专利名称：一种检测人凋亡素2配体生物活性的方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种检测人凋亡素2配体(humanapoptosis 2 ligand，简称hApo-2L)生物活性的方法。
Apo-2L(apoptosis 2 ligand)，又称TRAIL(TNF relatedapoptosis-inducing ligand)，中文译为凋亡素2配体，或称肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。是TNF(肿瘤坏死因子)家族的一个新成员，于1995年由Wiley SR等人克隆获得。与其它肿瘤坏死因子家族的成员一样，Apo-2L也能诱导肿瘤细胞发生凋亡，而且具有自身的特点，主要表现为(1)抑瘤的有效性Apo-2L单独使用，就可有效诱导肿瘤细胞凋亡，甚至使一些对放化疗不敏感的细胞发生凋亡，而TNF等在应用时，一般需要化疗药物CHX(放线菌酮)等的辅助。(2)抑瘤的广谱性研究证实，Apo-2L可诱导近2/3现有的肿瘤细胞系发生凋亡，其中包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、淋巴癌以及肾脏肿瘤和中枢神经系统肿瘤等。(3)与放化疗药物有明显的协同作用Apo-2L的使用可明显降低放化疗药物的用量。(4)低的毒副作用体外实验证实，Apo-2L对人脐静脉血管内皮细胞、肺成纤维细胞、乳腺细胞、肾脏细胞、前列腺上皮细胞、结肠平滑肌细胞、星状细胞等均无诱导凋亡的作用。动物实验也证实，即使在Apo-2L用量很大的情况下(10mg/kg/d，静脉注射)，也无明显的毒副作用产生。综上所述，Apo-2L由于具有低毒、广谱、高效等优点，从而有望成为一种新的抗肿瘤药物，因此受到研究者的广泛关注，但迄今为止，尚无一种标准的检测Apo-2L生物活性的方法出现，相关文献常采用不同的细胞系检测活性，造成结果的不可比性。
本发明的目的在于提供一种hApo-2L生物活性的检测方法，以便进一步推动hApo-2L的研究。
本发明采用下述技术方案以传代用培养基(90％RPMI 1640+10％FBS)培养L929细胞，2×105/ml浓度每孔100ul接种96孔板，放CO2孵箱过夜，以稀释用培养基(95％RPMI 1640+5％FBS)稀释样品加样，并于加样后加入终浓度为500ng/ml的放线菌素D(actinomycin D)或放线菌酮(cycloheximide)，再放CO2孵箱过夜，MTT(噻唑蓝)染色，SDS裂解，在波长570nm处有最大光吸收。用此法检测到凋亡素2配体的半致死剂量(LD50)在1-5ng/ml范围内。
本发明提供的测活方法，检测到的hApo-2L的半致死剂量降至1-5ng/ml，而文献报道的hApo-2L的LD50一般在50-200ng/ml范围内，因此本发明测活方法的灵敏度，是传统方法的几十倍。另外，本发明使用的L929细胞系，是一个建系早、培养条件成熟、代时短、容易培养的细胞系，因此可在较短的时间内获得大量细胞，使测活更加方便。
本发明用下述实例进行说明实施例1细胞培养L929细胞为小鼠成纤维肉瘤细胞系，培养基为传代用培养基(90％RPMI 1640+10％FBS)；培养条件为37℃、5％CO2；传代时以0.25％胰蛋白酶消化，1∶5到1∶10传代。
实施例2测活步骤
(1)铺板以0.25％的胰蛋白酶消化细胞，用上述传代用培养基悬浮细胞，凋整细胞浓度至2×105个/ml，之后接种96孔板(下称测活板)，每孔100ul，放置37℃、5％CO2孵箱培养过夜。
(2)稀释取另一块96孔板(下称稀释板)，每孔加稀释用培养基(95％RPMI 1640+5％FBS)100ul，根据样品蛋白含量以稀释用培养基对样品预稀释，把预稀释后的样品加入稀释板的A、B、C、D、E、F行的第1列，每孔100ul，每个样品两行，之后从1到12列进行2倍系列稀释，G、H行留做空白对照。
(3)加样甩出测活板内的液体，把稀释板的液体加入到测活板相应的孔内。
(4)将上述测活板内加入放线菌素D或放线菌酮，并使其终浓度为500ng/ml。
(5)药物作用将上述测活板放置37℃、5％CO2孵箱过夜。
(6)每孔加MTT(10mM PBS配制，PH7.4)20ul，置37℃、5％CO2培养4-6小时，每孔加10％SDS(0.01N HCl配制)100ul，37℃、5％CO2孵箱过夜。酶标仪检测OD570。
(7)结果计算以OD570为纵坐标，稀释倍数为横坐标作图，从图上找出50％最小效应点的稀释倍数K。然后用下述公式算出半致死剂量
权利要求
1.一种检测人凋亡素2配体(hApo-2L)生物活性的方法，包括铺板、加样、培养、染色、溶解及结果计算等步骤，其特征在于(1)测活过程使用L929(小鼠成纤维肉瘤细胞mousefibrosarcoma cell)细胞系；(2)测活过程中加入放线菌素D(actinomycin D)或放线菌酮(cycloheximide)。
2.根据权利要求1所述的活性测定方法，其特征在于可以检测各种形式的人凋亡素2配体的生物活性，包括天然人凋亡素2配体分子、重组人凋亡素2配体分子、可溶性人凋亡素2配体分子等。
全文摘要
本发明涉及一种检测人凋亡素2配体(hApo－2L)生物活性的方法。本发明采用小鼠成纤维肉瘤细胞系L929进行测活，并在测活过程中加入放线菌素D或放线菌酮。利用本发明检测到的hApo－2L的半致死剂量在1－5ng/ml范围内，其灵敏度是传统测活方法的几十倍。
文档编号C12Q1/04GK1428433SQ01144949
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者牛晓霞, 刘永全, 刘红燕 申请人:北京三元基因工程有限公司