专利名称：注射用重组人白介素11制剂及制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程新药——注射用重组人白介素11的配方和制备工艺。
背景技术：
白介素11(IL-11)是一种直接刺激造血干细胞和巨核细胞增生并诱导巨核细胞成熟而促进血小板生成的细胞因子。1990年，Yang等发现，灵长类动物细胞PU-34(基质细胞来源)的培养上清中含有一种新的细胞因子可促使血小板升高，经鉴定与以往报道的其他细胞因子基因序列均不相同，命名为白介素11(IL-11)；随后，他们又克隆了人IL-11基因序列(GenBank Accession NoM81890)[1，2]。人IL-11分子有178个氨基酸，富含碱性氨基酸(等电点为11.7)，分子内或分子间无二硫键，亦无糖基化位点，原核细胞表达的IL-11具有与天然IL-11同样的生物活性。
化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，在许多类型肿瘤的治疗中取得了明显的治疗效果；但化疗药物普遍有明显的毒、副作用，尤其对造血、肠胃道等系统特别突出，严重限制了化疗药物的使用剂量及治疗效果，许多化疗方案在已经取得一定效果的时候也多因病人出现的造血功能障碍而中断。采用输血的途径一方面效果有限，另一方面又因日益增多的血源性疾病所困扰。血小板生成因子(TPO)和IL-11的出现使人们看到了治疗血小板减少症的希望。TPO同IL-11相比，在应用上存在两条明显的缺陷一是TPO升高血小板的作用过强，难以控制，容易发生血栓的形成，而IL-11提高血小板的作用较慢，不易引起血栓的形成；另外TPO必须经真核细胞表达才具有活性，其制备成本昂贵，而IL-11经原核细胞(细菌)表达就具备活性。因此，IL-11在生产工艺和临床应用方面更有优势。
重组人白介素-11用于预防骨髓抑制性化疗药物治疗非骨髓恶性肿瘤所造成的严重血小板减少症，并降低此类病人对血小板回输的需要。国内已有研究机构利用细菌表达系统以天然形式表达重组人白介素11，但其表达量极低，不能满足生产的要求。为满足我国广大肿瘤化疗病人的迫切临床需要，迫切要求有一种能提供大量的、高比活性的、价格合理的重组人白介素-11生产工艺。
技术内容本发明的目的是提供一种产品活性高、表达量高和纯化工艺简单的重组人白介素11制备工艺；以及一种不含任何保护剂和防腐剂、有效期长达24个月的注射用重组人白介素11制剂配方。
注射用重组人白介素11的处方为每支含a.1～7mg的重组人白介素11的冻干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O。
所述的注射用重组人白介素11，其优选方案为每支含a.3±0.5mg的重组人白介素11的冻干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O。
上述的注射用重组人白介素11的制备工艺包括菌种库→种子液制备→发酵→收菌→碎菌→制备融合蛋白粗制品→制备融合蛋白精制品→制备重组IL-11粗制品→制备重组IL-11粗制品→稀释、分装和冻干→成品检定，其特征在于种子菌液的制备取一支生产菌种，接种于含有氨苄青霉素100mg/LLB培养基平板，37℃培养16小时，挑取单个菌落接种到LB液体培养基中，振荡培养基使其OD600值在0.4～0.8之间，即可供发酵罐接种用。
发酵基础培养基溶液为(1升)Na2HPO4.12H2O 7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00g
Yeast 5.00gGlycerol 10.00g补料为(1升)MgSO4.7H2O5.00gTyphone83.33gYeast 41.67gGlycerol 416.67g发酵温度和时间37℃培养，以200ml/小时的速度补料，当OD600为7～8时调整温度至37℃，加入诱导剂IPTG，当浓度0.2mM时诱导4小时，然后终止发酵；碎菌取一定量的菌体，悬浮于适量的0.01M PBS(pH7.0)缓冲液中(菌体与悬浮液的体积比为1∶10)，冰浴下使用高压均质机进行碎菌，共三个循环；取样进行染色涂片，显微镜下检查，基本无完整细胞，离心(20000rpm)20分钟，4℃，收集上清即为粗制IL11的融合蛋白；融合蛋白精制品的制备将“融合蛋白粗制品”经连接了Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以Trx-IL-11融合蛋白为主(纯度大于70％)的蛋白溶液，为“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脱条件为不同pH的Tris-HCl缓冲液，融合蛋白精制品用0.1mol/L NaOH调整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小时；重组IL-11粗制品的制备“融合蛋白精制品”经SDS-PAGE电泳证实纯度后，加入一定剂量的重组牛肠激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小时后取小样进行SDS-PAGE电泳并染色，用IL-11标准品作对照，应出现相同分子量的明显条带，根据融合蛋白的残留量可将酶切时间适当延长，但不可超过40小时；重组IL-11精制品的制备“IL-11粗制品”经0.8m过滤后用水稀释至电导率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF阳离子交换柱纯化，上样后平衡条件为10×柱床体积(CV)的20mmol/L磷酸盐缓冲液(PB)pH7.5～8，再用3个柱床体积pH9.0，40mmol/L磷酸盐缓冲液继续洗涤层析柱后，用含200mmol/LNaCl的上述pH9.0磷酸盐缓冲液洗脱，收集主要洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳并充分染色，此为半成品；加甘氨酸半成品的制备用无热原超纯水及药用级磷酸盐、甘氨酸配置5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液，平衡Superdex75层析柱，将“重组IL-11精制品”上该柱纯化并完成缓冲液转换，收集洗脱峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs内合并，用0.22μm滤器过滤除菌，合格后进行冻干。
稀释、分装和冻干检定合格的“加甘氨酸半成品”，根据其蛋白浓度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液稀释至1.6mg/ml，并及时分装和冻干将上述除菌过滤的“加甘氨酸半成品”分装于西林瓶中，每小瓶含2ml液体，随后进行冻干处理，整个冻干过程加温不可超过30℃。冻干后按配比加入甘氨酸、磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O、磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O，然后压瓶盖、封口。
本发明的特点和优点有1)得到纯度＞95％的重组人IL-11；2)产物重组人IL-11的比活性高，比活性大于5×106U/mg；3)生产工艺简单，产物收率高，生产成本低。
处方选择的依据每一剂量所含重组人白介素11为3mg左右，是因为临床最佳用量是50μg/kg，甘氨酸是赋形剂，能增加重组人白介素11对热的稳定性。
具体实施例方式
重组人白介素11的制备方法菌种库→种子液制备→发酵→收菌→碎菌→制备融合蛋白粗制品→制备融合蛋白精制品→制备重组IL-11粗制品→制备重组IL-11粗制品→稀释、分装和冻干→成品检定。
具体过程如下1、制造用菌种库的建立原始菌种涂布Amp+的LB平板，挑取单菌落接入Amp+的LB培养液，37℃振荡培养12小时，然后加入无菌甘油，振荡使甘油均匀分布，终浓度至15％，分装菌种管，作为制造用菌种库保存于-70℃，但每次只限传3代。每批制造用菌种库均应进行下列鉴定，合格后方可投产。
1)形态观察将上述菌种接种LB平板，37℃培养后，菌种具有典型大肠杆菌的形态特征，且无杂菌生长。
2)格兰氏染色涂片镜检该菌为格兰氏阴性杆菌。
3)对抗生素的抗性与原始菌种一样具备Amp抗性。
4)IL11表达量摇床中培养，在IPTG诱导下，SDS-PAGE电泳显示Trx-IL11表达量始终稳定在占菌体总蛋白20％左右。质粒检查表达载体质粒DNA酶切图谱与原始表达载体酶切图谱完全一致2.种子菌液的制备取一支生产菌种，接种于含有氨苄青霉素Amp(100mg/L)LB(培养基)平板，37℃培养16小时，挑取单个菌落接种到LB液体培养基中(含Amp 100mg/L)，振荡培养基使其OD600值在0.4～0.8之间，即可供发酵罐接种用。种子液每次均进行质粒稳定性检查。
3.发酵3.1发酵用培养基成分3.1.1基础培养基溶液(1升)Na2HPO4.12H2O 7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00gYeast 5.00gGlycerol 10.00g3.1.210×补料(1升)MgSO4.7H2O 5.00gTyphone 83.33gYeast 41.67gGlycerol416.67g3.2发酵罐灭菌及种子液的接种往B.Braun 30升发酵罐中加入20升基础培养基，蒸发灭菌(121℃20分钟)，待发酵罐冷却后，再接入种子菌液(接种比例是以将种子菌液OD600＝0.8时的种子菌液与发酵培养基体积比1∶50定为标准即向20升发酵培养基中加入OD600＝0.8的400ml种子菌液)；这一过程不加抗生素。
3.3发酵条件3.3.1温度和时间37℃培养，以200ml/小时的速度补料，当OD600为7～8时调整温度至37℃，加入诱导剂IPTG(当浓度0.2mM)诱导4小时，然后终止发酵。
3.3.2培养基总装量约22L。
3.3.3通气量保持发酵液中溶解氧浓度为40％。
3.3.4搅拌速度294rpm。
3.3.5酸碱度6.5～7.0。
3.4发酵要求发酵过程必须无菌操作，发酵车间不得同时进行其他细菌的发酵。发酵完毕，必须冲洗干净并将发酵罐灭菌处理。
3.5收菌发酵终止后，取出菌液，低速离心(5000rpm，20分钟，4℃)，收集菌体，用生理盐水洗涤一次，所有上清液待灭菌后弃取。将湿菌体称量，于-20℃保存。
3.6碎菌取一定量的菌体，悬浮于适量的0.01M PBS(pH7.0)缓冲液中(菌体与悬浮液的体积比为1∶10)，冰浴下使用高压均质机进行碎菌，共三个循环；取样进行染色涂片，显微镜下检查，基本无完整细胞，离心(20000rpm)20分钟，4℃，收集上清即为粗制IL11的融合蛋白(Trx-IL11)。
4.rHuIL-11的分离纯化4.1融合蛋白粗制品的制备菌体裂解后，经高速离心(20000rpm，20min)，收集上清，为“融合蛋白粗制品”。融合蛋白粗制品应尽快进入下一步纯化，如无法立即处理，可保存于4℃48h。
4.2融合蛋白精制品的制备将“融合蛋白粗制品”经连接了Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以Trx-IL-11融合蛋白为主(纯度大于70％)的蛋白溶液，为“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脱条件为不同pH的Tris-HCl缓冲液，不加入任何对人体有害的物质。融合蛋白精制品用0.1mol/L NaOH调整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小时。
4.3重组IL-11粗制品的制备“融合蛋白精制品”经SDS-PAGE电泳证实纯度后，加入一定剂量的重组牛肠激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小时后取小样进行SDS-PAGE电泳并染色，用IL-11标准品作对照，应出现相同分子量的明显条带，根据融合蛋白的残留量可将酶切时间适当延长，但不可超过40小时。酶切结束后，将该酶切产物放置4℃，为“IL-11粗制品”，可在4℃可保存48小时。
4.4重组IL-11精制品的制备从这一步开始所有操作必须在一万级层流环境中进行。配置缓冲液所用的水及无机盐(磷酸盐)，及容器均需为医用级或无热原。“IL-11粗制品”经0.8m过滤后用水稀释至电导率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF(Pharmacia产品)阳离子交换柱纯化。上样后平衡条件为10×柱床体积(CV)的20mmol/L磷酸盐缓冲液(PB)，pH7.5～8，再用3个柱床体积pH9.0，40mmol/L磷酸盐缓冲液继续洗涤层析柱后，用含200mmol/L NaCl的上述pH9.0磷酸盐缓冲液洗脱，收集主要洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳并充分染色，为“IL-11精制品”。如4天内进行下一步处理，则放4℃保存；如超过4天则放-80℃保存。此为半成品。
4.5加甘氨酸半成品的制备用无热原超纯水及药用级磷酸盐、甘氨酸配置5mmMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液，平衡Superdex75层析柱，将“重组IL-11精制品”上该柱纯化并完成缓冲液转换，收集洗脱峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs内合并，用0.22μm滤器过滤除菌，为“加甘氨酸半成品”。取样做无菌实验和热原实验，合格后进行冻干。“加甘氨酸半成品”可在4℃保纯7天。如7天内不能及时处理，应保存在-30℃。在酶切后的纯化步骤中，特别注意去除热原质，所有容器均经过干热灭菌，用于分子筛层析的溶液，在配置后也立即进行了去除热原质的处理。整个分离纯化过程中，没有加入任何对人体有害的物质。
5.稀释、分装和冻干检定合格的“加甘氨酸半成品”，根据其蛋白浓度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液稀释至1.6mg/ml，并及时分装和冻干将上述除菌过滤的“加甘氨酸半成品”分装于西林瓶中，每小瓶含2ml液体，随后进行冻干处理，整个冻干过程加温不可超过30℃。冻干后按配比加入甘氨酸、磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O、磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O。然后压瓶盖、封口，于4℃保存。最终使每支针剂含3mgIL-11的冻干粉，其余成分由23mg甘氨酸、1.6mg磷酸氢二钠(7H2O)、0.55mg磷酸二氢钠(1H2O)组成，使用前用1ml注射用水溶解，溶解液pH值为7.0。冻干的全过程(进箱、出箱、抽真空等)必须在严格的无菌条件下进行，冻干后的制品水分含量低于3％，同机一次冻干的制品作为一批。
权利要求
1.一种注射用重组人白介素11制剂，该制剂组分以每支计算包括a.1～7mg的重组人白介素11的冻干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O。
2.根据权利要求1所述的注射用重组人白介素11，其特征在于该制剂组分以每支计算包括a.3±0.5mg的重组人白介素11的冻干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O。
3.一种制备上述的注射用重组人白介素11的工艺，包括菌种库→种子液制备→发酵→收菌→碎菌→备融合蛋白粗制品→制备融合蛋白精制品→制备重IL-11粗制品→制备重组IL-11粗制品→稀释、分装和冻干→成品检定，其特征在于种子菌液的制备取一支生产菌种，接种于含有氨苄青霉素100mg/LLB培养基平板，37℃培养16小时，挑取单个菌落接种到LB液体培养基中，振荡培养基使其OD600值在0.4～0.8之间，即可供发酵罐接种用。发酵基础培养基溶液为(1升)Na2HPO4.12H2O7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl 0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00gYeast 5.00gGlycerol10.00g补料为(1升)MgSO4.7H2O5.00gTyphone83.33gYeast 41.67gGlycerol 416.67g发酵条件温度和时间37℃培养，以200ml/小时的速度补料，当OD600为7～8时调整温度至37℃，加入诱导剂IPTG，当浓度0.2mM时诱导4小时，然后终止发酵；碎菌取一定量的菌体，悬浮于适量的0.01M PBS(pH7.0)缓冲液中(菌体与悬浮液的体积比为1∶10)，冰浴下使用高压均质机进行碎菌，共三个循环；取样进行染色涂片，显微镜下检查，基本无完整细胞，离心(20000rpm)20分钟，4℃，收集上清即为粗制IL11的融合蛋白；融合蛋白精制品的制备将“融合蛋白粗制品”经连接了Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以Trx-IL-11融合蛋白为主(纯度大于70％)的蛋白溶液，为“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脱条件为不同pH的Tris-HCl缓冲液，融合蛋白精制品用0.1mol/LNaOH调整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小时；重组IL-11粗制品的制备“融合蛋白精制品”经SDS-PAGE电泳证实纯度后，加入一定剂量的重组牛肠激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小时后取小样进行SDS-PAGE电泳并染色，用IL-11标准品作对照，应出现相同分子量的明显条带，根据融合蛋白的残留量可将酶切时间适当延长，但不可超过40小时；重组IL-11精制品的制备“IL-11粗制品”经0.8m过滤后用水稀释至电导率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF阳离子交换柱纯化，上样后平衡条件为10×柱床体积(CV)的20mmol/L磷酸盐缓冲液(PB)，pH7.5～8，再用3个柱床体积pH9.0，40mmol/L磷酸盐缓冲液继续洗涤层析柱后，用含200mmol/LNaCl的上述pH9.0磷酸盐缓冲液洗脱，收集主要洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳并充分染色，此为半成品；加甘氨酸半成品的制备用无热原超纯水及药用级磷酸盐、甘氨酸配置5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液，平衡Superdex75层析柱，将“重组IL-11精制品”上该柱纯化并完成缓冲液转换，收集洗脱峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs内合并，用0.22μm滤器过滤除菌，合格后进行冻干。稀释、分装和冻干检定合格的“加甘氨酸半成品”，根据其蛋白浓度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的缓冲液稀释至1.6mg/ml，并及时分装和冻干将上述除菌过滤的“加甘氨酸半成品”分装于西林瓶中，每小瓶含2ml液体，随后进行冻干处理，整个冻干过程加温不可超过30℃。冻干后按配比加入甘氨酸、磷酸氢二钠Na2HPO4.7H2O、磷酸二氢钠Na2HPO4.1H2O，然后压瓶盖、封口。
全文摘要
本发明提供一种注射用重组人白介素11制剂及制备工艺，每支含a.1～7mg的重组人白介素11的冻干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氢二钠Na
文档编号C12P21/02GK1421245SQ01133699
公开日2003年6月4日 申请日期2001年11月22日 优先权日2001年11月22日
发明者徐进 申请人:武汉春天生物工程股份有限公司