专利名称：人受精促进肽受体tcp11及其编码序列及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产，更具体地说，本发明的多肽被命名为人受精促进肽受体TCP11。
在正常的生理状态下，哺乳动物的精子要进行成功的受精，必须经过获能和随后的顶体反应。顶体反应这一细胞外的事件使精子穿透透明带并和卵细胞的质膜融合，而获能过程则使精子在正确的时间和地点获得受精能力。在正常的生理状态下，仅有极少数的精子能真正到达受精地点，而这种对于精子群体的选择压力有助于确保“最合适的”精子能够受精，因此，对于精子获能过程的调控机制的研究具有重要的理论意义和临床意义(Fraser LR.(1998)Sperm capacitation and the acrosome reaction.Hum Reprod.Suppl 19-19)1991年，Mazarakis等采用差异筛查的方法克隆了鼠Tcp11基因(Mazarakis，N.D.，et al.(1991).Isolation and characterization of a testis-developmentally regulated gene from the distalinversion of the mouse t-complex.Devolopment 111(2)561-567.)。首先制备睾丸cDNA文库，用来源于鼠肝和睾丸的随机cDNA探针筛查该文库，得到600个“睾丸特异的”克隆。再用2周和3周来源的cDNA探针筛查这些克隆，得到259个克隆。为了区分减数分裂前(2 weeks)和减数分裂期、减数分裂后(3 weeks)各个阶段，用3周来源的cDNA探针筛查，得到12个克隆。随后用来自这12个克隆的cDNA探针与2周和3周来源的睾丸、肾、肝、脑的总RNA进行杂交，得到了2个克隆与三周鼠的睾丸总RNA有杂交信号。其中，Clone46作进一步研究。以Clone46来源的cDNA探针与17天→27天的鼠的睾丸总RNA进行Northern杂交，显示从减数分裂粗线期的较后阶段或次级精母细胞的较早阶段开始表达，具有阶段性。对此克隆测序，获得1515bp的部分序列。用此片段作探针筛查t6/tw1鼠睾丸cDNA文库，得到一个含有2028bp的克隆，并含有完整的开读框架，编码566个氨基酸，对比Clone46和pBs13的序列，在510、789有2个静止突变，而在508位的G→C的转换使pBs13编码的Gly→Clone46编码的Arg，而修饰了一个PKC的磷酸化位点。pBs13即鼠Tcp11基因定位于鼠17号染色体t complex的distal inversion。
用Ecoli重组蛋白制备的anti-Tcp11抗体识别后期精子，Western blot显示，抗体结合一个来自于睾丸的68KD的蛋白质，而在其他组织来源的蛋白质中未检测到杂交信号。对比TCP11 mRNA和蛋白质的表达，显示了该基因处于翻译调控之下(Hosseini，R.，etal.(1994).The mouse t-complex gene，Tcp-11，is under translational control.Mech.Dev.47(1)73-80.)1997年，Fraser等通过anti-Tcp11 IgG抗体证实Tcp11蛋白位于精子顶体的Cap区域，但是在顶体反应的精子的头部未检测到。当附睾精子在anti-Tcp11 IgG Fab片段孵育120min后，进行CTC分析，观察到anti-Tcp11 IgG Fab片段对获能的促进作用和偶然顶体丢失的抑制，提示处理组比未处理组的精子具有更高的受精能力。体外受精试验也证实，anti-Tcp11 IgG Fab片段能更快地受精和维持更高的受精能力。
因为anti-Tcp11 IgG Fab片段的这些反应与FPP和Adenosine的作用类似，同时进行三组实验，结果显示Fab片段的作用位点与FPP相同而与Adenosine相区别。同时FPP的竞争性抑制剂Gln-FPP抑制Fab片段的作用，而FPP的浓度效应抑制Fab片段的促进作用，提示Tcp11是FPP的受体(Fraser，L.R.et al.(1997).TCP-11，the product of a mouse t-complex gene，plays a role in stimlation of capacitation and inhibition of the spontaneous acrosome reaction.MolReprod Dev 48(3)375-378)。
进一步的实验也证实了这一点，特异性的3H-FPP对于精子膜的结合，可以显著地被Gln-FPP和anti-Tcp11 IgG Fab片段抑制。因此证实，FPP、Gln-FPP、anti-Tcp11 IgG Fab片段竞争同一个结合位点。此外，用抗血清A231287有到顶体反应的精子比未处理的精子结合的3H-FPP显著地减少，提示大部分FPP的结合位点与精子顶体的Cap域有关，Tcp11正定位于此(Adeoya-Osiguwa S.A.et al.(1998).FPP modulates mammalian sperm function via TCP-11 andthe adenlyl cyclase/cAMP pathway.Mol.Reprod.Dev.51(4)468-476)。
同时有实验证实，100nM的FPP显著地促进cAMP的产生，Gln-FPP抑制FPP的这种作用，但不抑制Adenosine的作用。而anti-Tcp11 IgG Fab片段(1/25 dilution)促进cAMP的产生。这些证据均支持Tcp11蛋白是FPP的受体(Fraser LR et al.(1997)A fertilization promoting peptide(FPP)-related tripeptide competitively inhibits responses to FPPa cause of male subfertility？Mol Reprod Dev.48(4)529-35)。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码人受精促进肽受体基因TCP11的蛋白，本发明新的人类基因被命名为人TCP11。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人MGRF-2的方法。
本发明还涉及这种人TCP11核酸序列利多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQID NO7所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO6从核苷酸185-1510位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人TCP11蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，较佳的，该多肽是具有SEQ ID NO7序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人TCP11蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人TCP11蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人TCP11蛋白的重组细胞。
(c)在适合表达人TCP11蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞。
(d)分离出具有人TCP11蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1722个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO6，其中开放读框位于185-1510位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”和“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组份分开。
在本发明中，术语“人TCP11蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO6中185-1510位核苷酸序列及其简并序列，该简并序列是指，位于SEQ ID NO6序列的编码框185-1510位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO6中185-1510位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO74所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，较佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO6从中核苷酸185-1510位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该主语还包括与SEQ ID NO6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人TCP11相同功能的蛋白的、SEQ ID NO6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)，纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度，基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人TCP11蛋白多肽”指具有人TCP11蛋白活性的SEQ ID NO7序列的多肽。该术语还包括具有与人TCP11相同功能的、SEQ ID NO7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人TCP11蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人TCP11 DNA杂交的DNA所编码的蛋白。以及利用抗人TCP11多肽的抗血清获得的多肽或蛋白，本发明还提供了其他多肽，如包含人TCP11多肽或其片段的融合蛋白，除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了TCP11多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人TCP11多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明还提供人TCP11蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人TCP11多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术，类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物，应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人保守性TCP11变异多肽”指与SEQ ID NO7的氨基酸序列性质相比，有至多10个，较佳的至多8个，更佳的至多5个，最佳的至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明还包括人TCP11多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内人TCP11的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核苷酸分子，该分子通常具有人TCP11核苷酸序列的5-110个，较佳地15-50个连续核苷酸，该探针可用于检测样品中是否存在编码人TCP11的核酸分子。
本发明还包括检测人TCP11核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人TCP11多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
本发明所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列，一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酶母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞，COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人TCP11 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人TCP11基因产物或片段，较佳地，指那些能与人TCP11基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人TCP11蛋白的分子，也包括那些并不影响人TCP11蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人TCP11基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利NO 4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人TCP11基因产物或其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人TCP11或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人Eur.J.Immunol.6611，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.1981)。本发明的抗体包括能阻断人TCP11功能的抗体以及不影响人TCP11功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人TCP11基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人TCP11基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与释放后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人TCP11核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得，对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已经的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
只要获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时，通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，多核苷酸全长为1722个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO6，其中开放读框位于185-1510位核苷酸。
同源检索发现，本发明的基因同小Tcp-11高度同源。在氨基酸水平上它与小鼠的相关基因Tcp-11的一致性为78％(
图1)。可以推测本发明的基因是小鼠Tcp-11在人体中的同源基因。
在附图中，图1为本发明的人TCP11蛋白(上方)与小鼠Tcp-11蛋白(下方)的氨基酸序列同源比较图，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“*”标出，相似的氨基酸用“.”或“”标出。
图2为本发明的人TCP11基因的CDNA序列及编码的氨基酸。其中ATG为起始密码，TGA为终止密码，AATAAA为加尾信号。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1人TCP11的cDNA序列的克隆和测定1、逆转录反应及3’-cDNA末端快速扩增((Rapid amplification of cDNA ends，RACE)。
按QIAGEN公司总RNA提取试剂盒提供的方法提取和处理睾丸组织总RNA，取3ul用于逆转录反应，逆转录反应采用SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech)进行。3’-RACE-Ready cDNA由健康成人睾丸总RNA逆转录而来。3’-通用引物(Universal primer mix，UPM)由试剂盒提供。TCP11等位基因特异的引物(the gene specific primer，GSP)序列为5’-CGA AAT ATC CTG GCG ACT CAG AGG-3’(SEQ ID No1)PCR反应条件94℃ 2min；94℃ 30sec，68℃-0.5℃/cycle 30sec，72℃ 2min，10cycles；94℃ 30sec，63℃ 30sec，72℃ 2min，22cycles；最后72℃延伸10min。
2、PCR产物的测序将上述获得的PCR扩增产物与pGEM-T easy载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM107，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，然后在ALF express DNA sequencer进行双向测序。最后用电脑软件Omiga2.0拼接序列，获得全长cDNA序列，共1722bp，详细序列见SEQ ID NO6，其中开放读框位于185-1510位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人TCP11的氨基酸序列，共441个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO7。
实施例2同源比较用本发明的人TCP11的全长cDNA序列，用NCBI的BLAST程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)与已收录的ESTs和nr数据库进行核酸同源性分析，用预测的全长开读框架的核酸序列与相应的氨基酸序列搜索nr和SWISS-PROT数据库，进行氨基酸同源性分析，结果发现本发明的基因同小鼠Tcp11高度同源。在氨基酸水平上它与小鼠的Tcp11的相同性为78％(图1)。可以确定本发明的人TCP11基因是小鼠Tcp11在人体中的同源基因。
此外，本发明人TCP11(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人TCP11的表达水平或者抑制人TCP11的过度表达。本发明的人TCP11蛋白或其活性多肽片段可能施用于病人，以治疗或减轻因人TCP11缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断，尤其是对因为该基因功能受损而引起的男性不育患者。
实施例3人TCP11在大肠杆菌中的表达编码人TCP11的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中含全长cDNA质粒为模板进行扩增，以合成插入片段。
5’寡核苷酸引物序列为5’-TTGCGGATCCATGGCACCAAAAGGCATATTGGG(SEQ ID NO2)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人TCP11编码序列的23个核苷酸；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTTCGTCGACTCAAACAGACTCCACTTTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO3)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，一个释放终止子和人TCP11的编码序列。
限制性同切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操作子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和SaII消化pQE-9载体、插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始，随后用连接混合物转化购自Oiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Konr)。在含有Amp和Kau的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用BstXI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明人TCP11的cDNA插入片段已正确装入载体。
过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-产乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000mg，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人TCP11。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人TCP11，可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO7的序列一致。
实施例4人TCP11在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人TCP11的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，用实施例1中含全长cDNA质粒为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-TTGCGAGCTCATGGCACCAAAAGGCATATTGGG(SEQ ID NO4)该物引含有SalI限制性内切酶的酶切位点，按之是由起始密码子开始的人TCP11编码序列的19个核苷酸。
3’端引物序列为5’-GTTCGGATCCTCA AACAGACTCCACTTTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO5)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和人TCP11的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗体(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(flori)、一个病毒复制起点(SV 40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的poly A顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用SacI、BamHI消化pcDNA3载体、插入片段，随后将插入片段连接到poDNA3载体，随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证结果表明人TCP11的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力，去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％ Triton的50mM Tris HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰，再用50mM Tris HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(Ph8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析，最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO7的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下，重组分子用层析法进行分离后备用，也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用50-100ug/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100ug/0.2ml的剂量进行腹内注射以加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次，获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人TCP11基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
序列表(1)一般信息(i)申请人四川大学华西医院(ii)发明名称人受精促进肽受体TCP11及其编码序列，及制法和用途(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO 1的信息(i)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 1CGA AAT ATC CTG GCG ACT CAG AGG(2)SEQ ID NO 2的信息(i)序列特征(A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 2TTG CGG ATC CAT GGC ACC AAA AGG CAT ATT GGG(3)SEQ ID NO 3的信息(i)序列特征A)长度35碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 3GTT CGT CGA CTC AAA CAG ACT CCA CTT TTG TTT CC(4)SEQ ID NO 4的信息(i)序列特征A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 4TTG CGA GCT CAT GGC ACC AAA AGG CAT ATT GGG(5)SEQ ID NO 5的信息(i)序列特征A)长度35碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 5GTT CGG ATC CTC A AA CAG ACT CCA CTT TTG TTT CC(6)SEQ ID NO 6的信息(i)序列特征A)长度1722碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 61 cgaaatatcc tggcgactca gagggcagag aacgtaacta gtcatcaaac tgaggagctg61 tccgtgtgca acaactcaag ataaaattct tgactattga aatgcgaaaa attagattga121 ggctttgcgg ctgaattaga ttggtttttc ttgtggccac atgaggtcgc tgctggttaa181 ctgaatggca ccaaaaggca tattggggtc atttccaaca gctatgaacc tgagtctgga241 aggcaaggtc aaggagacag tgcacaatgc cttttgggac catcttaaag agcaactatc301 agcaactccc cctgacttca gctgtgctct tgaacttctg aaagaaatta aagagatctt361 gctatcactg ctattaccac gccagaaccg cctgagaatt gagattgaag aagctctgga421 catggacttg ctcaagcagg aggcagaaca tggggccctg aaagtcctct atctctctaa481 gtacgttctc aacatgatgg ctttgctgtg tgcaccagtt cgagatgaag cagtgcagaa541 actagaaaac attacggatc ctgtttggct actgagaggg atcttccagg ttctgggccg601 gatgaaaatg gacatggtga actacactat ccagagcctt caaccccacc tgcaggaaca661 ttccattcag tatgaacggg ctaaattcca ggaactcctc aataagcagc ctagtctcct721 taatcacacc accaaatggc tgacccaagc agcaggagac ctcaccatgt cacctccgac781 ttgcccagac acttctgact cctccagtgt ggctggcccc tctcccaatg aggcagccaa841 caacccagag cccctcagcc ccacaatggt gctgtgtcag ggcttcttga acctccttct901 ctgggacctt gaaaatgaag agttccctga gaccctgctg atggacagaa cccggctgca961 ggagctgaag tcccagttgc accagttaac cgtcatggcc tcagtcttgc tggtggccag1021 tagtttctcc ggcagtgttt tgtttggctc accccaattt gtagataaac tgaaacgcat1081 aaccaaatcc ttgttggaag actttcactc caggcctgag gaagctatac tgactgtgag1141 tgaacaggta tctcaggaaa tccatcaaag cctcaagaat atgggccttg ttgctctaag1201 cagtgataat acagcatctc taatgggaca gctccagaac attgccaaga aggagaactg1261 tgtctgcagt gttattgatc agcggatcca tttgtttctc aaatgctgtt tggttcttgg1321 tgtgcagcgg tctctattag accttcctgg aggccttact ctcattgaag cagaactggc1381 agaactgggc caaaagtttg tcaacttgac acatcacaat cagcaggtgt ttggtcccta1441 ctacactgag atcctaaaaa ccctcatttc cccagcccag gcactggaaa caaaagtgga1501 gtctgtttga tagcgtcggc tcagagccct ggtaccttgg acccaagagg aggcccatca1561 tcttcctgga gtaacatcac cagtgaccag cagacagtga gcttctatcc caggccctgc1621 agccagtaca ccaaggctgt agggatcaag catgtaaaca ccaactggtc catacccatt1681 cattaataaa cttcttaagt gcaagaagaa aaaaaaaaaa aa(7)SEQ ID NO 7的信息(i)序列特征A)长度441碱基(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO 7MAPKGILGSFPTAMNLSLEGKVKETVHNAFWDHLKEQLSATPPDFSCALELLKEIKEILLSLLLPRQNRLRIEIEEALDMDLLKQEAEHGALKVLYLSKYVLNMMALLCAPVRDEAVQKLENITDPVWLLRGIFQVLGRMKMDMVNYTIQSLQPHLQEHSIQYERAKFQELLNKQPSLLNHTTKWLTQAAGDLTMSPPTCPDTSDSSSVAGPSPNEAANNPEPLSPTMVLCQGFLNLLLWDLENEEFPETLLMDRTRLQELKSQLHQLTVMASVLLVASSFSGSVLFGSPQFVDKLKRITKSLLEDFHSRPEEAILTVSEQVSQEIHQSLKNMGLVALSSDNTASLMGQLQNIAKKENCVCSVIDQRIHLFLKCCLVLGVQRSLLDLPGGLTLIEAELAELGQKFVNLTHHNQQVFGPYYTEILKTLISPAQALETKVESV
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于它包括编码具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述的序列编码—多肽，该多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于该序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列。
4.一种分离的TCP11蛋白多肽，其特征在于它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物；更佳的该多肽是具有SEQ IDNO.7序列的多肽。
5.一种载体，其特征在于它含有权利要求1所述的DNA。
6.一种用权利要求5所述载体转化的宿主细胞。
7.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于该细胞包括原核细胞和真核细胞。
8.根据权利要求7所述宿主细胞，其特征在于原核细胞有大肠杆菌、枯草杆菌；真核细胞有酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；较佳的真核细胞有CHO细胞、COS细胞。
9.一种产生具有人TCP11蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人TCP11蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人TCP11蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸185-1510位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人TCP11蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人TCP11蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人TCP11蛋白活性的多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.6中人核苷酸185-1510位。
11.一种能与权利要求4所述的TCP11蛋白多肽特异性结合的抗体。
12.一种核苷酸分子，其特征在于它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
13.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中5-110个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人受精促进肽受体基因TCP11蛋白。本发明的蛋白被命名为TCP11蛋白。本发明提供了该TCP11蛋白的cDNA编码序列、该序列编码的多肽，以及利用重组技术生产所述的新的人TCP11蛋白的方法。本发明还提供了这种新的人TCP11蛋白的应用。
文档编号C12P21/02GK1408866SQ0112885
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月17日 优先权日2001年9月17日
发明者张思仲, 马用信, 夏庆杰, 肖翠英, 邱为民 申请人:四川大学华西医院