专利名称：通过遗传改变莽草酸路径来改变生物体中精细化学品含量的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过培养生物体尤其是植物用来产生精细化学品尤其是维生素E、维生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物体尤其是植物的莽草酸路径在野生型基础上被遗传改变，本发明还涉及转基因生物体自身。
生物体，尤其是植物，呈现出一系列具有高经济重要性的作为精细化学品的代谢物。以举例方式提及的精细化学品为芳族氨基酸、水杨酸衍生物、类苯丙烷(phenylpropanoids)、黄酮类化合物、1，2-二苯乙烯、呫吨酮和醌，尤其是具维生素E或维生素K活性的混合的含异戊二烯基的脂类化合物。
用于产生精细化学品的生物技术方法为培养可产生这些精细化学品的生物体并从生物体中分离目标精细化学品。
以定向方式改变生物体中精细化学品含量，通过生物技术产生精细化学品的经济方法及用生物体作为已加工或未加工的食品或饲料是人们所希望的，其中所述以定向方式改变生物体中精细化学品含量如增加想要的精细化学品含量和/或阻止代谢物向不想要的精细化学品的转变。
经济上重要的精细化学品的实例为塑体醌、泛醌以及类异戊二烯侧链连接至芳香母核上的具维生素E或维生素K活性的化合物。
天然存在的具维生素E活性的八种化合物均为6-色原烷醇衍生物(Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，A 27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第4章，478-488，维生素E)。生育酚基团(1a-d)显示一个饱和侧链，而生育三烯酸基团(2a-d)显示一个不饱和侧链 1a，α-生育酚R1＝R2＝R3＝CH31b，β-生育酚R1＝R3＝CH3，R2＝H1c，γ-生育酚R1＝H，R2＝R3＝CH31d，δ-生育酚R1＝R2＝H，R3＝CH3 2a，α-生育三烯酸R1＝R2＝R3＝CH32b，β-生育三烯酸R1＝R3＝CH3，R2＝H2c，γ-生育三烯酸R1＝H，R2＝R3＝CH32d，δ-生育三烯酸R1＝R2＝H，R3＝CH3在本发明中，维生素E理解为包括具维生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酸。
这些具维生素E活性的化合物是重要的天然脂溶性抗氧化剂。人和动物维生素E缺乏可导致病理生理学上的疾病。因此，将维生素E化合物作为食品和饲料、药物制剂和化妆品中的添加物是有大的经济价值的。
天然存在的具维生素K活性的化合物为1，4-萘醌衍生物(Ullmann工业化学百科全书，A27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第5章，488-506，维生素K)。叶绿醌(早期名称维生素K1)呈现出一个很大程度上饱和的侧链，而甲基萘醌类(早期名称维生素K2)呈现出一个具4至13个异戊二烯残基的不饱和侧链。
在本发明中，维生素K理解为包括所有具维生素K活性的化合物，尤其是上述化合物。
类异戊二烯侧链的生物合成始于异戊二烯焦磷酸酯(IPP)。IPP与其异构体二甲烯丙焦磷酸酯(DMAPP)相平衡。IPP与DMAPP首尾缩合产生单萜(C10)香叶基焦磷酸(GPP)。进一步添加IPP单元产生倍半萜(C15)焦磷酸法呢酯(FPP)和双萜(C20)香叶基香叶焦磷酸酯(GGPP)。
叶绿醌含有C20叶绿基链，其中只有第一个异戊二烯单元含有双键。GGPP通过香叶基香叶焦磷酸酯氧化还原酶(GGPPOR)转化为叶绿基焦磷酸酯(PPP)，后者进一步形成生育酚的起始物质。
导致维生素E和K形成的混合的含异戊二烯基脂类的环结构为醌，其起始代谢物来自莽草酸路径。
分支酸从赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)开始，通过它们的缩合，经中间体3’-脱氢奎尼酸、3’-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸和5’-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸产生3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)而形成的。赤藓糖-4-磷酸在卡尔文循环中形成，而PEP是通过糖原酵解提供的。
在高等植物中，酪氨酸是从分支酸开始，通过预苯酸和arogenate而形成的。芳族氨基酸酪氨酸转化为羟基苯丙酮酸，后者通过双加氧作用转化为尿黑酸。
尿黑酸接下来结合叶绿基焦磷酸酯(PPP)或香叶基香叶焦磷酸酯以形成α-生育酚和α-生育三烯酸的前体，分别名为2-甲基-6-叶绿基-氢醌和2-甲基-6-香叶基香叶基氢醌。与作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸的甲基化作用步骤首先产生2，3-二甲基-6-叶绿基醌醇，接下来环化产生γ-生育酚，并进一步甲基化产生α-生育酚。
通过过表达或下调生育酚合成路径的生物合成基因来改变植物中的维生素E含量是公知的，为了本发明的目的，其中所述生育酚合成路径理解为从羟基苯丙酮酸至生育酚的生物合成路径。
WO 97/27285描述了通过提高生育酚表达或通过下调对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)来改变生育酚含量。
WO 99/04622和D.DellaPenna等，科学(Science)1998，282，2098-2100描述了来自集胞藻属(Synechocystis)PCC6803和拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)的编码γ-生育酚甲基转移酶的基因序列，并描述了将其掺入转基因植物，后者具改变的维生素E含量。
进一步公知在植物中通过过表达或下调类异戊二烯侧链生物合成路径的生物合成基因来改变维生素E含量。
WO 99/23231显示了在转基因植物中香叶基香叶还原酶的表达导致增加的生育酚生物合成。
WO 00/08169描述了编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和香叶基香叶焦磷酸酯氧化还原酶的基因序列，并描述了将它们掺入转基因植物，后者具改变的维生素E含量。
虽然所有这些方法产生的生物体尤其是植物具有改变的精细化学品维生素E的含量，但对于通过从转基因生物体分离而产生维生素E的方法而言，维生素E含量水平仍经常不令人满意。
本发明的一个目的是提供通过培养可产生精细化学品的生物体或转基因生物体来产生精细化学品的进一步的方法，其中所述生物体或转基因生物体具有不显示上述现有技术缺点的优化特性。
我们发现该目的通过这样一种产生精细化学品的方法而达到，其中培养其莽草酸路径在野生型基础上被遗传改变的生物体。
为了本发明的目的，尤其是对高等植物而言，莽草酸路径理解为始于D-赤藓糖-4-磷酸，经莽草酸、分支酸、预苯酸、arogenate、酪氨酸直至并包括4-羟基苯丙酮酸的上述生物合成路径(G.Michal，生物化学路径，生物化学图集(Biochemical pathways，Biochemie-Atlas)，SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg，柏林，1999，59至60页，图4.7-1和第4.7.1章)。
优选地，为了本发明目的，将莽草酸路径理解为从莽草酸至4-羟基苯丙酮酸的代谢路径，尤其优选地理解为从分支酸至4-羟基苯丙酮酸的代谢路径，在植物中该代谢路径从分支酸经预苯酸、arogenate和酪氨酸而进行。
精细化学品理解为来自莽草酸路径的生物体代谢产物。在此上下文中，莽草酸路径如上所述始于D-赤藓糖-4-磷酸并终止于4-羟基苯丙酮酸。对于这些代谢物而言，莽草酸路径的起始化合物D-赤藓糖-4-磷酸、终产物4-羟基苯丙酮酸以及所有上述中间体构成了由生物体生物转化为代谢物的起始化合物，它们此后也称为中间体。
优选的精细化学品为芳族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、水杨酸衍生物、叶酸衍生物、类苯丙烷(如木素、木酚素或香豆素，尤其是莨菪亭或莨菪苷)、黄酮类化合物(如查耳酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素或异黄酮类化合物)、1，2-二苯乙烯、呫吨酮或醌衍生物(如维生素E、维生素K、泛醌、塑体醌或紫草宁。
尤其优选的精细化学品为维生素E、维生素K或泛醌，尤其是维生素E。
根据莽草酸路径的遗传改变是否导致朝向形成莽草酸路径之一部分的某一中间体的代谢物流量增加或减少，在生物体中由该中间体生物合成的精细化学品含量得以增加或减少。因此，莽草酸路径的遗传改变优选地理解为朝向莽草酸路径中间体的代谢物流量的增加或减少。
导致朝向中间体的代谢物流量增加的莽草酸路径的遗传改变，以及由此对应的精细化学品的遗传改变为下列方法A、B或CA提高野生型莽草酸路径中至少一种酶的活性，例如通过过表达莽草酸路径的编码具该酶活性的蛋白质的基因，通过关闭导致中间体产生的代谢路径的反向调节机制，如关闭反馈抑制或导入在目标生物体中不受调节的直向同源基因。
B向生物体中导入至少一种这样的基因，对该基因而言在野生型中不存在直向同源基因且其桥接野生型莽草酸路径的代谢路径。例如，由于该新基因的功能，该基因可在桥接终止处引起朝向中间体的物质流量增加。
C灭活编码这样的酶的基因，该酶与产生目标产物的代谢路径的酶竞争。
导致朝向中间体的代谢物流量减少的莽草酸路径的遗传改变，以及由此对应的精细化学品的遗传改变为下列方法D、E或FD过表达一种代谢基因，并因此提高偏离该中间体的对应的酶活性；E灭活编码形成该中间体的酶的基因，例如通过反义技术或共抑制来灭活；F表达这样的基因，对该基因而言在野生型中不存在直向同源基因。例如该基因可桥接野生型的莽草酸路径的代谢路径，并且由于新基因的功能，该基因可引起朝向桥接中间体的物质流量减少。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，生物体中莽草酸路径的遗传改变导致朝向目标中间体的代谢物流量增加，并因此增加了相应的目标精细化学品。
优选通过至少一种选自方法A和B的方法，也就是说通过方法A和/或B，增加朝向莽草酸路径的目标中间体流量并因此增加目标精细化学品，方法A和B具有上述含义。
因此，本发明方法的一个优选实施方案包括进行至少一种选自A和B方法，用于遗传改变莽草酸路径，A和B具有下列含义A提高野生型莽草酸路径的至少一种酶的活性；B将至少一种基因导入生物体，其中对该基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其桥接野生型的莽草酸路径的代谢路径。
根据方法A可实现对野生型莽草酸路径的至少一种酶活性的提高，例如通过过表达编码具该酶活性的蛋白质的核酸即莽草酸路径的基因，通过关闭导致中间体产生的代谢路径的反向调节机制，如关闭反馈抑制或导入在目标生物体中不受调节的直向同源基因。
优选地，野生型莽草酸路径的至少一种酶的活性是根据方法A通过过表达莽草酸路径中编码具该酶活性的蛋白质的核酸而提高的。
在本方法的一个优选实施方案中，方法A是通过向生物体导入编码分支酸变位酶的核酸而进行的。
分支酸变位酶理解为具有将分支酸转化为预苯酸的酶活性的蛋白质。
原则上，所有的分支酸变位酶均可用于本发明的方法中，如欧芹(Petroselinum Crispum)分支酸变位酶(登记号T14902，T14901)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)分支酸变位酶(T36865)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分支酸变位酶(A33894)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)分支酸变位酶(AAD30065)或下面描述的拟南芥菜分支酸变位酶或下面描述的大肠杆菌(E.coli)分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶(tyrA)的分支酸变位酶活性。
在一个优选的实施方案中，使用了编码这样的分支酸变位酶的分支酸变位酶基因，其中所述分支酸变位酶的活性在生物体中受到减轻的翻译后调节。减轻的调节理解为与野生型的调节相比，对活性的调节为不超过99％，优选地不超过70％，尤其优选地为50％，特别优选地为0％，即对活性没有调节。
编码其活性在生物体中受到减轻的调节，尤其是不受到调节的分支酸变位酶的分支酸变位酶基因为例如在表达位点处受到减轻的翻译后调节，尤其是不受到翻译后调节的来自不同属生物体的分支酸变位酶基因，或为来自相同生物体或来自相关属生物体的分支酸变位酶基因。
根据本发明，生物体理解为原核生物或真核生物，如细菌、酵母、藻类、藓类植物、真菌或植物，它们作为野生型或通过遗传改变后可产生上述精细化学品。优选的生物体为光合活性生物体，如蓝细菌、藓类植物、藻类或植物，它们的野生型已能产生上述的精细化学品。
尤其优选的生物体为植物。
根据本发明方法的方法A的一个进一步优选的实施方案中，将编码其活性受到减轻的翻译后调节的分支酸变位酶的分支酸变位酶基因导入植物。
它们为例如一些细菌分支酸变位酶基因或由其衍生的分支酸变位酶基因，即为编码这样的蛋白质的核酸，其中所述蛋白质包含细菌分支酸变位酶的氨基酸序列，其活性在植物中受到减轻的翻译后调节，如下面描述的编码大肠杆菌分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶(tyrA)的分支酸变位酶活性的核酸或通过氨基酸的替换、插入或删除而衍生于该序列的序列，后者在氨基酸水平上与细菌分支酸变位酶的序列具有至少30％的同源性，优选地至少50％的同源性，更优选地至少70％的同源性，尤其优选地至少90％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
在本说明书中，术语“替换”理解为用一个或多个氨基酸置换一个或多个氨基酸。优选进行所谓的保守置换，其中替换氨基酸具有与原始氨基酸类似的特性，如用Asp置换Glu、用Asn置换Gln、用Ile置换Val、用Ile置换Leu以及用Thr置换Ser。
删除是用直接键替换氨基酸。优选的删除位置为多肽的末端和独立的蛋白质结构域之间的结合处。
插入为将氨基酸导入多肽链，直接键在形式上被一个或多个氨基酸替换。
两个蛋白质间的同源性优选地理解为在全长蛋白质中氨基酸的一致性，其优选地通过比较，在程序算法GAP(UWGCG，University ofWisconsin，Genetic Computer Group)的辅助下设置下列参数来计算间隔权重12长度权重4平均匹配2.912平均不匹配 -2.003因此，在氨基酸水平上与上述大肠杆菌分支酸变位酶的序列具至少30％同源性的蛋白质应理解为这样的蛋白质，将其序列与上述分支酸变位酶的序列优选地使用上述程序算法，用上面设置的参数进行比较，结果为具有至少30％的同源性。
细菌分支酸变位酶基因或由其衍生的分支酸变位酶基因也可编码具有分支酸变位酶特性和其它酶特性的蛋白质，如下述来自大肠杆菌K12的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因(tyrA)。如下所述，当组合进行方法A和B时该实施方案是尤其优选的。
在本发明方法的方法A的一个尤其优选的实施方案中，尤其是当只进行方法A时，将分支酸变位酶基因导入生物体的特定位点，在该位点处，相应的分支酸变位酶受到减轻的翻译后调节。
在此上下文中，优选使用在表达位点处受到减轻的翻译后调节的来自相同生物体或来自相关属生物体的编码分支酸变位酶的核酸。
分离自生物体不同部位的分支酸变位酶同工型在它们的调节方面是不同的。
可将来自生物体或相关属生物体特定部位的相应分支酸变位酶基因导入编码的分支酸变位酶不受到翻译后调节的生物体的其它部位。
在植物中本发明方法的一个尤其优选的实施方案为将编码植物胞质分支酸变位酶的核酸导入植物质体来实施方法A。
原则上适用于此目的的核酸为编码植物胞质分支酸变位酶的所有核酸，优选地为编码拟南芥菜胞质分支酸变位酶的核酸(Seq ID No.3)和由其衍生的天然或非天然核酸。
已发现在多种生物体中，存在多种同工型的分支酸变位酶。因此从拟南芥菜分离了三种不同的分支酸变位酶(Eberhard等，1993，FEBS 334，233-236；Eberhard等，1996，植物杂志(Plant J.)10，815-821；Mobley等，1999，基因(Gene)15；240(1)115-123)。
这些同工型在它们的定位和它们的酶特性方面相互间是不同的。这样，分支酸变位酶-1位于质体且通过芳族氨基酸变构调节。
胞质同工酶分支酸变位酶-2受到未知的调节(Benesova，M.Bode，R，植物化学(Phytochemistry)1992，31，2983-2987)。
编码拟南芥菜胞质分支酸变位酶的核酸以及由其衍生的天然或非天然核酸应理解为编码这样的蛋白质的核酸，其中所述蛋白质包含胞质分支酸变位酶氨基酸序列(SEQ ID No.4)，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，优选地至少50％的同源性，更优选地至少70％的同源性，尤其优选地至少90％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.4具有至少30％同源性的蛋白质应理解为这样的蛋白质，通过将其序列与序列SEQ ID No.4优选地使用上述程序算法，用上面设置的参数进行比较，结果为具有至少30％的同源性。
在本发明方法的另一优选的实施方案中，将编码拟南芥菜胞质分支酸变位酶(SEQ ID No.4)的核酸导入植物的质体。
例如可根据遗传密码通过反向翻译多肽序列获得合适的核酸序列。
为此目的优选使用的密码子为那些根据植物特异的密码子使用而频繁使用的密码子。通过参考计算机对所研究植物的其它已知基因的估定易于确定密码子使用。
在本发明方法的一个进一步尤其优选的实施方案中，将序列SEQ ID No.3的核酸导入植物质体。序列SEQ ID No.3代表拟南芥菜胞质分支酸变位酶(分支酸变位酶-2)基因。
将编码分支酸变位酶的核酸导入植物质体可如如下详述的将分支酸变位酶预苯酸脱氢酶导入植物那样通过导入表达盒而进行，其中表达盒中的核酸序列编码分支酸变位酶融合蛋白质，融合蛋白质中的一部分为支配该多肽转运的转运肽。优选叶绿体特异的转运肽，其在将胞质分支酸变位酶转运至叶绿体后，被从分支酸变位酶部分酶切掉。
在本发明方法的一个进一步尤其优选的实施方案中，将这样的核酸构建体导入植物，其中所述核酸构建体包含编码质体转运肽的核酸和包含编码以下蛋白质的核酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
编码质体转运肽的核酸为例如在三个阅读框中的烟草质体转酮醇酶的质体转运肽的三个盒的DNA序列，它们为在NcoI切割位点处具有ATG密码子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI，或为编码拟南芥菜质体分支酸变位酶-1的质体转运肽的核酸(SEQ ID No.7)KpnI_GGCGTCATTGTTGATGAGATCGTCTTGTTGCTCCTCTGCGATTGGTGGGTTCTTCGACCATCGACGTGAATTATCAACCTCAACACCCATTTCCACTCTTCTTCCTCTTCCATCAACCAAATCTTCTTTCTCTGTTCGTTGTTCTCTTCCTCAGCCATCAAAGCCACGCTCTGGAACCAGCTCTGTTCACGCCGTTATGACACTCG_NCo1编码拟南芥菜质体分支酸变位酶-1的质体转运肽的核酸优选地用于胞质分支酸变位酶在质体中的定位。
因此，在本发明方法的一个进一步尤其优选的实施方案中，将这样的核酸构建体导入植物，其中所述核酸构建体包含编码拟南芥菜质体分支酸变位酶-1的质体转运肽的核酸和包含编码以下蛋白质的核酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
在本发明方法的方法A的一个尤其优选的实施方案中，将包含序列(SEQ ID No.5)的核酸构建体导入植物。
SEQ ID No.5构成了编码拟南芥菜质体分支酸变位酶-1的质体转运肽的核酸和编码拟南芥菜胞质分支酸变位酶-2的核酸的核酸构建体。
本申请尤其涉及这些核酸构建体，并涉及它们在本发明方法的方法A中的应用。
图1以举例的方式示出了从赤藓糖-4-磷酸至维生素E的生物合成示意图。由于分支酸变位酶基因增加的表达，野生型的莽草酸路径被遗传改变，且朝向羟基苯丙酮酸的代谢物流量增加。对于羟基苯丙酮酸，现在可得到较大量的，其进一步朝向生育酚反应。提高的羟基苯丙酮酸含量导致向维生素E和/或维生素K的转化提高。提高的羟基苯丙酮酸含量优选地导致增加的维生素E含量。
如下详述的那样构建表达盒使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常规重组和克隆技术将合适的启动子与合适的分支酸变位酶核酸序列融合，且优选地将编码质体转运肽的核酸插入启动子和分支酸变位酶核酸序列之间，即优选地将合适的启动子与合适的上述核酸构建体并与聚腺苷酸化信号融合。
用于改变野生型莽草酸路径的方法B如上所述通过将至少一种这样的基因导入生物体而进行，所述基因在野生型中不存在其直向同源基因且其桥接野生型莽草酸路径的代谢路径。该基因编码这样的酶，由于新的酶活性，该酶引起朝向桥接终止处的中间体的物质流量增加。该新的酶活性优选地不受生物体的调节，也就是说使代谢路径短路，以避免如在代谢中的限制性调节位置。这使得可以将朝向限速物质的代谢物流量与现存的调节解偶联。
与野生型直向同源的基因理解为来自另一生物体的基因，该基因所编码的酶活性在野生型中已存在。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”理解为来自另一生物体的基因，在转化前该基因所编码的酶活性不存在于野生型中或未被活化。
与野生型直向同源的基因优选地理解为来自另一生物体的功能等同物，功能等同物理解为基因产物(蛋白质)的全部特性。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”优选地理解为在野生型中该基因不存在上面定义的功能等同物，因此建立了产生替代代谢路径的代谢性能，用来产生已存在于植物中的产物(包括代谢物)。
根据本发明，如上所述的用于方法A的生物体理解为原核生物体或真核生物体，如细菌、酵母、藻类、藓类植物、真菌或植物，它们作为野生型或通过遗传改变后可产生上述精细化学品。优选的生物体为光合活性生物体，如蓝细菌、藓类植物、藻类或植物，它们的野生型已能产生上述的精细化学品。
尤其优选的生物体为植物。
因此，在本发明方法的一个尤其优选的实施方案中，将植物用作欲转化的生物体。在这种情况下，基因为细菌基因，该基因在优选地适于进行方法B的植物中不存在其直向同源基因。
在本发明方法的方法B的一个优选的实施方案中，该植物莽草酸路径的代谢路径被至少一种导入的基因桥接。
在本发明方法的方法B的一个尤其优选的实施方案中，将编码预苯酸脱氢酶的核酸导入植物。编码预苯酸脱氢酶的所有基因均适用于本发明方法的该优选实施方案。
预苯酸脱氢酶理解为具有将预苯酸转化为4-羟基苯丙酮酸酶活性的酶。
编码预苯酸脱氢酶且可用于本发明方法的核酸的实例为来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(存取号X78413)、集胞藻属spec PCC 6803(slr2081)、恐兽球菌(Deinococcus radiodurans)(AAF10695)或枯草芽孢杆菌(P20692)的预苯酸脱氢酶基因，这些基因均是已知的，且可从国际互联网数据库中得到。通过将序列与这些已知的预苯酸脱氢酶基因进行同源性比较，可发现其它的例子，如来自Termotoga maitima(AAD35430)或幽门螺旋体(Heliobacter pylori)26695(存取号AAD08422)的潜在预苯酸脱氢酶基因。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，使用了预苯酸脱氢酶基因，导入的是这样的核酸，其编码的蛋白质包含集胞藻属spec PCC 6803预苯酸脱氢酶的氨基酸序列，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与集胞藻属spec PCC 6803预苯酸脱氢酶的序列具有至少30％的同源性，优选地至少50％的同源性，更优选地至少70％的同源性，尤其优选地至少90％的同源性，且其具有预苯酸脱氢酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上与集胞藻属spec PCC 6803预苯酸脱氢酶的序列具至少30％同源性的蛋白质应理解为这样的蛋白质，将其序列与集胞藻属spec PCC 6803预苯酸脱氢酶的序列优选地使用上述程序算法，用上面设置的参数进行序列比较，显示出具有至少30％的同源性。
图1以举例的方式示出了从赤藓糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意图。由于预苯酸脱氢酶基因增加的额外表达，野生型的莽草酸路径被遗传改变，且朝向羟基苯丙酮酸的代谢物流量增加。对于羟基苯丙酮酸，现在可得到较大量的，其进一步朝向生育酚反应。提高的羟基苯丙酮酸含量导致向维生素E和/或维生素K的转化提高。提高的羟基苯丙酮酸含量优选地导致增加的维生素E含量。
但根据需要，将本发明代谢路径的桥接与莽草酸路径过表达的其它酶结合是有利的，目的在于达到使朝向形成目标精细化学品的代谢物流量增大。
在本发明方法的一个进一步优选的实施方案中，将方法A和B结合使用。
在本发明方法变体的一个尤其优选的实施方案中，将编码预苯酸脱氢酶的核酸与编码分支酸变位酶的核酸组合导入植物。
例如，这种组合可通过导入两种核酸而实现，其中两种核酸分别编码具分支酸变位酶活性的酶和具预苯酸脱氢酶活性的酶。对于这种实施方案，需要将两种不同的核酸导入植物，其中每一种核酸编码这些酶之一。
在本发明方法的一个尤其优选的实施方案中，这种组合是通过将一种编码分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸导入植物而实现的。
分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因编码的蛋白质具有分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶两者的酶特性。因此导入一种核酸过表达酶活性，或导入酶活性，其受到减轻的翻译后调节(分支酸变位酶)且酶特性(预苯酸脱氢酶)被新导入。
分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶理解为具有将分支酸转化为4-羟基苯丙酮酸的酶活性的酶。
在本发明方法变体的一个进一步尤其优选的实施方案中，将这样的核酸导入，其编码的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，优选地至少50％的同源性，更优选地至少70％的同源性，尤其优选地至少90％的同源性，且其具有分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的酶特性。
具有氨基酸序列SEQ ID No.2的蛋白质构成了大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶(tyrA)。
因此，在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.2具有至少30％同源性的蛋白质应理解为这样的蛋白质，将其序列与序列SEQ ID No.2优选地使用上述程序算法，用上面设置的参数进行序列对比，结果为具有至少30％的同源性。
本说明书中所提及的所有核酸例如可为RNA、DNA或cDNA序列。
可如上所述根据遗传密码通过反向翻译多肽序列获得合适的核酸序列。
为此目的优选使用的密码子为那些根据生物体特异的密码子使用而频繁使用的密码子。通过参考计算机对所研究生物体的其它已知基因的估定易于确定密码子使用。
例如，如果该蛋白质欲在植物中表达，通常有利地使用植物的密码子使用来进行反向翻译。
进一步优选的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶或编码它们的核酸尤其为细菌来源的核酸，如来自草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因(存取号X60420；其蛋白质也可通过删除5’末端的109 Bp区域而转换为单功能的预苯酸脱氢酶，然后例如如上所述用作预苯酸脱氢酶)或来自支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因(存取号AAF01289)，或易于从数据库中对多种基因组序列已知的生物体通过将其氨基酸序列或其对应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID No.2或上述其它序列如来自扬氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的潜在分支酸变位酶一预预苯酸脱氢酶基因(存取号Q58029)进行同源性比较而鉴定。
尤其优选使用的核酸编码细菌分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。
尤其优选使用的核酸具有序列SEQ ID No.1。这种核酸构成了原核大肠杆菌K12基因组DNA，其编码具序列SEQ ID No.2的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶，也称为tyrA基因。
图1以举例的方式示出了从赤藓糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意图。由于分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因增加的表达，野生型的莽草酸路径被遗传改变，且朝向形成羟基苯丙酮酸的代谢物流量增加。对于羟基苯丙酮酸，现在可得到较大量的，其进一步朝向生育酚反应。提高的羟基苯丙酮酸含量导致向维生素E和/或维生素K的转化提高。提高的羟基苯丙酮酸含量优选地导致增加的维生素E含量。
在本发明的用于产生精细化学品的方法中，优选地在培养转基因生物体的步骤后，收获该生物体并从生物体分离精细化学品。
生物体用适于生物体的已知方式收获。在液体营养培养基中通过发酵培养的微生物(如细菌、藓类植物、酵母和真菌)或植物细胞可例如通过离心、倾析或过滤而分离。以已知方式在营养基质上培养植物并收获。
从收获的生物量中以已知方式分离精细化学品，例如通过提取，并且如果合适的话，采用进一步的化学或物理的纯化方法，如沉淀法、结晶法、热分离法(如精馏法)或物理分离法如层析法。
例如，优选地从含油植物中通过化学转化和蒸馏从植物油或从蒸汽蒸馏物(除臭剂冷凝物)中分离维生素E，其中所述蒸汽蒸馏物在植物油的除臭过程中获得。
从除臭剂冷凝物分离维生素E的其它方法例如在DE 31 26 110 A1，EP 171 009 A2，GB 2 145 079，EP 333 472 A2和WO 94/05650中进行了描述。
优选地通过用包含上述核酸尤其是包含编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的核酸构建体或用上述核酸构建体，尤其是编码质体转运肽和胞质分支酸变位酶的核酸构建体转化起始生物体(尤其是植物)来产生转基因生物体(尤其是植物)。
将编码核酸序列或编码核酸构建体功能性连接至一个或多个调节信号的这些核酸构建体以下也称为表达盒，其中所述一个或多个调节信号确保在生物体尤其是在植物中的转录和翻译。
因此，本发明还涉及这样的核酸构建体，其充当表达盒角色并包含与一个或多个确保在生物体尤其是在植物中转录和翻译的调节信号功能性连接的上述核酸，尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸，或上述核酸构建体，尤其是编码质体转运肽和胞质分支酸变位酶的核酸构建体。
表达盒优选地包含确保在质体中定位的编码质体转运肽的核酸。
表达盒包含调节信号，也称为调节核酸序列，其支配编码序列在宿主细胞中的表达。根据一个优选的实施方案，表达盒包含上游序列(即在编码序列的5’末端、启动子)和下游序列(即在3’末端、聚腺苷酸化信号)，且如果合适的话，还包含其它可操作地与插入的编码序列连接的调节元件，其中所述编码序列至少为上述基因之一。可操作地连接应理解为启动子、编码序列、终止子的依次排列，且如果合适的话，还有以这种方式排列的其它调节元件，其中当表达编码序列时，每一调节元件可行使其预期功能。
下文以举例的方式描述了优选的核酸构建体、植物表达盒和产生转基因植物的方法。
优选的用于可操作连接的序列为(但不限于)确保在质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、核、油质体或其它区室中进行亚细胞定位的靶向序列以及翻译增强子如烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)15(1987)，8693-8711)。
合适的表达盒启动子原则上为任一可支配外源基因在植物中表达的启动子。优选地使用植物启动子或来自植物病毒的启动子。尤其优选花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子(Franck等，细胞(Cell)21(1980)，285-294)。如所知的那样，该启动子包含多个转录效应子的识别序列，它们总体上导致了插入基因的永久性和组成型表达(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
表达盒也可包含化学诱导型启动子，这种启动子可使植物中外源tyrA基因及时地在特定点表达。可使用的此类启动子的实例尤其为PRP1启动子(Ward等，植物分子生物学(Plant.Mol.Biol.)22(1993)，361-366)、水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导的启动子(EP-A 388186)、四环素诱导的启动子(Gatz等，(1992)植物杂志(Plant J.)2，397-404)、脱落酸诱导的启动子(EP-A 335528)或乙醇-或环己酮-诱导的启动子(WO93/21334)。
进一步地，优选的启动子尤其为那些确保在以下组织或植物器官中表达的启动子，其中例如精细化学品尤其是维生素E或其前体的生物合成在该组织或植物器官中进行。必须提及的启动子尤其是那些确保在叶中特异性表达的启动子。可提及的启动子为马铃薯胞质FBPase启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-245)。
在转基因烟草植物的种子中，在种子特异的启动子协助下外源蛋白质可占总可溶种子蛋白质0.67％的稳定表达(Fiedler和Conrad，生物/技术(Bio/Technology)10(1995)，1090-1094)。因此表达盒可包含例如种子特异的启动子(优选菜豆蛋白启动子(US 5504200)、USP启动子(Baumlein，H.等，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)(1991)225(3)，459-467)、LEB4启动子(Fiedler和Conrad，1995)、蔗糖结合蛋白启动子(Zitat))、LEB4信号肽、欲表达基因和ER滞留信号。
使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学最新方法，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常规重组和克隆技术，通过例如将合适的启动子与合适的上述核酸序列尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸序列并与聚腺苷酸化信号融合来产生表达盒，且优选地在启动子和核酸序列之间插入核酸，且该核酸编码叶绿体特异的转运肽。
如上所述用于分支酸变位酶的、确保其靶向质体的插入序列是尤其优选的。
也可使用其核酸序列编码融合蛋白的表达盒，尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶融合蛋白的表达盒，融合蛋白的一部分为支配多肽转运的转运肽。优选叶绿体特异的转运肽，其在蛋白质尤其是分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶已转运至叶绿体后被从蛋白质部分尤其是分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶和/或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶部分酶切下来。尤其优选来自烟草(Nicotiana tabacum)质体转酮醇酶的转运肽或其它转运肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位转运肽，或铁氧还蛋白NADP氧化还原酶转运肽和异戊二烯焦磷酸酯异构酶-2转运肽)或它们的功能等同物。
质体分支酸变位酶的转运肽或其编码核酸尤其优选地应用于上述胞质分支酸变位酶或编码胞质分支酸变位酶的核酸。
本发明另一尤其优选使用的核酸为在三个阅读框中的烟草质体转酮醇酶的质体转运肽的三个盒的DNA序列，它们为在NcoI切割位点处具有ATG密码子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI质体转运肽的另一实例为拟南芥菜质体异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽。
本发明的核酸，尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸，可合成获得或天然获得，或可包含合成核酸和天然核酸的组成或可由多种生物体的多个异源基因片段组成。
如上所述优选的为合成的核苷酸序列，其中的密码子是为植物所优选的。为植物所优选的密码子可从在大多数感兴趣的植物种类中具最高蛋白质频率的密码子来确定。
当制备表达盒时，可按顺序操作多个DNA片段，以获得便于以正确的方向读出并具有正确阅读框的核苷酸序列。为进行DNA片段相互间的连接，可将衔接子或接头加至片段上。
可方便地将包含一个或多个限制性位点的接头或多接头以转录方向提供给启动子和终止子区域，用于该序列插入。通常，接头具1至10个，在大多数情况下为1至8个，优选地具2至6个限制性位点。通常在调节区域的接头大小为小于100bp，通常小于60bp，但至少为5bp。启动子可为宿主植物自身的或同源的启动子，或为外源的或异源启动子。按转录的5’-3’方向，表达盒优选地包含启动子、编码核酸序列或核酸构建体，以及转录终止区域。不同的终止区域可如所希望的那样相互交换。
而且，可进行提供合适限制性切割位点或去除过量DNA或限制性切割位点的操作。体外诱变、引物修补、限制或连接可用于插入、删除或替换，并适用于如碱基转换或颠换。
可提供片段的互补末端用于连接，可进行适当的操作如限制、外切或填平突出端形成平末端。
优选的聚腺苷酸化信号为植物聚腺苷酸化信号，优选那些基本上对应于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的聚腺苷酸化信号，尤其是Ti质粒pTiACH5的T-DNA基因3(章鱼碱合酶)的聚腺苷酸化信号(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835往后)或其功能等同物。
本发明还涉及上述核酸尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸，或上述核酸构建体，或蛋白质的用途，用于产生转基因植物。
优选地，这些转基因植物中精细化学品尤其是泛醌、维生素E和/或维生素K，优选地维生素E的含量较野生型相比提高了。
已知具高维生素E含量的植物对非生物应力的抗性增加。非生物应力理解为如低温、霜、干旱、高温和盐。
本发明因此还涉及上述核酸的用途，用于产生对非生物应力的抗性高于野生型的转基因植物。
上述蛋白质和核酸可用于在转基因生物体中产生精细化学品，优选地在转基因植物中产生维生素E、维生素K和/或泛醌，尤其是用来产生维生素E。
将外源基因转移入生物体的基因组尤其是植物的基因组称为转化。在植物中，尤其是由植物组织或植物细胞转化和再生植物的公知方法可用于瞬时或稳定转化。
用于转化植物的合适方法为通过聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化法、使用基因枪的生物弹射击法-所谓的粒子轰击法、电穿孔法、在含DNA的溶液中培育干燥胚、显微注射法和上述农杆菌介导的基因转移。上述方法例如在S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)出版的转基因植物(Transgenic Plants)一书的第1卷，设计和应用(Engineering andUtilization)中的B.Jenes等，基因转移技术(Techniques for GeneTransfer)，128-143，以及在Potrykus，植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.)42(1991)，205-225中进行了描述。
优选地将欲表达的构建体克隆入适用于转化根瘤农杆菌的载体，如pBin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711)。
因此，本发明还涉及包含上述核酸、核酸构建体或表达盒的载体。
用表达盒转化的农杆菌可使用已知的方式转化植物，如将划破的叶或叶部分置于农杆菌溶液，并接下来在合适的培养基中培养它们。
表达盒不仅可用于转化植物，也可用于转化细菌尤其是蓝细菌、藓类植物、酵母、丝状真菌和藻类。
至于遗传改变的植物(以下也称为转基因植物)的优选产生方法，优选地将编码本发明蛋白质尤其是分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的融合表达盒克隆入如适于转化根瘤农杆菌的pBin19载体。
用此载体转化的农杆菌接下来可使用已知的方式转化植物，尤其是转化培育植物，如将划破的叶或叶部分置于农杆菌溶液，并接下来在合适的培养基中培养它们。
用农杆菌转化植物的方法是已知的，如F.F.White“在高等植物中用作基因转移的载体(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)”一文中所述的方法(参见S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)出版的转基因植物一书的第1卷，设计和应用，15-38页)。可用公知方式从划破的叶或叶部分的转化细胞再生包含了整合入表达盒的用于表达本发明基因尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的转基因植物。
为了用编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸转化宿主植物，将表达盒作为插入部分掺入重组载体，其中重组载体的载体DNA包含其它功能调节信号如包含用于复制或整合的序列。合适的载体尤其在“植物分子生物学和生物技术中的方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)，第6/7章，71-119页(1993)中进行了描述。
例如可将植物表达盒掺入具35S启动子的转化载体pBin-19的衍生物中(Bevan，M.，核酸研究，128711-8721(1984))。图2示出了具种子特异性豆球蛋白B4启动子的转化载体pBin-19的衍生物。
使用上述引用的重组和克隆技术，可将表达盒克隆入使得它们复制的合适载体中，例如在大肠杆菌中合适克隆载体的实例为pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。在大肠杆菌和农杆菌中均可复制的双元载体尤其适用。
本发明因此涉及上述核酸的用途，尤其是涉及编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的用途，涉及上述核酸构建体的用途，尤其涉及用于产生遗传改变植物的表达盒或用于转化植物、植物细胞、植物组织或植物部分的表达盒的用途。优选的使用目的是增加植物或植物部分的精细化学品含量，尤其是维生素E、维生素K或泛醌的含量，优选地增加维生素E的含量。
根据对启动子的选择，表达可特异地发生在植物的叶、种子、花瓣或其它部分中。
因此，本发明还涉及通过将上述核酸或上述核酸构建体导入起始生物体基因组用来产生遗传改变的生物体的方法。
本发明优选地涉及转化植物的方法，其包括将含有编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸序列的表达盒导入植物细胞或植物原生质体，并再生它们以产生完整的植物。
本发明还涉及遗传改变的生物体，涉及改变野生型莽草酸路径的代谢物流量的遗传改变并涉及野生型的精细化学品含量改变的生物体的精细化学品含量。
如上所述，优选的遗传改变生物体的精细化学品尤其是维生素E、维生素K和泛醌，优选地维生素E的含量较野生型的含量升高。
遗传改变的生物体根据本本发明理解为尤其是其中进行了遗传改变的生物体，当起始生物体包含所讨论的核酸时，该遗传改变使得相对于野生型而言，编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的基因表达提高，或当起始生物体不包含所讨论的核酸时，该遗传改变使得相对于野生型而言，引起了野生型进行编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的基因表达。
在一个优选的实施方案中，如上所述将光合活性生物体如蓝细菌、藓类植物、藻类或植物，尤其优选地植物用作起始生物体，并因此也作为遗传改变的生物体，作为用于产生其精细化学品含量较野生型升高的生物体。
此类转基因植物、它们的增殖物质以及它们的植物细胞、植物组织或植物部分是本发明的进一步的对象。
用于本发明目的的植物尤其为单子叶植物和双子叶植物。
优选的植物为万寿菊、向日葵、拟南芥属(Arabidopsis)、烟草、红胡椒、大豆、番茄、茄子、红胡椒(bell pepper)、胡萝卜、马铃薯、玉米、saladings和甘蓝、谷物、苜蓿、燕麦、大麦、裸麦、小麦、黑小麦、高梁和小米、稻子、苜蓿、亚麻、棉花、大麻、十字花科如油料种子油菜或芸苔、sugarbeet、甘蔗、坚果和葡萄藤类或木材类如白杨或紫杉。
尤其优选的植物为拟南芥菜、万寿菊(Tagetes erecta)、欧洲油菜(Brassica napus)、烟草、芸苔、马铃薯和其它油料作物如大豆。
遗传改变的生物体，尤其是植物可如上所述用于产生精细化学品，尤其是用于产生维生素E、维生素K和泛醌。
根据本发明的遗传改变植物可如直接或在以公知的方式加工后用作食品或饲料，该遗传改变的植物可为人或动物消费，且其具有增高的精细化学品含量，尤其是增高的维生素E、泛醌和/或维生素K，优选地维生素E含量。
增高的精细化学品含量是指为了本发明目的，这些化合物在植物中的生物合成与未被遗传改变的植物中至少一代植物相比，前者具有人工获得的提高的生物合成的能力。
增高的维生素E含量通常是指总生育酚含量的增高。但增高的维生素E含量也理解为尤其是指上述8种具生育酚活性的化合物的含量改变。
例如，将分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因导入植物令人吃惊地导致生育三烯酸含量的明确增高。
当维生素E含量增高时，生育酚含量或生育三烯酸含量均可增高。优选地升高生育酚含量。但在某些情况下，也优选地升高生育三烯酸含量。
例如，维生素E的生物合成位点在植物中尤其为叶组织，因此本发明核酸尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的叶特异性表达是有意义的。但这不构成限制，因为表达也可以组织特异性方式在植物的所有其它部分尤其是含脂肪的种子中进行。
一个进一步优选的实施方案因此涉及本发明核酸尤其是编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的种子特异性表达。
此外，外源的分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的组成型表达是有利的。另一方面，也希望进行诱导型表达。
可例如在体外通过枝条分生组织增殖测定重组表达的分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的表达效率。另外，可在温室实验中对被测试植物测试分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因性质和表达水平的改变以及它们对维生素E生物合成的影响。
本发明现在通过下面的实施例阐述，但不限于这些实施例一般实验条件重组DNA的序列分析用Licor激光荧光DNA测序仪(可从MWG Biotech，Ebersbach得到)，使用Sanger法对重组DNA分子进行测序(Sanger等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74(1977)，5463-5467)。
实施例1-编码大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的tyrA基因的克隆从大肠杆菌K12用正义特异性引物(tyrA5’SEQ ID No.10)和反义特异性引物(tyrA3’SEQ ID No.9)通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码tyrA基因的DNA。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行PCR，其中所述反应混合物中包含- 2μl大肠杆菌K12细胞悬液- 0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol tyrA5’-40pmol tyrA3’-15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循环条件下进行PCR步骤194℃5分钟(变性)步骤294℃3秒步骤355℃1分钟(退火)步骤472℃2分钟(延伸)步骤2至4重复30次步骤572℃10分钟(后延伸)步骤64℃(等候)用标准方法将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-T(Promega)。所产生的扩增子通过用M13F(-40)引物进行测序鉴定。
实施例2-产生包含编码大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的tyrA基因的表达盒产生在组成型CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等，细胞(Cell)21285-294，1980)控制下表达大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的转基因烟草和拟南芥菜植物。所产生的用于组成型表达大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的质粒基础为pBinAR-TkTp-10(RalfBadur，博士论文，University of Gttingen，1998)。该载体为pBinAR的衍生物(Hfgen和Willmitzer，植物科学(Plant Sci.)66221-230，1990)，其包含CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等，1980)、章鱼碱合酶基因的终止信号(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)和编码烟草质体转酮醇酶的转运肽的DNA序列。将大肠杆菌K12分支酸变位酶预苯酸脱氢酶以正确的阅读框克隆入该载体，产生分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶与质体转运肽的翻译融合。它可使转基因转运入质体。
为构建该质粒，用侧翼的SmaI或SalI限制性切割位点将tyrA基因从质粒pGEM-T/tyrA分离。用标准方法将该片段连接入SmaI/SalI切割的pBinAR-TkTp-10(见图2)。该质粒(pBinAR-TkTp-10/tyrA)用于产生转基因烟草和拟南芥菜(A.thaliana)植物。
在图2中的片段A(529 bp)包含CaMV 35S启动子(花椰菜花叶病毒的核苷酸6909至7437)，片段B(245bp)编码烟草转酮醇酶的转运肽，片段C(1232Bp)编码大肠杆菌K12 tyrA基因，且片段D(219Bp)编码章鱼碱合酶基因的终止信号。
实施例3-产生用于表达位于种子特异的启动子控制下的大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸构建体为了构建嵌合的DNA构建体，用来产生表达位于种子特异的启动子控制下的大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的转基因拟南芥菜、烟草和欧洲油菜植物核酸构建体，使用了载体pPTVkanLeP-IPP-TP-9。
该载体为pGPTVkan的衍生物(D.Becker，E.Kemper，J.Schell，R.Masterson.植物分子生物学(Plant Molecular Biology)201195-1197，1992)，其uidA基因已删除。取而代之的是，载体pPTVkanLeP-IPP-TP-9包含豆球蛋白B4基因的种子特异的启动子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)、编码拟南芥菜质体特异的异戊二烯焦磷酸酯异构酶-2(IPP-2)转运肽的序列(Badur，未公开发表)以及根瘤农杆菌胭脂碱合酶的终止信号(Depicker等，分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Genet.)1，561-73，1982)。
将编码大肠杆菌K12 tyrA的核酸片段以用T4聚合酶补平的具钝末端的SmaI/SalI片段克隆入载体pPTVkanLeP-IPP-TP-9(图3)，产生具IPP-2转运肽的翻译融合。这样确保了分支酸变位酶-预预苯酸脱氢酶输入质体。该质粒(pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA)用于产生转基因烟草、拟南芥菜和欧洲油菜植物。
在图3中，片段A(2700bp)包含蚕豆(Vicia faba)豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(206bp)编码拟南芥菜异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段C(1234bp)编码大肠杆菌K12tyrA基因，且片段D(272 bp)编码胭脂碱合酶基因的终止信号。
实施例4-产生表达tyrA基因的转基因拟南芥菜植物基于改良真空渗入法用根瘤农杆菌菌株(GV3101[pMP90])转化野生型拟南芥菜植物(哥伦比亚)(Steve Clough和Andrew Bent.植物浸入用于拟南芥菜的农杆菌介导转化的简化方法(Floral dipa simplified methodfor of Agrobacterium mediated transformation of A.thaliana)，植物杂志(Plant J)16(6)735-43，1998；Bechtold，N.Ellis，J.和Pelltier，G.，见通过渗透成熟拟南芥菜植物进行植物农杆菌介导的基因转移(PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants)一书中，CRAcad Sci Paris，1993，1144(2)204-212)。所用的根瘤农杆菌细胞事先用质粒pBinAR-TkTp-10/tyrA和pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA转化(图2和3)。
原代转化的种子基于它们对抗生素的抗性进行选择。将对抗生素具抗性的幼苗种植入土壤中，并将充分发育的植物用于生物化学分析。
实施例5-产生表达tyrA基因的转基因欧洲油菜植物大体按照Bade，J.B.和Damm，B.的方法(见植物的基因转移(GeneTransfer to Plants)，Potrykus，I.和Spangenberg，G.编辑，Springer LabManual，Springer Verlag，1995，30-38)产生转基因油料种子油菜植物，其中所述方法也指出了所用培养基和缓冲液的组成。
用根瘤农杆菌菌株GV3101[pMP90]进行转化。质粒pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA用于转化(图3)。用70％乙醇(v/v)将欧洲油菜var.Westar的种子进行表面灭菌，于水中在55℃洗10分钟，在1％强度的次氯酸盐溶液(25％v/v Teepol，0.1％v/v吐温20)中孵育20分钟，并用无菌水洗6次，每次20分钟。在滤纸上干燥种子3天，并在含15ml发芽培养基的玻璃烧瓶中对10-15粒种子发芽。从一些幼苗(约10cm)去除根和顶端，并将剩下的下胚轴截成约6mm长的部分。这样获得的约600个外植体在50ml基本培养基中洗30分钟，并转移入300ml烧瓶中。加入100ml愈伤组织诱导培养基后，于100转/分培养培养物24小时。
将农杆菌菌株29℃于补充了卡那霉素(20mg/l)的Luria肉汤培养基中过夜培养物，并取2ml，在50ml不含卡那霉素的Luria肉汤培养基中29℃培养4小时，直至OD600达到0.4-0.5。以2000转/分沉淀培养物25分钟后，将细胞沉淀重悬于25ml基本培养基。通过加入更多的基本培养基，将溶液的细菌浓度调节至OD600为0.3。
用无菌吸头将愈伤组织诱导培养基从油料种子外植体移除，加入50ml农杆菌溶液，小心地混合该反应物并孵育20分钟。去除农杆菌悬液，用50ml愈伤组织诱导培养基洗油料种子外植体1分钟，并接下来加入100ml愈伤组织诱导培养基。定轨摇床上以100转/分共培养24小时。通过移去愈伤组织诱导培养基停止共培养，并在100转/分下，用25ml洗涤培养基洗外植体两次，每次1分钟，然后用100ml洗涤培养基洗外植体两次，共60分钟。将洗涤培养基和外植体一起转移入15cm培养皿，并用无菌吸头移去培养基。
至于再生，每次将20至30个外植体转移入含25ml补充有卡那霉素的枝条诱导培养基的90mm培养皿中。该培养皿用两层Leukopor密封并在25℃和2000勒下孵育，且光周期为16小时光照/8小时黑暗。每隔12天，将发育的愈伤组织转移至含枝条诱导培养基的新培养皿中。再生完整植物的所有进一步的步骤如Bade，J.B和Damm，B.(见植物基因转移，Potrykus，I.和Spangenberg，G.编辑，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述进行。
实施例6-产生表达tyrA基因的转基因烟草植物将10ml补充有抗生素的YEB培养基(5g/l牛肉膏，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM MgSO4)与根瘤农杆菌菌落培养，并于28℃过夜培养。用台式离心机于4℃3500转/分沉淀细胞20分钟，然后在无菌条件下重悬于无抗生素的新鲜YEB培养基中。细胞悬液用于转化。
通过植物繁殖获得无菌培养的野生型植物。为此目的，只截去植物的顶端，并转移至在无菌保存广口瓶中的新鲜的2MS培养基中。至于植物的其它部分，去除叶子的上表面毛和叶子的中央脉。使用剃刀片将叶分成约1cm2大小部分。将农杆菌培养物转移入小的培养皿(直径2cm)。叶部分简短地抽拨自该溶液，并将叶的底面以接触培养基的方式置于培养皿(直径9cm)中的2MS培养基上。在暗处于25℃放置2天后，将外植体转移至具愈伤组织诱导培养基的平板中并在环境受控的箱子中于28℃保温。每7-10天更换培养基。一旦形成愈伤组织，就将外植体转移入无菌保存广口瓶中的补充有凯福隆(claforan)的枝条诱导培养基(0.6％BiTec琼脂(w/v)，2.0mg/l玉米素核糖，0.02mg/l萘基乙酸，0.02mg/l赤霉酸，0.25g/ml凯福隆，1.6％葡萄糖(w/v)和50mg/l卡那霉素)上。约一个月后器官发生开始，并可截断已形成的枝条。将枝条在补充有凯福隆和选择标记的2MS培养基上培养。一旦发育出相当多的根球，则可将植物装盆于种子堆肥中。
实施例7-实施例4、5和6的转基因植物的鉴定分析用上述构建体转化的植物(拟南芥菜、欧洲油菜和烟草)的叶和种子中生育酚和生育三烯酸的含量。为此目的，在温室中培养转基因植物，并将表达大肠杆菌K12分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC测定这些植物的叶和种子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情况下，将额外表达tyrA基因的转基因植物与未转化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。
表1A(幼叶)和1B(老叶)示出了在SNN野生型和过表达大肠杆菌Tyr A基因的植物中不同年龄的烟草叶中α-生育酚、γ-生育酚、α-生育三烯酸和总维生素E的含量[μg/g FW](数据显示为MW+/-SD，n＝9)。表A幼叶
表B老叶
实施例8-克隆编码在质体中表达的拟南芥菜分支酸变位酶-1的基因的亚片段使用正义特异性引物(CM-1TP 5’SEQ ID No.11)和反义特异性引物(CM-1TP 3’SEQ ID No.12)从拟南芥菜通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码分支酸变位酶-1的转运肽的DNA序列。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行PCR，其中所述反应混合物中包含-2μl拟南芥菜cDNA-0.2 mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
- 1.5mM Mg(OAc)2- 5μg牛血清白蛋白- 40pmol CM-1TP 5’引物- 40pmol CM-1TP 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循环条件下进行PCR步骤194℃5分钟(变性)步骤294℃3秒步骤355℃1分钟(退火)步骤472℃2分钟(延伸)步骤2至4重复30次步骤572℃10分钟(后延伸)步骤64℃(等候)用标准方法将扩增子克隆入PCR克隆载体pCR-script(stratagene)。所产生的扩增子通过用载体特异性引物进行测序鉴定。
实施例9-克隆编码在胞质中表达的拟南芥菜分支酸变位酶-2的基因使用正义特异性引物(CM-2 5’SEQ ID No.13)和反义特异性引物(CM-2 3’SEQ ID No.14)从拟南芥菜通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码分支酸变位酶-2的DNA。
PCR条件如下在50μl反应混合物中进行PCR，其中所述反应混合物中包含-2μl拟南芥菜cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol CM-2 5’引物
- 40pmol CM-2 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循环条件下进行PCR步骤194℃5分钟(变性)步骤294℃3秒步骤355℃1分钟(退火)步骤472℃2分钟(延伸)步骤2至4重复30次步骤572℃10分钟(后延伸)步骤64℃(等候)用标准方法将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-T(Promega)。所产生的扩增子通过用M13F(-40)引物进行测序鉴定。
实施例10-产生由编码分支酸变位酶-1(CM-1)的转运肽(TP)的DNA序列和编码分支酸变位酶-2(CM-2)的DNA序列组成的嵌合构建体CM-1-TP-CM-2为了产生嵌合基因CM-1-TP-CM-2，将质粒pCR-Script/CM-1-TP用限制性酶NcoI/SalI消化。
将用限制性酶NcoI/SalI从质粒pGEM-Teasy/CM-2分离的CM-2 DNA片段连接入该质粒。该嵌合DNA构建体(SEQ ID No.5)(pCR-Script/AtCM-1TP-AtCM-2，图4)的翻译导致融合蛋白质的形成，其中所述融合蛋白质中CM-1的转运肽与CM-2(SEQ ID No.6)融合。
实施例11-产生包含嵌合基因CM-1-TP-CM-2的植物表达盒产生了这样的转基因植物，其首先在组成型CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等，细胞，21285-294，1980)控制下且接下来在Viciafaba豆球蛋白基因的种子特异性启动子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)控制下表达来自拟南芥菜的嵌合基因CM-1-TP-CM2。
产生用于嵌合基因CM-1TP-CM-2的组成型表达的质粒基础为载体pBinAR(Hfgen和Willmitzer，植物科学(Plant Sci.)66221-230，1990)。该载体包含CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等，1980)和章鱼碱合酶基因的终止信号(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)。为了产生该质粒，用侧翼限制性酶切位点KpnI/SalI将嵌合基因CM-1-TP-CM2从质粒pCR-script/AtCM-1TP-AtCM-2分离出来(图4)。使用标准方法将该片段连接AKpnI/SalI-切割的pBinAR。所得的质粒(pBinAR/CM-1TP/CM-2，图5)用于产生转基因拟南芥菜和烟草。
为了在植物中产生可使嵌合基因CM-1TP/CM-2进行种子特异性表达的质粒，使用了豆球蛋白B4基因的种子特异性启动子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)。从质粒pGEMTeasy/lePNOS上通过在启动子5’侧翼的EcoRI切割位点和在启动子3’侧翼的KpnI切割位点，分离该豆球蛋白B4基因启动子的2.7kb片段。质粒pBinAR/CM-1TP/CM-2也用限制性酶EcoRI和KpnI处理。结果，CaMV 35S启动子被从该质粒切除(见图5)。接下来将作为EcoRI/KpnI片段的豆球蛋白基因启动子克隆入该载体，得到在该种子特异的启动子控制下表达嵌合基因CM-1TP-CM-2的质粒(见图6)。该质粒(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)用于产生转基因拟南芥菜和烟草植物。
实施例12-产生表达嵌合基因CM-1-TP-CM-2的转基因拟南芥菜植物类似于实施例4，用质粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)产生该植物。
实施例13-产生表达tyrA基因的转基因欧洲油菜植物类似于实施例5，用质粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)产生该植物。
实施例14-产生表达tyrA基因的转基因烟草植物类似于实施例6，用质粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinARleP/CM-1TP/CM-2)产生该植物。
实施例15-实施例12、13和14的转基因植物的鉴定分析用上述构建体转化的植物(拟南芥菜，欧洲油菜和烟草)的叶和种子中生育酚和生育三烯酸的含量。为此目的，在温室中培养转基因植物，并将表达编码胞质分支酸变位酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC测定这些植物的叶和种子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情况下，额外表达分支酸变位酶基因的转基因植物与未转化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。序列表<110>太阳基因两合公司(SunGene GmbH & Co.KgaA)<120>通过遗传改变莽草酸路径来改变生物体中精细化学品含量<130>0817/780/2000<140><141><160>14<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1238<212>DNA<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(25)..(1143)<400>1cccgggtggc ttaagaggtt tatt atg gtt gct gaa ttg acc gca tta cgc51Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg1 5gat caa att gat gaa gtc gat aaa gcg ctg ctg aat tta tta gcg aag 99Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys10 15 20 25cgt ctg gaa ctg gtt gct gaa gtg ggc gag gtg aaa agc cgc ttt gga 147Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly30 35 40ctg cct att tat gtt ccg gag cgc gag gca tct atg ttg gcc tcg cgt 195Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg45 50 55cgt gca gag gcg gaa gct ctg ggt gta ccg cca gat ctg 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Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu20 25 30Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu35 40 45Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu50 55 60Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg65 70 75 80Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro85 90 95Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg100 105 110Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu115 120 125Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly130 135 140Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly145 150 155 160Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser165 170 175Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro180 185 190Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala195 200 205Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln210 215 220Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile225 230 235 240Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg245 250 255His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val260 265 270Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu275 280 285Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala290 295 300Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr305 310 315 320Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys325 330 335Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp340 345 350Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala355 360 365Asn Asp Asn Arg Gln370<210>3<211>1006<212>DNA<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)<220><221>CDS<222>(64)..(858)<400>3ctttagcatt gaggaagaag aagaagaaag cttcattttt ccaggggata cagttgaagc 60ggc atg gca aga gtc ttc gaa tcg gat tcg ggt tct ggt tgt tcc aat 108Met Ala Arg Val Phe Glu Ser Asp Ser Gly Ser Gly Cys Ser Asn
1 5 10 15gta ctg agt ctt gac tta atc aga gaa tcg ttg att agg caa gaa gac156Val Leu Ser Leu Asp Leu Ile Arg Glu Ser Leu Ile Arg Gln Glu Asp20 25 30acc atc gtc ttc agc ttg atc gag aga gct aag ttt cca ctc aat tct204Thr Ile Val Phe Ser Leu Ile Glu Arg Ala Lys Phe Pro Leu Asn Ser35 40 45cct gct ttc gag gaa tct cgt tgt cta gat tct gga agt ttc tct tct252Pro Ala Phe Glu Glu Ser Arg Cys Leu Asp Ser Gly Ser Phe Ser Ser50 55 60ctc act gag ttt ttc gtc aga gag aca gaa atc atc caa gct aag gta300Leu Thr Glu Phe Phe Val Arg Glu Thr Glu Ile Ile Gln Ala Lys Val65 70 75gga aga tat gaa tac ccg gaa gag aat cct ttc ttc ctt gag aac att348Gly Arg Tyr Glu Tyr Pro Glu Glu Asn Pro Phe Phe Leu Glu Asn Ile80 85 90 95cct cac tcg gtt ttt cct acg cac aaa tat cca tcg gct ttg cac cct396Pro His Ser Val Phe Pro Thr His Lys Tyr Pro Ser Ala Leu His Pro100 105 110aag gct cta tct gtt aac att aac aaa caa atc tgg gat att tac ttt444Lys Ala Leu Ser Val Asn Ile Asn Lys Gln Ile Trp Asp Ile Tyr Phe115 120 125aaa gaa ttg ctt cct ttg ttt gtc aaa cct ggc gat gat ggc aac tat492Lys Glu Leu Leu Pro Leu Phe Val Lys Pro Gly Asp Asp Gly Asn Tyr130 135 140cca tca act gct gct agt gat ctc gcc tgt tta caa gct ctt tcg aga540Pro Ser Thr Ala Ala Ser Asp Leu Ala Cys Leu Gln Ala Leu Ser Arg145 150 155agg att cac tac ggt aaa ttt gta gct gag gtc aaa ttc aga gat gct588Arg Ile His Tyr Gly Lys Phe Val Ala Glu Val Lys Phe Arg Asp Ala160 165 170 175cca caa gat tac gag cct gcg att cgc gct cag gat aga gag gct ttg636Pro Gln Asp Tyr Glu Pro Ala Ile Arg Ala Gln Asp Arg Glu Ala Leu
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1.通过培养生物体产生精细化学品的方法，其中生物体的莽草酸路径在野生型基础上被遗传改变。
2.如权利要求1中所述的方法，其中用至少一种选自方法A和B的方法进行莽草酸路径的遗传改变，A和B具有下列含义A提高野生型莽草酸路径的至少一种酶的活性；B将至少一种基因导入生物体，其中对该基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其桥接野生型的莽草酸路径的代谢路径。
3.如权利要求2中所述的方法，其中在方法A中，莽草酸路径的至少一种酶的活性通过过表达编码具该酶活性的蛋白质的核酸而增加。
4.如权利要求3中所述的方法，其中将编码分支酸变位酶的核酸导入生物体。
5.如权利要求4中所述的方法，其中将编码这样的分支酸变位酶的核酸导入生物体，在生物体中该分支酸变位酶的活性受到减轻的翻译后调节。
6.如权利要求5中所述的方法，其中将编码这样的分支酸变位酶的核酸导入生物体，在生物体中表达位点处该分支酸变位酶受到减轻的翻译后调节。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中所用的生物体为植物。
8.如权利要求7中所述的方法，其中将胞质分支酸变位酶导入植物的质体。
9.如权利要求8中所述的方法，其中将核酸构建体导入植物，其中所述核酸构建体包含编码质体转运肽的核酸和包含编码以下蛋白质的核酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ IDNo.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
10.如权利要求9中所述的方法，其中将编码质体分支酸变位酶的质体转运肽的核酸用作编码质体转运肽的核酸。
11.如权利要求10中所述的方法，其中将核酸序列SEQ ID No.5的核酸构建体导入植物。
12.包含编码质体转运肽的核酸和包含编码以下蛋白质的核酸的核酸构建体，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶的酶特性。
13.如权利要求12中所述的核酸构建体，其中将编码质体分支酸变位酶的质体转运肽的核酸用作编码质体转运肽的核酸。
14.如权利要求13中所述的核酸构建体，其包含核酸序列SEQ IDNo.5。
15.如权利要求2至11中任意一项所述的方法，其中所用的生物体为植物，且其中当进行方法B时，将编码预苯酸脱氢酶的核酸作为这样的基因导入植物，该基因在野生型中不存在其直向同源基因。
16.如权利要求1至11和权利要求15中任意一项所述的方法，其中将编码预苯酸脱氢酶的核酸与编码分支酸变位酶的核酸联合导入植物。
17.如权利要求16中所述的方法，其中将编码分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸导入植物。
18.如权利要求17中所述的方法，其中导入这样的核酸，其编码的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的酶特性。
19.如权利要求18中所述的方法，其中使用细菌来源的核酸。
20.如权利要求18或19中所述的方法，其中所用核酸包含SEQ ID No.1所示的序列。
21.核酸构建体，其包含将如权利要求3至6、8以及15至17中任意一项所述的核酸功能性连接至确保在植物中转录和翻译的一个或多个调节信号。
22.如权利要求21中所述的核酸构建体，其还包含编码质体转运肽的核酸。
23.如权利要求22中所述的核酸构建体，其包含权利要求12的核酸构建体。
24.如权利要求22中所述的核酸构建体，其包含编码质体转运肽的核酸和包含编码以下蛋白质的核酸，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通过氨基酸的替换、插入或删除衍生于该序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的酶特性。
25.如权利要求3至6、8和15至17中任意一项所述的核酸以及如权利要求12至14和21至24中任意一项所述的核酸构建体的用途，用于产生转基因植物。
26.如权利要求25中所述的用途，其中转基因植物的精细化学品含量较野生型的精细化学品含量相比，是增加的。
27.如权利要求25中所述的用途，其中转基因植物对非生物应力的抗性与野生型相比，是提高的。
28.遗传改变的生物体，其中该遗传改变改变了野生型莽草酸路径的代谢物流量，且生物体的精细化学品含量与野生型相比被改变了。
29.如权利要求28所述的遗传改变的生物体，其中当起始生物体包含所讨论的核酸时，该遗传改变使得相对于野生型而言，编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的基因表达提高，或，当起始生物体不包含所讨论的核酸时，该遗传改变使得相对于野生型而言，引起了野生型进行编码分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶或分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的核酸的基因表达。
30.如权利要求29所述的遗传改变的生物体，其用如权利要求21至24中任意一项所述的核酸构建体转化。
31.如权利要求29所述的遗传改变的生物体，其包含如权利要求21至24中任意一项所述的核酸构建体。
32.如权利要求28至31中任意一项所述的遗传改变的生物体，其中所用的生物体为植物。
33.产生如权利要求28至32中任意一项所述的遗传改变的生物体的方法，其包括将至少一种如权利要求3至6、8和15至17中任意一项所述的核酸或至少一种如权利要求12至14和21至24中任意一项所述的核酸构建体导入起始生物体的基因组中。
34.如权利要求28至32中任意一项所述的遗传改变的生物体的用途，用于产生精细化学品。
35.如权利要求28至32中任意一项所述的遗传改变的生物体用作饲料和食品的用途，其用于生产加工食品。
36.如权利要求3至6、8和15至17中任意一项所述的核酸以及如权利要求12至14和21至24中任意一项所述的核酸构建体的用途，用于增加生物体中精细化学品的含量。
37.如权利要求3至6、8和15至17中任意一项所述的核酸以及如权利要求12至14和21至24中任意一项所述的核酸构建体的用途，用于在生物体中产生精细化学品。
全文摘要
本发明涉及通过培养生物体尤其是植物产生精细化学品尤其是维生素E、维生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物体尤其植物的莽草酸路径在野生型基础上被遗传改变，本发明还涉及转基因生物体自身。
文档编号C12N9/90GK1439054SQ01811927
公开日2003年8月27日 申请日期2001年6月28日 优先权日2000年6月29日
发明者R·巴杜拉, M·盖格尔, I·孔策, S·佐默 申请人:太阳基因两合公司