>14caraayccnt ggtggtgg 18<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<220><221>misc_特征<222>(3，6，15)<223>n＝a或g或c或t<400>15ggncgncgrt trtcnggrtc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>16cgagctcttc attgatggcg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>17gcagctacac acgagttggg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>18gcaacaccta aatggttggg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>19gcaagaagtc tacaagcgcc 20<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>20gccaacgtat tcacgg 16<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>21tgatgaacca ctcgatcccc 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>22aagacaccac cttctaccgc 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>23caagtggaat tctgcagcgg 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>24cctcctacaa aacctgctgg g 21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>25tcgcggatag cttttagggc 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>26tgagttttta gaagactccc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>27cgcttcagtg gtgttgtccc 20<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明PCR引物<400>28cgtaccactc cacggaaatt cccg 24<210>29<211>2369<212>DNA<213>乳发酵短杆菌<220><221>CDS<222>(484)..(1938)<400>29acagaatcag cgccggcaga gaaacgtcca aagactaatc agagattcgg tataaaggta 60aaaatcaacc tgcttaggcg tctttcgctt aaatagcgta gaatatcggg tcgatcgctt 120ttaaacactc aggaggatcc ttgccggcca aaatcacgga cactcgtccc accccagaat 180cccttcacgc tgttgaagag gaaaccgcag ccggtgcccg caggattgtt gccacctatt 240ctaaggactt cttcgacggc gtcactttga tgtgcatgct cggcgttgaa cctcagggcc 300tgcgttacac caaggtcgct tctgaacacg aggaagctca gccaaagaag gctacaaagc 360ggactcgtaa ggctaccagc taagaaggct gctgctaaga aaacgaccaa gaagaccact 420aagaaaacta ctaaaaagac caccgcaaag aagaccacaa agaagtctta agccggatct 480tat atg gat gat tcc aat agc ttt gta gtt gtt gct aac cgt ctg cca 528Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro1 5 10 15gtg gat atg act gtc cac cca gat ggt agc tat agc atc tcc ccc agc 576Val Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser20 25 30ccc ggt ggc ctt gtc acg ggg ctt tcc ccc gtt ctg gaa caa cat cgt 624Pro Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg35 40 45gga tgt tgg gtc gga tgg cct gga act gta gat gtt gca ccc gaa cca 672Gly Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro50 55 60ttt cga aca gat acg ggt gtt ttg ctg cac cct gtt gtc ctc act gca 720Phe Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala65 70 75agt gac tat gaa ggc ttc tac gag ggc ttt tca aac gca acg ctg tgg 768Ser Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp80 85 90 95cct ctt ttc cac gat ctg att gtt act ccg gtg tac aac acc gat tgg 816Pro Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp100 105 110tgg cat gcg ttt cgg gaa gta aac ctc aag ttc gct gaa gcc gtg agc 864Trp His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser115 120 125caa gtg gcg gca cac ggt gcc act gtg tgg gtg cag gac tat cag ctg 912Gln Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu130 135 140ttg ctg gtt cct ggc att ttg cgc cag atg cgc ctt gat ttg aag atc 960Leu Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile145 150 155ggt ttc ttc ctc cac att ccc ttc cct tcc cct gat ctg ttc cgt cag 1008Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln160 165 170 175ctg ccg tgg cgt gaa gag att gtt cga ggc atg ctg ggc gca gat ttg 1056Leu Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu180 185 190gtg gga ttc cat ttg gtt caa aac gca gaa aac ttc ctt gcg tta acc 1104Val Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr195 200 205cag cag gtt gcc ggc act gcc ggg tct cat gtg ggt cag ccg gac acc 1152Gln Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr210 215 220ttg cag gtc agt ggt gaa gca ttg gtg cgt gag att ggc gct cat gtt 1200Leu gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val225 230 235gaa acc gct gac gga agg cga gtt agc gtc ggg gcg ttc ccg atc tcg 1248Glu Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser240 245 250 255att gat gtt gaa atg ttt ggg gag gcg tcg aaa ggc gcc gtt ctt gat 1296Ile Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp260 265 270ctt tta aaa acg ctc gac gag ccg gaa acc gta ttc ctg ggc gtt gac 1344Leu Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp275 280 285cga ctg gac tac acc aag ggc att ttg cag cgc ctg ctt gcg ttt gag 1392Arg Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu290 295 300gaa ctg ctg gaa tcc ggc gcg ttg gag gcc gac aaa gct gtg ttg ctg 1440Glu Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu305 310 315cag gtc gcg acg cct tcg cgt gag cgc att gat cac tat cgt gtg tcg 1488Gln Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser320 325 330 335cgt tcg cag gtc gag gaa gcc gtc ggc cgt atc aat ggt cgt ttc 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420 425 430tcc atc aaa cgg caa atg gtg gca gct gtc cat gat ttg aag cac aat 1824Ser Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn435 440 445ccg gaa tct gcg gca acg cga atg aaa acg aac agc gag cag gtc tat 1872Pro Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr450 455 460acc cac gac gtc aac gtg tgg gct aat agt ttc ctg gat tgt ttg gcg 1920Thr His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala465 470 475cag tcg gga gaa aac tca tgaaccgcgc acgaatcgcg accataggcg 1968Gln Ser Gly Glu Asn Ser480 485ttcttccgct tgctttactg ctggcgtcct gtggttcaga caccgtggaa atgacagatt 2028ccacctggtt ggtgaccaat atttacaccg atccagatga gtcgaattcg atcagtaatc 2088ttgtcatttc ccagcccagc ttagattttg gcaattcttc cctgtctggt ttcactggct 2148gtgtgccttt tacggggcgt gcggaattct tccaaaatgg tgagcaaagc tctgttctgg 2208atgccgatta tgtgaccttg tcttccctgg atttcgataa acttcccgat gattgccaag 2268gacaagaact caaagttcat aacgagctgg ttgatcttct gcctggttct tttgaaatct 2328ccaggacttc tggttcagaa atcttgctga ctagcgatgt c 2369<210>30<211>485<212>PRT<21 3>乳发酵短杆菌<400>30Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val1 5 10 15Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser Pro20 25 30Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg Gly35 40 45Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro Phe50 55 60Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala Ser65 70 75 80Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp Pro85 90 95Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp Trp100 105 110His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser Gln115 120 125Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu Leu130 135 140Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile Gly145 150 155 160Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln Leu165 170 175Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu Val180 185 190Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr Gln195 200 205Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr Leu210 215 220Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val Glu225 230 235 240Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile245 250 255Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp Leu260 265 270Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp Arg275 280 285Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu Glu290 295 300Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu Gln305 310 315 320Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser Arg325 330 335Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Arg340 345 350Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys Asn355 360 365Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro370 375 380Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn His385 390 395 400Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala405 410 415Thr Glu Leu Thr Gly Ala 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权利要求
1.具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力降低或缺失。
2.权利要求1的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力通过向编码海藻糖合成途径的酶的染色体基因引入突变或破坏该基因来降低或缺失。
3.权利要求2的棒状细菌，其中，编码海藻糖合成途径的酶的基因由编码海藻糖-6-磷酸合酶、编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因或二者组成。
4.权利要求3的棒状细菌，其中，编码海藻糖-6-磷酸合酶的基因编码SEQ ID NO30的氨基酸序列，编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因编码SEQ ID NO32的氨基酸序列。
5.生产L-谷氨酸的方法，包括以下步骤在培养基中培养权利要求1-4任一项的棒状细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。
6.编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO30的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO30氨基酸序列并具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
7.权利要求6的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列的DNA，(b)与包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有55％或更大的同源性，并编码具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
8.编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO32的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO32氨基酸序列并具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
9.权利要求8的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列的DNA，(b)与包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有60％或更大的同源性，并编码具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
全文摘要
L－谷氨酸可以通过培养具有L－谷氨酸生成能力的棒状细菌以在培养基中产生和积累L－谷氨酸并由培养基中收集L－谷氨酸来生产,其中,所述细菌中编码海藻糖－6－磷酸合酶的基因、编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因或二者被破坏,因而海藻糖合成能力降低或缺失。
文档编号C12P13/14GK1335394SQ0112174
公开日2002年2月13日 申请日期2001年7月5日 优先权日2000年7月5日
发明者大泷博美, 中村纯, 泉井裕, 中松亘 申请人:味之素株式会社