专利名称：一种将外源基因转入灵芝的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过化学诱导将外源基因转入灵芝的方法，尤其是涉及一种利用聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液(PTC)将外源基因高效转入灵芝的方法。
灵芝是一种珍贵的药用和食用菌，由于对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起了国际医学界的瞩目。中国、日本、韩国、英国、美国已广泛开展了灵芝的生化、药理、临床等方面的研究。但是关于灵芝的分子生物学方面的研究，目前很少见报道，迄今尚未有外源基因转入灵芝中的报道。为了进行灵芝的分子生物学研究，建立一个高效的转化系统是必需的，也是利用现代基因工程定向改良灵芝的药用品质的前提。此外，灵芝是一种对人体无任何毒副作用的大型药用和食用真菌，以它作为外源基因的受体菌，对人体安全可靠，具有与细菌、酵母菌等不同的独特优点，它是一种应用前景很广的异源基因表达系统。因此，通过基因工程技术建立稳定、高效的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。
本发明的目的在于提供一种利用PTC转化缓冲液将外源基因高效转入灵芝的方法，以便建立稳定、高效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种。
本发明的目的是通过以下技术措施实现的用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后，利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。本方法的转化效率可达60-100个转化子/μgDNA.107转化子。
本发明包括以下具体步骤(1)灵芝原生质体的制备用PDA液体培养基26-28℃，120-180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟；接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，160-200rpm摇床培养3天；用由1-5g溶壁酶溶解于100mL0.1-1.0mol/L的渗透压稳定剂溶液而成的溶壁酶液，按每300mg灵芝菌丝体加1mL溶壁酶液计算，在30℃、pH值为6.0条件下酶解3-4小时；将所得原生质体用灭菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂洗涤一次，然后用15mL STC洗涤一次，最后溶于1mL STC中；血球计数板计数，然后稀释到108个/mL，4℃保存备用；(2)原生质体转化取160μl灵芝原生质体(约2×107个)，加入30-70μL PTC转化缓冲液，再加入10-50μL真菌表达载体、浓度为10-100mmol/L的ATA 10-100μL和浓度为10-100mmol/L亚精胺5-50μL，充分混匀后，冰浴45分钟；然后加入1-2mL STC缓冲液，室温静置25分钟；4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1-2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板；一般2-3个星期后，转化子长出。
本发明中所述的真菌表达载体通常为含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒；该质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达。
本发明中所述的MYG液体再生培养基为麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。
本发明中所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。
本发明中所述的PTC缓冲液由浓度为10-80％(w/v)的PEG4000，浓度为1-10mmol/L的CaCl2，浓度为1-10mmol/L的Tris混合而成。
在本发明中所述的STC缓冲液由浓度为0.1-0.8mol/L的山梨醇，浓度为的10-100mmol/L Tris.Cl，浓度为10-100mmol/L的CaCl2混合而成。
本发明方法适用于现有的各种灵芝菌种，例如泰山赤灵芝，日本灵芝，韩国灵芝等，可用于转化的外源基因包括动物、植物、细菌等各种来源的基因。以下以p53基因(一种抑癌基因)的转化为例，并结合
本发明方法的效果。
从图1至图3可以看出，经本发明方法用含有p53基因的pAN7-1质粒转化处理的灵芝原生质体在含有100μg/mL HmB的MYG平板上生长出众多菌株，而且这些菌株在无选择压力的情况下经过5次传代后，仍能保持良好的HmB抗性；而未经本发明方法处理的灵芝原生质体则全部不能在含HmB的MYG平板上生长；说明本发明方法已有效地将外源质粒转入灵芝中，并且使该质粒上的hph基因在灵芝中得到稳定、高效表达，图4中，野生型灵芝菌株总DNA与探针之间没有形成杂交带，而转化株p53-1#、2#未酶切的基因组DNA样品，在高分子量的位置与探针形成杂交带。证明含有p53基因的外源质粒已经整合到这两株灵芝的基因组DNA中。转化株p53-1#基因组DNA用BamHI单酶切的样品，则在约2kb和4kb处各产生1条杂交带(两条杂交带的大小系根据图中各电泳条带的迁移率估算得出的)，证明可能有2个拷贝的p53基因整合到p53灵芝转化株1#的基因组DNA中。从图5中，我们测得转基因菌株p53-1#和p53-2#的OD630分别为0.363和0.469，扣除阴性对照孔(来自非转化灵芝菌丝的总蛋白)的OD630值0.093后，二者的净OD值分别为0.270和0.303，根据线性回归方程求得二者的浓度分别为8.45U/ml和11.22U/ml，换算成干菌丝含量分别为16.90U/g和22.44U/g。即1#、2#转基因灵芝菌株中，每克灵芝干菌丝中可表达p53蛋白16.90U和22.44U。
从5张图的显示结果已充分说明本发明方法能有效地将外源基因高效转化入灵芝中，并使之得到稳定的复制、传代和表达，从而建立了灵芝的高效转化系统。
本发明方法所建立的灵芝转化系统，为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用和开发。具体说来，主要包括1.灵芝有着很高的蛋白质分泌能力，能正确进行表达产物的翻译后加工，包括肽链剪切和糖基化等，且糖基化的方式与高等真核生物的类似，而且灵芝还是已经确认的安全菌株，对人体有益无害，并有成熟的发酵和后处理工艺，因而可以利用灵芝转化技术将一些具有重要经济价值的、来自高等生物的外源基因导入灵芝中表达。这样，利用灵芝发酵方法即可快速、大规模、廉价地生产具有活性的外源蛋白质。
2.通过灵芝转化技术将一些与优良性状有关的基因导入灵芝中，可在短时间内快速定向改良灵芝菌株，培育出优质高产的灵芝新品种。
3.在基础研究方面，灵芝的转化作为真菌的基因克隆和表达系统，可用于基因分离、基因组结构、基因表达及其调控等方面的研究，并且可为建立其它大型真菌的转化系统提供理论和实验依据。
下面对附图作具体说明。
图1是未经转化处理的灵芝原生质体在含有100μg/mL HmB(潮霉素)的MYG平板上培养15天后的结果。
图2是用本发明方法将含有p53基因的pAN7-1质粒进行转化处理后的灵芝原生质体在含有100μg/mL HmB的MYG平板上培养15天后的结果。
图3是从图2中的转化平板上随机挑取3个含有p53基因的抗性转化子，将这3株转化子先在不含HmB的MYG平板上连续传代5代后，再接种到一个含有100μg/mL HmB的MYG平板上培养3星期后的结果。
图4是将2个随机选取的p53基因灵芝转化菌株和一株未转化的野生型灵芝菌株进行Southern blot分析的结果。其中，1号泳道为质粒pAN7-1(6.7kb长，酶切成线状质粒)的Southern blot结果，作为正对照。2号泳道为野生型灵芝基因组DNA的Southern blot结果，作为负对照。3号泳道为转化株p53-1#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。4号泳道为转化株p53-2#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。5号泳道为转化株p53-1#基因组DNA BamHI酶切的Southern blot结果。
图5是将上述两株p53基因灵芝转化菌株进行ELISA分析的结果。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
用PDA液体培养基于28℃，180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mLMYG再生培养基中，200rpm摇床培养3天，然后以4000转/分钟离心10min，去上清液，用0.6mol/L的硫酸镁溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取1克灵芝湿菌丝，加3mL由2g溶壁酶溶于100mL0.6mol/L的硫酸镁溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解2小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到108个/mL，4℃保存备用。
取160μl灵芝原生质体(约2×107个)，加入30μL PTC转化缓冲液，再加入20μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒(约10μg)和50μL、10mmol/L ATA，5μL、20mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为60个转化子/μgDNA.107原生质体。
本实施例1中的MYG液体再生培养基为麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。
本实施例1中的PTC缓冲液由浓度为10％(w/v)的PEG4000，浓度为1mmol/L的CaCl2，浓度为1mmol/L的Tris混合而成。
本实施例1中的STC缓冲液由浓度为0.1mol/L的山梨醇，浓度为的10mmol/L Tris.Cl，浓度为10mmol/L的CaCl2混合而成。
实施例2用PDA液体培养基于26℃，140rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体4天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mLMYG再生培养基中，180rpm摇床培养3天，然后以3000转/分钟离心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取2克灵芝湿菌丝，加5mL由2.5g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的甘露醇溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到108个/mL，4℃保存备用。
取160μl灵芝原生质体(约2×107个)，加入50μL PTC转化缓冲液，再加入15μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒(约15μg)和20μL、20mmol/L ATA，10μL、10mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1.5mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1.5mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为85个转化子/μgDNA.107原生质体。
本实施例2中的MYG液体再生培养基为麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。
本实施例2中的PTC缓冲液由浓度为40％(w/v)的PEG4000，浓度为5mmol/L的CaCl2，浓度为5mmol/L的Tris混合而成。
本实施例2中的STC缓冲液由浓度为0.4 mol/L的山梨醇，浓度为的50mmol/L Tris.Cl，浓度为50mmol/L的CaCl2混合而成。
实施例3用PDA液体培养基于27℃，150rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mLMYG培养基中，130rpm摇床培养4天，然后以4000转/分钟离心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取5克灵芝湿菌丝，加15mL由3g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的葡萄糖溶液中而成的溶壁酶液，30℃酶解3小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.6mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到108个/mL，4℃保存备用。
取160μl灵芝原生质体(约2×107个)，加入70μL PTC转化缓冲液，再加入50μL含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒(约20μg)和50μL、100mmol/L ATA，20μL、30mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入2mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG再生固体培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为75个转化子/μgDNA.107原生质体。
本实施例3中的MYG液体再生培养基为麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。
本实施例3中的PTC缓冲液由浓度为80％(w/v)的PEG4000，浓度为10mmol/L的CaCl2，浓度为10mmol/L的Tris混合而成。
本实施例3中的STC缓冲液由浓度为0.8mol/L的山梨醇，浓度为的100mmol/L Tris.Cl，浓度为100mmol/L的CaCl2混合而成。
权利要求
1.一种利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后，利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。
2.根据权利要求1所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是包括以下具体步骤(1)灵芝原生质体的制备用PDA液体培养基26-28℃，120-180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟；接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，160-200rpm摇床培养3天；用由1-5g溶壁酶溶解于100mL0.1-1.0mol/L的渗透压稳定剂溶液而成的溶壁酶液，按每300mg灵芝菌丝体加1mL溶壁酶液计算，在30℃、pH值为6.0条件下酶解3-4小时；将所得原生质体用灭菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂洗涤一次，然后用15mL STC洗涤一次，最后溶于1mL STC中；血球计数板计数，然后稀释到108个/mL，4℃保存备用；(2)原生质体转化取160μl灵芝原生质体(约2×107个)，加入30-70μL PTC转化缓冲液，再加入10-50μL真菌表达载体、浓度为10-100mmol/L的ATA 10-100μL和浓度为10-100mmol/L亚精胺5-50μL，充分混匀后，冰浴45分钟；然后加入1-2mL STC缓冲液，室温静置25分钟；4℃8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1-2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板；一般2-3个星期后，转化子长出。
3.根据权利要求1或2所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是所述的真菌表达载体通常为含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒；该质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达。
4.根据权利要求2所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是所述的MYG液体再生培养基为麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；再在该MYG液体培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。
5.根据权利要求2或4所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。
6.根据权利要求1或2所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是所述的PTC缓冲液由浓度为10-80％(w/v)的PEG4000，浓度为1-10mmol/L的CaCl2，浓度为1-10mmol/L的Tris混合而成。
7.根据权利要求2所述的利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法，其特征是所述的STC缓冲液由浓度为0.1-0.8mol/L的山梨醇，浓度为的10-100mmol/L Tris.Cl，浓度为10-100mmol/L的CaCl2混合而成。
全文摘要
本发明公开了一种将外源基因转入灵芝的方法,用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体,所制备的原生质体经精制、纯化后,利用PTC转化缓冲液,以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞,将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中,再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养,从而获得灵芝转化株。本方法的转化效率可达60－100个转化子/μgDNA.10
文档编号C12N1/14GK1358840SQ0112974
公开日2002年7月17日 申请日期2001年10月11日 优先权日2001年10月11日
发明者李刚, 李宝健 申请人:李刚, 李宝健