专利名称：快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及对虾养殖中传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测装置。
对虾养殖业是我国海水养殖的支柱性产业，也是亚洲和美洲许多发展中国家的支柱性海洋产业。近几年来，我国加强了对虾病害防治和养殖高新技术的研究与应用，同时也积极引进原产于南美洲的凡纳对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)和细角对虾(Litopenaeus stylirostris，俗称蓝对虾)等新的虾种进行养殖，特别是我国华南地区采用高位池和过滤海水防病养虾系统等高新技术进行凡纳对虾和斑节对虾养殖取得了显著的成功，促进了我国对虾养殖产量的迅速回升。但由于在凡纳对虾和细角对虾亲虾和幼体的引进过程中，危害严重的各种对虾病毒也随之带入我国对虾养殖地区。传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus，简写IHHNV)，又称畸形综合症病毒(Runt-deformity syndrome virus)，可造成对虾幼体和仔虾高达80％的累积死亡率，存活的个体头部畸形，体小，对对虾养殖产量造成很大影响。由于该病毒粒子微小(直径17-26nm)，即使用透射电镜也很难发现。因此，找出传染性皮下及造血组织坏死病毒的快速检测方法能有效控制该病毒的流行。
目前，世界上主要有三种方法检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒1.电镜法，该法检测仪器昂贵，样品预处理复杂，灵敏度低，不适合现场测定；2.基因探针法，价格高，操作复杂；3.聚合酶链式反应法，国外产品价格很高，不适合我国对虾养殖业户。
本发明的目的是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒，以便可以快速、灵敏、准确地判断各种对虾苗种、幼虾、成虾及亲虾是否携带传染性皮下及造血组织坏死病毒。
本发明的试剂盒主要由以下几种试剂配方组成试剂A组织裂解液；试剂BDNA提取液；试剂CPCR反应液，其中含有特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，其序列分别为5’-TCATCCCGACGACGAAGAA和5’-GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。
试剂C中所含的特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，应有足够的含量，一般每种的含量应不少于8pm。
本发明所提供的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒的使用方法如下一、传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA的提取1.取待检样品组织25-30mg，于1.5ml离心管中，加200ul TE缓冲液，捣烂。
2.200ul样品中加入400ul溶液A，混匀后，加入3ul蛋白酶K，置于55℃水浴5-10分钟，裂解过程中上下混匀几次。降解完全的样品应为半透明粘稠液体，否则应继续保温处理。
3.加入600ul氯仿，轻轻混匀，以保证DNA的完整性。
4.用台式离心机10000转/分离心5分钟，取500ul上清液，置于1.5ml离心管中。
5.加入500ul溶液B，混匀，室温放置2分钟。10000转/分离心5分钟。
6.吸去上清液，加入100ul 1.2M NaCl，轻轻摇动混匀直至DNA样品完全溶解。加入3ul核糖核酸A，混匀，置于55℃水浴5-10分钟。
7.加入300ul冷乙醇，-20℃放置10分钟。10000转/分离心3-4分钟。倒掉乙醇，用70％乙醇洗一次。倒置于干净的滤纸上，室温干燥。
8.待检样品DNA用50ul水溶解。
二、PCR反应在取1-2ul待检样品DNA加入反应管C中，混匀后在PCR仪中进行以下反应94℃ 2分钟 72℃ 5分钟15℃ 停止反应结束后取5-10ul加4ul溴酚蓝混匀后进行2％琼脂糖凝胶电泳，确定扩增产物。如出现约540bp的反应产物，说明待检样品携带传染性皮下及造血组织坏死病毒。
使用本发明的试剂盒，经实际试验，证明可以快速、灵敏、准确地判断各种对虾苗种、幼虾、成虾及亲虾是否携带传染性皮下及造血组织坏死病毒。
实施例凡纳对虾和细角对虾幼苗用对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒检测。试剂盒组成为试剂A组织裂解液。其组成为0.5％SDS，0.25M EDTA；试剂BDNA提取液。其组成为氯仿∶1.2M氯酸钠＝6∶1；试剂CPCR反应液，每管组成为2mM MgCl2，2.5ul 10X PCR缓冲液，17.2ul ddH2O，4ul 10mMdNTP，1u Taq，10pm IHHNV-5’，10pm IHHNV-3’。
按本发明所提供的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒的使用方法，提取传染性皮下及造血组织坏死病毒DNA，进行PCR反应，反应结束后取5-10ul加4ul溴酚蓝混匀后进行2％琼脂糖凝胶电泳，即可发现幼苗是否携带有传染性皮下及造血组织坏死病毒。
权利要求
1.一种快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试剂组成试剂A组织裂解液；试剂BDNA提取液；试剂CPCR反应液，其中含有特定引物IHHNV-5’和IHHNV-3’，其序列分别为5’-TCATCCCGACGACGAAGAA和5’-GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所说的试剂CPCR反应液，每管组成为2mM MgCl2，2.5ul 10X PCR缓冲液，17.2ul ddH2O，4ul 10mMdNTP，1u Taq，1 0pm IHHNV-5’，10pm IHHNV-3’。
全文摘要
本发明提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测试剂盒，该试剂盒主要由以下几种试剂配方组成试剂A组织裂解液；试剂BDNA提取液；试剂CPCR反应液，其中含有特定引物IHHNV－5’5’－TCATCCCGACGACGAAGAA和IHHNV－3’5’－GGTTGTCTCCTCCGCTTGTC。使用本发明的试剂盒，经实际试验，证明可以快速、灵敏、准确地判断各种对虾苗种、幼虾、成虾及亲虾是否携带传染性皮下及造血组织坏死病毒。
文档编号C12Q1/70GK1410549SQ0112787
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月21日 优先权日2001年9月21日
发明者胡超群, 沈琪, 任春华, 张吕平 申请人:中国科学院南海海洋研究所