专利名称：一种零背景高通量定向表达克隆的方法
技术领域：
本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种零背景高通量定向表达克隆的方法。特别适合于利用PCR产物直接构建表达文库。
背景资料基因组测序提供了大量的新的基因，迫切需要发展新的技术大规模地研究基因和蛋白质的功能，因而很多公司都致力于发展高通量克隆表达技术。
目前已有几家公司推出了高通量的克隆表达系统，如Invitrogen的EchoTM系统、Gibco/Life Technologies的GatewayTM系统，Novagen pTriEx-1的克隆系统，这几个系统采用的技术路线相似，即克隆PCR的产物后，用Cre酶介导LoxP位点的同源重组构建表达载体，不需经限制性内切酶介导进行亚克隆，能高通量构建多种表达载体。这在一定程度上提高了实验效率，降低了实验成本。但这几种方法均存在不足，主要表现在以下三个方面一、实验周期长，克隆效率低，不能零背景、定向克隆。以上高通量克隆表达系统进行基因克隆的第一步采用的是常规PCR扩增，连接酶介导连接的方法。为了提高连接效率，载体中往往引入致死基因来消除载体自连背景。用T载体克隆PCR产物是一个很有效的方法，但利用T载体，不能用高保真的DNA聚合酶扩增目的基因，因为只有缺乏3′---5′校正酶活性的DNA聚合酶才能在PCR扩增产物3′端加一个碱基A，与T载体3′端突出的T互补，这样造成了PCR掺入错误增加。另外，目的基因不能定向克隆到表达载体上，所以这些方法都需要经过较复杂的筛选才能得到正确的克隆。Invitrogen公司的基于拓扑异构酶I(Topoisomerase I)介导的五分钟快速连接的克隆方法被认为是目前最先进的克隆方法，但它也没有解决克隆的保真性和方向性问题。PCR扩增的目的基因克隆到拓扑异构酶化的载体后，需经PCR找出基因以正确方向插入的克隆，然后从这些正确克隆中随机挑选几个经测序分析以确定克隆基因内部有无PCR引入的突变；众所周知，缺乏3′---5′校正酶活性的DNA聚合酶在每轮PCR扩增过程中的错误率为0.1％(而高保真的DNA聚合酶(如Pfu)的保真性是缺乏3′---5′校正酶活性的DNA聚合酶的10倍以上)，因而测序分析是不可避免的，这样从扩增目的基因到筛选出插入方向正确、读框正确的克隆至少需要三天的时间，另外，由于拓扑异构酶识别的碱基序列为CCCTT，且它催化的是一个可逆反应，所以如果克隆片段较大，克隆的效率会大大降低。1999年John AHeyman等人利用此方法大规模克隆和表达啤酒酵母的6035个开放阅读框时，只有75％的开放阅读框得到以正确方向插入克隆，其中只有41％克隆在酵母中成功表达，因而整个实验的成功率最终只有30％。
二、Cre酶介导loxP位点的同源重组构建表达载体的方法，能广泛适用于构建以细菌、真菌、动物、植物等为宿主的表达载体，是一个高通量的方法，但它也有着缺陷1、主要适合融合表达，目的基因一般融合在loxP位点的C端，表达的目标蛋白N端会多出十多个氨基酸，这与天然蛋白质的构象及功能上必定会有一定的差异。
2、loxP位点是一个反向重复序列，能形成一个茎环结构，降低翻译的效率，难以适应非融合表达。
3、难以平行构建原核表达载体和真核表达非融合载体，引入loxP位点在起始密码上游，势必要引入三十几个额外核苷酸，不能同时满足原核SD序列的距离要求及真核Kozak序列的一致性要求。
三、实验成本较高，对大规模的研究来说并不经济。基因克隆使用的拓扑异构酶化的载体昂贵(19美元/反应)，介导同源重组的Cre酶也较贵(10美元/反应)，用PCR鉴定克隆方向及通过测序分析选择正确的开放阅读框都极大的增加了研究成本。
(参见刊物“Genome Research 1999年第9卷383-392页”；“Protein Expression and Purification 2001年第22卷159-164页”)发明内容本发明的目的是提供一种生物基因表达克隆的技术，真正能做到零背景，高通量定向克隆，且能同时构建原核表达载体和真核表达栽体，既能融合表达，也能非融合表达。
本发明是这样实现的。按克隆的目标要求选择一个表达载体和目标基因。在表达载体中引入了两个特殊限制性内切酶酶切位点序列和一个致死基因表达单元；在目标基因一对PCR扩增引物的5′端分别引进了3----5个特定的碱基，在dATP(或dGTP或dCTP或dTTP)存在的条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体双酶切得到的粘性末端匹配，从而可以定向克隆在经两个特殊的限制性内切酶双酶切的载体上。
具体做法是，选择一个表达载体和目标基因。在表达载体上首先设计一个多核苷酸的接头，其两端分别引进一个Cpo I和Not I酶切位点，中间接一个致死基因的表达单元，将此接头引入表达载体上。载体经Cpo I和Not I双酶切，产生这样两个粘性末端3′ GC—— —— ——CGCCGG5′5′GTCCG—— —— ——GC3′；扩增目标基因的一对PCR引物的5′端分别引进5′GACT3′和5′GGCCT3′这样4--5个核苷酸，PCR扩增得到的产物加dATP和T4DNA聚合酶作用，产生这样的粘性末端5′GACT—— —— ——A 3′3′ A—— —— ——TCCGG 5′；该粘性末端正好可与载体双酶切产生的的粘性末端匹配，从而使PCR产物定向克隆到载体上。
多核苷酸接头两端的限制性内切酶可以是Cpo I、Ear I、Not I、Sap I、Sty I中的任意两种或Cpo I、Ear I、Sap I、Sty I中的任一种。任何酶切后能得到的5′突出粘性末端的碱基种类不超过3种(含3种)的限制性内切酶均能使用。
本发明与现有技术相比具有明显的优势一、能做到零背景，高通量定向克隆。首先PCR引物与克隆载体都经过了特殊的设计，每一对PCR引物均可在其5′端额外引进2--5个特定的核甘酸，得到的PCR产物经T4DNA聚合酶处理后，会产生相互不能匹配的的粘性末端，而载体上引入一个接头，用特殊的限制性内切酶消化后产生的粘性末端恰好能与处理过的PCR产物的粘性末端匹配，使外源片段定向克隆到载体上，勿需再判断基因的插入方向，简化了实验步骤。由于所有的PCR扩增及载体构建均可采用这一思路，因而此方法适用于克隆目前所有的DNA聚合酶扩增的PCR产物，尤其适合用目前保真性最好的聚合酶(Pfu)进行PCR扩增，将PCR引入的突变降至最小，可省去测序的麻烦。为了避免载体自连的背景干扰，在载体上还引入了一个致死基因的表达单元，真正做到了零背景克隆。可进行5分钟快速连接，30分钟快速转化，大大提高了实验效率，整个基因克隆工作在一天内即可完成，克隆重组效率从理论上讲可达99％以上。
二、与目前报道的所有基于PCR建库的方法相容，可利用PCR产物直接构建表达文库，既适合于以细菌、真菌作为宿主的高通量克隆和表达，也适用于以动物、植物等作为宿主的高通量克隆和表达。
三、实验成本低。首先此技术省去了经PCR扩增判断基因的插入方向和测序分析基因的正确性这两步，大大减少了实验费用；其次不使用Cre酶和拓扑异构酶化的载体，只使用常规的T4DNA聚合酶和连接酶，每个反应的成本在人民币1元左右，是一个非常经济的方法。如果进行高通量的克隆和表达，其优越性更加突出。
具体实施例方式
下面以实施例对本发明进一步说明实施例1利用该方法在大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的寡聚-1，6-葡萄糖苷酶。
选择表达载体pBV220和目标基因寡聚-1，6-葡萄糖苷酶。设计一个多核苷酸的接头，其两端分别引进一个Cpo I和Not I酶切位点，中间接一个致死基因的表达单元，将此接头引入大肠杆菌表达载体pBV220上，即获得零背景高通量定向克隆的表达载体，将此载体用Cpo I和Not I双酶切，回收大片段，其两端各有一个5′端突出3个或4个碱基的粘性末端。根据枯草芽孢杆菌寡聚-1，6-葡萄糖苷酶的基因序列，设计一对引物，其5′端分别引进了5′GACT3′、5′GGGCCT3′这几个额外的核苷酸；以枯草芽孢杆菌的基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶(Pfu)进行PCR扩增，得到的产物在dATP存在情况下，经T4DNA聚合酶处理后，其PCR产物两端各有一个5′端突出3个或4个碱基的粘性末端，该产物能定向克隆到经Cpo I、Not I双酶切的载体上，再转化大肠杆菌，得到的转化子99％以上均能正确表达寡聚-1，6-葡萄糖苷酶。
实施例2黑曲霉内切菊粉酶在毕氏酵母中的表达。
按实施例1方法设计同样一个接头，引入毕氏酵母表达载体pIC3.5K上，按同样的方法设计扩增黑曲霉内切菊粉酶基因的引物，用Pfu聚合酶扩增黑曲霉内切菊粉酶基因，扩增产物在d ATP存在的条件下，同样用T4DNA聚合酶处理后定向克隆到经Cpo I、Not I双酶切的载体上，转化毕氏酵母，得到的转化子90％以上均能正确表达内切菊粉酶。
权利要求
1.一种零背景、高通量、定向克隆表达的方法，主要包括一个表达载体和经PCR引物扩增的目的基因，其特征在于在表达载体中引入了两个特殊限制性内切酶酶切位点序列和一个致死基因表达单元；在扩增目标基因一对PCR引物的5′端分别引进了3～5个特定的碱基，在dATP(或dGTP或dCTP或dTTP)存在的条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体双酶切得到的粘性末端匹配，从而可以定向克隆在经两个特殊的限制性内切酶双酶切的载体上。
2.根据权利要求1所述的零背景、高通量、定向克隆表达的方法，其特征在于在表达载体上首先设计一个多核苷酸的接头，其两端分别引进一个Cpo I和Not I酶切位点，中间接一个致死基因的表达单元，将此接头引入表达载体上，载体经Cpo I和Not I双酶切，产生这样两个粘性末端3′ GC—— —— ——CGCCGG5′5′GTCCG—— —— ——GC3′；目的基因一对PCR引物的5′端分别引进5′GACT3′和5′GGCCT3′这样3--4个核苷酸，PCR扩增得到的产物加dATP和T4DNA聚合酶作用，产生这样的粘性末端5′GACT—— —— ——A3′3′ A—— —— ——TCCGG5′；该粘性末端正好可与载体双酶切产生的的粘性末端匹配，从而使PCR产物定向克隆到载体上。
3.根据权利要求1所述的零背景、高通量、定向克隆表达的方法，其特征在于两个特殊的限制性内切酶，可以是酶切后能得到的5′突出粘性末端的碱基种类不超过3种(含3种)的限制性内切酶，具体可以是Cpo I (或Ear I、Not I、Sap I、Sty I)和Not I(或Cpo I、Ear I、Sap I、Str I)。
4.根据权利要求1所述的零背景、高通量、定向克隆表达的方法，其特征在于可与所有基于PCR建库的方法相容。
5.根据权利要求1所述的零背景、高通量、定向克隆表达的方法，其特征在于可用于以细菌、真菌、动物、植物作为宿主的高通量的克隆和表达。
全文摘要
本发明提出了一种零背景、高通量、定向克隆表达的方法,它是基于特定限制性内切酶双酶切表达载体,利用T
文档编号C12N15/66GK1341748SQ01133518
公开日2002年3月27日 申请日期2001年9月30日 优先权日2001年9月30日
发明者马立新, 蒋思婧 申请人:湖北大学