专利名称：利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法
技术领域：
一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法属于快速分离并裂解生物粒子的细胞以获取核酸的技术领域。
本发明的特征在于，它依次含有以下步骤(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质--核酸的复合物；(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
所述的第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基因扩增用的模板。
对于小分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加入固相吸附介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤(4)、(5)依次进行。
所述的固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
所述的分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
所述的细胞裂解液含有2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
所述的细胞裂解液组成为15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
所述的洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
使用证明它达到了预期目的。
图2从人全血中用磁球提取的基因组DNA进行HLA-A等位基因PCR扩增后产物的琼脂糖电泳检测图。O阴性对照，P阳性对照。
图3用磁性微球从全血中分离DNA的流程示意图。
实施例2用纳米磁性微球分离大肠杆菌的基因组的(genomic)DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli大肠杆菌菌株。取收获的细胞培养液300μl，再加入50μl纳米磁性微球悬浮液。振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃去上清液。向磁球加入300μl细胞裂解液(3mol/l NaI，4mol/l尿素，30g/l Triton-100(三硝基甲苯)，10mmol/l EDTA(pH6.5)，25mmol/l Tris·HCl(pH6.5))(下同)，摇匀，室温静置5min。加入300μl异丙醇。在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，弃上清后，再用70％乙醇洗磁性微球2次。然后加上述100μlTE溶液(pH＝6.0)，室温静置10min。再用磁性分离架把磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。DNA产量约为30μg/ml，与传统的十二烷基硫酸钠(SDS)加蛋白酶K破胞，酚-氯仿抽提法相比，产量及纯度相当。
实施例3用纳米磁性微球吸附分离全血中白细胞并提取其中DNA。
本试验所用全血由健康供血者提供，用血液1/6体积的ACD(23mmol/l柠檬酸，80mmol/l葡萄糖，45mmol/l柠檬酸钠)抗凝。取适量的血液300μl，加入50μl上述磁性微球溶液(用上述pH＝6.0的TE溶液悬浮)，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置3min后，用磁性分离架把磁球固定。弃其他部分。加入300μl细胞裂解液，振荡混匀，室温静置2min。再加入300μl异丙醇振荡混匀，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，弃上清液。用70％乙醇洗涤2次磁球后，加入上述pH6.0的TE溶液，10min后用磁性分离架把磁球固定，收集洗脱液，进行凝胶电泳分析，紫外分光分析。提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶(0.9％)电泳检测，电泳图谱见附
图1。该方法建立了一种快速高效的从全血中制备基因组DNA的方法，它不用有毒试剂，操作安全。分别用在上述操作中所获的含人类基因组DNA的洗脱液或所获的吸附有基因组DNA的磁珠直接作模板进行公知的HLA-A(人类白细胞抗原)等位基因的PCR试验，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。电泳图谱见附图2。本试验建立了一种快速高效的HLA等位基因扩增的磁珠-PCR法(microsphere based PCR)，与传统制样方法相比更为简单，快速，模板制备仅需10min，并且排除了PCR抑制剂，且无非特异性扩增。图3是本发明的磁性分离法的流程示意图。1是白细胞，2是红细胞，3是磁球，4是DNA，5是磁铁。先使磁球3和生物样品人全血轻微振荡再静置，磁球3吸附白细胞1后被磁铁5吸附在管壁，弃去其余溶液。加入细胞裂解液后进入裂解白细胞结构的过程，破胞后，DNA4被磁球3吸附后，在磁铁5作用下吸附在管壁上，弃去其余溶液，用TE洗脱缓冲液把DNA从磁球上洗下后，将磁球通过磁铁5固定，将含DNA的TE溶液移至新管中。对300μl人全血，采用100μl磁球溶液(15μg/μl)可得到结果。
实施例4用纳米磁性微球分离大肠杆菌的质粒DNA。
样品为培育过夜的含质粒的E.coli菌株，试验步骤为取收获的细胞培育液300μl，然后加入50μl纳米磁性微球悬浮液(15μg/μl)，振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃溶液，向磁球加入300μl细胞裂解液，摇匀，室温静置5min，再加入300μl异丙醇振荡混匀，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，转移上清液至另一新管中，重新加入50μl纳米磁性微球悬浮液及300μl异丙醇，摇匀，室温静置5min，用磁性分离架把磁球固定，弃上清，再用70％乙醇洗涤磁球2次。然后加入上述pH6.0的TE溶液100μl，和适量RNA酶溶液，在适宜温度下降解RNA。再用磁性分离架将磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖电泳检测。质粒DNA产量约为5μg/ml，与传统的方法相比，产量及纯度相当。如果要用纳米磁性微球分离大肠杆菌的RNA，则可用DNA酶来代替上述的RNA酶，其余步骤相同。
实施例5用经过处理的纤维膜吸附DNA片断。
在高温消毒的eppendorf管中加入剪成直径0.5厘米圆形膜片的处理后的玻璃纤维膜，再在纤维膜上加入0.4mg/μl的双链λ-DNAmarker(Hand III酶切)15μl，又加入5mol·L-1NaI溶液80μl，轻微振荡15s，然后静置1min。再加入助吸剂异丙醇100μl，轻微振荡5s，静置2min。用离心法除去上清液。用100μl、70％的乙醇洗涤吸附DNA的膜片2次。加入50μlTE溶液(pH＝8.0，10mmol·L-1Tris.Cl，1mmol.L-1EDTA)。在水溶中用62℃恒温12min，把DNA从膜片洗脱下来。然后用离心法把膜片与TE溶液分离，把得到的TE溶液用琼脂糖水平凝胶电泳检测分离的DNA片断。整个操作只需15min。
实施例6用经过处理的纤维膜分离大肠杆菌的基因组DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli菌株。取收获的细胞培养液300μl，然后加入剪成宽0.3厘米的处理过的条状纤维膜膜片。振荡混匀后用吸管吸取再弃去上清液。加入300μl细胞裂解液(20gGuSCN，100ml TE(pH6.0)(10mmol·L-1Tris.Cl，25mmol.L-1EDTA)，20gPEG8000)，摇匀，室温静置5min。加入300μl 70％乙醇，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置5min。用吸管吸取后再弃去上清液，再用70％乙醇洗膜片2次。然后加pH＝6.0的上述100μl TE溶液，室温静置10min。收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。DNA产量约为40μg/ml，与传统的SDS加蛋白酶K破胞，酚—氯仿抽提法相比，产量及纯度相当。
权利要求
1.一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，依次包含分离并裂解生物粒子的细胞结构并从中分离出核酸的步骤，其特征在于，它依次含有以下步骤(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质——核酸的复合物；(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
2.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基因扩增用的模板。
3.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于对于小分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加入固相吸附介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤(4)、(5)依次进行。
4.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
5.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
6.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的细胞裂解液含有2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
7.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的细胞裂解液组成为15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
8.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于所述的洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
全文摘要
利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法属于生物粒子快速分离技术领域,其特征在于:它用纳米磁性微球悬浮液或经特别处理的纤维膜作固相吸附介质来分离生物粒子中的细胞,再用细胞裂解液裂解细胞结构,通过固相吸附和解吸附以便直接从全血、血浆、唾液、尿液、细胞和组织培养液等生物样品中富集含有核酸的白细胞、病毒粒子、上皮细胞、培养细胞等的生物粒子,并获取核酸。这种方法简便快速,可用于各种不同规模和品种的样品制备,而且易于实现自动化、微型化装置的构建。
文档编号C12P19/34GK1355319SQ0114044
公开日2002年6月26日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者张旭, 谢欣, 陈继明, 陈德朴, 费维扬, 程京 申请人:清华大学, 北京博奥生物芯片有限责任公司