专利名称：重组葡激酶(126)的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组葡激酶(126)的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
心脑血管疾病是一种普遍的多发病，危害性极大。
葡激酶Sak是来源于金黄色葡萄球菌的一种非酶蛋白。它象链激酶SK一样，与纤溶酶原结合形成复合物，去催化纤溶酶原转化为纤溶酶，然后对血纤维蛋白进行水解。Sak优先选择与血栓上的纤溶酶原结合，水解其中的血纤维蛋白，当血浆中不存在血栓时，血纤维蛋白溶酶则被血浆中的(α-AP)中和，不降低凝血系统中的纤维蛋白原，不易引起全身性溶血。具有分子量小、渗透性好、溶栓速度快、副作用小等特点。用于心肌梗塞、脑栓塞、肺栓塞等疾病的治疗。
成熟的葡激酶分子中含有136个氨基酸，肽链中没有二硫键，对溶液中成熟葡激酶分子构象研究表明，分子中有两个相似大小的结构域，中心距为3.7nm，分子形状类似一个易变的“哑铃”。葡激酶在分离过程中经常以三种形式存在成熟SaK，成熟SaK分子N-末端降解6个和10个氨基酸的产物，即Sak-M、SaK-Δ6和Sak-Δ10，Sak-ΔN10分子量更低，在与纤溶酶原作用过程中，效果更好。
已有药理试验表明，曾对100名急性心肌梗塞病人的临床试验中(52名患者使用r-tPA；48名患者使用r-SAK，其中25名10mg，23名20mg剂量)，比较了r-Sak两个剂量(10mg和20mg)，20分钟一次性滴注给药与r-tPA(商品名Alteplase)治疗效果。实验结果表明，r-Sak动脉早期开通作用明显。从开通的程度比较r-Sak最适剂量20mg，90分钟内TIMI-3开通率较r-tPA高。另一项在30名外周动脉栓塞患者使用体内导管引导法进行r-Sak给药，对r-Sak的溶栓效应，安全性及纤维蛋白专一性和在病人体内的免疫原性进行了研究。结果表明，r-Sak的溶栓有效性及动脉再通的结果非常好，r-Sak具有明显的纤维蛋白专一性。生产重组葡激酶(126)，市场前景广阔。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行，操作方便，能获得高纯度产品，生产周期短，效率高，可实现大规模工业化生产制备葡激酶(126)的制备方法。
本发明所述的重组葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其编码的氨基酸为AAG GGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCALys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu ProACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACTThr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val ThrGGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTAGly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAASer Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile LysCCT GGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATTPro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys IleGAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTT GTT ATT GAA AAG AAAVal Val Ile Glu Lys Lys本发明所述的重组葡激酶(126)基因的高效表达工程菌株为pBVS126/DH5α菌种己由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏
保藏日期为2001.12.14 保藏编号为No.0664分类命名为大肠埃希化菌本发明葡激酶用于心肌梗塞、脑栓塞、肺栓塞等疾病的治疗。
重组葡激酶(126)基因的制备方法采用基因克隆技术，工艺过程如下以纤溶活性高的金黄色葡萄球菌为PCR扩增模板，将扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220载体质粒，转化大肠杆菌，构建成重组葡激酶工程菌株。
其中扩增模板的筛选方法为取得金黄色葡萄球菌，接种于LB的液体培养基中，振荡过夜，离心、收集上清，用于血纤维蛋白平板，培养，视为纤溶性阳性者，具有SaK活性，选其中纤溶活性最高的一株用作PCR扩增模板。
葡激酶(126)基因扩增方法为取金黄色葡萄球菌单菌落，接种于LB液体试管培养基中，振荡过夜，离心、收集菌体，加入缓冲液，悬浮，煮沸，室温下离心分离，上清直接用作PCR反应。
反应所用引物为上游引物(P-1)为5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT下游引物(P-2)为5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.
扩增反应步骤控制为92℃60秒50℃50秒72℃50秒30个循环，然后72℃延伸12分钟。
葡激酶(126)基因的构建与鉴定方法为将PCR扩增产物和pUC19质粒载体以相同的内切酶水解，加入连接酶，保温，转化大肠杆菌，涂于平板上，培养过夜；取白色菌落，培养过夜，提取质粒，用内切酶双酶解后，以琼脂糖凝胶电泳检查，证明获得葡激酶pUC-SaK126重组质粒。
葡激酶(126)表达质粒的构建方法为将pUC-SaK126质粒双酶解，以内切酶酶解的原核表达载体pBV220重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于平板，培养过夜；提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检查，视含Sak126基因特征片断者，为表达质粒pBVS126。
重组葡激酶及其衍生物蛋白质的分离纯化方法为细胞破碎，提取粗酶，超滤截流后，进行疏水层析得产品。
即将重组葡激酶或其衍生物发酵收集菌泥，经用上柱缓冲液悬浮，破碎细胞，离心收集上清，直接用于超滤。以50KD切向流膜包超滤截去约50％的杂蛋白，使粗酶液的纯度达到80％以上。滤出液以NaCl溶液稀释，直接上疏水层析柱，经阶段洗脱，SDS-PAGE电泳分析，合并纯品，纯度可达95％以上，蛋白纯品收率在80％以上。
工艺简单，生产周期短，成本低，效率高，适合大规模工业化生产。
本发明未作说明解释之处，按常规操作进行即可。
本发明重组葡激酶(126)的制备方法采用基因克隆技术，简单易行，操作方便，能获得高纯度产品，生产周期短，成本低，效率高，可实现大规模工业化生产。
图1、本发明pUC-126重组质粒的构建图。
图2、本发明pBVS126表达质粒的构建图。
图3、葡激酶126序列分析图。
图4、葡激酶126氨基酸N末端序列分析图谱。
图5、葡激酶126组成分析图。
图6、葡激酶126蛋白质等电点分析图谱。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
本发明所述的重组葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其编码的氨基酸为AAGGGCGATGACGCGAGTTATTTTGAACCALys GlyAspAspAlaSerTyrPheGluProACAGGCCCGTATTTGATGGTAAATGTGACTThr GlyProTyrLeuMetValAsnValThrGGAGTTGATGGTAAGGGAAATGAATTGCTAGly ValAspGlyLysGlyAsnGluLeuLeuTCCCCTCGTTATGTCGAGTTTCCTATTAAASer ProArgTyrValGluPheProIleLysCCTGGGACTACACTTACAAAAGAAAAAATTPro GlyThrThrLeuThrLysGluLysIleGAATAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACAGCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTAGAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTATTAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACGAAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAAAAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTTGTT ATT GAA AAG AAAVal Val Ile Glu Lys Lys重组葡激酶(126)基因的高效表达工程菌株为pBVSl26/DH5α制备方法如下l、扩增模板的筛选从医院外科包扎伤口的绷带上分离到20株金黄色葡萄球菌，分别接种于LB的液体培养基中，37℃振荡过夜，4℃，5000rpm离心，收集上清，取l0μl于人血纤维蛋白平板，37℃，培养16h，观测其周围是否有溶解圈，有溶解圈的为纤溶活性阳性，纤溶活性大小与溶解圈大小成正比。共获得5株具有SaK活性，选其中纤溶活性最高的一株(J-7)用作PCR扩增模板。
2、引物设计及葡激酶126基因扩增根据已知葡激酶序列，设计一对引物，用该引物扩增出的葡激酶基因片段，为不含信号肽，且在成熟的葡激酶前缺失10个氨基酸残基的葡激酶基因。
上游引物(P-1)为5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT；下游引物(P-2)为5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.
取金黄色葡萄球菌J-7单菌落，接种于LB液体试管培养基中，37℃振荡过夜。取菌液100μl，4℃，5000rpm离心5分钟，收集菌体。加入TE(pH8.0)缓冲液50μl，悬浮，于100℃，煮沸3分钟，室温，10000rpm，离心5分钟，上清直接用作PCR反应ddH2O31μl10×PCR缓冲液5μldNTP(2.5mmol)4μl引物P-1(50pmol) 2μl引物P-2(50pmol) 2μlJ-7(金葡菌)模板 5μl混匀，95℃变性5分钟，加入1μl(2.5u/μl)的TaqDNA聚合酶，振荡、离心，放入PCR扩增仪，按以下步骤进行反应92℃ 60秒50℃ 50秒72℃ 50秒共30个循环，然后72℃延伸12分钟。取5μl PCR反应物，以1.2％琼脂糖电泳检查，出现380bp左右的DNA片断。
3、葡激酶126基因的构建与鉴定将PCR扩增产物和pUC19质粒载体以相同的限制性内切酶(EcoRI-BamHI)水解后，加入T4DNA连接酶反应体系，16℃保温10h，转化大肠杆菌JM109，涂于Xgal-IPTG-LB(含AmP)平板上，37℃培养过夜。取白色菌落，接入LB(含Ap)的液体培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，用限制性内切酶(EcoRI-BamHI)双酶解后，以1.2％琼脂糖凝胶电泳检查，可见380bp左右的DNA片断出现，证明已获得葡激酶126重组质粒(pUC-SaK126)。质粒构建如图1所示。
4、葡激酶126表达质粒的构建将pUC-SaK126质粒以EcoRI-BamHI双酶解后，以相同的限制性内切酶酶解的原核表达载体pBV220(含PRPL启动子，CIts857基因等调空元件)重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于LB(含AmP)平板37℃，培养过夜。提取质粒，以EcoRI-BamHI双酶切，1.2％琼脂糖凝胶电泳检查，似含Sak126基因特征片断者，为表达质粒pBVS126。并经上海基康生物公司自动分析测序仪3700型测定了核苷酸序列。表达质粒构建如图2所示，序列测定如图3所示。
5、葡激酶126的分离纯化方法一种试验方法是将重组葡激酶或其衍生物发酵液离心收集菌泥后，以湿重菌泥50g加入1000mlPBS(pH7.2)上柱缓冲液悬浮，按常规超声破碎或高压溶浆法破碎细胞，离心收集上清，直接用于PALL Maximate盒式过滤系统。以截流量50KD切向流膜包超滤。其方法如下滤器名称及型号PALL公司盒式过滤系统Maximate型实验技术参数及条件截流分子量50KD膜包介质Omega环境温度10-15℃有效过滤面积0.19m2入口压力30-20psig出口压力20-15psig滤出液速率50-500ml/min按Maximate盒式过滤系统技术要求，将管道连接好，启动蠕动泵，视其样品浓度及粘度，调节进出口压力。每块膜包可允许每次超滤2-50L的样品，一般5-10L的葡激酶粗酶液，只需1-2h即可超滤完毕。如果样品量增大，只增加膜包就可以了，因为Maximate盒式过滤系统最多可同时夹6块膜包，但超滤时间并不会延长，因为膜包与膜包为并联通道模式，就葡激酶每次以30-100L的发酵罐菌泥所提粗酶液均可用此系统。使用起来非常方便。
以截流量50KD切向流膜包超滤截流可去掉约50％的葡激酶杂蛋白，使粗酶液的纯度达到80％以上。所以我们用超滤截流的方法不仅达到了纯化蛋白的目的，也省去了往常预过滤的烦琐步骤，可谓一举两得。
切向过滤系统可重复地用于加工环境中，为了保证处理各批物料的效果可靠与稳定，必须很恰当地保养和使用膜包，在每次使用后按说明书要求及时进行清洗和保养。清洗膜的目的是为了将污垢从膜包和系统中去除，使膜的通透性恢复至起初的洁净状态。保证每次使用膜包维持其原有特性，防止细菌等其它微生物的生长。
用Maximate盒式过滤系统，不仅经济，周期短，达到了预过滤和纯化的双重目的。
另一种试验方法是将以分子截流量50KD超滤滤出液葡激酶蛋白同4MNaCl-PBS(pH)缓溶液1∶1混合，直接上疏水层析柱(PhenyI Sepharose High Performance)，经阶段洗脱，SDS-PAGE电泳分析，纯度可达95％以上，合并纯品，蛋白收率在80％以上。其具体实验步骤如下柱介质PhenyI Sepharose High Performance柱参数D＝10cm，H＝20cm，CV＝1.57L分离纯化步骤(1)平衡2MnaCl-50mMNa2HPO4-50mMNaH2PO4(pH7.2)平衡体积 3-5CV平衡流速 150ml/min(2)上样2MNaCl-50mMNa2HPO4-50mMNaH2PO4(pH7.2)上样比例 10mg/ml上样流速 150ml/min(3)淋洗2MNaCl-50mMNa2HPO4-50mMNaH2PO4(pH7.2)淋洗体积 3CV淋洗流速 200ml/min(4)洗脱a1MNaCl-50mMNa2HPO4-50mMNaH2PO4(pH7.2)洗脱体积 3CV洗脱流速 150ml/minb0.2MNaCl-50mMNa2HPO4-50mMNaH2PO4(pH7.2)洗脱体积 3CV洗脱流速 150ml/min(5)水洗水洗体积 10CV水洗流速 200ml/min(6)原位清洗1M NaOH清洗体积 2CV清洗流速 100ml/min(7)水洗水洗pH至中性水洗流速 200ml/min按上述条件平衡、上样、洗脱，SDS-PAGE凝胶电泳分析，纯度可达95％以上，合并纯品，蛋白收率在80％以上。如柱子长期不用，则用20％的乙醇4-8℃保存。
6、葡激酶126的鉴定将重组葡激酶126工程菌接种在LB(含Amp)液体培养基30℃振荡培养5h，42℃继续培养4h，取100μl培养液，室温10000rpm，离心10min，去上清，沉淀加入50μlSDS-PAGE电泳缓冲液100℃煮沸5min，室温10000rpm，离心10min。对照以大肠杆菌DH5α或诱导前培养液同样方法处理。点样10μl，依次为标准品、DH5α、诱导前、诱导后样品两组，走SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用手术刀将SDS-PAGE电泳凝胶切开。一组用于考马斯亮蓝染色、脱色，可见诱导样品在分子量14.5KD处有非常浓集的区带，而对照样品DH5α和诱导前培养液几乎无此区带。SDS-PAGE电泳凝胶经扫描分析，SAK126蛋白约占菌体总蛋白的50％。
另一组凝胶放在1.5mm厚的人血纤维蛋白平板上，37℃保温60min，与考马斯亮蓝染色凝胶对照，可见分子量14.5KD处有非常明显的透明区带，而对照样品DH5α和诱导前培养液均无透明区带。由此可见重组葡激酶126产物具有纤溶活性。
结果分析(1)蛋白质N末端序列分析检测标准及技术要求蛋白质N端分析方法，自动Edman降解仪器名称及型号美国应用生物系统公司491蛋白序列分析仪分析测试结果将葡激酶126样品上样分析，得N末端15个氨基酸序列为M-K-G-D-D-A-S-Y-F-E-P-T-G-P-Y。分析图谱如图4所示。
(2)氨基酸组成分析检测标准及技术要求氨基酸组成分析(OPA/FMOC)柱前衍生法仪器名称及型号美国惠普公司HP1100氨基酸分析仪方法及条件以6N盐酸于110℃水解24小时，旋转蒸发至干，用饱和硼酸缓冲液定容，应用OPA/FMOC自动柱前衍生化方法测定氨基酸组成，外标法定量。
其结果如下(单位mol/％)Asp 8.82Glu 11.60Ser 5.87Gly/His 14.58
Thr5.92Ala7.80Arg5.30Tyr4.47Cys2.68Met3.75Val5.94Phe5.37Ile4.64Leu5.72Lys 7.54氨基酸组成分析如图5所示。(3)蛋白质等电点的测定检测标准及技术要求毛细管等点聚焦方法仪器名称及型号美国Beckman公司P/ACE5000型毛细管电泳仪实验方法和条件使用Beckman公司的毛细管等点聚焦试剂盒，按照说明书的实验方法和步骤进行测定。
毛细管50μm(I.D.)X27cm(有效柱长20cm)中性涂层柱，两性电解质pH3-10。
聚焦阳极液91mmol/L H3PO4Gel液，聚焦阳极液20mmol/L NaOH，聚焦电压13.75KV，聚焦时间2min检测波长(UV)280nm，毛细管温度20℃等电点Marker的pI分别为9.45、5.10、2.75。
实验结果migration time(min) pI10.51 9.4522.54 sample23.91 smaple25.49 5.1033.96 2.75
以标准等电点Marker的迁移时间(migratian time，MT)对等电点(pI)进行线性回归，得回归方程y＝a+bx其中a＝12.44，b＝-0.9999(n＝3)，将被测样品的迁移时间带入回归方程计算，得到样品的等电点为6.0(MT＝22.54min)和5.6(MT＝23.91min)。分析图谱如图6所示。本发明所述的重组葡激酶(126)，其基因全DNA序列及其编码的氨基酸为AAGGGCGAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCALys GlyAsp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu ProACAGGCCCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACTThr GlyPro Tyr Leu Met Val Asn Val ThrGGAGTTGAT GGT AAG GGA AAT GAA TTG CTAGly ValAsp Gly Lys Gly Asn Glu Leu LeuTCCCCTCGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAASer ProArg Tyr Val Glu Phe Pro Ile LysCCTGGGACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATTPro GlyThr Thr Leu Thr Lys Glu Lys IleGAATACTAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCGGlu TyrTyr Val Glu Trp Ala Leu Asp AlaACAGCATAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAAThr AlaTyr Lys Glu Phe Arg Val Val GluTTAGATCCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACTLeu AspPro Ser Ala Lys Ile Glu Val ThrTATTATGAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAATyr TyrAsp Lys Asn Lys Lys Lys Glu GluACGAAGTCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGTThr LysSer Phe Pro Ile Thr Glu Lys GlyTTTGTTGTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATTPhe ValVal Pro Asp Leu Ser Glu His IleAAAAACCCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAGLys AsnPro Gly Phe Asn Leu Ile Thr LysGTTGTTATT GAA AAG AAAVal ValIle Glu Lys Lys
权利要求
1.一种重组葡激酶(126)的制备方法，其特征在于以纤溶活性高的金黄色葡萄球菌为PCR扩增模板，将扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220载体质粒，转化大肠杆菌，构建成重组葡激酶工程菌株。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于扩增模板的筛选方法为取得金黄色葡萄球菌，接种于LB的液体培养基中，振荡过夜，离心、取上清，用于血纤维蛋白平板测定，似有溶解圈的，选其中纤溶活性最高的一株用作PCR扩增模板。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)基因扩增方法为取金黄色葡萄球菌单菌落，接种于LB液体试管培养基中，振荡过夜，离心、收集菌体，加入缓冲液，悬浮，煮沸，室温下离心分离，上清直接用作PCR反应。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于反应所用引物为上游引物为5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT下游引物为5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于扩增反应步骤控制为92℃ 60秒50℃ 50秒72℃ 50秒30个循环，然后72℃延伸12分钟。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)基因的构建与鉴定方法为将PCR扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pUC19载体质粒，转化大肠杆菌，涂于平板上，培养过夜；取白色菌落，接入LB的液体培养基中，培养过夜，提取质粒，用内切酶双酶解后，以琼脂糖凝胶电泳检查，构建成重组葡激酶工程菌株(pUC-SaK126)。
7.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)表达质粒的构建方法为将pUC-SaK126质粒双酶解，以相同酶解的原核表达载体pBV220重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于LB-AmP平板，培养过夜；提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳检查，含Sak126基因特征片断者，为表达质粒pBVS126。
8.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)的分离纯化方法为细胞破碎，提取粗酶，超滤截流后，进行疏水层析得产品。
全文摘要
本发明涉及一种重组葡激酶(126)的制备方法，属于生物工程技术领域。重组葡激酶(126)基因分子量小、蛋白分子均一、抗原性小、专一性高、溶栓速度快、副作用小，性能稳定，药用效果好，用于心肌梗塞、脑栓塞、肺栓塞等疾病的治疗。本发明制备方法采用基因克隆技术，以纤溶活性高的金黄色葡萄球菌为PCR扩增模板，将扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220载体质粒，转化大肠杆菌，构建成重组葡激酶工程菌株，简单易行，操作方便，能获得高纯度产品，适宜大规模工业化生产。
文档编号C12N15/54GK1394952SQ01144248
公开日2003年2月5日 申请日期2001年12月14日 优先权日2001年12月14日
发明者赵玉山, 崔维初, 苗得足, 李广 申请人:山东瑞阳制药有限公司