专利名称：应用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统标记蛋白质的一般方法
技术领域：
本发明涉及应用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统，用硒代甲硫氨酸标记蛋白质的方法、以及用重氢标记蛋白质的方法。
蛋白质的结构生物学的研究中，采用了X线结晶分析法、核磁共振(NMR)光谱法、中子衍射法。为了实施这些方法，每种方法必须大量制备用重原子标记、同位素标记、重氢标记、且保持其活性的蛋白质。以前的X线结晶分析法中，至少需要2种结晶，即天然型的蛋白质结晶、以及为了确定格子数，将重原子掺入该结晶中的重原子标记结晶。在获得后一种结晶的过程中，伴随着很多困难，因此，尽管前一种结晶的结晶化获得成功，但仍然不能阐明其结晶结构的例子也很多。对此，提出的解决方案有将一部分正在使用的技术甲硫氨酸中的离子原子置换为重原子硒的硒代甲硫氨酸而加以利用。该方法是利用基因工程的方法，将目的基因导入培养细胞或大肠杆菌中，然后在含硒代甲硫氨酸的培养基中培养，使该基因编码的蛋白质表达，从而将硒代甲硫氨酸导入该蛋白质中。
一方面，用NMR光谱法、中子衍射法分析蛋白质的立体结构和分子内水分子的局限性时，必须要将蛋白质中的氢原子置换成重氢。该方法采用的手段是将目的基因导入大肠杆菌等微生物中，然后在含有重氢标记的氨基酸的培养基上培养，使基因产物表达，制备重氢标记的蛋白质。
业已证实，用含硒代甲硫氨酸的蛋白质所得的1种结晶即可对其结构进行分析，因此该蛋白质是有用的蛋白质。但是，以前使用的用硒代甲硫氨酸标记蛋白质的方法存在很多缺点。这些缺点是(1)甲硫氨酸不仅是与细胞中蛋白质合成的各种代谢有关的必须氨基酸，而且硒本身对细胞的毒性强，所以不能将培养基中的甲硫氨酸全部替换为硒代甲硫氨酸，因此，要制备必需量的含硒代甲硫氨酸的蛋白质，必须要大量培养；(2)由于硒代甲硫氨酸的价格昂贵，而且毒性强，使培养后含高浓度硒代甲硫氨酸培养基的废弃成为重大的问题。
另一方面，用重氢标记蛋白质是用NMR光谱法、中子衍射法分析蛋白质的立体结构的必要条件，但迄今为止，上述利用微生物培养的方法是重氢标记蛋白质的唯一方法。该方法有下述很多必须解决的缺点(1)操作烦杂、(2)标记效率低、(3)由于需要大量的重氢标记氨基酸，故成本非常高，而且由于其毒性强，在培养基的废弃方面留下重大的问题。
此外，同样的理由，也没有开发下述的实用手段即用基因工程的方法制备NMR光谱法中所用的、含有用碳13(13C)或氮15(15N)标记的氨基酸的蛋白质。
在这种现状下，期望有一种制备标记蛋白质的方法，该方法能保持目的蛋白的原有活性、并能将该蛋白质中所要求的氨基酸按所要求的那样标记、效率高、价格低且废液少。
本发明的另一个方案是用上述制造方法所得的硒代甲硫氨酸标记的蛋白质。
本发明还有一个方案是含重氢的氨基酸标记蛋白质的制造方法，其特征在于，从小麦胚芽提取物中完全除去混入该胚芽提取物的胚乳，将所得的无细胞蛋白质合成用的细胞提取物中的天然型氨基酸变为重氢标记氨基酸后，使用含代替天然型氨基酸的重氢标记氨基酸的蛋白质合成反应液的组成、在批式条件下、或透析条件下，进行无细胞蛋白质合成。
本发明还有一个方案是用上述制造方法所得的含重氢的氨基酸标记的蛋白质。
图2是用透析式无细胞蛋白质合成法合成48小时并精制的GFP(A)和DHFR(B)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2的(A)和(B)中，泳道2和泳道3都是天然型蛋白质的电泳结果、泳道4和泳道5都是含硒代甲硫氨酸蛋白质的电泳结果。另外，第2泳道和第4泳道表示合成反应后的反应原液的电泳结果、第3泳道和第5泳道是反应原液精制后的每种蛋白质的电泳结果。第1泳道作为对照，表示蛋白质翻译模板不存在下进行合成反应的结果。图中的箭头表示生成的蛋白质条带、MM表示分子量标志。
图3是精制的含硒代甲硫氨酸GFP的萤光发光光谱图。
图4是表示通用性无细胞蛋白质合成用的模板分子合成质粒(pEU1)结构的模式图。
图5是用透析式无细胞蛋白质合成法合成的重氢标记DHFR和经48小时合成后精制的DHFR的电泳图。图中，箭头表示生成的蛋白质条带、各数字表示反应时间。此外，“天然氨基酸”和“天然”表示使用天然型氨基酸时的DHFR合成结果；“重氢标记氨基酸”和“重氢标记的”表示使用重氢标记L型氨基酸时的DHFR合成结果。“放大的”是扩大电泳图；“纯化的”是精制的DHFR的电泳图。
本发明中，无细胞蛋白质合成系统所用的细胞提取物是小麦胚芽提取物，优选基本上完全除去胚乳成分杂质的小麦胚芽提取物。作为原料的该小麦胚芽提取物可按下述实施例1中所示的方法获得，特别优选将有白色小伤部分的胚芽以及茶色或黑色的胚芽完全除去、仅由黄色的胚芽组成的小麦胚芽为原料而制备的小麦胚芽提取物。
硒代甲硫氨酸标记蛋白质时，小麦胚芽提取物中的甲硫氨酸被置换成了硒代甲硫氨酸。具体的置换方法在下述的实施例中描述。例如，首先用抽提溶液由小麦胚芽制备提取物，该抽提溶液含有预先除去甲硫氨酸、并添加了硒代甲硫氨酸的20种氨基酸混合物(含19种氨基酸和硒代甲硫氨酸的溶液)。或者，也可以按以前采用含有全部20种氨基酸的抽提溶液，由小麦胚芽制备提取物。然后将上述胚芽提取物进行凝胶过滤、制备含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的小麦胚芽提取物，凝胶过滤所用的溶液含有除甲硫氨酸以外的19种氨基酸中添加了硒代甲硫氨酸的20种氨基酸。
用重氢标记蛋白质时，小麦胚芽提取物中的天然型氨基酸置换成重氢标记的氨基酸。具体的置换方法在下述的实施例中描述。例如，使用未预先除去要标记的天然型氨基酸、而添加了相应的重氢标记氨基酸的抽提溶液，或使用含有20种重氢标记氨基酸混合液的抽提溶液由小麦胚芽制备提取物。然后用凝胶过滤柱将所制备的小麦胚芽提取物进行凝胶过滤，该柱经过含目的重氢标记的氨基酸溶液，或含20种重氢标记氨基酸混合液的溶液平衡，凝胶过滤中，提取物的氨基酸中的目的氨基酸或全部20种氨基酸与重氢标记氨基酸交换，制备成小麦胚芽提取物。
在所得的蛋白质是硒代甲硫氨酸标记蛋白质时，本发明中使用的蛋白质合成反应液的组成，可以是现有已知的无细胞蛋白质合成系统(无细胞蛋白质合成反应系统)所使用的组成中，将甲硫氨酸置换成硒代甲硫氨酸的组成。例如，该反应液由以下组分组成24％体积的小麦胚芽提取物(浓度为200A260nm单位/ml)中，加入1,000单位/ml的核糖核酸酸酶抑制剂(RNAsin)、30mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)-KOH，pH7.6、95mM醋酸钾，2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鸟苷三磷酸(GTP)、16mM磷酸肌酸、0.380mM亚精胺、含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20种L氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40等。
另外，所得的蛋白质是重氢标记蛋白质时，可以使用以下的组成即在上述同样的现有已知无细胞蛋白质合成系所用的组成中，将要标记的天然氨基酸置换成相应的重氢标记氨基酸，或将2 0种氨基酸全部置换成重氢标记氨基酸。
在上述蛋白质合成反应液中，添加编码目的蛋白质的mRNA，进行蛋白质的合成。可使用由已知方法制备的mRNA，但是，本发明中，为了合成作为蛋白质合成翻译模板的mRNA，利用藤构建的具有通用性的质粒(pUE)(参照图4)。该质粒是无细胞蛋白质合成系统中用作模板的质粒，其特征是(1)具有启动子功能的碱基序列；(2)在该序列下游区至少有以下构成的转录模板的碱基序列苜蓿花叶病毒(AMV)前导序列、存在于烟草花叶病毒(TMV)RNA的5′末端非翻译序列(5’UTR)的Ω序列、序列表的序列号1或序列号2或序列号3所述的碱基序列、或者与上述序列有70％相同性、而且与存在帽子类似物(CAP)结构的mRNA的翻译起始活性相比，能使其mRNA约有70％以上的翻译起始活性的碱基序列；(3)在该序列下游的多个限制性酶切位点；(4)ORF(开放读框)的终止密码子下游区设置至少由500个以上碱基形成的3′末端非翻译序列(3′UTR)。由上述质粒转录的mRNA中，其5′末端非翻译序列有AMV前导序列、TMVΩ序列、或序列表的序列号1或序列号2、或序列号3所述的碱基序列，而且有长的3′末端非翻译序列，所以该mRNA稳定、而且翻译效率高。序列表的序列号1或序列号2、或序列号3所述的碱基序列是作为5′末端非翻译序列使用、以AMV前导序列及TMVΩ序列为基础设计而得到的多核苷酸。
按该质粒的环状原样使用时，由于在该质粒中未插入特定的转录终止位点，因此所合成的转录产物mRNA是各种分子大小的mRNA。在启动子区的上游，设置具有规定转录终止位置的终止子功能的序列，也可以得到一定分子大小的转录产物。此外，也可以在转录反应之前，用限制酶将该质粒切断，使其开环而作为直链型的质粒使用。
本发明中用作翻译模板的mRNA可以用上述质粒制备，也可以用其本身的已知方法制备。
作为稳定且翻译效率高的mRNA，优选使用其5′末端的一侧配置上述AMV前导序列、TMVΩ序列、或者下述病毒所具有的5′末端非翻译序列(5’UTR)的mRNA烟草蚀纹病毒(ETV)[Niepel，M.和Gallie，D.R.(1999)J.Virol.，73，9080-9088][Kawarasaki，Y.，等，(2000)Biotechnol.Prog.，16，517-521]、烟草脉斑病毒、马铃薯病毒、梅痘病毒。或下述病毒的5′末端的内部核糖体进入部位(IRES)序列也可用作上述5′末端非翻译序列脑心肌炎病毒、泰勒尔鼠脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、典型猪霍乱病毒、牛腹泻病毒、C型肝炎病毒。
此外，为了构建稳定、且翻译效率高的mRNA，其3′末端一侧配置的非翻译序列可使用例如，蕃茄丛矮病病毒[Wu，B和white，K.D.，(1999)J.Virol.，73，8982-8988]的3′末端非翻译序列。
还有，已知卫星烟草坏死病毒[Timmer，R.，等.，(1993)J.Biol.Chem.268，9504-9510]，以及大麦黄矮病病毒[Guo，L.，等，(2001)Molecular Cell 7，1103-1109]中，通过5′末端非翻译序列和3′末端非翻译序列的相互作用而有效地进行翻译，在目的mRNA的构建中，也可使用这些5′末端非翻译序列和3′末端非翻译序列。
此外，也可以由随机序列的RNA库，按照已报道的文献[Owens，G.C.，等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98，1471-1476][Venkatesan，A.和Dasgupta，A.，(2001)Mol.Cell.Biol.21，2826-2837]中所述的方法，筛选出具有高翻译效率功能的序列，该序列也可用于mRNA的构建。或者，也可将这些文献中所述的碱基序列用作mRNA的5′末端非翻译序列或3′末端非翻译序列。
构建mRNA时所用的模板DNA不限于环状的质粒DNA，也可使用由PCR扩增所得的直链状双链DNA。在这种埸合，也可以采用T7RNA聚合酶的启动子作为转录反应的启动子，随后是ETV的5′末端非翻译区、目的蛋白质的基因、以及最后是T7RNA聚合酶的终止子序列，由此配置成的基因用T7RNA聚合酶转录，制备mRNA，接着使其在无细胞蛋白质合成系统中反应。
本发明中的蛋白质合成采用由上述方法制备的小麦胚芽提取物和蛋白质合成反应液，按照无细胞蛋白质合成法进行。有关无细胞蛋白质的合成，可以按照以前的批式法进行。也可以由利用透析法、超滤膜的一体型无细胞蛋白质合成系统进行，该透析法可以用插入目的基因的上述质粒，在同一容器内连续进行mRNA合成(转录)和蛋白质合成(翻译)。以下，对一体型无细胞蛋白质合成系统和批式无细胞蛋白质合成法进行说明。
批式无细胞蛋白质合成法是指，将mRNA合成反应所得的mRNA加入无细胞蛋白质合成反应中，通过从反应开始至该反应结束的一次性反应来合成蛋白质。mRNA可用其已知的合成方法获得，也可利用上述质粒来合成。蛋白质的合成可按照 藤已报道的有关利用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成[Endo，Y.等，(1992)J.Biotech.，25，221-230][Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，550-564(2000)]中所述的方法进行。
一方面，一体型透析式无细胞蛋白质合成系统中，将目的基因插入上述质粒中，按其环状型原样、或制备成直链加入RNA合成反应液中，在23～37℃下，预备反应约5分钟，优选在30℃下，反应10分钟。根据需要，该预备反应步骤也可以省略，但是，该预备反应步骤中，由于RNA聚合酶在模板DNA启动子区的结合而进行有效的转录起始反应，使随后的保温阶段中的mRNA合成量增加，其结果使翻译阶段中的蛋白质合成量增加，因此，进行预备反应更为合适。RNA合成反应液由以下组分组成模板DNA、4种底物核糖核苷5′-三磷酸、根据需要还有CPA分子、RNA聚合酶、亚精胺、镁离子及适当的缓冲液等。具体的例子是，例如，可以使用由以下组分组成的RNA合成反应液80mMHepes-KOH pH7.6、16mM醋酸镁、2mM亚精胺、10mM二硫苏糖醇(DTT)、2.5mM的各种核苷5′-三磷酸[NTP；ATP、GTP、尿苷-5′-三磷酸(UTP)、胞苷5′-三磷酸(CTP)]、核糖核酸酶抑制剂(1,000单位/ml)、质粒DNA(50μg/ml)、以及SP6 RNA聚合酶(3,000单位/ml)。应说明，在合成5′末端含有CAP结构的RNA的场合，该溶液中也可追加5mM的7mGpppG。
然后，将含上述质粒的RNA合成反应液与上述蛋白质合成反应液(制备硒代甲硫氨酸标记蛋白质时，是添加代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的反应液，或者制备重氢标记蛋白质时，是含有代替天然型氨基酸的重氢标记氨基酸的反应液)混合。将此混合液移至透析膜管内之后，将其浸入装满了预先准备好的蛋白质合成用透析外液(上述添加了代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的溶液，或者制备重氢标记蛋白质时，是含有代替天然氨基酸的重氢标记氨基酸的溶液)的容器中。在30℃、静置的条件下反应约3小时，首先，主要是合成mRNA。
随后的步骤是将反应温度降低至26℃，在静置的条件下，边透析边继续进行反应。在该过程中，透析膜内的低分子，特别是与mRNA合成的最适浓度一致而按高浓度设定的ATP、GTP、镁离子的浓度随着透析的进行而降低，接近于由蛋白质合成反应液(上述添加了代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的溶液，或者制备重氢标记蛋白质时，是含有代替天然氨基酸的重氢标记氨基酸的溶液)制成的透析外液的浓度，透析膜内的溶液成分几乎已达到蛋白质合成反应的最适浓度。
随着透析的进行，促进了蛋白质合成反应，该反应速度达到最大而使蛋白质合成。该无细胞蛋白质反应继续60小时以上、合成二氢叶酸还原酶(DHFR)时，每1ml反应容量可得到约4mg的蛋白质。
利用透析膜的该系统中，环状型、直链型中的任何一种质粒都可使用。但是，从合成的收率和成本考虑，优选使用环状型的质粒。此外，在促进翻译起始活性的CAP存在、或不存在的任一种条件下，该系统都可能实施。但是，mRNA合成中使用的CAP本身，对其与蛋白质合成中必要的因子的强结合有抑制作用，降低了蛋白质合成的效率，因此，在CAP不存在的条件下进行合成是实用的。
还有，利用超滤膜，与上述同样，采用mRNA合成后、继续在同一容器内进行无细胞蛋白质合成的转录和翻译一体化的无细胞蛋白质合成系统，也可以进行蛋白质的硒代甲硫氨酸标记和含重氢的氨基酸标记。
首先，用上述质粒作为模板，用配备好超滤膜的旋转柱通过透析法合成mRNA。合成反应是用上述RNA合成反应液在30～37℃下进行，反应时间根据所需的RNA合成量而定，但通常大约3～5小时为好。此外，对这里所用的旋转柱上配备的超滤膜的分子量界限大小无特别的限定，只要其孔径能使合成的RNA与RNA合成所需的底物、合成的副产物等低分子物质分离即可，优选分子量界限为5,000～100,000的超滤膜。这些膜的孔径为10～50。
反应结束后，将反应容器旋转柱离心、洗净，将纯化的mRNA收集在膜上。随后，将含有小麦胚芽提取物的上述无细胞蛋白质合成液加入同一旋转柱内，然后浸入装满上述无细胞蛋白质合成液制成的透析外液(含有含代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20种L型氨基酸、或含代替天然型氨基酸的重氢标记氨基酸的20种L型氨基酸)的容器中，在23℃下开始无细胞蛋白质合成反应，并在静置的条件下进行反应。
由该系统所得的蛋白质合成收率与用透析膜的上述系统的收率大致相同。此外，将旋转柱的过滤器上的mRNA以过滤器原样投入上述利用透析膜的系统中的透析管内，也可以合成蛋白质。还有，本发明中，对于含有CPA结构的mRNA，也能完全同样地在其合成以及精制之后有效地进行蛋白质合成反应。
利用超滤膜的系统中，可采用环状型、直链型中的任何一种质粒，而且在CAP存在、不存在的任何一种条件下，该系统都能够实施。采用5′端有CAP结构的mRNA时，蛋白质合成的收量高，但由直链型质粒合成的5′端有CAP结构的mRNA与由环状型质粒在CAP不存在下合成的mRNA相比，两者的合成量无太大的差别，从成本考虑，优选在CAP不存在下、采用环状型质粒的合成条件。
上述2种一体型无细胞蛋白质合成系统都是首先进行mRNA合成，然后在同一反应容器内继续进行蛋白质合成的连续式系统，是转录、翻译非共轭的系统。在这些系统中，至少对于选自下述的1种或2种以上的因素而言，也可以引进在反应开始后，在必要时追加、或连续追加的添加手段，这些因素是蛋白质合成的翻译模板mRNA、能量再生系统的酶、底物(含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20种L型氨基酸、或含有代替天然型氨基酸的重氢标记氨基酸的20种L型氨基酸)、以及能源。这些因素可以按极少的量连续地添加、也可以隔一定的时间添加。另外，在这些系统中，为了维持其合成反应的效率，也可以引入在该合成反应开始后，在反应过程中对上述无细胞蛋白质合成反应中必要的物质进行交换的处理。例如，也可以引进将无细胞蛋白质合成反应液(含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20种L型氨基酸、或含有代替天然氨基酸的重氢标记氨基酸的20种L型氨基酸)制成的透析外液的所需量，连续或不连续地交换的手段。
还有，为了追加添加、或交换上述无细胞蛋白质合成反应中的必要物质，这些系统也可以具备保存必要物质的手段。此外还有，这些系统也可以具备除去该合成反应中无细胞蛋白质合成反应副产物的排出手段。也可以选择1种或2种以上用于必要物质、副产物的追加、保存、交换、和/或排出的手段，组合起来引入。
此外，这些系统的反应容器内的反应液所接触的表面中，如果至少在与透析手段或分子筛手段有关的表面上，例如透析膜或超滤膜上，预先施予蛋白质涂层，可进一步提高蛋白质合成的效率。亦即，通过用蛋白质的涂层处理，可以使mRNA的转录效率、以及在其后发生的蛋白质翻译效率提高。用作涂层的蛋白质例如有白蛋白，但不一定限于白蛋白。另外，用于涂层的蛋白质不必特别固定在与透析手段或分子筛手段有关的表面，用含蛋白质的溶液洗数次也有效果。该方法简便且令人满意，但不限于这种方法。例如，用白蛋白在透析膜上制备涂层的场合，用水和白蛋白的混合溶液作为内液、用水作为外液透析数小时即可。当然，内液和外液的组成也可以互换。对含有用作涂层的蛋白质溶液的浓度无特别的限定，但溶解饱和浓度已足够，低于此浓度也可以。
还有，本发明中，用小麦胚芽提取物进行上述的一体型或批式无细胞蛋白质合成的场合，优选在不搅拌反应液的静置条件下进行蛋白质合成反应。
由采用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成法，进行绿色萤光蛋白质(GFP)和二氢叶酸还原酶(DHFR)的硒代甲硫氨酸标记。
小麦胚芽提取物的制备和用该小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成法按照已报导的文献(Endo，Y.等，(1992)J.Biotech.，25，221～230)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559～564)进行。
首先，用改进的Johnston等的方法(Johnston，F.B.等(1957)Nature，179，160～161)获得小麦胚芽。先将北海道产的气候枯(チホク)小麦种子(未消毒)按每1分钟100g的比例加入碾磨机(RotorSpeed Mill pulverisette 14型Fritsch公司生产)中，在8,000rpm下温和地破碎。将此破碎物在6,000rpm下再次破碎，通过筛分获得粗胚芽级分(筛孔大小0.71mm～1.00mm)后，用聚乙烯板等带静电的带电体吸附，除去混入该胚芽级分内的种皮等杂质。
再用筛和带静电的带电体，将胚芽粒子分为小粒(0.71mm～0.85mm)、中粒(0.85mm～1mm)、轻粒(0.85mm～1mm，且重量轻)3个级分，最后用肉眼进行分辨，采集黄色的胚芽。小粒级分表现出最高的蛋白质合成活性。根据推测，轻粒是在种子破碎时，胚芽上产生的小伤胚芽在浮选操作中破坏的粒子。然后，用上述所得的黄色胚芽制成试样，为了完全除去该试样中的小麦胚乳成分，将所得的小麦胚芽放入收集器内，用冷蒸馏水(DDW)冷却并洗净，然后悬浮于0.5％的非离子表面活性剂NP-40溶液中，用超声波洗净器反复洗净，直至洗净液变白浊。在蒸馏水存在下，再经过1次超声波洗净后，通过吸滤收集小麦胚芽，用冷蒸馏水(DDW)洗净数次，将小麦胚芽纯化。如此纯化的小麦胚芽是基本上除去小麦胚芽内夹杂的内因性蛋白质合成抑制因子、小麦糖、硫堇、以及核糖核酸酶等的物质，亦即基本上不夹杂胚乳成分的物质。
小麦胚芽提取物的制备按常规方法(Erickson，A.H.等，(1996)Methods in Enzymol.，96，38-50)进行。以下的操作在4℃下进行。将上述纯化的小麦胚芽用液氮冷冻后在研钵中研碎，每1mg所得的粉体中，加入1ml部分改变的帕他松(バタ-ソン)等的方法中的抽提液(含有80mM Hepes-KOH，pH7.8、200mM醋酸钾、2mM醋酸镁、4mM氯化钙、8mM二硫苏糖醇、除甲硫氨酸以外的19种L型氨基酸各0.6mM、蛋白分解酶抑制剂FUT、E-64和PMSF各1μM)，小心搅拌，使其不产生泡沫。然后在30,000g下离心15分钟，回收上清作为胚芽提取物，在预先用溶液(40mM Hepes-KOH，pH7.8、100mM醋酸钾、5mM醋酸镁、4mM二硫苏糖醇、除甲硫氨酸以外的19种L型氨基酸中补充了硒代甲硫氨酸的20种氨基酸)平衡好的Sephadex G-25柱(Coarse)上进行凝胶过滤。或者，用以前所用的含全部20种氨基酸的溶液代替上述的抽提液，与上述同样地制备胚芽提取物。在这种场合下，凝胶过滤柱预先用含有除甲硫氨酸外的19种氨基酸的凝胶过滤溶液平衡，再进行凝胶过滤操作，然后在所得过不含甲硫氨酸的小麦胚芽提取物中补足硒代甲硫氨酸、制备小麦胚芽提取物。试样的浓度调整至170～250A260nm(A260/A280＝1.5)。
所用的蛋白质合成反应液由以下组分组成24％容积的小麦胚芽提出液(浓度为200 A260nm单位/ml)、1,000单位/ml核糖核酸酶抑制剂(RNAsin)、30mMHepes-K0H，pH7.6、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM亚精胺、含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的20种L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40。
gfpmRNA或dhfrmRNA合成用的质粒按以下方法构建而成以质粒pPSP65为基础，插入SP6或T7启动子等的RNA聚合酶结合的碱基序列，在其下游插入具有mRNA的翻译起始重要功能的AMVΩ序列的转录模板碱基序列，在此序列下游再引入gfp基因或dhfr基因，在3′末端插入编码gfp或dhfr基因来源的3’UTR和聚(A)100的序列(图4)。用限制酶HindIII，在导入该质粒聚(A)下游的限制酶位点(HindIII位点)将其切断开环，作为直链型质粒DNA使用。
为了由上述直链型质粒转录mRNA，反应容器的底部采用由透析膜制成的微型旋转柱(Amicon公司生产，YM-10)。将含有上述直链型质粒DNA的RNA合成反应液{80mM Hepes-KOH，pH7.6、16mM醋酸镁、2mM亚精胺、10mM二硫苏糖醇(DTT)、核苷5′-3三磷酸[NTP；ATP、GTP、尿苷-5′-3三磷酸(UTP)、胞苷5′-3三磷酸(CTP)]各2.5mM、核糖核酸酶抑制剂(1,000单位/ml)、质粒DNA(50μg/ml)、SP6RNA聚合酶(3,000单位/ml)}在37℃下保温2小时，合成mRNA。还要说明，YM-10用牛血清白蛋白做涂层处理后使用。
反应结束后，将此反应器(微型旋转柱)离心处理。通过理心处理，使溶液中的核苷三磷酸、CAP等底物、副产物吡咯啉酸、离子、以及缓冲液等低分子通过滤孔除去、合成的mRNA等高分子留在过滤器上。溶液中加入水，反复上述的操作数次，完全除去合成的mRNA级分中的吡咯啉酸等低分子蛋白质合成抑制物，将合成的mRNA收集在过滤器上。还有，该纯化操作中，模板DNA不能除去而残留在过滤器上，但未呈现出对翻译反应的抑制作用。
mRNA可从收集该mRNA的过滤器以水溶液的形式回收，或照原样收集在过滤器上用于无细胞蛋白质合成系中。
将由此所得的mRNA加入上述无细胞蛋白质合成反应液中，进行批式或一体型无细胞蛋白质合成系统的蛋白质合成。mRNA作为水溶液回收而使用时，将mRNA加入上述蛋白质合成反应液中，并使其浓度为0.2μM。蛋白质合成反应、亦即翻译反应在26℃、静置的反应条件下进行。
关于批式无细胞蛋白质合成法的GFP和DHFR的合成量，通过放射性同位素在三氯乙酸不溶级分中的掺入量来测定，再进一步用放射自显影分析合成的蛋白质。
用透析法大量合成的蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺电泳法和考马斯亮蓝(CCB)染色法分析[Endo，Y.等，(1992)J.Biotenol，25，221-230][Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97，559～564(2000)]。
GPT的精制以及通过萤光分光光度计的发光光谱分析的活性测定按Deschamps等的方法[Deschamps，J.R.等，(1995)ProteinExpression and Purification，6，555-558]进行。发光光谱的测定采用岛津RF-5000型萤光光度计。DHER的活性用Stanley等的方法[Methods.Enzymol.18，195-199(1971)]测定。
其结果如下所示。
图1表示将甲硫氨酸置换为硒代甲硫氨酸的蛋白质合成系统中，用批式法合成GFP和DHFR时每种蛋白的合成量(A)、以及每种合成产物的放射自显影分析结果[(B)和(C)]。图1的(B)和(C)分别表示有关GFP和DHFR的结果；图中的Met(甲硫氨酸)是指天然型的蛋白质、Se-met(硒代甲硫氨酸)是指硒代甲硫氨酸蛋白质。正如由放射自显影所知，含硒代甲硫氨酸的GFP和含硒代甲硫氨酸的DHFR的电泳迁移率与其各自含甲硫氨酸的天然型蛋白质的相同。此外，由蛋白质随时间而变浓的结果可知，其合成量随反应时间延长而增加。如由图1的(A)所示可知，在甲硫氨酸置换为硒代甲硫氨酸的合成反应系统方面，虽然可看到含硒代甲硫氨酸GTP合成(●—●)的合成量比对照的天然型GFP合成(○—○)约低20-25％，但是含硒代甲硫氨酸GFP的合成效率高。关于含硒代甲硫氨酸DHFR合成(■—■)和天然型DHFR合成(□—□)也得到同样的结果。
一方面，在不含甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸的反应系统的实验中，合成反应在1小时后完全停止(○--○)。在该时间内合成的GFP，相当于硒代甲硫氨酸存在下，4小时批式反应所合成的含硒代甲硫氨酸GFP量的约12％。这种现象表明，用凝胶过滤操作未能除去而残存于胚芽提取物中的甲硫氨酸，在反应开始后的1小时内被用于蛋白质合成中的结果。这种现象还表明，在硒代甲硫氨酸存在下批式合成的GFP中，有12％的量是含甲硫氨酸的GFP、88％是含硒代甲硫氨酸的GFP。如下面所述，透析式无细胞蛋白质合成系统的大量合成方面，由于含硒代甲硫氨酸GFP的合成是连续的，随着其含量的增加，天然型GFP混入量的比例降低，实际上成为可忽略的微量。在用DHFR基因作为模板的含硒代甲硫氨酸DHFR合成方面，也可证实同样的看法[图1的(A)](□--□)。
然后，用一体型透析式无细胞蛋白质合成法进行含硒代甲硫氨酸GFP和含硒代甲硫氨酸DHFR的大量合成、并由此反应液将蛋白质精制。图2是用上述方法经48小时反应合成并精制的GFP(A)和DHFR(B)的各自的天然型(泳道2和3)蛋白质、以及含硒代甲硫氨酸蛋白质(泳道4和5)的SDS-丙烯酰胺凝胶电泳图。图中的箭头指示每种蛋白质的条带。由图2可知，天然型蛋白质和含硒代甲硫氨酸的蛋白质都依赖于添加的模板而有效地合成。泳道1是作为对照、在模板不存在下反应所得反应液的电泳带型。由于GFP、DHFR用一体型透析式无细胞蛋白质合成法的合成效率都很高，所以反应液中这些产物含量也高，可以按照常规方法简便地精制(泳道3和4)。图2(B)所示的DHFR例子中，用氨甲喋呤为配体的亲和层析法精制时，通过1次层析操作，可以制备出纯度接近100％的天然DHFR和含有硒代甲硫氨酸DHFR的试样(泳道3和4)。
泳道3和4所示的实验结果还表明，含硒代甲硫氨酸的DHFR对配体氨甲喋呤与天然型的DHFR有同样强的亲和性。可以认为，该同祥的亲和性意味着合成的含硒代甲硫氨酸的DHFR与天然型DHFR有相同的酶活性。
更重要的是，用一体型透析式无细胞蛋白质合成法，按上述那样所得的合成蛋白质中，硒代甲硫氨酸的含量非常高。换言之，所得的含硒代甲硫氨酸的非天然型蛋白质是高纯度的蛋白质。根据图1所示的硒代甲硫氨酸存在下，反应4小时后所合成的GFP和DHFR中的硒代甲硫氨酸的含量、以及甲硫氨酸与硒代甲硫氨酸不存在下的合成动力学结果，可以计算出硒代甲硫氨酸的含量。在批式反应4小时后所合成的GFP和DHFR蛋白质量分别是每1ml反应液0.4mg和0.45mg；由于这些蛋白质的甲硫氨酸残基中，至少约80％是硒代甲硫氨酸(含甲硫氨酸蛋白质的比例最大约为20％)，所以，可计算出，含甲硫氨酸GFP的量为0.08mg、含甲硫氨酸DHFR的量为0.09mg。一方面，用一体型透析式无细胞蛋白质合成系统时，48小时反应后的GFP和DHFR合成量分别为2.8mg和3.1mg。亦即，用一体型透析式无细胞蛋白质合成系统大量制备的含硒代甲硫氨酸蛋白质的纯度，若按上述方法计算，GFP和DHFR均为97.1％。
由此，与以前使用的方法相比，按照本发明的硒代甲硫氨酸导入蛋白质的导入率要高得多。以前利用的硒代甲硫氨酸导入蛋白质的导入法是将大肠杆菌进行大量培养，但已报道的该导入率最大只有53％[Huber，R.E.等，(1967)Biochim.Biophys.Acta，141，587-599]。
因此，本发明的非天然型氨基酸导入法与以前的方法比较，是非常优良的。
接着，对精制的这些含硒代甲硫氨酸蛋白质的酶学性质从生物化学上进行研究。在410nm-600nm的范围，测定图2所示的一定浓度的精制GFP标品在395nm激发时的荧光发光光谱，其结果示于图3。由图3可知，天然型的含甲硫氨酸GFP[图3的(A)]和含硒代甲硫氨酸GFP[图3的(B)]的荧光发光光谱未见有差别。亦即，可以说，甲硫氨酸残基置换为硒代甲硫氨酸的GFP其活性的变化在通常的测定感度之下。
此外，DHFR的酶学性质的研究结果归纳在表1中。由表1可知，表示天然型的含甲硫氨酸DHFR(Met-DHFR)和含硒代甲硫氨酸DHFR(SeMet-DHFR)的酶化学性质的参数，即对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH的米氏常数Km和最大速度Vmax，两种酶间都未见有差别。亦即，甲硫氨酸残基置换为硒代甲硫氨酸的DHFR保持了与天然型DHFR相同的酶活性。
表1
然后，进行质量分析，其目的是确认蛋白质合成时，硒代甲硫氨酸进入mRNA上的甲硫氨酸密码子指示部位，亦即在蛋白质分子中本来是甲硫氨酸残基的部位，导入了硒代甲硫氨酸。由天然蛋白质(对照)和含硒代甲硫氨酸蛋白质的质量差，可确定含硒代甲硫氨酸的GFP含有5.9个原子硒、另外，含硒代甲硫氨酸的DHFR含有4.8原子硒。这些测定值，与GFP和DHFR的甲硫氨酸残基数分别为6个和5个的事实非常一致。进一步由质量分析的分布可知，在这些含硒代甲硫氨酸的蛋白质中所含的非标记蛋白质杂质的比例约为2％～4％，该值与由图1和2的实验值所得的计算值非常一致。
以上事实表明，本发明的含硒代甲硫氨酸蛋白质，可以高效率地合成、且维持其原有的蛋白质活性。该事实表明，上述小麦胚芽无细胞蛋白质合成反应中，与甲硫氨酸tRNA的合成、40S核糖体亚粒子和翻译起始氨酰基tRNA(甲硫氨酸tRNA)复合体形成、肽链伸长反应、以及翻译终止反应有关的因子群中，无论哪种因子，对硒代甲硫氨酸的识别都与对甲硫氨酸一样，保持其使该氨基酸类似化合物进入蛋白质中的性质。
小麦胚芽采用由实施例1所述的方法制备的基本上不夹杂胚乳成分的原料。同时，小麦胚芽提取物的制备按照与实施例1完全相同的方法进行。但是，抽提用溶液和凝胶过滤所使用的溶液中，含有重氢标记的20种L型氨基酸，以代替含硒代甲硫氨酸的20种氨基酸。所制备的提取物的浓度调整至170-250A260nm(A260/A280＝1.5)。
蛋白质合成反应液的组成与实施例1所述的相同，但含有重氢标记的20种L型氨基酸，以代替含硒代甲硫氨酸的20种氨基酸。
二氢叶酸还原酶(DHFR)的合成所用的质粒、mRNA的合成方法、蛋白质合成方法、以及合成的蛋白质的分析，同样按实施例1所述的方法进行。
其结果如以下所示。
图5表示一体型透析式无细胞蛋白质合成系统中，20种L型天然型氨基酸全部置换为重氢标记氨基酸的DHFR的合成量。在反应开始后的第0、12、24、48小时，分别取1μl反应液，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、并进行考马斯亮蓝(CBB)染色、检测反应液中的蛋白质。图中，箭头表示生成的DHFR条带。用光密度计测定该条带的染色强度时，DHFR的合成随时间而大致直线地进行，进一步搞清了重氢标记的DHFR合成量与天然型DHFR合成量之间未见有差别。
由此可以认为，采用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统的本发明的方法是有效的重氢标记蛋白质合成方法。合成反应进行48小时后，用氨甲喋呤柱精制的重氢标记的DHFR收量为3.5mg。此外，从扩大的电泳图(实线部分)、以及精制品的电泳图可确认，电泳中的重氢标记DHFR的迁移率也比天然DHFR稍有降低。可以认为，这种所看到重氢标记DHFR在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的迁移率降低现象起因于质量数的增加、直接地表明合成了含重氢的DHFR。
其次，与实施例1同样，从生物化学方面研究精制的重氢标记的DHFR的酶学性质。由表2可知，表示天然型的DHFR和重氢标记DHFR的酶化学性质的参数，即对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH的米氏常数Km和最大速度Vmax，两种酶间都未见有差别。亦即，明确了由重氢标记氨基酸制成的DHFR保持了与天然型DHFR大致相同的酶活性。
表2
由以上的结果可以确定，本发明的含有20种L型重氢标记氨基酸的蛋白质，可以高效率地合成、且维持其原有的蛋白质活性。
工业上的利用可能性根据本发明的标记蛋白质的方法，可以高效率地制备出高纯度的标记蛋白质。因此，利用无细胞蛋白质合成系统的本发明的标记蛋白质的制备方法，可以用于制备X线分析中所用的结晶样品。此外，这里所述的标记方法同样可以用于制备含重氢的蛋白质、该方法还可作为将任意一种氨基酸用其对应的同位素标记氨基酸等标记的一般手段。
更重要的方面是，不仅是重氢、而且在13C、15N等的同位素标记蛋白质的制备方面也有效、并可期待广泛用于蛋白质的结构分析中。
如上述那样本发明的标记蛋白质的制造方法可于以下方面蛋白质的X线结晶分析、核磁共振分析、以及中子衍射法等的高次结构分析用试样的制备、或利用同位素效果的蛋白质的催化机制的解释等。
序列表说明序列号1设计用作5′非翻译区的多核苷酸序列号2设计用作5′非翻译区的多核苷酸序列号3设计用作5′非翻译区的多核苷酸序列表<110> 远藤弥重太独立行政法人产业技术综合研究所和和研药株式会社<120> 应用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统标记蛋白质的一般方法<130> GP01-1018<140><141><150> JP P2000-220127<151> 2000-07-21<150> JP P2000-306119<151> 2000-10-05<160> 3<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 34<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的说明设计用作5′端非翻译区的多核苷酸<400> 1gaacaauuac cauacauuuu acauuacaac uaca 34<210> 2<211> 29<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的说明设计用作5′非翻译区的多核苷酸<400> 2gaacaacaac aacaacaaac aacaacaaa 29<210> 3<211> 15<212> RNA<213> 人工合成序列<220><223> 人工合成序列的说明设计用作5′非翻译区的多核苷酸<400> 3ggacaacaac aacaa 1权利要求
1.硒代甲硫氨酸标记蛋白质的制造方法，其特征在于，从小麦胚芽提取物中完全除去混入该胚芽提取物的胚乳，将所得的无细胞蛋白质合成用的细胞提取物中的甲硫氨酸变为硒代甲硫氨酸后，使用含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的蛋白质合成反应液组成、在批式条件下、或透析条件下，进行无细胞蛋白质合成。
2.用权利要求1所述的制造方法所得的硒代甲硫氨酸标记蛋白质。
3.含有重氢氨基酸标记蛋白质的制造方法，其特征在于，从小麦胚芽提取物中完全除去混入该胚芽提取物的胚乳，将所得的无细胞蛋白质合成用的细胞提取物中的天然型氨基酸变为重氢标记氨基酸后，使用含有代替天然型氨基酸的重氢标记氨基酸的蛋白质合成反应液组成、在批式条件下、或透析条件下，进行无细胞蛋白质合成。
4.用权利要求3所述的制造方法所得的含重氢氨基酸标记的蛋白质。
全文摘要
提供硒代甲硫氨酸标记蛋白质的制造方法以及用该方法制造的蛋白质，其特征在于利用小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统，从小麦胚芽提取物中完全除去混入该胚芽提取物的胚乳，将所得的无细胞蛋白质合成用的细胞提取物中的甲硫氨酸变为硒代甲硫氨酸后，使用含有代替甲硫氨酸的硒代甲硫氨酸的蛋白质合成反应液组成、在批式条件下、或透析条件下，进行无细胞蛋白质合成。进一步用同样的手法，提供重氢标记的蛋白质的制造方法和该方法制造的蛋白质。
文档编号C12N15/10GK1471585SQ01813171
公开日2004年1月28日 申请日期2001年7月18日 优先权日2000年7月21日
发明者远藤弥重太, P·库马, 西川茂道, 道 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 和研药株式会社, 远藤弥重太