用于浸提可可矢车菊苷配质的改进方法

专利名称：用于浸提可可矢车菊苷配质的改进方法
背景技术：
已知经常服用食用多酚是有益的，这些多酚在多种水果和蔬菜中很常见。红酒、绿茶和可可全都经过验证富含多酚，而且在工业化国家中已经发现，经常饮用红酒和绿茶均与心脏病死亡成负相关。
目前已知可可矢车菊苷配质低聚物在结构和功能之间表现出明确的关系，就是说各个低聚物，或者含有尺寸类似的各种低聚物的级分，表现出特定的不受其他低聚物影响的生物功能。因此，重要的是确保所采用的浸提方法不仅能最大可能地增溶可可多酚，而且要能有效地浸提出可可豆中所有存在的可可多酚低聚物。
利用水或有机溶剂，或者水与有机溶剂的混合物来浸提可可豆，可以除去黄嘌呤生物碱(主要是咖啡因和可可碱)以及其他产生令人不快的苦味的可溶性可可豆成分。在这些苦味的可溶性成分中包括矢车菊苷配质。
美国专利1,750,795(1926年授予Defren)公开了通过将可可豆浸泡在60℃水中然后丢弃水并焙烤可可豆来除去“大部分可溶性可可豆苦味成分”的方法。
已经采用热水处理法来除去黄嘌呤以提供无刺激性的可可豆。参见美国专利4,407,834“可可脱可可碱的方法”(1983年6月28日授权给Chiovini等人)和美国专利4,755,391“从可可物质中除去甲基黄嘌呤的方法”(1988年7月5日授权给Chiovini等人)。
可可浸提物可以通过以水和/或醇浸提可可固体来进行制备，该可可固体是由发酵过、传统焙烤过的可可豆或可可粒制造的。Osakabe等人采用了无水或者去离子水大于40％v/v的含水乙醇在室温下制备了粗多酚浸提物。参见日本专利94-64717“预防胃溃疡用的食品或饮品”(1995年10月4日)。
Zieglader等人采用甲醇在室温下从可可豆中浸提多酚。参见“可可的抗氧化作用”(Rev.Choc.Confect.Bak，83-6，1983)，其公开了甲醇浸提物的制备。该浸提物含有“单体单宁母体(儿茶素、花色素和其可溶性缩合物)”。其可用作保存油以防止其氧化的添加剂。Griffiths等人采用了也是在室温下获得的甲醇浸提物从成熟的可可粒获得多酚浸提物，该浸提物可用于研究可可和其他植物中植物性多酚的特性。参见“可可属种子多酚的对比性研究”，(Biochemical J.74362-365，1960)。Rigaud等人从冻干的可可豆和葡萄籽制造浸提物，并且指出使用甲醇作为溶剂排除了高级低聚物的存在。参见“从可可豆和葡萄籽用正相高效液相色谱法分离矢车菊苷配质”(J.Chromatography 654255-60，1993)。Jalal和Collin从可可植物的不同部位制备浸提物以分析在该植物每个部位中存在的多酚。浸提采用70％的冷甲醇进行，然后是乙酸乙酯。参见“可可成熟植株、秧苗和组织培养物的多酚”(Phytochemistry，161377-1380，1977)。
丙酮/水也已经用于浸提可可豆。Clapperton等人报道了采用冷的70％丙酮来浸提从发酵过的可可豆制造的脱脂可可粉。参见“多酚和可可香精，Groupe多酚”(第XVI届Intern.Conf.，Lisbon，Portugal，7月13-16日，1992年)。Rigaud合并了乙醇第一浸提物与采用60％丙酮/水混合物的第二浸提物。参见“从可可豆和葡萄籽用正相高效液相色谱法分离矢车菊苷配质”(J.Chromatography，654255-60，1993)。
传统上，处理和加工可可豆的目的是最大限度降低多酚给可可豆带来的苦味，结果是降低了可可豆中多酚的含量。显著降低多酚含量的两种方式是，可可豆的带壳发酵以及焙烤发酵过的可可豆以破壳并且辅助脱壳过程。Zieglader等人报道了由发酵过的可可豆制造的浸提物与由未发酵的可可豆制造的浸提物相比其抗氧化活性有所损失，并且认为抗氧化能力的下降与发酵过的可可豆浸提物中多酚含量降低相关。所有前述浸提方法都采用发酵过的可可豆来进行，并且在许多情况下也对可可豆进行焙烤。因此，矢车菊苷配质的产率比未发酵可可豆浸提物中所发现的要低得多。
在最初的溶剂浸提步骤之后进行乙酸乙酯浸提步骤，已经成为惯例。参见Forsyth和Roberts，“可可多酚物质3.可可无色花青素的结构”，Biochem.J.74，374-378，1960；Thompson等人，“植物性矢车菊苷配质。第I部分，前言；自然界中植物性矢车菊苷配质的分离、结构以及分布”，J.Chem.Soc.Perkin I，卷11，1387-99，1972；Jalal和Collins，“可可成株、秧苗以及培养物的多酚”，Phytochemistry，161377-1380，1977；“类黄酮”，J.B.Harborne主编，Chapman and Hall Ltd.，London，1988，其中的第2章，Porter等人，“Flavans和原花色素”；美国专利5,554,645(1994年10月3日授权给Romanczyk等人)。其效果是制造了含有单体和低级低聚物，而不含高级低聚物或者非常少的浸提物。参见LeeA.“苹果汁的酚类低分子和高分子矢车菊苷配质”，J.Sci.Fd Agric.29，471-477，1978。
可可豆在浸提之前是否经过脱脂对多酚的浸提产率有影响。如果可可豆未经过脱脂，那么可可豆中的脂肪就会干扰溶剂的增溶作用，并且多酚产率会显著降低(Lazarus等人，“类黄酮和其他多酚”，Methods in Enzymology系列，Lester Packer主编，Academic Press，New York，出版中)。
可可浸提物可以从由未发酵或发酵过的晒干可可豆制备的可可固体进行制备。可可豆经过研磨、脱脂和浸提。采用了70％丙酮/30％去离子水的混合物，然后是70％甲醇浸提以及两次氯仿浸提。然后是乙酸乙酯浸提，添加水并且除去乙酸乙酯。或者，可可豆经过70％丙酮浸提。在两种情况下，浸提均在室温下进行并且冷冻干燥该含水的浸提物。参见美国专利5,554,645(1994年10月3日授权给L.Romanczyk等人)以及WO 98/09533，1998年3月12日公开。
而且，可可浸提物可以从部分脱脂的可可固体进行制备，该可可固体是由未经过焙烤的可可豆制备的。所得到的可可固体，无论是从发酵、发酵不足还是未发酵的可可粒而来，与由常规焙烤的可可豆或可可粒制备的可可固体相比，均具有较高的可可多酚含量，即可可矢车菊苷配质含量。参见美国专利6,015,913(2000年1月18日授权给K.S.Kealey等人)。
脱脂、冷冻干燥、未发酵的可可豆含有约2％的黄嘌呤生物碱，而常规加工的可可豆则含有更高的量。可可碱是咖啡因的降解产物，二者均是众所周知的神经系统刺激物。过量摄入黄嘌呤生物碱被视为有害的。因此，在某些情况下，希望制备不含黄嘌呤生物碱的可可浸提物。
因此，需要的是从可可固体中浸提出可可矢车菊苷配质的改进方法，并且在某些情况下使可可浸提物脱咖啡因和脱可可碱。
发明简述本发明提供了从由未焙烤的可可豆制备的部分或全脱脂的可可固体浸提可可多酚的改进方法，可可多酚包括儿茶素、表儿茶素和可可矢车菊苷配质低聚物。该改进方法包含在常压下或压力下以能够增溶多酚的酸化溶剂或者含有该溶剂的酸化水溶液进行浸提。优选向该溶剂或溶剂水溶液中添加其量足以使pH值从约6.5降低至约2～约4的酸。优选食用的或生理可接受的酸。
可可固体由未发酵、发酵不足或发酵过的可可豆制备。有机溶剂可以选自低级烷基醇、低级烷基酮以及低级烷基乙酸酯。适宜的溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸甲酯和乙酸乙酯。溶剂水溶液优选仅含有最高约50体积％的水；虽然也可以含有更多量的水，但是随着水含量增多浸提效率会降低。优选的含水有机溶剂包括约50％～约70％异丙醇、约80％～约100％丙酮和约80％～约95％乙醇。单独使用乙醇优先地浸提七聚物以上的可可矢车菊苷配质低聚物。约80％异丙醇与约20％水的混合物优先地浸提单体以及最高至六聚物的低聚物，并且包括六聚物。
本发明也提供了从由未焙烤的可可豆制备的部分脱脂或全脱脂可可固体浸提可可多酚的方法，可可多酚包括儿茶素、表儿茶素和可可矢车菊苷配质低聚物。该方法包含在常压下或压力下以能够增溶可可多酚的非酸化有机溶剂浸提可可固体的步骤。可可豆优选未发酵或发酵不足的可可豆；虽然也可以采用发酵过的可可豆，但是浸提物中高级低聚物的含量会较少。
发酵不足可可豆典型地其发酵系数(factor)为275或更低。优选的发酵不足可可豆包括深蓝灰色、紫色或紫棕色可可豆，或者深蓝灰色与紫色可可豆、紫色与棕色可可豆或者深蓝灰色、紫色与棕色可可豆的混合物。未发酵或发酵不足可可豆含有至少约1重量％至最高约15-17重量％的总可可矢车菊苷配质/g脱脂可可固体，典型地约4-7％。
溶剂可以选自低级烷基醇、低级烷基酮以及低级烷基乙酸酯。适宜的溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸甲酯和乙酸乙酯。溶剂水溶液可以含有最高约50体积％的水；虽然也可以存在更多量的水，但是所浸提的可可多酚的总量却会不随之而提高。优选的溶剂包括50％-60％丙酮和100％乙醇。浸提可以在从0℃至高达所用溶剂或溶剂水溶液沸点的温度下在所用的浸提压力下进行。如果溶剂是甲醇，浸提优选在室温下进行。如果溶剂是乙醇，浸提优选在约20℃～约50℃下进行。如果溶剂是异丙醇，浸提优选在约70℃下进行。如果溶剂是丙酮水溶液，浸提优选在约50℃至溶液沸点下进行。
在前述方法中，如果采用的是酸化溶剂或溶剂水溶液，优选较低的浸提温度。如果采用的是非酸化溶剂或溶剂水溶液，可以采用较高的浸提温度。
本发明也提供了从部分或全脱脂可可固体中选择性浸提低分子量可可矢车菊苷配质低聚物的方法。所采用的溶剂是优先浸提低级低聚物的溶剂，比如乙酸甲酯或乙酸乙酯。可可豆优选是未发酵或发酵不足的可可豆；但是，发酵过的可可豆也可以采用。浸提优选在约20℃～约50℃下进行。所得到的可可浸提物基本上由单体、二聚物和三聚物构成。
本发明也提供了从由未焙烤的可可豆制备的部分脱脂或全脱脂可可固体中选择性浸提较高分子量可可矢车菊苷配质低聚物的方法。该方法包含以下步骤(a)以乙酸乙酯浸提可可固体；(b)回收浸提的可可固体；(c)以高级低聚物的良溶剂来浸提回收的可可固体，比如丙酮、乙醇以及其与最高50％水的混合物；(d)分离可可固体与可可浸提物；并且(e)任选干燥可可浸提物。浸提优选在约20℃～约50℃下进行。可可豆优选未发酵或发酵不足的可可豆；但是，发酵过的可可豆也可以采用。可可浸提物基本上由至少是四聚物和高级低聚物构成。
本发明进一步提供了在常压或压力下采用适于增溶可可矢车菊苷配质的溶剂或者该溶剂水溶液从部分脱脂或全脱脂可可固体中浸提可可多酚的连续方法，可可多酚包括儿茶素、表儿茶素和可可矢车菊苷配质低聚物。该方法包含以下步骤(a)使一系列填充了含有不同量可可多酚的可可固体的室与按逆流方向流动的溶剂接触，并且(b)循环可可浸提物。可以干燥该液体可可浸提物。优选的溶剂包括低级烷基醇、低级烷基酮以及低级烷基乙酸酯。适宜的低级烷基醇是甲醇、乙醇和异丙醇。优选乙醇。适宜的低级烷基酮是丙酮。适宜的低级烷基乙酸酯是乙酸甲酯和乙酸乙酯。优选循环可可浸提物直到基本上不再有任何可可多酚从可可固体中浸提为止，可可多酚包括表儿茶素、儿茶素和/或可可矢车菊苷配质。
如果溶剂是醇类，那么可可浸提物可以用作液体浸提物，称为“酊剂”，如果除去了溶剂就可以作为水溶液，或者在除去溶剂或溶剂和水之后就成为水溶性的干粉了。如果采用了溶剂，那么通过闪蒸出溶剂来干燥可可浸提物。如果采用的是溶剂水溶液，通过在干燥含水浸提物之前闪蒸出溶剂，就可以干燥可可浸提物。含水浸提物可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、急骤干燥或者转鼓式干燥来进行干燥。
本发明提供了从由可可豆制备的部分脱脂或全脱脂可可固体回收可可矢车菊苷配质和可可碱的方法。该方法包含以下步骤(a)以乙醇在约50℃～约70℃下浸提可可固体，(b)冷却乙醇浸提物，冷却温度和时间均要足以使可可碱沉淀，(c)分离沉淀的可可碱，并且(d)任选从浸提物中除去乙醇以回收干燥的可可矢车菊苷配质。可可豆优选未经过焙烤的未发酵或发酵不足的可可豆；但是，也可以采用发酵过的可可豆以及发酵并焙烤过的可可豆。
本发明也提供了最大限度地降低从部分脱脂或全脱脂可可固体浸提得到的可可矢车菊苷配质中可可碱含量的方法。该方法包含以下步骤(a)以异丙醇浸提可可固体以得到含有可可矢车菊苷配质和可可碱的醇浸提物，(b)冷却醇浸提物，冷却温度和时间均要足以使可可碱沉淀，并且(c)分离可可碱与醇浸提物。
在前述方法中，冷却在0℃～约5℃下进行最长约12小时，而分离步骤则通过过滤浸提物、离心浸提物、或者使可可碱吸收在适宜的吸收剂上来进行。


图1(b)是曲线图，其表示采用100％异丙醇作为浸提溶剂时温度0℃、20℃、50℃和70℃对单体、五聚物以及十聚物的低聚物百分回收率的影响。
图1(c)是曲线图，其表示采用100％甲醇作为浸提溶剂时温度0℃、20℃、50℃和70℃对单体、五聚物以及十聚物的低聚物百分回收率的影响。
图2是曲线图，表示丙酮和乙醇在浸提高级低聚物方面最为有效。回收率以标准丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5v/v)百分产率表示。
图3是曲线图，表示发酵和可可豆加工对采用丙酮∶水∶乙酸作为浸提溶剂时浸提得到的单体和矢车菊苷配质低聚物量的影响。结果以从未发酵可可豆获得的百分产率表示。
图4是曲线图，表示发酵和可可豆加工对采用沸水作为浸提溶剂时浸提得到的单体和矢车菊苷配质低聚物量的影响。结果以从未发酵可可豆获得的百分产率表示。
图5是从可可豆浸提多酚的方法流程示意图。
图6是流程示意图，表示使可可浸提物脱可可碱的方法。含可可碱的溶剂蒸汽通过三路阀流向冷却板左侧。液流然后切换至右侧。然后从左侧排空溶剂。打开冷凝器的左侧门并且从冷凝器板上刮掉粗的可可固体碱或者以溶剂冲洗而以液体形式回收之。在右侧重复相同的步骤。回收溶剂。
图7是曲线图，对比了通过在50℃下以乙酸乙酯浸提由未发酵可可豆制备的可可固体而制备的浸提物与随后以丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5)浸提该乙酸乙酯浸提过且干燥过的可可固体而制备的浸提物其二者的可可固体低聚物分布型。百分回收率与从未发酵可可豆获得的可可固体的丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5)浸提物进行了对比。
图8对比了采用80％乙醇∶20％水作为溶剂时从由发酵和发酵不足可可豆制备的可可固体所达到的单体和低聚物产率。
发明详述可可多酚包括可可矢车菊苷配质，其可以从各种可可属基因型通过本文以下所述方法获得。单体包括(+)儿茶素、(-)-表儿茶素以及其各自的差向异构体(即，(-)-儿茶素和(+)-表儿茶素)。可可浸提物中已经经过鉴别的矢车菊苷配质低聚物包括二聚物至十八聚物。低聚物可以是线性或支化的。线性4～8低聚物的结构如下 其中x是0-16的整数。支化低聚物具有如下结构 其中a和b独立地是0-15的整数。
通过碳氧氧化性偶合反应形成第二个界于类黄酮之间的键而形成A型低聚物，从而也可以产生矢车菊苷配质低聚物的结构变体，参见以下(“类黄酮”，J.B.Harborne主编，Chapman and Hall Ltd.，London，1988，其中的第2章，Porter等人，“Flavans和原花色素”；Porter，Methods in Plant Biochemistry，第I卷，植物性酚类，Dey和Harborne主编；Academic PressSan Diego，Ca，1989)。由于该转化反应的复杂性，A型原花色素不象单键低聚物那样经常遇到 基于其色彩，可可豆可分为四种主要棕色(全发酵)、紫色/棕色、紫色(发酵不足)以及深蓝灰色(未发酵)。用于最大限度浸提可可矢车菊苷配质的可可固体优选由未发酵或发酵不足的可可豆制备(即，深蓝灰色可可豆、紫色可可豆、深蓝灰色与紫色可可豆的混合物、紫色和棕色可可豆的混合物、或者深蓝灰色、紫色和棕色可可豆的混合物)。可可豆更优选深蓝灰色和/或紫色的。未发酵可可豆比发酵过的可可豆具有更高含量的可可多酚(Kim和Keeney，J.Food Sci.49 1090，1984；Porter等人，“可可多酚主要类黄酮以及某些次要代谢物的鉴定”，Phytochemistry，第30卷，第5号，1657-1663，1991)。
当可可豆的发酵系数小于等于275时，可可豆或其混合物的可可多酚含量比较高。“发酵系数”采用用以表征可可豆发酵度的分级系统来确定。比如，深蓝灰色可可豆指定为1、紫色可可豆为2、紫色/棕色可可豆为3而棕色可可豆为4。落入每个范围之内的可可豆百分数乘以其加权值。因此，对于某一100％棕色可可豆样品其“发酵系数”是100×4或者400，而对于100％紫色可可豆样品就是100×2或者200。50％深蓝灰色可可豆和50％紫色可可豆样品其发酵系数就是150[(50×1)+(50×2)]。
基于全脱脂可可固体的重量，未发酵或发酵不足可可豆优选含有至少1重量％的总可可矢车菊苷配质，优选3-7重量％，更优选7-12重量％，并且最优选13-17重量％。
制备适用于浸提的可可物料的方法参见美国专利5,554,645(1996年9月10日授权给Romanczyk等人)。将收割的可可豆荚剥开并且取出带果肉的可可豆以进行冷冻干燥。从冷冻干燥的物料上手工除去果肉并且将可可豆进行如下操作。首先将冷冻干燥的可可豆手工脱壳并且以TEKMAR磨机研磨成细粉状物料。然后将得到的物料通过Soxhlet浸提法采用比如再蒸馏己烷作为溶剂脱脂一整夜。在室温下经真空从脱脂的物料中除去残留的溶剂。或者，在阻滞发酵的条件下晒干可可豆并且将可可豆机械干燥然后脱壳。
通过加工可可豆或可可粒而不进行焙烤步骤，然后将可可豆研磨成巧克力液并且回收部分脱脂的可可固体，或者将焙烤过的可可豆或可可粒螺杆压榨成部分脱脂的可可固体而不进行研磨步骤，就可以获得可可多酚含量更高，即可可矢车菊苷配质含量高的部分脱脂或全脱脂可可固体。如果该方法中采用了发酵不足的可可豆，那么就可以获得甚至更高水平的矢车菊苷配质。该方法保留了可可多酚，因为它省略了常规的焙烤步骤。该方法基本上由以下步骤构成(a)将可可豆加热到刚好足以使含湿量降低到约3重量％并且使可可豆壳松脱的豆内温度，典型地采用红外加热设备进行约3～4分钟；(b)从可可壳中扬出可可粒；(c)螺杆压榨可可粒；并且(d)回收可可脂以及部分脱脂的可可固体，该可可固体含有包括可可矢车菊苷配质的可可多酚。在进行加热步骤之前可可豆任选清洗，比如在空气流化床密度分离机中。可可豆优选加热到豆内温度为约100℃～约110℃，更优选低于约105℃。扬制可以在空气流化床密度分离机中进行。前述加热可可豆以降低含湿量并且使可可壳松脱的方法参见美国专利6,015,913(2000年1月18日授权给Kealey等人)。
豆内温度(IBT)可以通过以可可豆(约80-100个可可豆)填充保温容器比如保温瓶的方式进行测量。为了在从加热装置转移至保温瓶过程中保持可可豆的温度，将保温容器进行适当密封以保持其中样品的温度。将温度计插入填充有豆的保温容器中并且相对于保温瓶中的豆平衡温度计的温度。温度计读数即豆的IBT温度。IBT也可以视为豆的平衡物料温度。
在本发明全文中，适用如下的定义。本文所用的“高级低聚物”包括矢车菊苷配质六聚物至十聚物或者更高聚物，而“低级低聚物”指的是从二聚物开始的矢车菊苷配质并且包括五聚物。本文所用的“可可浸提物”是这种浸提物，其含有从研磨可可豆，优选脱壳可可豆，通过以溶剂或溶剂水溶液打浆脱脂可可固体并且除去可可固体以回收液体浸提物而浸提得到的未指定化合物混合物。液体浸提物可以通过现有技术熟练人员已知的常规方法进行干燥。
浸提方法包含以下步骤以适当的溶剂或含水溶液打浆部分脱脂或全脱脂可可固体以增溶可可多酚、分离浸提过的可可固体与溶剂相，比如通过离心，并且任选除去溶剂。浸提方法优选是连续的方法。
所用的溶剂可以是能够增溶可可固体中存在的表儿茶素和儿茶素单体和可可矢车菊苷配质低聚物的溶剂，优选食品级溶剂。溶剂优选选自低级醇比如甲醇、乙醇和异丙醇，乙酸酯比如乙酸甲酯或乙酯，以及丙酮。溶剂可以采用水溶液或未稀释的形式。令人惊奇的是，优选的水稀释度随着所用溶剂的不同而不同。
将溶剂或溶剂水溶液的pH值酸化成约2～约4可以提高或降低矢车菊苷配质的浸提效率，取决于浸提程序中所用的溶剂。溶剂或溶剂水溶液中有或无0.5％乙酸对浸提效率有可变的影响，取决于所采用的溶剂以及溶剂浓度。浸提过程中所用的酸可以是任何非无机酸。优选的酸是食品级或生理可接受的酸比如甲酸、柠檬酸、磷酸和乙酸。如果浸提在较高的温度下进行，则不优选酸。
可可浸提物可以进行脱可可碱和脱咖啡因处理，而且这些甲基黄嘌呤可以回收和纯化。优选的溶剂根据可可碱是丢弃还是回收而有所不同。如果可可碱被丢弃，低温下最好的浸提溶剂是异丙醇。但是，如果欲回收可可碱以进行纯化，最好的溶剂是乙醇并且浸提应该在50-70℃下进行。除去甲基黄嘌呤的理想条件必须与浸提矢车菊苷配质的理想条件取得均衡，以便提供高效简便的用于制造不含可可碱的可可多酚浸提物的方法。
或者，可以采用凝胶渗透色谱法从浸提物中除去甲基黄嘌呤，参见美国专利5,554,645(1996年9月10日授权给Romanczyk等人)。简而言之，部分纯化方法采用液体色谱在Sephadex LH 20(28×2.5cm)上进行。通过向去离子水中的步骤梯度来辅助分离。起始梯度组合物从去离子水中的15％甲醇开始，然后每隔30分钟依次是去离子水中的25％甲醇、去离子水中的35％甲醇、去离子水中的70％甲醇并且最终是100％甲醇。收集咖啡因和可可碱洗脱液之后的流出物作为单一的级分，它是不含黄嘌呤生物碱的原始浸提物的细级分。
也可以通过将甲基黄嘌呤吸收到固体吸收剂上，然后从吸收剂上彻底冲洗掉基本上不含咖啡因和可可碱的浸提物，由此从可可浸提物中除去甲基黄嘌呤。在该方法中可以采用各种固体吸收剂，比如高分子树脂以及活性炭。吸收剂优选在水中基本上是中性的。中性树脂吸收剂的实例是半煅烧树脂XE-340(Rohm&Haas制造)。通过酸洗热活化的炭然后以水漂洗至中性或者以碱水中和酸活化碳然后以水漂洗至中性，就可以获得中性的活性炭。
脱脂可可固体的溶剂浸提可以采用间歇法或连续法进行，优选逆流方法。在间歇法中，需要大的溶剂与固体比以从可可固体中浸提出可可多酚。另外，一般需要几个相继的浸提步骤来浸提出所有存在的可可多酚，包括矢车菊苷配质。优选的浸提方法是连续的逆流式浸提方法。在该方法中，浸提效率和方法的成本效益得到优化，使其可以针对生产目的进行放大。利用溶剂通过可可固体的连续逆流流动就可以大大降低溶剂固体比，因为溶剂可以连续地循环。另外，由于溶剂连续流过可可固体，没有必要进行双溶剂浸提操作或者以含水溶剂洗涤固体以确保所有的矢车菊苷配质均已从可可固体中浸提出来。
如下文所述，矢车菊苷配质的浸提效率根据所用溶剂的不同而有很大差异。而且，令人惊奇地发现，某些溶剂优先浸提高级低聚物，而其他溶剂则优先浸提单体和低级低聚物。所用溶剂的类型，无论该溶剂是否是含水溶液，浸提温度以及其他因素均可以影响高或低分子量矢车菊苷配质低聚物的选择性浸提。通过以两种独立的溶剂先后对同一可可粉进行浸提，其一浸提单体和低级低聚物而另一种浸提高级低聚物，就有可能在同一浸提程序中获得独立的矢车菊苷配质级分而不必将浸提物处以复杂的分离方法以分离高级和低级低聚物。因此，本发明的进一步的实施方案是从可可固体在大规模的一步法中选择性地浸提低聚物的方法，该方法避免了色谱分离低聚物时又贵又复杂的方法。
实验程序对照浸提物在如下的实施例中，所有的溶剂浸提物均与对照浸提物进行对比，该对照浸提物是通过浸提采用实施例1部分A所述程序制备的未发酵、冷冻干燥的脱脂可可豆而制备的。所用的溶剂是70％丙酮、29.5％水和0.5％乙酸的混合物。所有的水溶液均以％(v/v)表示。以100ml该溶剂混合物打浆10g脱脂可可物料并且在50℃声波破碎5-10分钟。浆液在4℃下以3000×G离心分离15分钟并且使上层清液通过玻璃棉。粗矢车菊苷配质的产率为15-20％。
矢车菊苷配质低聚物的分离和定量在以下的实施例中，采用以下所述的分析方法来分离和按聚合度来定量可可浸提物中的单体和矢车菊苷配质低聚物。以下所述用以鉴别可可浸提物中矢车菊苷配质低聚物的方法基于HammerstoneJ.F.等人，“采用高效液相色谱/质谱鉴别可可(可可属)中的矢车菊苷配质和巧克力”，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496所报道的研究工作。采用以下所述的分析方法来定量研究据报道含有各种类型的原花色素的食品和饮料样品，参见Lazarus S.A.等人的“食品和饮料中原花色素的高效液相色谱/质谱分析”，J.Ag.FoodChem.；1999；47(9)；3693-3701。Lazarus等人(1999)的方法所报道的分析法采用了荧光检测法，因为它选择性较高并且灵敏度也较高。
样品采用Adamson G.E.等人的“定量可可和巧克力样品中的矢车菊苷配质的HPLC方法并且使之与总抗氧化能力相关”，J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)；4184-4188所报道的分析方法进行分析。然后将样品直接与对照浸提物进行对比，以便对比对照浸提物中的单体和矢车菊苷配质低聚物来精确地确定其单体和矢车菊苷配质低聚物的水平。
浸提物中矢车菊苷配质单体和低聚物的总量也可以采用Adamson等人所报道的方法确定。但是，样品与每种单体和低聚物的标准混合储液对比，而不是将样品的水平与对照浸提物进行对比，这样就可以计算出浸提物中存在的每种矢车菊苷配质的绝对量。通过Adamson等人所报道的方法可以制得单体和矢车菊苷配质低聚物的标准混合储液以及校正曲线。
实施例部分A——由冷冻干燥的可可豆制造制备脱脂可可物料的方法参见美国专利5,554,645(1996年9月10日授权给Romanczyk)。除非另有说明，所用的可可豆是未发酵的Sulawesi可可豆。按照如下方式加工之。将收割的可可豆荚剥开并且取出带果肉的可可豆以进行冷冻干燥。从冷冻干燥的物料上手工除去果肉并且将可可豆进行如下操作。首先将冷冻干燥的可可豆手工脱壳并且以TEKMAR磨机研磨成细粉状物料。然后将得到的物料通过Soxhlet浸提法采用再蒸馏己烷作为溶剂脱脂一整夜。在室温下经真空从脱脂的物料中除去残留的溶剂。
部分B——由焙烤的可可豆制备采用West African可可豆通过常规方法来制备可可粉，该方法包含以下步骤焙烤可可豆，使豆内温度为95℃～160℃，从焙烤过的可可豆中扬出可可粒、将焙烤过的可可粒研磨成巧克力液，压榨巧克力液以提取出可可脂，然后回收可可脂和部分脱脂的可可固体。可可固体可以采用己烷作为溶剂进一步脱脂，如之前部分A所述。
部分C——由未焙烤的可可豆制备通过将晒干的未发酵Sulawesi可可豆加工成可可固体而不进行可可豆或可可粒的焙烤步骤并且根据需要不进行将可可豆研磨成巧克力液的步骤，即螺杆压榨可可豆以提供可可脂和部分脱脂的可可固体，就可以获得可可多酚含量高，即可可矢车菊苷配质含量高的部分脱脂的可可固体。可可多酚得以保留，因为省略了常规的焙烤步骤。该方法包括以下步骤(a)将可可豆加热到刚好足以使含湿量降低到约3重量％并且使可可豆壳松脱的豆内温度；(b)从可可壳中扬出可可粒；(c)螺杆压榨可可粒；并且(d)回收可可脂以及部分脱脂的可可固体，该可可固体含有包括可可矢车菊苷配质的可可多酚。加热典型地在红外加热设备中进行约3～4分钟。在进行加热步骤之前可可豆任选清洗，比如在空气流化床密度分离机中。可可豆优选加热到豆内温度为约100℃～约110℃，更优选低于约105℃。扬制可以在空气流化床密度分离机中进行。前述加热可可豆以降低含湿量并且使可可壳松脱的方法参见美国专利6,015,913(2000年1月18日授权)。
采用由实施例1部分A所述的未发酵、冷冻干燥的脱脂可可豆制备的可可固体来制备浸提物。以100ml溶剂将10g脱脂可可物料在50℃下打浆5-10分钟。对于酸化的溶剂，向溶剂和含水溶剂中添加0.5％的乙酸。所用的溶剂是乙醇、甲醇、异丙醇和丙酮。溶剂与水的百分比是不同的。在室温下以3000×G离心浆液5分钟，然后使上清液通过0.45μm滤器。采用前述的分析方法来确定矢车菊苷配质的浸提量以及可可浸提物的低聚物分布型。每种低聚物的检测量表示为与采用前述对照浸提物经浸提得到的同一低聚物的量的百分比。
异丙醇异丙醇的结果表示在表1(酸化)和2(未酸化)中。
表1-酸化异丙醇
表2-未酸化异丙醇
对于含水异丙醇而言，在任何稀释度下随着低聚物尺寸的提高，所浸提的矢车菊苷配质会显著减少。80％异丙醇和20％水溶液的效率最低。50％、60％和70％异丙醇溶液对于除十聚物以外的所有低聚物都是最为有效的，100％异丙醇对十聚物最为有效。应该指出，对于单体和低级低聚物(最高五聚物)而言，50-70％异丙醇溶液的效率是80％和100％异丙醇效率的两倍以上。
结果表明，添加酸在全部水稀释度(50％、40％、30％和20％水)下均可在总体上提高低聚物的浸提。但是，向80％异丙醇中添加酸的效果是使所浸提的低级低聚物的量加倍，但却并没有显著改变所浸提的高级低聚物的量。
甲醇甲醇的结果表示在表3(酸化)和表4(未酸化)中。
表3-酸化甲醇
表4-未酸化甲醇
数据表明，在使用70％和80％甲醇时，对低级低聚物的浸提最好，而在使用100％甲醇时，会增强对高级低聚物的浸提。对于五聚物以上的低聚物，随着低聚物尺寸的增大，醇浓度越低其效率也越低。
添加酸可提高低聚物产率。但是，100％甲醇不受酸存在的影响。
丙酮丙酮的结果表示在表5(酸化)和表6(未酸化)中。
表5-酸化丙酮
表6-未酸化丙酮
对于较低的丙酮浓度(50和60％)而言，浸提效率随着低聚物尺寸的增加而提高。对于80％和100％丙酮而言，浸提效率随着低聚物尺寸的增大而降低。
乙醇的结果表示在表7(酸化)和表8(未酸化)中。
表7-酸化乙醇
表8
结果表明，乙醇好于含水乙醇并且酸化的乙醇好于未酸化的乙醇。数据也表明，在采用70％和80％乙醇时，对低级低聚物的浸提最好，而在采用100％乙醇时，对高级低聚物的浸提会增强。对于五聚物以上的低聚物，随着低聚物尺寸的增加，醇浓度越低其效率就越低。
因此，是选用100％溶剂还是选用含水溶剂混合物将取决于可可浸提物中所希望的矢车菊苷配质低聚物分布型。
进行试验来确定温度对采用甲醇、乙醇和异丙醇浸提可可矢车菊苷配质的影响。按照前述进行浸提，只是温度为0℃、20℃、50℃和70℃，甲醇除外，因为其沸点为64℃。结果表示在表9-11中。
表9-100％异丙醇
表10-100％甲醇
表11-100％乙醇
在采用100％异丙醇时，随着浸提温度的升高所有矢车菊苷配质低聚物的浸提效率均有显著提高(见图1b)。在采用100％乙醇时，直至50℃时所有低聚物的浸提效率均有提高(见图1A)。在采用100％甲醇时，温度的影响随着低聚物尺寸的不同而不同。比如，单体的产率不受温度影响，二聚物至七聚物的产率随着温度从0℃升高至20℃而有所提高；而在温度从0℃升高至20℃时，高级低聚物(八聚物～十聚物)的产率有显著提高，但在超过20℃之后，产率降低(见图1c)。
溶剂效率的总体对比见图2。为每种溶剂选择了能获得最佳矢车菊苷配质总产率的稀释度。从图中可以看出，单体与最高至七聚物的低聚物其产率的差异在各个溶剂之间并没有太大的差别。但是，对于高级低聚物而言，很清楚地看到，某些溶剂优先浸提低级低聚物，而其他溶剂则优先浸提高级低聚物。比如，异丙醇是单体和低级低聚物极其有效的溶剂，但是对于高级低聚物，其效率则显著降低。相反地，乙醇在浸提单体和低聚物时是效率最低的溶剂，但是在浸提高级低聚物时却相当有效。
如图3所示，来自发酵过的可可豆的浸提物所含的可可矢车菊苷配质比由未发酵可可豆制备的浸提物少75～100％。矢车菊苷配质的相对损失随着低聚物尺寸的增加而提高。加热可可豆来除壳(如美国专利6,015,913的方法)也会降低浸提物中的可可矢车菊苷配质水平。来自加热过的可可豆的可可浸提物所含的矢车菊苷配质低聚物水平是来自未发酵、手工脱壳可可豆的可可浸提物所含水平的10-50％。
结果表明，可可豆的发酵和随后的加工对浸提物中矢车菊苷配质含量的影响要显著高于所选溶剂类型的影响。
进行试验以对比浸提物的矢车菊苷配质量和低聚物分布型，这些浸提物是采用按照美国专利6,015,913(Kealey等人)所述程序加工过的(a)发酵过的、(b)发酵不足的以及(c)未发酵的未焙烤可可豆进行浸提时获得的。可可固体由三组可可豆通过实施例1部分A所述方法制备。每个组制备两个浸提物。第一浸提物采用丙酮/水/乙酸(70％/29.5％/0.5％)标准溶剂混合物在50℃下制备。第二浸提物采用80％乙醇和20％水的混合物作为溶剂在80℃下制备。含水乙醇浸提物中存在的每种低聚物的量表示为标准丙酮/水/乙酸浸提物中存在的低聚物量的百分比。
结果见表12。
表12
结果表明，当采用发酵过的可可豆进行浸提时，矢车菊苷配质的产率会显著降低。而且，在来自发酵可可豆的浸提物中实际上不存在高级低聚物。使用100％乙醇作为溶剂可以获得极高的九聚物和十聚物产率(相比标准溶剂的100％，九聚物为103％而低聚物为110％)。相比标准溶剂的100％，以80％乙醇进行浸提则得到低得多的产率(九聚物为37％，十聚物为18％)。
以100％乙酸乙酯在50℃下浸提1g通过实施例1所述方法从未发酵可可豆获得的可可粉三次。混合浸提物并且在真空下旋转蒸发浓缩至干。以10ml标准丙酮/水/乙酸(70％/29.5％/0.5％)溶剂再生该干浸提物、纯化并且按照之前所述分析低聚物含量。然后将乙酸乙酯浸提过的可可固体在真空烘箱中干燥过夜以除去任何残留的溶剂。以标准丙酮/水/乙酸溶剂(70％/29.5％/0.5％)在50℃下浸提该干燥的固体、纯化，然后按照之前所述分析其低聚物含量。两个浸提物的低聚物含量均表示为采用标准丙酮/水/乙酸溶剂(70％/29.5％/0.5％)在50℃下由未发酵可可豆制备的浸提物的低聚物含量的百分比。结果表示在表13中。
表13
从表13和图7可以看出，采用乙酸乙酯作为溶剂可以获得只含有单体和低级低聚物的浸提物，所有的高级低聚物都留在浸提过的可可固体中。然后采用标准丙酮/水/乙酸溶剂(70％/29.5％/0.5％)或者100％乙醇可以有效地浸提出高级低聚物。
结果表示在表14中。
表14
在采用乙醇作为溶剂时可可碱的产率最高，而在采用异丙醇作为溶剂时其产率最低。产率随着温度的升高而提高。结果表明，可可碱最易溶解于乙醇中而最不易溶解于异丙醇中，并且溶解度随着温度而提高。
为了达到可可碱最低的浸提，并且因此而有利于从浸提物中除去之，理想的浸提是采用异丙醇在最低温度下进行。由此实现矢车菊苷配质的浸提。然后通过使浸提物在约0-4℃冷却过夜而使可可碱从浸提物中沉淀出来并且通过过滤浸提物而回收之。
为了从可可豆中回收最大量的可可碱，理想的浸提是采用乙醇在50-70℃下进行。浸提之后，将乙醇浸提物冷却到0-5℃，从而沉淀出可可碱。通过过滤、接触式(contiguous)离心机离心或者吸附到中性吸收剂上随后进行洗脱，就可分离出可可碱。
优选通过使含可可碱的溶剂蒸汽输送通过处于密闭橱内的冷却板系统(如图6所示意)的方式来收集粗固体。然后从系统中排出溶剂并且回收以做进一步的利用。同时，从冷却板上刮掉粗可可碱，并且将其溶解在水溶液中。通过重结晶可可碱、干燥晶体并且将其再次溶解在去离子的二次蒸馏水中而获得纯化的药品级可可碱。
虽然就此已经详细地描述了本发明的优选实施方案，但是要知道本发明由附录的权利要求所限定而不是由之前描述中所给出的具体细节所限定，在不背离本发明精神或范围的情况下可以对这些具体细节作出许多明显的变型实施方案。
权利要求
1.从部分或全脱脂可可固体浸提可可多酚的改进方法，包含以能够增溶可可多酚的酸化溶剂浸提可可固体。
2.权利要求1的方法，其中酸化溶剂是酸化的含水溶剂。
3.从部分或全脱脂可可固体浸提包括含量提高的高级矢车菊苷配质低聚物的可可矢车菊苷配质低聚物的改进方法，包含以甲醇、乙醇或异丁醇浸提可可固体。
4.权利要求1或2的方法，其中可可多酚包括儿茶素、表儿茶素和可可矢车菊苷配质低聚物。
5.权利要求1、2或3的方法，其中可可固体由未经焙烤的可可豆制备。
6.权利要求5的方法，其中可可豆是未发酵或发酵不足的可可豆。
7.权利要求6的方法，其中发酵不足的可可豆其发酵系数为275或更低。
8.权利要求6的方法，其中可可豆是深蓝灰色可可豆、紫色可可豆或者紫棕色可可豆，或者是深蓝灰色可可豆与紫色可可豆的混合物、紫色可可豆与棕色可可豆的混合物或者深蓝灰色可可豆、紫色可可豆和棕色可可豆的混合物。
9.权利要求1或2的方法，其中溶剂被酸化至pH值约2～约4。
10.权利要求8的方法，其中酸是食用酸或者生理可接受的酸。
11.权利要求1的方法，其中有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸甲酯或乙酸乙酯。
12.权利要求2的方法，其中有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸甲酯或乙酸乙酯。
13.权利要求12的方法，其中酸化溶剂是乙醇。
14.权利要求2的方法，其中酸化的含水溶剂含有最多约50％的水。
15.权利要求2的方法，其中酸化的含水溶剂是约95％乙醇和约5％水、约50％～约70％异丙醇和约30％～约50％水，或者约80％丙酮和约20％水。
16.权利要求2的方法，其中含水溶剂是约80％异丙醇和约20％水的混合物。
17.权利要求1、2或3的方法，其中浸提在0℃至所用溶剂沸点的温度下进行。
18.权利要求1、2或3的方法，其中浸提在约20℃～约50℃下进行。
19.权利要求1、2或3的方法，其中浸提在压力下进行。
20.权利要求1的方法，其中溶剂是甲醇而浸提在室温下进行，其中溶剂是乙醇而浸提在约20℃～约50℃下进行，并且其中溶剂是异丙醇而浸提在约70℃下进行。
21.从部分或全脱脂可可固体选择性浸提低分子量可可矢车菊苷配质低聚物的方法，包含以乙酸甲酯或乙酸乙酯浸提可可固体的步骤。
22.通过权利要求21的方法获得的可可浸提物。
23.从部分脱脂或全脱脂可可固体选择性浸提较高分子量可可矢车菊苷配质低聚物的方法，包含以下步骤(a)以乙酸乙酯浸提可可固体；(b)回收浸提过的可可固体；(c)以丙酮、乙醇或其含水混合物浸提回收的可可固体；(d)分离可可固体与可可浸提物；并且(e)任选干燥可可浸提物。
24.通过权利要求23的方法获得的可可浸提物。
25.采用适于增溶可可矢车菊苷配质的溶剂或者含水溶剂从部分脱脂或全脱脂可可固体中浸提可可多酚的连续方法，其包含以下步骤(a)使一系列含有可可固体的室与按逆流方向流动的溶剂接触，(b)回收可可浸提物，并且(c)循环可可浸提物。
26.权利要求25的方法，其中可可多酚包括儿茶素、表儿茶素和可可矢车菊苷配质低聚物。
27.权利要求25的方法，其中该方法在压力下进行。
28.权利要求25的方法，其中浸提在0℃至所用溶剂沸点的温度下进行。
29.权利要求25的方法，其中溶剂是低级烷基醇、低级烷基酮或者低级烷基乙酸酯，或者含水溶剂是低级烷基醇、低级烷基酮或者低级烷基乙酸酯和最高约50％水。
30.权利要求29的方法，其中溶剂是约95％乙醇和约5％水。
31.权利要求25的方法，其中循环可可浸提物直到基本上不再有任何可可多酚从可可固体中浸提为止。
32.权利要求25的方法，其中在循环结束之后，通过闪蒸出溶剂并且通过冷冻干燥、喷雾干燥、急骤干燥或者转鼓式干燥除去浸提物中任何存在的水而干燥浸提物。
33.从由未焙烤的可可豆制备的部分脱脂或全脱脂可可固体回收可可矢车菊苷配质和可可碱的方法，包含以下步骤(a)以乙醇在约50℃～约70℃下浸提可可固体，(b)冷却乙醇浸提物，冷却温度和时间均要足以使可可碱沉淀，(c)分离沉淀的可可碱，并且(d)从浸提物中除去乙醇以回收干燥的可可矢车菊苷配质。
34.通过权利要求33的方法获得的可可浸提物。
35.最大限度地降低从由未焙烤的可可豆制备的部分脱脂或全脱脂可可固体经浸提得到的可可矢车菊苷配质中可可碱量的方法，包含以下步骤(a)以异丙醇浸提可可固体以得到含有可可矢车菊苷配质和可可碱的醇浸提物，(b)冷却醇浸提物，冷却温度和时间均要足以使可可碱沉淀，并且(c)分离可可碱与醇浸提物。
36.权利要求33或35的方法，其中冷却在0℃～约5℃下进行约1小时～约12小时并且其中分离步骤通过过滤浸提物、离心浸提物、或者使可可碱吸收在基质上的方式进行。
37.通过权利要求35的方法获得的可可浸提物。
全文摘要
通过以能增溶矢车菊苷配质的溶剂或含水溶剂浸提脱脂可可豆而制造了富含矢车菊苷配质低聚物的可可浸提物。浸提物中矢车菊苷配质的产率随着所用可可豆、所用溶剂、所用溶剂的pH值以及浸提温度的不同而不同。可优化浸提参数来提高矢车菊苷配质的产率并且实现有选择性地浸提较高或较低分子量的低聚物。优选的浸提方法是逆流式溶剂浸提方法，可可浸提物在其中循环。
文档编号A23G1/00GK1446052SQ01813914
公开日2003年10月1日 申请日期2001年6月11日 优先权日2000年6月9日
发明者J·F·小哈默斯通, M·J·基梅尔 申请人:马尔斯公司