专利名称：将分子识别转导成不同信号的信号适体的制作方法
背景技术：
相关领域的描述美国专利第5,475,096号和第5,270,163号中描述的SELEX法(下文称为SELEX)提供了一类核酸分子产品，每种产品具有独特的序列，各自都具有特异性地与所需的靶化合物或分子结合的特性。各核酸分子是给定的靶化合物或分子的特异性配体。SELEX以以下独特的见解为基础核酸具备形成各种二维和三维结构的足够能力，以及它们的单体内存在的作为事实上任何化学物质(不论是单体还是聚合物)的配体(形成特异的结合配偶)的足够的化学通用性。任何大小的分子都可用作靶标。
SELEX法涉及使用相同的通用选择主题从候选物的混合物中进行筛选然后进行结构改进的逐步迭代法，以事实上获得结合亲和力和选择性的任何所需标准。该方法从核酸混合物(较佳是含有随机序列的片段)开始，包括在有利于结合的条件下使所述混合物与靶标接触的步骤、将未结合的核酸从已结合于靶分子的核酸中分离的步骤、解离核酸-靶标配偶的步骤、扩增从所述核酸-靶标配偶解离得到的核酸以产生富含配体的核酸混合物的步骤，然后根据需要重复所述结合、分离、解离和扩增步骤。
在含有大量的可能的序列和结构的核酸混合物中，对给定靶标的结合亲和力范围很大。含有如20个核苷酸随机片段的核酸混合物可具有4.sup.20种候选可能性。那些对靶标具有较高亲和力常数的分子最有可能与靶标结合。在分离、解离和扩增后，获得第二种核酸混合物，这种混合物富含具有较高结合亲和力的候选物。附加的筛选逐步有利于最佳的配体，直到所得的核酸混合物主要仅含有一条或少数几条序列。然后，可进行克隆、测序，并单独测试其作为纯的配体的结合亲和力。
重复筛选、分离和扩增过程，直至达到所需的目标。在最常见的例子中，连续进行筛选/分离/扩增，直到在下一轮中结合强度不再明显增加。该方法可用于具有多至约10.sup.18种不同的核酸种类的样品。测试用混合物的核酸较佳包括随机序列部分以及有效扩增所需的保守序列。可采用若干方法生产核酸序列变体，包括随机核酸序列的合成和从随机解离的细胞核酸中进行大小筛选。可变的序列部分可含有完全随机序列或部分随机序列；它还可含有与随机序列结合的保守序列的次级部分(subportion)。在进行筛选/分离/扩增循环之前或期间，可通过诱变的方式导入或提高测试核酸中的序列变异。
大多数常规的诊断试验依赖生物聚合物受体或者它们的配体的固定作用。这类试验花费的时间多，并且是劳动强度大的工作，因此需要发展不需要多次固定或洗涤步骤的同源试验形式。先前已在诊断试验中引入适体，不过它们的主要用途是作为抗体的取代物。例如，Gilardi等人已将荧光染料偶联到麦芽糖结合的蛋白质上，并能直接读取溶液中的麦芽糖的浓度1，Marvin和Hellinga已将荧光染料偶联到葡萄糖结合的蛋白质上，然后读取溶液中葡萄糖的浓度2。
先前已将寡核苷酸和核酸用于有义杂交3，这些物质还可潜在地用于检测金属4。已筛选出针对种类繁多的靶分析物(如离子、小的有机分子、蛋白质和超大分子结构如病毒或组织)的适体18，19。
配体结合的蛋白质5或小分子6向生物传感器的转化高度依赖于给定受体的结构和动力学，因此，将适体转化成生物传感器可能相对简单些7，8。在它们的同源配体的存在下，适体通常进行“诱导吻合”的构型改变9，因此，所附加的染料易于在其所处的局部环境中发生配体依赖性变化。与其它试剂(如抗体)不同，适体易于合成，染料则易于被引入特异性的位点。因此，可采用合理的和随机的工程学策略快速产生适体生物传感器。
现有技术由于缺乏与含有显示溶液中同源配体的存在的报道分子的种类(适体)结合的核酸而有缺陷。本发明满足本领域这种由来已久的需求和需要。
发明概要在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种将信号适体在与配体结合后的构型变化转导成由报道分子产生的不同信号的方法，它包括使信号适体与配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测所述信号适体与所述配体结合后由其构型改变产生的所述报道分子产生的不同信号，从而实现构型变化的转导。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种将信号适体在与配体结合后的构型改变转导成由荧光染料产生的光信号的方法。此方法包括使信号适体与配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测所述信号适体与所述配体结合后由其构型改变产生的所述荧光染料产生的光信号，从而实现构型变化的转导。
在本发明的又一实施方式中，本发明提供一种给上述公开的配体定量的方法，它包括使上述公开的信号适体与配体接触，其中，所述信号适体与所述配体结合；测量由所述信号适体与所述配体结合产生的上述光信号的增加；其中，光信号的增加与结合于上述信号适体的配体的量呈正相关。
从下述为公开的目的而给出的本发明目前优选的实施方式的描述中，将可理解本发明的其它和另外的方面、特征、利益和优点。
附图的简短描述因此，通过结合在附图中阐述的某些实施方式，关于本发明的上述和其它特征、优点和目标将变得清楚、可以实现、并且将会被更详细地理解，尤其是上述简单归纳的本发明将会被更具体的描述。这些附图形成本说明书的一部分。但是，应注意的是，附图所阐述的是本发明的优选实施方式，因此，不应认为本发明的范围受到这些实施例的限制。
图1显示由NMR分析获得的抗腺苷适体的三维模型11，12。选择用于将染料结合到RNA、ATP-R-Ac13(蓝色)或DNA、DFL7-8(橙色)、适体的一些位点显示为黄色。结合的腺苷显示为紫色。
图2显示染料结合到RNA和DNA适体的位点。在图2A的RNA适体中，吖啶被插入，以取代残基13(ATP-R-Ac13)。荧光素在5′端结合(ATP-R-F1)、在具有七腺嘌呤基连接物的5′端结合(ATP-R-F2)、以及取代残基13(ATP-R-F3)。在图2B的DNA适体中，荧光素在5′端插入(DEL0)、在残基7的位置上插入、以及在残基7和8之间插入(DFL7-8)。残基从次级结构上5′端开始计数。
图3显示信号适体ATP-R-Ac13(图3A)和DFL7-8(图3B)的特性。在ATP、GTP、CTP和UTP(对于ATP-R-Ac13，配体的量为1mM；对于DFL7-8，配体的量为200μM)的存在下，测得相对荧光单位(ΔRFU)有部分增加。
图4显示信号适体ATP-R-Ac13(图4A)和DFL7-8(图4B)的突变型没有信号。在ATP的存在下(对于ATP-R-Ac13和Mut34，配体的量为1mM；对于DFL7-8和Mut9/22，配体的量是250μM)。
图5显示信号适体ATP-R-Ac13(图5A)和DFL7-8(图5B)的反应曲线。以各种浓度的ATP(●)和GTP(■)绘制出ΔRFU。各数据点是3个值的平均值与标准偏差。使用Kaleidograph程序(Synergy Software)对数据进行曲线拟合。
图6显示从DNA信号适体的反应曲线衍生的Scatchard曲线。RFU、ΔRFU(x轴)的部分增加与ΔRFU/[ATP]之比(y轴)绘制成曲线。
图7显示信号适体DFL7-8(图7A)及其双重突变型Mut9/22(图7B)的洗脱曲线。在使用放射性标记的适体后，使用44ml选择缓冲液洗涤柱。在选择缓冲液(15ml)中使用0.3mM的GTP溶液(从左边其第1个箭头)。在用另外10ml选择缓冲液洗涤后(第二个箭头)，加入含0.3mM的ATP溶液的选择缓冲液(15ml，第三个箭头)。
发明的详细描述在一个实施方式中，本发明涉及一种将信号适体在与配体结合后的构型变化转导成由报道分子产生的不同信号的方法，它包括使信号适体与配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测所述信号适体与所述配体结合后由其构型改变产生的所述报道分子产生的不同信号，从而实现构型变化的转导。
所述不同的信号可以是光信号、电化学信号或者酶信号。光信号的代表性例子是荧光、比色强度、各向异性、极化、寿命、发射波长和激发波长。在化学合成、转录或后转录期间，产生上述信号的报道分子可以共价结合于适体，或者可以非共价的方式附于适体上。所述报道分子可以是荧光染料，如吖啶或荧光素。适体可以是经任意修饰的DNA或RNA，但可不含有蛋白质或生物聚合物；配体可以是被信号适体结合的非核酸分子。配体和信号适体可存在于溶液中。此外，可将信号适体固定在固相载体上，而且，它可平行固定在固相载体上，而形成信号芯片。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种将信号适体在与配体结合后的构型改变转导成由荧光染料产生的光信号的方法。此方法包括使信号适体与配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测所述信号适体与所述配体结合后由其构型改变产生的所述荧光染料产生的光信号，从而实现构型改变的转导。
在本发明的这个方面，所述光信号可以是本文所公开的光信号。所述报道分子可以是荧光染料，如吖啶或荧光素。它与所述适体共价结合，要么取代所述适体中的核酸，要么在两个核酸之间插入而不干扰配体结合位点。适体可以是抗腺苷RNA适体(如ATP-R-Ac13)或者是抗DNA适体(如DFL7-8)。在这些例子中，配体是腺苷。配体和信号适体可被固定在固相载体上。通过使信号适体平行固定，可形成信号芯片。
在本发明的又一实施方式中，本发明提供一种给上述公开的配体定量的方法，它包括使上述公开的信号适体与配体接触，其中，所述信号适体与所述配体接触；测量由所述信号适体与所述配体结合产生的上述光信号的增加；其中，光信号的增加与结合于上述信号适体的配体的量成正相关。
本发明涉及一种使用含有(尤其是)荧光染料的工程设计的适体检测溶液中同源配体或分析物的存在并对其进行定量的方法。
术语“适体”或“选择的核酸结合的种类”在本文中应包括非修饰性或经化学修饰的RNA或DNA。尤其是，可采用亲和层析或过滤分离方法进行选择，采用反转录(RT)、聚合酶链式反应(PCR)或等温扩增进行扩增。
术语“信号适体”在本文中应包括具有以如下方式附于其上的报道分子的适体在该适体与配体相互作用产生构型变化后，所述报道分子产生不同的信号。
术语“报道分子”在本文中应包括但不限于通过荧光或比色强度、各向异性、极化、寿命或者发射波长或激发波长的改变而产生信号的染料。报道分子还可包括在它们的电化学状态下发生变化的分子，例如，在氧化-还原反应中，电子载体的局部环境改变了带电离子的还原电势；或者，报道分子可包括产生信号的酶，如β-半乳糖苷酶或荧光素酶。
术语“配体”在本文中应包括除了核酸序列外与适体结合的任何分子。但是，配体可以是核酸结构，如茎-环结构。
术语“附于”在本文中应包括但不限于RNA的化学合成期间或转录期间或转录后的共价偶联。该术语还可包括非共价偶联，如非共价结合于酶的活性位点的适体在与配体相互作用后被释放并激活该酶。
术语“构型改变”在本文中应包括但不限于空间排练的变化，包括没有伴生空间排列的化学环境的微妙改变。
术语“不同的信号”在本文中应包括但不限于可测量的光信号、电化学信号或酶信号。
为了阐述本发明的各个实施方式，给出下列实施例，这些实施例并不是以任何方式对本发明进行限制。
实施例1材料从Roche Molecular Biochemicals购得ATP(二钠盐)和GTP(二钠盐)，从Sigma购得ATP琼脂糖(C8键，9个原子的间隔基)。从Glen Research购得亚磷酰胺荧光素、5′-亚磷酰胺荧光素和亚磷酰胺吖啶。从New England Biolabs购得T4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶缓冲液。从ICN购得放射性[γ-32p]ATP。
实施例2信号适体的制备如先前所述合成一系列适体-染料共轭物(图2)，并进行去保护处理20-23。内部标记的适体使用亚磷酰胺荧光素和亚磷酰胺吖啶合成，而末端标记的适体则使用5′-亚磷酰胺荧光素产生。采用Wincott等人23的方法的修改方案进行RNA适体-染料共轭物的去保护处理。在去保护处理的第一部分，使树脂在室温下在3∶1的NH4OH∶EtOH中悬浮13小时，而不是在55℃悬浮17小时。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化所述适体，然后在37℃用0.3M NaOAc洗脱过夜，之后用乙醇沉淀。将所得适体再悬浮在50μl H2O中，接着以RNA 0.025ml cm-1μg-1、DNA 0.027mlcm-1μg-1的消光系数测量其A260值，从而对所得适体进行定量。
使所得适体在选择缓冲液中热平衡，所采用的条件根据经验而定，以获得最佳的荧光强度。在进行荧光测量前，先将RNA适体(500nM)悬浮在选择缓冲液中，该缓冲液含有300mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH7.6)和5mM MgCl2，在65℃进行3分钟的热变性处理，然后在热循环控制装置中以每12秒钟1℃的速率使其缓慢冷却至25℃。将DNA适体(150nM)悬浮在上述选择缓冲液中17，75℃热变性3分钟，然后使其在10-15分钟内冷却至室温。
实施例3荧光测量所有的测量都在从SLM-AMINCO Spectronic Instruments购得的LuminescenceSpectrometer系列2上进行。以它们各自的最大值(吖啶λex＝450nm；荧光素λex＝495nm)激励各实验样品，并在相应的发射最大值(吖啶λem＝495nm；荧光素λem＝515nm)测量荧光强度。用移液管将适体溶液(对于RNA，溶液体积为200μl；对于DNA，溶液体积为1000μl)加到荧光计孔(Stama Cells，Inc.)中，然后加入标准体积的各浓度配体溶液(对于RNA，加50μl；对于DNA，加1.5μl)。
实施例4通过等容洗脱进行的结合亲和力的测量对于5′端标记，在37℃使适体在T4多核苷酸激酶反应混合物(1μl T4多核苷酸激酶(10单位)，2μl DNA，0.5μl 10x多核苷酸激酶缓冲液，0.5μl[γ-32P]ATP(7000Ci/mmol)，6μl水，总体积为10μl)中培育1小时。用25ml选择缓冲液平衡具有2.5ml总体积(Vt)和1.16ml空隙体积(Vo)的ATP琼脂糖柱。使适体(10μg)热平衡后施加到上述柱上。柱上ATP的浓度([L]，见下文)是2.6mM。然后用选择缓冲液洗涤该柱，以1ml的亮收集各份洗出液。将每份洗出液的等分(5μl)点到尼龙滤色片上，然后使用Phosphorimager(Molecular Dynamics)定量测定所存在的放射性。使用额外的44ml选择缓冲液对该柱进行展开，接着用15ml含有0.3mM GTP溶液的选择缓冲液展开。用另外的10ml选择缓冲液洗涤该柱后，用15ml含0.3mM ATP溶液的选择缓冲液将任何残留的放射性物质完全洗脱出来。对于适体DFL7-8，在加入ATP溶液前，使用73ml的最终洗脱体积(ve)对柱进行展开。使用下面的方程计算ATP-琼脂糖的信号适体Kd的上限Kd＝[L]×(Vt-Vo)/(Ve-Vo)，16已发表了几种结合小分子的有机配体的适体的三维结构10-14。在本试验中，为了设计信号适体(图1)，使用了两种抗腺苷适体11，12，15的结构，其中一种选自RNA库16，而另一种选自DNA库17。使用Insight 2程序(Molecular Simulations)来观察和操作这些抗ATP适体的结构。将荧光染料放在官能残基的附近，通过测定在同源配体ATP的存在下产生的荧光强度是否有变化来评价所得的嵌合体产生信号的能力。
由RNA和DNA制得的不同的抗腺苷信号适体选择性表现出溶液中腺苷的存在。荧光强度的增加可重现地随着腺苷浓度的增加而增加，这一增加可用来进行定量。在本发明的方法中，可将荧光团放在适体上接近配体结合位点的地方，以避免它们被封阻或破坏，或者将它们放在使较大的配体诱导的适体结构(如螺旋旋转)的构型改变可被监测的位置上。例如，抗腺苷RNA适体的残基13邻近结合团，但它不参与与ATP的相互作用，而是向外指向溶液中(图1A)。因此，在RNA适体中引入吖啶部分，使其取代位置13上的腺苷，称为ATP-R-Ac13(图2)。类似地，DNA适体的残基7也接近结合位点，并且也不直接与ATP相互作用(图1B)。从而，荧光团可取代残基7，可在残基7和8之间插入，所得的物质分别称为DFL7和DFL7-8(图2)。
在所测试的各种构建物中，ATP-R-F1、ATP-R-F2、ATP-R-F13、DFL0和DFL7适体，在加入ATP后的荧光强度显示出不很明显的变化(5％或以下)。但是，ATP-R-Ac13和DFL7-8适体在1mM ATP的存在下的荧光强度则有明显的增加。增加的范围在25-45％。
实施例5信号适体的特性为了评估ATP-R-Ac13信号适体(图3A)和DFL7-8信号适体(图3B)对ATP的特异性，测量了在GTP、CTP和UTP的存在下的荧光变化。没有观察到荧光有明显的配体依赖性增加。此外，通过省略或取代关键的官能残基，构建了不与ATP结合的ATP-R-Ac13和DFL7-8的突变型。由诱变研究知道，RNA适体的残基G34对于结合是必需的，而DNA适体的残基G9和G22则对于与ATP配体的接触是关键的。构建了缺乏G34的RNA适体的突变型(Mut34)(图4A)，和其G9和G22都被胞苷残基取代的DNA适体的双重突变型(Mut9/22)(图4B)。这些突变型信号适体的荧光没有显示出ATP依赖性的增加。
为了证明信号适体可用于计算溶液中的分析物的量，通过测量ATP-R-Ac13(图5A)和DFL7-8(图5B)的荧光强度，将其作为ATP和GTP浓度的函数，绘制反应曲线。对于ATP，两种信号适体的荧光强度都显示有梯度地增加，而对于GTP，其荧光强度的变化较少或没有。虽然这些信号适体的反应曲线是可完全再现的，但是它们不可能与基于所报道的原始适体的Kd的简单结合模型相吻合。但是，DNA适体的原始结合数据是以假设该适体仅含有单一配体结合位点为基础，而NMR结构显示该DNA适体具有两个结合位点。
为了测定信号适体中是否检出两个ATP结合位点，将荧光变化对荧光变化与未结合ATP的浓度的比值作图。所得的非线性Scatchard曲线(图6)是双相的，这表明存在多个结合位点。信号数据与适体协调地与两个ATP分子结合的模型相吻合，使用下式进行计算(F-F0)=K1(F1-F0)[L]+K1K2(F2-F0)[L]21+K1[L]+K1K2[L]2]]>F荧光信号F0未络合的底物的荧光F1单结合的底物的荧光F2双结合的底物的荧光K1初级络合物的形成常数K2次级络合物的形成常数这项分析结果产生两个离解常数，较高的亲和力位点具有30+/-18μM的Kd，1(1/K1)，较低的亲和力位点具有53+/-30μM的Kd，2(1/K2)。计算出在结合第一ATP(F1)后的荧光的相对改变为-0.004％，可忽略不计，而算得由于三元络合物(F2)的形成而导致的荧光的相对改变为49％。两个结合位点间的亲和力的相似性与该DNA(即抗腺苷适体)的序列和结构对称性一致。由于在形成三元络合物后观察到荧光的最大变化，所以含有该荧光素指示器的位点的亲和力受到轻微的干扰，该信号适体主要反映了配体与这个位点的相互作用。
采用测定适体对ATP的Kd的恒溶剂成分洗脱法16分别检测信号适体的结合能力。将信号适体施加到ATP亲和柱上，然后用缓冲液和核苷酸逐步洗脱。RNA信号适体ATP-R-Ac13与柱的结合很差，它的估算Kd值大于毫摩尔。这些结果与产生信号所需的相对大量的ATP一致(图5A)。引入吖啶后RNA适体的亲和力的减少与将染料引入麦芽糖结合蛋白质和葡萄糖结合蛋白质后所观察到的亲和力的减少类似1，2。
与此不同，DNA信号适体DFL7-8(图7A)具有低于13微摩尔的表观Kd，并且该适体不可用GTP从ATP亲和柱上洗脱下来。从柱色谱法推测得的该DNA适体的亲和力与上述该较低亲和力位点的计算亲和力是可比的。非信号双重突变型Mut9/22并未结合到该亲和柱上(图7B)。DNA信号适体低于RNA信号适体的Kd与该由DNA信号适体产生的较好信号应答一致(图5B)。但是，还是难于与DNA适体的结合与信号产生的研究进行直接比较，因为未修饰的适体含有两个协作性的腺苷结合位点17，这两个位点可能已受到染料的引入的不同影响。
实施例6其它信号适体考虑了含有信号适体的报道分子可以是除了荧光染料或其它氟石(fluor)之外的分子，并且这类报道分子可产生除了光信号外的不同信号。这类分子的电化学状态可以改变，即由电子载体的局部环境的变化引起的氧化还原电势的改变可产生不同的信号。在这样的相互作用中，构型的改变可能不是空间的，而是化学环境的改变。或者，报道分子可以是自身可产生不同信号的酶，如β-半乳糖苷酶或荧光素酶。
这样的报道分子可以非共价连接于适体。报道分子与如酶的活性位点的非共价连接，在与配体相互作用后可产生不同的信号；配体与信号适体的结合改变了该报道分子与该活性位点的非共价连接，从而激活了该酶。
实施例7诊断试验适体-染料共轭物可直接表现出溶液中分析物的存在和含量，而不需要事先的固定步骤或者洗涤步骤的事实，使得适体可以目前对其它适体(如抗体)来说还未适用的方式使用。通过如本文所述将荧光染料简单地加到现存的适体中，可快速合成用于传感器试验的大量新的试剂。所设计的化合物的第一代产物已可检测微摩尔到毫摩尔范围的分析物的事实使得上述可能性更加可行。将通过在更大范围的位置上加入更大范围的染料而进一步改进信号适体的敏感性。
本文引用到下述文献1.Gilardi，G.，Zhou，L.Q.，Hibbert，L.，Cass，A.E.，《分析化学》(AnalChem)，1994，66，3840-7；2.Marvin，J.S.，Corcoran，E.E.，Hattangadi，N.A.，Zhang，J.V.，Gere，S.A.，Hellinga，H.W.，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997，94，4366-71；3.Tyagi，S.，Kramer，F.R.，《自然生物化学》(Nat Biotechnol)，1996，14，303-8；4.Walter，F.，Murchie，A.，Liller，D.，《生物化学》(Biochemistry)，1998，37，17629-36；5.Giuliano，K.，Taylor，D.，《生物化学发展趋势》(Trends Biotechnol)，1998，16，135-40；6.Lehn，J.M.，《科学》(Science)，1993，260，1762-3；7.Bier，F.F.，Furste，J.P.，《实验》(Exs)，1997，80，97-120；8.Osborne，S.E.，Matsumura，I.，Ellington，A.D.，《化学生物的当前观点》(Curr Opin Chem Biol)，1997，1，5-9；9.Westhof，E.，Patel，D.J.，《结构生物学的当前观点》(Curr Opin StructBiol)，1997，7，305-9；10.Patel，D.J.，Suri，A.K.；Jiang，F.，Jiang，L.，Fan，P.，Kumar，R.A.，Nonin，S.，《分子生物学期刊》(J Mol Biol)，1997，272，645-64；11.Lin，C.H.，Patel，D.J.，《化学生物学》(Chem Biol)，1997，4，817-32；12.Jiang，F.，Kumar，R.A.，Jones，R.A.，Patel，D.J.，《自然》(Nature)，1996，382，183-6；13.Jiang，L.，Suri，A.K.，Fiala，R.，Patel，D.J.，《化学生物学》(Chem Biol)，1997，4，35-50；14.Dieckmann，T.，Butcher，S.E.，Sassanfar，M.，Szostak，J.W.，Feigon，J.，《分子生物学期刊》(J Mol Biol)，1997，273，467-78；15.Dieckmann，T.，Suzuki，E.，Nakamura，G.K.，Feigon，J.，《RNA》(Rna)，1996，2，628-40；16.Sassanfar，M.，Szostak，J.W.，《自然》(Nature)，1993，364，550-3；17，Huizenga，D.E.，Szostak，J.W.，《生物化学》(Biochemistry)，1995，34，656-65；18.Uphoff，K.W.，Bell，S.D.，Ellington，A.D.，《结构生物学当前的观点》(Curr Opin Struct Biol)，1996，6，281-8；19.Conrad，R.C.，Giver，L.，Tian，Y.，Ellington，A.D.，《酶学方法》(MethodsEnzymol)，1996，267，336-67；20.Andrus，A.，Cox，S.，Beavers，S.，Parker，A.，Anuskiewicz，J.，Mullah，B.，《核酸对称研究》(Nucleic Acids Symp Ser)，1997，37，317-8；21.Scaringe，S.A.，Fraacklyn，C.，Usman，N.，《核酸参考》(Nucleic AcidsRes)，1990，18，5433-41；22.Maglott，E.J.，Glick，G.D.，《核酸参考》(Nucleic Acids Res)，1998，26，1301-8；23.Wincott，F.，DiRenzo，A.，Shaffer，C.，Grimm，S.，Tracz，D.，Workman，C.，Sweedler，D.，Gonzalez，C.，Scaringe，S.，Usman，N.，《核酸参考》(NucleicAcids Res)，1995，23，2677-84。
本说明书中提及的任何专利或出版物都表明了本发明所属领域的熟练技术人员所掌握的水平。此外，这些专利和出版物都以与如果各个出版物被特殊与单独指定纳入作为参考相同的程度被纳入本文作为参考。
本领域中熟练的技术人员将易于理解，本发明可很好适用于实施所述目标，并且可获得所提及的结果和优点以及本文所述的那些固有特征。本发明的实施例与方法、步骤、处理、分子以及本文所述的特殊化合物都是本发明的代表性优选实施方式，它们是示范性的，而不是本发明范围的限制。本领域熟练的技术人员在不偏离权利要求的范围所限定的本发明的实质的情况下可对本文作出变动或将本发明用于其它用途。
权利要求
1.一种将信号适体在与配体结合后的构型变化转导成由报道分子产生的不同信号的方法，它包括使所述信号适体与所述配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测因信号适体与配体结合后发生的构型变化而导致的报道分子产生的不同信号，从而实现构型变化的转导。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同信号包括光信号、电化学信号或酶信号。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光信号选自荧光、比色强度、各向异性、极化、寿命、发射波长和激发波长。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号适体含有附于核酸结合种类(适体)上的报道分子。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述报道分子通过共价偶联或非共价偶联而附于核酸结合种类(适体)上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述报道分子与适体的共价偶联在是化学合成过程中、转录期间或转录后产生的。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述报道分子是染料。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述染料是荧光染料。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光染料选自吖啶和荧光素。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述适体选自RNA、DNA、修饰的RNA和修饰的DNA，其中，所述适体不是蛋白质或生物聚合物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配体是被信号适体结合的非核酸序列分子。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配体存在于溶液中。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号适体存在于溶液中，或者固定在固相载体上。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述信号适体平行地固定在固相载体上，其中所述固定化形成信号适体芯片。
15.一种将信号适体在与配体结合后的构型改变转导成由荧光染料产生的光信号的方法，它包括使所述信号适体与所述配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；检测因信号适体与配体结合后发生的构型变化而导致的报道分子产生的不同信号，从而实现构型变化的转导。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述光信号选自荧光、比色强度、各向异性、极化、寿命、发射波长和激发波长。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述信号适体含有通过共价偶联而附于核酸结合种类(适体)上的荧光染料。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述荧光染料取代所述适体中的核酸残基，或者在该适体的两个核酸残基之间插入，其中，这样的染料的位置并未干扰所述适体的配体结合位点。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述荧光染料是荧光素或吖啶。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述适体是抗腺苷RNA适体或抗腺苷DNA适体。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗腺苷RNA适体是ATP-R-Ac13。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗腺苷DNA适体是DFL7-8。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述配体是被信号适体结合的非核酸序列分子。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述配体是腺苷。
25.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述配体存在于溶液中。
26.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述信号适体存在于溶液中，或者固定在固相载体上。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述信号适体平行地固定在固相载体上，其中，所述固定化形成信号适体芯片。
28.一种定量测定权利要求15所述的配体的方法，它包括使权利要求15所述的信号适体与所述配体接触，其中所述信号适体与所述配体结合；测量由所述信号适体与所述配体结合而产生的权利要求15中所述的光信号的增加；其中，所述光信号的增加与结合于所述信号适体的配体的数量呈正相关。
全文摘要
本发明提供一种将信号适体在与配体结合后的构型变化转导成由报道分子产生的不同信号的方法。本发明还提供一种使与荧光染料偶联的适体(信号适体)与配体结合，然后测量所产生的光信号，从而检测并定量溶液中的配体的方法。
文档编号C12Q1/68GK1419606SQ01806964
公开日2003年5月21日 申请日期2001年2月2日 优先权日2000年2月3日
发明者A·埃林顿 申请人:研究发展基金会