用于同时糖化发酵的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于同时糖化发酵的方法和组合物的制作方法
相关信息本申请要求于2000年6月26日申请的题为“Synergistic Hydrolysisof Carboxymethyl Cellulose and Acid SwoUen Cellulose by TwoEndoglucanases(EGZ and EGY)(两种内切葡聚糖酶(EGZ和EGY)对羧甲基纤维素和酸胀纤维素的协同水解)”的美国临时申请号60/214,137和于2000年7月21日申请的题为“Methods and Compositions forSimultaneous Saccharification and Fermentation(用于同时糖化发酵的方法和组合物)”的美国临时申请号60/219,913的优先权，所述申请通过引用全部结合到本文中。在本说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献的内容都通过引用全部结合到本文中。
政府资助的研究本项研究部分由美国农业部(the U.S.Department of Agriculture)National Research Initiative(98-35504-6177和98-35505-6976)、美国能源部(the U.S.Department of Energy)Office of Basic Energy Science(FG02-96ER20222)和the Florida Agricultural Experiment Station，University of Florida资助。
背景技术：
通过用得自植物材料的可再生燃料替代基于石油的马达燃料，可以获得许多环境和社会利益(Lynd等，(1991)Science 2511318-1323；Olson等，(1996)Enzyme Microb.Technol.181-17；Wyman等，(1995)Amer.Chem.Soc.Symp.618272-290)。每年，美国燃烧掉超过1200亿加仑的马达燃料，大致相当于进口石油的总量。开发乙醇作为可再生的替代燃料，则具有消除美国对进口油依赖性，改善环境并提供新职业的潜力(Sheehan，(1994)ACS Symposium Series No.566，ACS Press，第1-53页)。
理论上，马达燃料进口油问题的解决方法似乎相当简单。不用石油，这是一种有限的资源，而是通过植物材料的发酵，可以有效地生产乙醇-一种可再生资源。实际上，巴西已经证明了生产乙醇并用乙醇作为主要马达燃料的可行性达20多年。同样，美国每年生产超过12亿加仑的燃料乙醇。目前，通过或者利用酿酒酵母(Saccharomycescerevosiae)或者利用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobiles(Z.mobilis))，从玉米淀粉或甘蔗糖浆生产燃料乙醇。然而，这些糖源中没有一种可以供应实现替代基于石油的马达燃料所需的量。另外，蔗糖和玉米淀粉都是相当昂贵的原料，它们有作为食品的竞争用途。
此外，这些糖底物仅代表植物中总糖类的一部分。实际上，植物中大多数糖类为木素纤维素形式，这是一种含有纤维素、半纤维素、果胶和木质素的复杂结构的聚合物。木素纤维素发现于例如植物的茎、叶、壳、苞叶(荚)和穗轴中。这些聚合物的水解，释放出中性糖包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖的混合物。没有一种已知的天然生物可以快速并有效地将所有这些糖代谢为乙醇。
尽管如此，在致力于利用这种底物源的过程中，the Gulf OilCompany开发了一种用称为同时糖化发酵(SSF)的基于酵母的方法，从纤维素生产乙醇的方法(Gauss等，(1976)U.S.P.N.3,990,944)。在单一容器中，将真菌纤维素酶制剂和酵母加入到纤维质底物的浆液中。在纤维素水解期间同时生产乙醇。然而，Gulf的SSF法有一些缺点。例如，迄今为止，真菌纤维素酶一直被认为对于大规模生物乙醇工艺而言太过昂贵(Himmel等，(1997)Amer.Chem.Soc.第2-45页；Ingram等，(1987)Appl.Envrion.Microbiol.532420-2425；Okamoto等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.42563-568；Philippidis，G.，(1994)Amer.Chem.Soc.第188-217页；Saito等，(1990)J.Ferment.Bioeng.69282-286；Sheehan，J.，(1994)Amer.Chem.Soc.第1-52页；Su等，(1993)Biotechnol.Lett.15979-984)。
发明概述用于纤维素水解的便宜酶法的开发，具有提高底物利用率以及所述糖化发酵法的经济学的重大潜力。因此，研制酶，最好是产生可以用于复合糖有效解聚和后续的所述糖快速发酵为乙醇的这类酶的生物催化剂，将具有重大利用。
某些微生物，例如菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，产生大量的水解酶和裂合酶，这些酶非常有效地降低含有复合糖的植物组织。具体地说，该生物产生两种不同的内切葡聚糖酶活性(包括EGY和EGZ)，已经发现这些酶活性当以特定量使用时，作为降解复合糖的高效酶组合物发挥作用。这些酶可以用作所需内切葡聚糖酶活性混合物的粗提物，或者最好是可以作为纯化组合物使用。
此外，可以将生物催化剂、最好是重组细菌、更优选产乙醇细菌工程化，以表达足以降解复合糖的特定量的一种或多种这些酶活性。这种生物催化剂适合于通过称为同时糖化发酵(SSF)的方法有效降解复合糖和随后发酵为乙醇。上述内切葡聚糖酶组合物或生物催化剂的一个优点是减少或不要求另外的真菌纤维素酶来降解所述复合糖。
本发明提供用于实施复合糖降解、更优选应用特定比率的内切葡聚糖酶活性来最优降解复合糖的内切葡聚糖酶活性。
另外，本发明提供工程化以供适用于降解复合糖的内切葡聚糖酶活性最优表达和分泌的重组宿主细胞。具体例举在供最优表达用的替代启动子的转录控制下表达内切葡聚糖酶的重组肠细菌埃希氏菌属(Escherichia)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。另外，也例举了在供以特定比率最优表达用的替代启动子的转录控制下表达两种不同内切葡聚糖酶celY和celZ的重组肠细菌。
本发明提供对这些宿主的进一步修饰，以包括允许所述细胞的内切葡聚糖酶的产生和/或分泌增加的一种或多种分泌型蛋白。在一个优选实施方案中，本发明提供对这些宿主的进一步修饰，以包括来源于一种有效的乙醇生产者例如运动发酵单胞菌的外源产乙醇基因。
因此，这些宿主能够表达高水平的、可以用来单独或与其它酶或重组宿主结合使用、以便从复合糖有效生产乙醇的蛋白质。
更具体地讲，在第一个方面，本发明提供一种用于降解寡糖的组合物，所述组合物包含具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶、和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
在第二个方面，本发明提供一种降解寡糖的方法，所述方法包括使寡糖与具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
在上述方面的一个实施方案中，所述寡糖与所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶的接触以任何顺序进行或者同时进行。
在上述方面的一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶、或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶来源于细胞提取物。所述细胞提取物来源于细菌细胞，例如已经被重组工程化以表达所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶，或者表达所述第一种和所述第二种内切葡聚糖酶两种酶的细菌细胞。在一个相关实施方案中，所述细菌细胞选自肠杆菌科(Enrerobacteriaceae)，最好或者是埃希氏菌属或者是克雷伯氏菌属，更优选含有一种由celZ编码的第一种内切葡聚糖酶和一种由celY编码的第二种内切葡聚糖酶，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
在上述方面的另一实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY，这两种内切葡聚糖酶的比率的范围最好为约1∶1至、更优选约9∶1至约19∶1。
在上述方面的再一实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶或所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶是经纯化的。
在上述方面的又一实施方案中，所述寡糖降解的协同因数(factor)范围为约1.1至约2.0，最好为约1.8。
在上述方面的再一实施方案中，所述组合物含有额外的一种酶，例如一种内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。
在上述方面的一个相关实施方案中，所述额外的酶为来源于真菌、最好是T.longibranchiatum的葡聚糖酶。
在上述方面的另一个相关实施方案中，所述额外的酶是一种产乙醇酶，最好是诸如丙酮酸脱羧酶或醇脱氢酶的产乙醇酶。
在上述方面的另一实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶分别包装。
在上述方面的另一实施方案中，所述组合物用于同时糖化发酵。
在上述方面的再一实施方案中，所述寡糖为纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶或其任何组合。
在上述方面的再一实施方案中，所述组合物或方法分别在水溶液中使用或进行。
在第三个方面，本发明提供一种适用于降解寡糖的重组宿主细胞，所述宿主细胞含有一种第一异源多核苷酸区段和一种第二异源多核苷酸区段，所述第一异源多核苷酸区段编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，而所述第二异源多核苷酸区段编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，并且其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和第二种两种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
在一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。在一个相关实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶来源于细胞提取物。所述细胞提取物来源于细菌细胞，例如已经被重组工程化以表达所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶的细菌细胞。在一个相关实施方案中，所述细菌细胞选自肠杆菌科，最好或者为埃希氏菌属或者为克雷伯氏菌属，更优选为大肠杆菌B、大肠杆菌DH5α或者产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
在上述方面的再一实施方案中，所述组合物含有额外的一种酶，例如一种内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。
在一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
在上述方面的一个相关实施方案中，所述额外的酶为来源于真菌、最好是T.longibranchiatum的葡聚糖酶。
在另一个相关实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
在另一个相关实施方案中，所述额外的酶是一种分泌型酶，最好是pul或out基因产物。
在上述方面的另一相关实施方案中，所述宿主细胞是产乙醇细菌细胞，例如大肠杆菌KO4(ATCC 55123)、大肠杆菌KO11(ATCC55124)、大肠杆菌KO12(ATCC 55125)和大肠杆菌LY01(ATCC＿＿)、产酸克雷伯氏菌M5A1和产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在第四个方面，本发明提供一种增强寡糖降解的方法，所述方法包括使寡糖与一种宿主细胞接触，所述宿主细胞含有一种第一异源多核苷酸区段和一种第二异源多核苷酸区段，所述第一异源多核苷酸区段编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；所述第二异源多核苷酸区段含有编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶的序列，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下。所述方法还提供所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，从而增强所述寡糖的降解。
在上述方面的一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。
在另一实施方案中，上述方法的宿主细胞是产乙醇的。
在另一实施方案中，所述方法在水溶液中进行。
在再一实施方案中，所述方法用来同时糖化发酵。
在又一实施方案中，所述方法包括降解选自以下的寡糖纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶或其任何组合。
在第五个方面，本发明提供一种制备适用于降解寡糖的重组宿主细胞的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入一种第一异源多核苷酸区段和一种第二异源多核苷酸区段，所述第一异源多核苷酸区段编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；所述第二异源多核苷酸区段含有编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶的序列，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下。所述方法还提供所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
在上述方面的一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。
在另一实施方案中，所述宿主细胞是产乙醇的。
在再一实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，并且celZ和celY来源于欧文氏菌属。
在又一实施方案中，所述第一异源多核苷酸区段或者所述第二异源多核苷酸区段、或者所述第一和第二两种多核苷酸区段的替代启动子含有一段来源于运动发酵单胞菌的多核苷酸片段。
在再一实施方案中，所述重组宿主细胞适用于同时糖化发酵，最好是产乙醇的。
在第六个方面，本发明提供一种制备重组宿主细胞整合体的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入含有pLOI2352(SEQ ID NO17)的多核苷酸序列的载体，并且鉴定稳定整合了所述载体的宿主细胞。
在第七个方面，本发明提供一种在宿主细胞中表达内切葡聚糖酶的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入含有pLOI2306(SEQ IDNO12)的多核苷酸序列的载体，并且鉴定表达所述内切葡聚糖酶的宿主细胞。
在第八个方面，本发明提供一种从寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括使所寡糖源与一种产乙醇宿主细胞接触，所述产乙醇宿主细胞含有一种第一异源多核苷酸区段和一种第二异源多核苷酸区段，所述第一异源多核苷酸区段编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；所述第二异源多核苷酸区段编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下。所述方法还提供所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，产生被降解的寡糖，所述降解的寡糖被发酵为乙醇。
在一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY基因编码，并且celZ和celY来源于欧文氏菌属。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞还含有一种编码至少一种pul基因或out基因的异源多核苷酸区段。
在再一个实施方案中，所述宿主细胞选自肠杆菌科，最好是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属，更优选是大肠杆菌KO4(ACC 55123)、大肠杆菌KO11(ATCC 55124)、大肠杆菌KO12(ATCC 55125)、LY01(ATCC＿＿)、产酸克雷伯氏菌M5A1或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在另一个实施方案中，所述方法在水溶液中进行。
在又一个实施方案中，所述寡糖选自纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶及其任何组合。
在另一个实施方案中，所述异源多核苷酸区段是pLOI 2352(SEQID NO17)，或者来源于pLOI 2352(SEQ ID NO17)。
在再一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
在另一个实施方案中，所述第一多核苷酸区段或者所述第二多核苷酸区段、或者所述第一和第二两种多核苷酸区段的替代启动子含有一段来源于运动发酵单胞菌的多核苷酸片段。
在第九个方面，本发明提供一种载体，所述载体含有下述一种质粒的多核苷酸序列或其片段pLOI2311、pLOI1620、pLOI2316、pLOI2317、pLOI2318、pLOI2319、pLOI2320、pLOI2323、pLOI2342、pLOI2348、pLOI2349、pLOI2350、pLOI2352、pLOI2353、pLOI2354、pLOI2355、pLOI2356、pLOI2357、pLOI2358或pLOI2359。
在第十个方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有具有下述一种质粒的多核苷酸序列或其片段的载体pLOI2311、pLOI1620、pLOI2316、pLOI2317、pLOI2318、pLOI2319、pLOI2320、pLOI2323、pLOI2342、pLOI2348、pLOI2349、pLOI2350、pLOI2352、pLOI2353、pLOI2354、pLOI2355、pLOI2356、pLOI2357、pLOI2358或pLOI2359。
在一个实施方案中，所述宿主是产酸克雷伯氏菌菌株P2(pCPP2006)、产酸克雷伯氏菌菌株SZ6(pCPP2006)、产酸克雷伯氏菌菌株SZ21(pCPP2006)或产酸克雷伯氏菌菌株SZ22(pCPP2006)。
在第十一个方面，本发明提供一种降解寡糖的方法，所述方法包括获得具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶、获得具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，并且使寡糖与所述第一种和第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
在第十二个方面，本发明提供一种增强寡糖降解的方法，所述方法包括使寡糖与具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，从而增强所述寡糖的降解。
在一个相关方面，本发明提供一种用于降解寡糖和/或增强寡糖降解的方法，即使寡糖与具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶对所述寡糖的降解，导致粘度改变，最好是粘度降低，更优选降低至少例如5厘泊、10厘泊、20厘泊、50厘泊、100厘泊、500厘泊或1000厘泊或更多的量，或在其范围内的量。
在一个优选实施方案中，所述寡糖为纤维素，例如非晶形纤维素或晶态纤维素，可以来源于例如纸、纸浆或植物纤维。
在第十三个方面，本发明提供一种适用于降解寡糖的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段。
在一个相关方面，所述宿主细胞通过包含一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段，适用于降低寡糖的粘度。
在一个实施方案中，所述第一异源多核苷酸区段处于一种替代启动子的转录控制之下，而所述第二异源多核苷酸区段处于一种替代启动子的转录控制之下。
在另一个实施方案中，所述细胞为细菌细胞，最好选自肠杆菌科，更优选选自埃希氏菌属或克雷伯氏菌属。
在另一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，并且celZ和celY来源于欧文氏菌属。
在另一个实施方案中，所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
在第十四个方面，本发明提供一种重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株P2(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
在第十五个方面，本发明提供一种重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ6(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
在第十六个方面，本发明提供一种重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ21(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
在第十七个方面，本发明提供一种重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ22(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
在第十八个方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段，其中所述编码第一种内切葡聚糖酶的第一多核苷酸区段或者所述编码第二种内切葡聚糖酶的第二多核苷酸区段或者这两种区段在氨基酸序列比对中与得自欧文氏菌属的celY基因产物或者celZ基因产物在共享能够降解多糖的功能活性方面足够同源。
在第十九个方面，本发明提供一种来源于本发明宿主细胞的、适用于与其接触时降解寡糖和/或降低寡糖粘度的提取物或组合物，例如分泌型多肽、裂解液或肉汤、或者纯的、半纯的或未经纯化的酶提取物或多肽。
根据以下详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点是显而易见的。
附图简述

图1显示了产乙醇重组宿主大肠杆菌KO11利用以稀酸预处理并且补充两种不同培养基的稻壳底物的发酵率。
图2显示了产乙醇重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌P2利用混合废办公用纸(office paper)的同时糖化发酵(SSF)率。得自SSF的不溶性残余物在随后的发酵期间作为结合的纤维素酶和底物的来源再循环。
图3显示了质粒pLOI2171-一种低拷贝启动子探针载体的结构，显示了用于选择的卡那霉素抗性基因(kan)、用于所述质粒的附加型维持的温度敏感型pSC101复制子(Rep(ts))、以及编码磷酸-β-葡糖苷酶(EGZ)的无启动子多糖酶基因celZ的取向。
图4是一幅图，显示出一个转化细菌菌落在CMC指示平板上测量的透明区的大小(x轴)和已表达的葡聚糖酶的量(y轴)之间高度相关。
图5显示了在pLOI2183质粒中用作替代启动子的运动发酵单胞菌DNA片段的部分核苷酸序列(SEQ ID NO1)。所述全长序列在GenBank中的登记号为AF109242(SEQ ID NO2)。指出两个转录起始位点(#)-35区和-10区、Shine-Delgarno位点(粗体)、部分载体和celZ序列(小写)、以及celZ起始密码子(以粗体显示的atg)。
图6为带有不同质粒的大肠杆菌DH5α细胞的电子显微镜照片，所述质粒即使有也表达很低水平(pUC 19；图A)、中等水平(pLOI2164；图B)和高水平(pLOI2307；图C)的葡聚糖酶，所述葡聚糖酶为位于外部细胞壁和内膜(im)之间周质内涵体(pib)的形式。所述条带代表0.1μm。
图7显示一幅示意图，详细描绘了用来构建celZ整合型载体pLOI2306的克隆策略，该载体是一种能够被导入重组宿主基因组中并且赋予所述宿主稳定的葡聚糖酶表达活性的遗传构建体。
图8是显示了celZ整合型载体pLOI2306(SEQ ID NO12)的图解，显示了得自运动发酵单胞菌的替代启动子、得自菊欧文氏菌的celZ基因、抗性标记(bla和tet)和产酸克雷伯氏菌靶序列的位置。
图9显示了EGY和EGZ协同作用的图示。根据括号中所示的计算的协同作用，将这两种酶稀释至相同的CMC酶活性(1.5IU/ml)。图A显示一幅图，描绘了酶比率对协同作用的影响。混合不同量的EGY和EGZ，以基于各种酶的作用维持恒定的预测活性(0.15IU/ml)。将分析物与CMC于35℃保温1小时，然后通过煮沸来终止。X轴上的数字表示EGZ和EGY的比率。协同作用显示在每个条带之上。图B显示一幅图，描绘了单独的和组合(9份EGZ+1份EGY)的EGZ和EGY对CMC的水解。基于单独的EGY和EGZ活性的总和，所有分析物都含有相等的总活性(0.15IU/ml)。协同作用显示在两种酶组合的每个点之上。图C显示一幅图，描绘了单独的和组合的EGZ和EGY对酸胀纤维素的水解。对于所述组合酶反应，使用9∶1的EGZ与EGY之比。基于单独的EGY和EGZ活性的总和，所有分析物都含有1.5IU/ml。协同作用显示在两种酶组合的每个点之上。
图10为得自两种复合糖-酸胀纤维素和Avicel的水解产物的薄层色谱(TLC)分析。在与酸胀纤维素和Avicel的反应中，分别使用大约1.5IU和25IU的CMC酶。Y轴的缩写G1，葡萄糖；G2，纤维二糖；G3，纤维三糖；G4，纤维四糖；以及G5，纤维五糖。泳道S，混合纤维寡糖标准；C，无酶对照；Z，EGZ；Y，EGY；以及Z+YEGZ+EGY。图A显示使用酸胀纤维素在与CMC酶(1μl上样量)温育6小时后的结果。图B显示使用酸胀纤维素在与CMC酶(2μl上样量)保温6小时后的结果。图C显示使用Avicel在与CMC酶(10μl上样量)保温48小时后的结果。
图11为显示EGZ和EGY对纤维寡糖水解的TLC分析。每个试验含有每ml大约0.07IU的CMC酶(2小时保温，35℃)。缩写S，混合纤维寡糖标准；G1，葡萄糖；G2，纤维二糖；G3，纤维三糖；G4，纤维四糖；以及G5，纤维五糖。图A显示水解之前的底物，图B显示与EGY保温后的底物，图C显示与EGZ保温后的底物，而图D显示在不同保温期(0、5、10和25)后纤维五糖的EGZ水解。
图12是说明菊欧文氏菌对非晶形纤维素利用的一种模型。使用三种葡糖苷酶来代谢非晶形纤维素。其中两种-EGY和EGZ是胞外内切葡聚糖酶，它们以协同方式一起发挥作用。EGY需要大的底物分子，并且将这些分子水解为较短的不溶性片段。EGY不水解可溶性纤维寡糖(2-5个葡糖基残基)。EGZ容易水解可溶性纤维寡糖(纤维五糖和纤维四糖)和中等长度的非晶形片段，产生纤维二糖和纤维三糖。纤维二糖和纤维三糖在细胞摄入期间被磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统磷酸化。第三种酶-磷酸-β-葡糖苷酶在细胞内完成水解。所产生的单体产物(葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸)通过糖酵解代谢。
图13图示celY的启动子-探针载体的构建。将运动发酵单胞菌染色体DNA的Sau3AI片段连接到pLOI2317的BamHI位点中，为celY编码区提供一个强的替代启动子(实心区段)。运动发酵单胞菌DNA片段(启动子1和启动子2)以空心区段显示。复制子和抗生素抗性基因以点画区段标注；其它载体DNA以细连线表示。箭头指示转录的方向。
图14描述了DH5a(pLOI2323)中celY启动子的转录起始位点和推定的启动子区。
图15图示用于CelY和CelZ将功能整合到产乙醇产酸克雷伯氏菌P2染色体中的pLOI2352的构建。celY和celZ的编码区以实心区段表示。用作启动子(启动子1和启动子2)的运动发酵单胞菌DNA片段以空心区段显示。复制子和抗生素抗性基因以点画区段标注；其它载体DNA以细连线表示。区段上的箭头指示转录的方向。小的空心箭头代表为flp重组酶所识别的FRT位点。FRT序列是非对称的，其布置允许在染色体整合之后缺失质粒DNA(复制子和选择标记)。
图16是用于通过双重同源重组使celZ失活的pLOI2357构建的图解。celY的编码区以实心区段显示。用作启动子(启动子1)的运动发酵单胞菌DNA片段以空心区段显示。复制子和抗生素抗性基因以点画区段标注；其它载体DNA以细连线表示。区段上的箭头指示转录的方向。小的空心箭头代表为flp重组酶所识别的FRT位点。
图17显示了说明纤维二糖苷利用的发酵肉汤的薄层色谱图的数字图象。左图(A)代表菌株P2(pCPP2006)，为缺乏菊欧文氏菌内切葡聚糖酶的亲代菌株，而右图(B)代表菌株SZ21(pCPP2006)，为分泌高水平CelY和CelZ内切葡聚糖酶的重组体。每个泳道点样约4μl肉汤，标记G1-G6是指相邻点中葡糖基残基的数目。两个图(A和B)的泳道从左到右1，初始(0h)；2，发酵10 h后；和3，发酵36h后。
图18显示产酸克雷伯氏菌M5A1的产乙醇衍生物从非晶形纤维素生产乙醇的量的图解。上图和中间图(A和B)中所示的结果包括得自三个重复测定的标准差；下图(C)中所示的结果代表单一发酵。上图(A)显示得自6.85g/L非晶形纤维素发酵的结果；中间图(B)显示得自15.33g/L非晶形纤维素发酵的结果；而下图(C)显示了28.96g/L非晶形纤维素发酵的结果。菌株P2(pCPP2006)是亲株，缺乏菊欧文氏菌内切葡聚糖酶基因。菌株SZ6(pCPP2006)分泌CelZ内切葡聚糖酶；菌株SZ21(pCPP2006)分泌CelY和CelZ内切葡聚糖酶；菌株SZ22(pCPP2006)分泌CelY内切葡聚糖酶。
发明详述为了使人们清楚地充分理解本发明的范围，提供以下定义。
I.定义本文所用的术语“重组宿主”意指包括适用于遗传操作的细胞，例如它们可以掺入异源多核苷酸序列，例如它们可以被转染。所述细胞可以是微生物细胞或高等真核细胞。该术语意味着包括最初被转染的细胞的子代。在优选实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，该术语意指包括肠杆菌科的所有兼性厌氧革兰氏阴性细菌细胞，例如埃希氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)、沙雷氏菌属(Serratia)、西地西菌属(Cedecea)、摩根氏菌属(Morganella)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsislla)、普罗威登斯菌属(providencia)、变形菌属(Proteus)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。特别优选的重组宿主是大肠杆菌或产酸克雷伯氏菌细胞。
术语“比率”意指包括预定组合中两种酶的量(例如根据活性测量的或者以摩尔测量的)之间的关系，其中所述比率优选不是天然存在的，更优选所述比率导致协同酶活性。
术语“具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶”和“具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶”意指分别包括根据来源(例如宿主细胞菌株，包括表达一种表达内切葡聚糖酶的克隆的天然存在的菌株或遗传修饰的菌株)，或使用本领域认可的技术(例如分子量测定或纯化表征)根据生物化学特性，其活性可以区别于具有第二种功能活性(例如根据其对特定底物的活性；与另一种酶的协同作用)的另一种内切葡聚糖酶(例如第二种内切葡聚糖酶)的内切葡聚糖酶。所述降解活性，例如对寡糖的酶促水解，也可以包括所述寡糖粘度的变化。
术语“协同作用”、“协同活性”和“协同的(synergized)”用来描述可区别多肽或多肽活性之间的相互作用，其中所述多肽结合在一起的总活性的作用大于单独活性的作用之和。所述多肽可以是例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的任何组合。多肽的活性包括对寡糖的降解(例如水解)，但也可以包括所述寡糖粘度的变化。对寡糖的协同降解因数最好约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或更优选约2.0，典型的因数约为1.8。
术语“异源多核苷酸区段”意指包括编码一种或多种对多肽或多肽的部分或片段的多核苷酸区段。异源多核苷酸区段可以来源于任何来源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成多核苷酸片段。
术语“多糖酶”、“纤维素酶”或“葡聚糖酶”在本文中可互换使用，意指包括能够催化任何连接的糖部分例如双糖、三糖、寡糖包括复合糖(complex carbohydrates)(在本文中也是指复合糖(complexsugars))降解或解聚的多肽，所述复合糖例如纤维寡糖和木素纤维素，也包括纤维素、半纤维素和果胶。该术语意指包括纤维素酶例如葡聚糖酶，最好包括内切葡聚糖酶，但也包括例如外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或这些纤维素酶的任何组合。
术语“内切葡聚糖酶”意指包括通常水解聚合底物中内部β-1，4糖苷键、而不优先水解位于该链末端的键的纤维素酶。
术语“替代启动子”意指包括可以在转录上控制并非其天然在转录上控制的感兴趣的基因的多核苷酸区段。在一个优选实施方案中，替代启动子的转录控制导致感兴趣基因表达增加。在一个优选实施方案中，一个替代启动子位于感兴趣基因的5’。可以用替代启动子取代天然启动子，或者除天然启动子外，还可以使用替代启动子。替代启动子可以相对于使用其的宿主细胞是内源的，或者它可以是被导入宿主细胞中的异源多核苷酸序列，例如相对于使用其的宿主细胞为外源的。适用于细菌的其它启动子包括例如lacZ、T7和SP6(参见例如Ausubel等，参见下文)。
术语“寡糖源”、“寡糖”、“复合纤维素”、“复合糖(complexcarbohydrate)”和复合糖(complex sugar)以及“多糖”基本上可互换使用，意指包括包含不止一种糖分子的任何糖源。这些糖可以来源于任何未经加工的植物材料或任何经加工的植物材料。实例为木材、纸、纸浆、植物来源纤维或包含不止一种连接糖部分(即一个糖残基)的合成纤维。一种特殊的寡糖源为木素纤维素，它占大多数植物材料干重的大约90％，含有糖类，例如纤维素、半纤维素、果胶和芳族聚合物例如木质素。纤维素占木素纤维素干重的30％-50％，是一种纤维二糖(葡萄糖的二聚物)的均聚物。同样，半纤维素占木素纤维素干重的20％-50％，是含有戊糖(木糖、阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖)的含乙酰和葡糖醛酸基侧链的混合物的复合聚合物。果胶占木素纤维素干重的1％-20％，是葡糖醛酸的甲基化均聚物。其它寡糖源包括羧甲基纤维素(CMC)、非晶形纤维素(例如酸胀纤维素)和纤维寡糖-纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。纤维素例如非晶形纤维素可以来源于纸或纸浆来源(包括例如其废液)或者例如农副产品，例如玉米秸、大豆可溶物质或甜菜废粕。上述糖类聚合物的任何一种或任何一种组合都是可供按照本发明的产物和方法解聚和随后通过发酵生物转化为乙醇的潜在的糖源。
术语“基因”或“多核苷酸区段”意指包括包含编码多肽的可读框、还可以包含非编码调节序列和内含子的核酸分子，例如多核苷酸。另外，该术语意指包括作图至一个功能基因座例如分别为欧文氏菌属和克雷伯氏菌属的out基因或pul基因、编码不止一种基因产物(例如分泌型多肽)的一种或多种基因。另外，该术语意指包括用于选定目的的一种特定基因。该基因可以对于宿主细胞为内源的，或者可以被重组导入所述宿主细胞中，例如作为在染色体外维持的质粒或者稳定整合到基因组中的质粒(或其片段)。在一个优选实施方案中，所述多核苷酸区段的基因参与糖生物转化为乙醇过程中的至少一个步骤。因此，该术语意指包括编码诸如以下的多肽的任何基因醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、分泌型蛋白或多糖酶，例如葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的任何组合。
术语“同时糖化发酵”或“SSF”意指包括应用一种或多种重组宿主(或其提取物，包括纯化或未经纯化的提取物)同时使复合糖降解或解聚和通过发酵将所述糖残基生物转化为乙醇。
术语“转录控制”意指包括在转录水平上调节基因表达的能力。在一个优选实施方案中，通过取代或者在感兴趣基因编码区的5’端附近添加替代启动子从而导致基因表达改变，调节转录并因此调节基因表达。在一个最优选的实施方案中，对一种或多种基因的转录控制进行工程化，以导致这类基因最佳表达，例如以所需比率的最佳表达。该术语也包括本领域众所周知的诱导型转录控制。
术语“表达”意指包括至少在mRNA产生水平上的基因表达。
术语“表达产物”意指包括已表达基因的所产生的产物，例如一种多肽。
术语“表达增加”意指包括至少在增加的mRNA产生水平上、最好在多肽表达水平上的基因表达的改变。
术语“产生增加”意指包括已表达多肽量的增加、所述多肽酶活性水平的增加或它们的组合。
术语“活性”和“酶活性”可互换使用，意指包括正常归因于所选多肽在适宜条件下产生时的任何功能活性。内切葡聚糖酶(例如EGY或EGZ)的活性例如为所述多肽使复合糖酶促解聚的能力。通常，所选多肽的活性包括与所产生的多肽相关的总酶活性。宿主细胞产生的、具有酶活性的多肽可能位于细胞的胞内空间中、可以是细胞相关多肽、可以被分泌到胞外环境中或者这些组合。用于测定与分泌活性相关的总活性的技术在本文中有描述，并且是本领域已知的。
术语“分泌的”意指包括多肽分泌到壁膜间隙中或分泌到胞外环境中(例如异源多肽，最好是多糖酶)增加。通常，所述多肽以超过天然存在的分泌量的增加的水平分泌。更优选术语“分泌的”是指与天然存在的分泌水平相比，给定多肽分泌增加至少10％，更优选至少约100％、200％、300、％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高。
术语“分泌型多肽”意指包括单独或与其它多肽结合、促进另一种多肽从细胞的胞内空间转运到胞外环境的任何多肽。在一个实施方案中，所述分泌型多肽包含足以给予革兰氏阴性宿主细胞分泌活性的所有必需的分泌型多肽。通常，分泌型蛋白在一个区或在一个基因座编码，所述一个区或一个基因座可以从一种宿主细胞中被分离出来，并用基因工程转移到另一种宿主细胞中。在一个优选实施方案中，所述分泌型多肽来源于具有分泌活性的任何细菌细胞。在一个更优选的实施方案中，所述分泌型多肽来源于具有II型分泌活性的宿主细胞。在另一个更优选的实施方案中，所述宿主细胞选自肠杆菌科。在一个最优选的实施方案中，所述分泌型多肽是分别来源于欧文氏菌属或克雷伯氏菌属的out基因或pul基因的一种或多种基因产物。此外，技术人员会认识到，也可以使用来源于与本文所述的out基因或pul基因足够同源的相关宿主的任何分泌型蛋白(Pugsley等，(1993)Microbiological Reviews 5750-108；Lindeberg等，(1996)Mol.Micro.20175-190；Lindeberg等，(1992)J.of Bacteriology 1747385-7397；He等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881079-1083)。
术语“来源于”意指包括从指定来源分离(完全或部分)多核苷酸区段或从指定来源纯化多肽。该术语意指包括例如从与指定多核苷酸源相关的序列或基于所述序列直接克隆、PCR扩增或人工合成。
术语“产乙醇的”意指包括微生物从用糖作为主要发酵产物生产乙醇的能力。该术语包括但不限于天然存在的产乙醇生物、具有天然存在的突变或诱导的突变的生物、以及已经被遗传修饰的生物。
术语“革兰氏阴性细菌”意指包括本领域公认的该术语的定义。通常，革兰氏阴性细菌包括例如肠杆菌科，其中包括埃希氏菌属和克雷伯氏菌属的菌种。
术语“足够同源”意指包括第一氨基酸序列或核苷酸序列含有足够数目或最低数目的与第二种氨基酸序列或核苷酸序列相同或等同氨基酸残基或核苷酸(例如具有相似侧链的氨基酸残基)，致使所述第一和第二氨基酸序列或核苷酸序列享有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，享有共同结构域并且在所述结构域的氨基酸序列之间具有至少约40％同源性、优选有50％同源性、更优选在所述结构域的氨基酸序列之间有60％、70％、80％或90％的同源性，并且含有至少1个、优选2个、更优选3个、甚至更优选4个、5个或6个结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文定义为足够同源。此外，至少享有40％同源性、优选有50％同源性、更优选有60％、70％、80％或90％的同源性并且享有共同功能活性的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文定义为足够同源。
在一个实施方案中，如果两种多核苷酸区段(例如启动子)由于核苷酸序列基本相同而具有基本相同的调节作用，则所述两种多核苷酸区段“足够同源”。通常，“足够同源的”序列至少在已知参与所需调节的区域中至少50％、更优选至少60％、70％、80％或90％相同。更优选不超过5个碱基不同。最优选不超过5个连续碱基不同。
为了测定两种多核苷酸区段或两种氨基酸序列的同一性百分比，将所述序列比对，以进行最佳比较(例如可以在第一和第二氨基酸序列或核酸序列中的一个或两个序列中引入空位，以进行最佳比对，而对于比较可以不理会非同源序列)。在一个优选实施方案中，用于比较的比对的参比序列的长度至少为参比序列长度的30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％或90％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中一个位置被第二序列中相应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的(在本文使用时，氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。这两个序列之间的同一性百分比随所述序列所享有的相同位置数目而变，并且考虑为进行这两个序列最佳比对而需要引入的空位数目及每个空位的长度。
两个序列之间的序列比较和同一性百分比的测定可以用数学算法来完成。在一个优选实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比利用加入到GCG软件包(可在http//www.gcg.com上得到)中GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法来测定，或者使用Blossom 62矩阵，或者使用PAM250矩阵，一个空位加权值(a gap weight)为16、14、12、10、8、6或4，而一个长度加权值(a length weight)为1、2、3、4、5或6。在另一个优选实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比利用GCG软件包(可在http//www.gcg.com上得到)中的GAP程序来测定，使用NWSgapdna.CMP矩阵，一个空位加权值为40、50、60、70或80，而一个长度加权值为1、2、3、4、5或6。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分比利用加入到ALIGN程序(version 2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS，411-17(1989))来测定，使用PAM120加权残基表，一个空位长度罚分(a gaplength penalty)为12，而一个空位罚分(a gap penalty)为4。
本发明的多核苷酸序列和氨基酸序列还可以用作“查询序列”，以在公共数据库中进行搜索，从而例如鉴定其它家族成员或相关序列，例如启动子序列。这类搜索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序来进行，分值(score)＝100，字长(wordlength)＝12，以获得与本发明多核苷酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，分值＝50，字长＝3，以获得与本发明多肽分子同源的氨基酸序列。为了获得引入空位的序列比对以进行比较，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述应用Gapped BLAST。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
II.内切葡聚糖酶之间的协同作用本发明至少部分基于下述的发现多种内切葡聚糖酶协同降解复合糖。本发明也部分基于产乙醇宿主细胞(例如产酸克雷伯氏菌P2)的两种内切葡聚糖酶(例如EGY和EGZ)的功能整合和表达，实现对寡糖(例如晶态纤维素)的协同降解并且通过同时糖化发酵(SSF)增加乙醇的产量。
在一个实施方案中，一种内切葡聚糖酶来源于菊欧文氏菌，是内切葡聚糖酶EGZ，由celZ基因编码(Boyer等，(1987)Eur.J.Biochem.162311-316)。在另一个实施方案中，一种内切葡聚糖酶来源于菊欧文氏菌，为内切葡聚糖酶EGY，由celY基因编码(Guiseppi等，(1991)Gene 106109-114)。菊欧文氏菌EGY和EGZ是在降解羧甲基纤维素(CMC)方面具有高活性的内切葡聚糖酶，分别属于IV型和II型分泌类(Hueck等(1998)Micro and Mol Biol Rev 62379-433)。EGY和EGZ在底物范围方面有所不同，在CMC和非晶形纤维素水解期间协同起作用，表明最适纤维素酶活性潜在需要两种酶。具体地说，EGZ水解纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、非晶形纤维素和CMC。EGY水解聚合底物为约10个葡糖基残基的产物。
在另一个实施方案中，所述内切葡聚糖酶(例如EGY和EGZ)分别经过纯化，并且以足以使寡糖底物协同降解发生的比率混合，这可以用本文公开的测定来测量。这些测定允许测定例如两种给定葡聚糖酶(例如内切葡聚糖酶)之间的比率并使其优化。通常，所述比率的范围为约9∶1至约19∶1。在一个实施方案中，EGZ与EGY之比可以为约9∶1或19∶1。在一个优选实施方案中，用与用菊欧文氏菌以及用SZ21产生的的相似的高EGZEGY比率，观察到最佳协同作用，所述SZ21是一种表达celY和celZ的产酸克雷伯氏菌重组体(参见实施例4)。
在再一实施方案中，所述内切葡聚糖酶可以同时与所述寡糖底物混合。在再一实施方案中，所述内切葡聚糖酶可以顺序加入到所述寡糖底物中。在一个优选实施方案中，在加入EGY，并将EGY活性热失活后，顺序加入EGZ至所述底物中。实施例3详细描述了各种比率的内切葡聚糖酶(例如EGY和EGZ)的协同作用、顺序加入内切葡聚糖酶(例如EGY和EGZ)的协同作用(参见表12)以及各种底物浓度(参见表11)和温育时间对所述内切葡聚糖酶协同活性的影响。
在再一实施方案中，对所述寡糖协同降解的因数约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0，更优选因数约为1.8。根据观察到的降解除以根据单独的EGY和单独的EGZ预测的作用之和，计算所述协同因数(Riedel等(1997)FEMS Microbiol.Lett.147239-243)。在一个实施方案中，所述内切葡聚糖酶是EGY和EGZ。预测的单独的EGY的作用约为总活性的10％，而预测的单独的EGZ的作用约为总活性的90％。
在本发明的另一方面，至少一种所述内切葡聚糖酶来源于细胞提取物。所述细胞可以被重组工程化，以产生至少一种内切葡聚糖酶。在一个优选实施方案中，所述细胞被重组工程化，以产生两种内切葡聚糖酶(例如EGY和EGZ)。例如，所述细胞可以是细菌细胞。所述重组细胞包含至少一种异源多核苷酸区段，或者优选包含两种或更多种异源多核苷酸区段，所述异源多核苷酸区段编码在一种或多种异源替代启动子的转录控制之下的多肽。所述异源多核苷酸和替代启动子可以基于质粒，或者被整合到所述生物的基因组中(如实施例中所述)。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞用作所需多肽的来源，以供用于将复合糖生物转化为乙醇或其中用于其中一个步骤中。在另一优选实施方案中，所述异源多核苷酸区段编码以高于该宿主中天然存在的水平表达的一种或多种内切葡聚糖酶(例如EGY或EGZ)。在一个实施方案中，所述内切葡聚糖酶分别从不同重组细胞中纯化，随后被混合以协同降解一种底物(例如寡糖)。在另一个实施方案中，一种重组宿主细胞可以同时产生两种或更多种内切葡聚糖酶，并且可以协同作用，以降解一种底物。
在本发明的另一方面，所述重组细菌宿主细胞是一种产乙醇细菌，例如产酸克雷伯氏菌P2，这是M5Al(Wood等(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)的一种产乙醇衍生物。在一个实施方案中，所述重组产乙醇细菌含有编码至少一种内切葡聚糖酶(例如EGY或EGZ)的至少一种异源多核苷酸区段(例如来源于欧文氏菌属的celY或celZ)。在一个优选实施方案中，所述重组产乙醇细菌含有不止一种编码内切葡聚糖酶的异源多核苷酸区段。例如，如实施例4中详细描述的，产乙醇菌株产酸克雷伯氏菌P2可以同时功能整合、表达和分泌celY和celZ，以从寡糖底物(例如晶态纤维素)生产乙醇。
在另一个实施方案中，所述重组宿主是一种革兰氏阴性细菌。在再一实施方案中，所述重组宿主来源肠杆菌科。例如，U.S.P.N.5,821,093(通过引用结合到本文中)的产乙醇宿主是合适的宿主，尤其包括大肠杆菌菌株KO4(ATCC 55123)、KO11(ATCC 55124)和KO12(ATCC 55125)以及产酸克雷伯氏菌菌株P2(ATCC 55307)。或者，可以通过导入例如得自有效乙醇生产者如运动发酵单胞菌的产乙醇基因，将本发明的非产乙醇宿主转变为产乙醇宿主(例如上述菌株)。采用标准技术的该类型基因工程产生能够将糖有效发酵为乙醇的重组宿主。另外，可以如已公开的PCT国际申请WO 98/45425中所述，使用LY01乙醇耐受菌株，该公开的专利申请通过引用结合到本文中(也参见例如Yomano等(1998)J.of Ind.Micrp.& Bio.20132-138)。
在另一优选实施方案中，本发明利用非产乙醇重组宿主，例如大肠杆菌菌株B、大肠杆菌菌株DH5α或产酸克雷伯氏菌菌株M5A1。运用本文所述的技术，可以用这些菌株来表达至少一种所需多肽，例如内切葡聚糖酶。另外，这些重组宿主可以与表达再一种所需多肽例如一种不同的内切葡聚糖酶的另一重组宿主结合使用。例如，可以将一种生产EGZ的重组宿主与一种生产EGY的重组宿主混合，以产生协同作用。另外，所述非产乙醇宿主细胞可以与产乙醇宿主细胞结合使用。例如，在应用例如用来使复合糖协同解聚的非产乙醇宿主之后，应用可供使所述经解聚的糖发酵的产乙醇宿主。因此，人们会认识到，应用例如非产乙醇和产乙醇重组宿主的均一培养物或混合培养物，可以使这些反应顺序进行或者同时进行。
在一个优选实施方案中，用于将糖底物发酵为乙醇的一种或多种基因在一种质粒上提供，或者被整合到宿主染色体中。更优选使用人工操纵子例如如U.S.P.N.5,821,093(该文献通过引用结合到本文中)中所述的PET操纵子，将糖底物发酵为乙醇的基因例如丙酮酸脱羧酶基因(例如pdc)和/或醇脱氢酶基因(例如adh)导入到本发明的宿主中。实际上，人们会认识到，本发明结合本领域已知的技术，提供了用于将多种基因导入到一种合适的宿主中的技术和载体(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley & Sons(1992)，Sambrook，J.等，Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)和Bergey′s Manual of DeterminativeBacteriology，Kreig等，Williams和Wilkins(1984)，所述文献通过引用结合到本文中)。
因此，使用本发明的方法，一种遗传构建体可以编码用于进行同时糖化发酵(SSF)的所有必需基因产物(例如葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、分泌型蛋白、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶)。例如，实施例4详细描述了产乙醇产酸克雷伯氏菌产生的细菌纤维素酶EGY和EGZ和添加的商业纤维素酶(Spezyme)对晶态纤维素(Sigmacelkl 50)的同时糖化发酵(SSF)。产乙醇产酸克雷伯氏菌产生的内切葡聚糖酶和商业纤维素酶(Spezyme)协同作用，增加从晶态纤维素(Sigmacell 50)生产乙醇(7％-22％)。所述有益效应几乎仅归因于EGY，尽管EGY的活性与EGZ相比要低。表达EGY的产乙醇产酸克雷伯氏菌菌株SZ22的活性几乎等同于表达EGY和EGZ两种活性的产乙醇产酸克雷伯氏菌菌株SZ21的活性。仅表达EGZ的产酸克雷伯氏菌菌株SZ6显示出从每升生产超过20,000 U内切葡聚糖酶获益很少。
在一个实施方案中，协同作用降解寡糖的两种内切葡聚糖酶的组合物也包括至少一种额外的酶活性。这种额外的活性可以是选自以下的葡聚糖酶活性内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。在另一实施方案中，这种额外的酶活性可以得自真菌，例如T.longibranchiatum。诸如T.longibranchiatum的真菌产生多种内切葡聚糖酶活性，推定所述活性在晶态纤维素水解期间与外切葡聚糖酶一起作用(Nidetzky等(1995)Synergistic interaction of cellulases fromTrichoderma reesei during cellulose degradation 第90-112页。在J.N.Saddler和M.E.Himmel(编著)Enzymatic degradation of insolublecarbohydrates ACS symposium series 618，American Chemical Society，Washington，D.C.；Tomme等(1995)Adv.Microbiol.Physiol.371-81；Woodward，J.(1991)Bioresource Technol.3667-75)。
与EGZ相反，EGY并不水解可溶性纤维二糖苷，而是优先作用于较长链的底物，产生可以用作外切葡聚糖酶活性新位点的末端。在没有加入真菌纤维素酶的情况下，EGY和EGZ协同作用，降解非晶形纤维素。实际上，木素纤维素性底物，被真菌和细菌共生体所产生的胞外酶混合物解聚。因此，菊欧文氏菌的酶和得自真菌T.reesei的酶的混合物可以在生物转化为乙醇期间改进木素纤维素性底物的消化。
人们也会认识到，可以用本领域已知的方法对重组宿主进一步操作，以使其在任何内源基因(例如重组酶基因)具有可能干扰所导入基因的稳定性、表达、功能和分泌的突变。此外，人们也会认识到，本发明意指包括与本文所述元件、基因或基因产物足够同源的任何调节元件、基因或基因产物即多肽。
为了有效地降解寡糖，最好使所述葡聚糖酶(例如EGY或EGZ)分泌到胞外环境中。因此，在本发明的另一实施方案中，已经将宿主细胞工程化，以表达有利于所需多肽从细胞中输出的分泌型蛋白。在一个实施方案中，所述一种或多种分泌型蛋白来源于革兰氏阴性细菌细胞，例如来自肠杆菌科的细胞。在另一实施方案中，所述分泌型蛋白得自欧文氏菌属，并且由out基因编码。在另一实施方案中，所述分泌型蛋白是来源于克雷伯氏菌属的pul基因。如果宿主细胞是肠细胞，例如具有细胞壁的革兰氏阴性细菌，则一种或多种这些分泌型蛋白的导入是尤为理想的。本发明的代表性革兰氏阴性宿主细胞得自肠杆菌科，包括例如埃希氏菌属和克雷伯氏菌属。在一个实施方案中，将一种或多种分泌型蛋白导入宿主中，导致与天然存在的分泌水平相比，所选蛋白(例如葡聚糖酶)的分泌增加。最好是，与天然存在的分泌水平相比，所述分泌的增加至少为约10％，更优选约为100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高。在一个优选实施方案中，分泌基因的添加，允许葡聚糖酶多肽以更高水平产生。在一个优选实施方案中，分泌基因的添加，允许所述葡聚糖酶多肽以更高的酶活性产生。在一个最优选的实施方案中，所述葡聚糖酶以更高水平和更高的酶活性产生。优选观察到葡聚糖酶活性增加至少约10％，更优选观察到约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。最优选与无分泌基因的细胞(例如或者缺乏分泌基因或者不以足够水平表达分泌基因的细胞)相比，达到葡聚糖酶活性增加数倍，例如约200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。在实施例中更详细地描述了用于导入这类基因和测量所需多肽例如葡聚糖酶的增加的输出的技术和方法。其它等同方法是本领域技术人员已知的。
EGY和EGZ通过不同机制分泌。如实施例4中所述，当在质粒(pCPP2006)上加入菊欧文氏菌out基因时，所产生的约70％的EGZ作为胞外产物分泌，符合II型分泌系统(Hueck，C.J.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62379-433)。在有或无所述out基因时，一半的EGY活性被分泌，符合IV型分泌系统(Hueck，C.J.参见上文)。
用于筛选具有所导入基因(例如内切葡聚糖酶编码基因，诸如celY和celZ以及醇脱氢酶基因)的菌株的方法是常规方法，通过可以鉴定表达或者醇脱氢酶(ADH)或者葡聚糖酶(例如EGZ或EGY)基因产物的细胞的目测筛选可以简化所述筛选方法。ADH基因产物产生乙醛，乙醛与对玫瑰苯胺的无色磺酸衍生物(leucosulfonic acid derivative)反应，产生一种亮红色产物。因此，ADH阳性克隆可以作为血红色菌落而容易地被筛选和鉴定出来。用于筛选多糖酶活性(例如内切葡聚糖酶，例如EGZ或EGY)的方法也引起如下在实施例中描述的明显可见的表型。
用于筛选两种内切葡聚糖酶之间协同作用的方法在实施例中有详细的描述。EGY和EGZ可以分别从用含有celY基因或celZ基因的质粒转化的重组宿主细胞中纯化。可以用无细胞培养肉汤来测定胞外内切葡聚糖酶活性。含有通过超声处理破碎的细胞的肉汤可以用来测定总活性。可以通过薄层色谱法分析纤维寡糖的水解。另外，可以通过分析样品的还原糖，在体外测定用CMC作为底物的内切葡聚糖酶活性。用3，5-二硝基水杨酸试剂与葡萄糖作为标准，可以测定还原糖。以所观测到的活性除以根据单独的EGY(10％)加上单独的EGZ(90％)预测的作用之和，计算协同作用。
或者，可以用含有两种内切葡聚糖酶的质粒转化重组宿主细胞，以同时产生两种内切葡聚糖酶。可以如上所述测定协同作用。可以进行同时糖化发酵(SSF)，以观察从底物生产乙醇的情况(如实施例4中所述)。在加入商业纤维素酶的SSF实验中，两种含有至少一种菊欧文氏菌内切葡聚糖酶的产酸克雷伯氏菌重组体，产生比缺乏菊欧文氏菌内切葡聚糖酶的亲代产酸克雷伯氏菌更多的乙醇。采用约1/3所加入量的商业纤维素酶(500 FPU/g纤维素相对于重组酵母的18 FPU/g纤维素)，这两种菌株也产生水平相当于最佳酵母SSF实验(Cho等(1999)J.Microbiol.Biotechnol.9340-345)的乙醇。
表达例如PET操纵子的重组细菌，通常在液体培养基中生长至高于未经修饰的亲代生物的细胞密度，因为产生中性发酵产物，而不是酸性发酵产物(Ingram等，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54397-404)。在平板上，产乙醇克隆作为大的看来更像酵母的隆起菌落而容易清楚可见。这些性状在构建新菌株期间一直是非常有用的，可以提供新构建体功效的初步指示。通过测试在乙醛指示平板(Conway等，(1987)J.Bacteriol.1692591-2597)上红色斑点产生的速度，也可以进行产乙醇潜力的快速评价。通常，证明在糖转化为乙醇方面有效的菌株，可以根据在转移的数分钟内在乙醛指示平板上红色斑点的产生来识别。
在本发明的一个最优选的实施方案中，单一的宿主细胞是产乙醇的，即具有或者天然存在的或者人工导入或增强(例如使用得自不同菌种或菌株的替代启动子和/或基因)的所有必需基因，因此所述宿主细胞具有产生和分泌两种葡聚糖酶、最好是内切葡聚糖酶、更优选至少两种内切葡聚糖酶的能力，足以降解复合糖并将经降解的糖发酵为乙醇。因此，这样一种宿主适用于同时糖化发酵。
此外，本发明考虑到，天然大肠杆菌发酵途径产生酸性产物和中性产物的混合物(为了丰富(in order of abundance))乳酸、氢+二氧化碳(得自甲酸)、乙酸、乙醇和琥珀酸。然而，运动发酵单胞菌PDC(丙酮酸脱羧酶)对于丙酮酸的Km低于任何竞争性大肠杆菌酶对丙酮酸的Km。通过表达高活性的PDC，将碳流有效地从乳酸和乙酰-CoA重新导向乙酰乙醛和乙醇。少量的琥珀酸可以通过缺失延胡索酸还原酶基因(frd)(Ingram等，(1991)U.S.P.N，5,000,000；Ohta等，(1991)Appl.Environ.Microbiol.57893-900)来消除。可以进行另外的突变(例如在pfl基因中或在ldh基因中)，以完全消除其它竞争性途径(Ingram等，(1991)U.S.P.N，5,000,000)。也可以引入、选择或者从特定背景中挑选除去可能危害所导入基因(或者基于质粒的或者整合到基因组中的)的稳定性的酶(例如重组酶，诸如recA)的其它突变。
另外，对于本领域技术人员而言应该显而易见的是，本发明赋予的将编码一种蛋白质或整个代谢途径的基因转化到一个可操作构建体中的能力是极其有用的。在该方面设想的是，例如将本发明应用于其中将得自不同基因座的基因置于染色体上的各种各样的场合。这可以是在单一启动子控制之下的多顺反子盒，或者可以使用不同的启动子。
产乙醇并且适用于按照本发明的方法进一步改进的示例性的大肠杆菌菌株包括例如KO4、KO11和KO12菌株以及LY01菌株-大肠杆菌菌株KO11的一种乙醇耐受突变体。理想的是，这些菌株可以来源于对环境逆境的适应性强的菌株-大肠杆菌菌株ATCC 11303，可以将这些菌株工程化，以成为产乙醇菌株，并且分泌多糖酶。另外，最近的PCR研究已经证实，ATCC 11303菌株缺乏所有已知与大肠杆菌致病性相关的基因(Kuhnert等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63703-709)。
可供按照本发明方法改进的另一种优选的产乙醇宿主是大肠杆菌KO11菌株，该菌株能够发酵得自许多不同的木素纤维素性材料和其它底物的半纤维素水解产物(Asghari等，(1996)J.Ind.Microbiol.1642-47；Barbosa等，(1992)Current Microbiol.28279-282；Beall等，(1991)Biotechnol.Bioeng 38296-303；Beall等，(1992)Biotechnol.Lett.14857-862；Hahn-Hagerdal等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.4162-72；Moniruzzaman等，(1996)Biotechnol.Lett.18955-990；Moniruzzaman等，(1998)Biotechnol.Lett.20943-947；Grohmann等，(1994)Biotechnol.Lett.16281-286；Guimaraes等，(1992)Biotechnol.Bioeng.4041-45；Guimaraes等，(1992)Biotechnol.Lett.14415-420；Moniruzzaman等，(1997)J.Bacteriol.1791880-1886)。在图1中，显示了该菌株的生物转化动力学。特别是，该菌株能够将得自稻壳的半纤维素水解产物(它含有58.5g/L戊糖和37g/L的己糖)快速发酵为乙醇(Moniruzzaman等，(1998)Biotechnol.Lett.20943-947)。已经注意到，该菌株能够在48-72小时内、在理想的条件下在24小时内将半纤维素水解产物完全发酵。
本发明的另一种优选的宿主细胞是细菌克雷伯氏菌属。特别是优选产酸克雷伯氏菌，因为同大肠杆菌一样，这种肠细菌具有代谢单体糖(为更复杂糖的组分)的天然能力。此外，产酸克雷伯氏菌的附加优点是能够转运并代谢纤维二糖和纤维三糖，这是纤维素酶促水解的可溶性中间产物(Lai等，(1996)Appl.Environ.Microbiol.63355-363；Moniruzzaman等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.634633-4637；Wood等，(1992)Appl.Environ.Microbool.582103-2110)。本发明提供产酸克雷伯氏菌的基因工程产乙醇衍生物，例如具有在PET操纵子(如本文所述和在U.S.P.N.5,821,093；Wood等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110中所述)内编码的运动发酵单胞菌pdc基因和adhB基因的菌株M5A1。
因此，所得的生物-菌株P2，从单体糖以及从各种各样的糖类包括棉子糖、水苏糖、蔗糖、纤维二糖、纤维三糖、木二糖、木三糖、麦芽糖等有效地生产乙醇(Burchhardt等，(1992)Appl.Envrion.Microbiol.581128-1133；Moniruzzaman等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.634633-4637；Moniruzzaman等，(1997)J.Bacteriol.1791880-1886；Wood等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)。可以按照本发明的方法对这些菌株作进一步修饰，以使其表达和分泌一种或多种多糖酶(例如内切葡聚糖酶)。因此，该菌株适用于在SSF法(Doran等，(1993)Biotechnol.Progress.9533-538；Doran等，(1994)Biotechnol.Bioeng 44240-247；Wood等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)中复合糖的生物转化。特别是，应用这种产乙醇P2菌株消除对添加补充纤维二糖酶的需要，而这是商业真菌纤维素酶中的稳定性最低的组分(Grohmann，(1994)Biotechnol.Lett.16281-286)。
适用于异源基因表达的启动子的筛选尽管在一个实施方案中，本发明的替代启动子用来改进异源基因例如多糖酶(例如一种内切葡聚糖酶)的表达，但人们会认识到，本发明也提供适用于增强任何合适基因产物的表达的替代启动子的筛选。一般而言，所述筛选方法利用实施例1中描述和在图3中描绘的克隆载体，该载体允许候选启动子片段方便地连接和有效连接于一种报道基因。在一个实施方案中，编码葡聚糖酶的celZ基因用作便利的报道基因，因为当带有所述质粒的细胞在特殊培养基(CMC平板)上生长时，由于该酶(葡聚糖酶)的表达导致强比色变化。因此，候选启动子例如特定的启动子序列或者可以以“鸟枪法”克隆和有效连接于所述载体的随机序列，可以被导入到宿主细胞中，根据CMC平板上表型葡聚糖酶介导的比色变化表明的基因表达增加，目测筛选所得的菌落。然后，加工具有所需表型的菌落，以产生转化DNA，并用合适的引物对所述启动子测序(有关更详细的细节，参见实施例1)。
在CMC平板上葡聚糖酶介导的比色变化和所述酶表达水平之间的高度相关性是候选启动子强度的出色的指示(图4)。因而，本发明的方法提供一种用于将候选替代启动子强度分级的快速目测试验。因此，根据特定基因产物需要的所需表达水平，可以用该测定选择特定的已鉴定的替代启动子。例如，如果仅仅需要最高表达水平，则可以选择产生最大比色变化的候选启动子。如果需要较低水平的表达，例如因为计划的待表达产物在高水平时有毒性或者必需以与另一种产物相同的水平表达，则可以鉴定、选择较弱的替代启动子，并且按照所描述的方法使用。
用内切葡聚糖酶指示平板测定，质粒pLOI2311含有在lac启动子控制下的celY编码区，pLOI2316被鉴定为定向以从lac启动子表达celY的克隆。用lac启动子取代天然启动子，增加了带有该质粒的重组大肠杆菌的celY的表达。另外，为了将与异源基因在工业菌株例如产乙醇产酸克雷伯氏菌P2菌株中表达相关的问题减至最小，用功能测定，从运动发酵单胞菌DNA的随机片段中分离出不受调节的启动子。采用这种方法，构建了含有运动发酵单胞菌Sau3A1片段作为异源片段的质粒(pLOI2323)(参见实施例4以及图13和14)。另外，带有质粒pLOI1620的大肠杆菌产生高水平的EGZ。有关质粒构建和异源启动子选择的更为详细的细节，参见实施例3和实施例4
实施例4描述了具有替代启动子的celY、celZ整合型载体(pLOI2352)的构建(参见图15)。为了确保该质粒的稳定性，将杂种基因整合到染色体中，并且用FLP重组酶系统(Martinez-Morales等(1999)J.Bacteriol.1817143-7148)促进进一步的基因修饰，使用于构建的抗生素抗性标记缺失。
III.应用方法复合糖的降解或解聚在一个实施方案中，用本发明的宿主细胞来使复合糖例如木素纤维素或寡糖降解或解聚为更小的糖部分。为了完成这一步，本发明的宿主细胞最好表达一种或多种多糖酶，例如内切葡聚糖酶，诸如EGY和EGZ，并且这些多糖酶可以从生产者生物中天然释放出来。或者，通过物理破碎所述细胞，从生产者细胞中释放出所述多糖酶。用于机械(例如剪切、超声处理)、酶促(例如溶菌酶)或化学破碎细胞的各种方法是本领域已知的，可以使用这些方法中的任一种。一旦从内部细胞空间释放出所需的多肽，则可以用它来将复合糖底物降解为更小的糖部分，以供随后生物转化为乙醇。所释放的多糖酶可以用本领域已知的标准生物化学技术来纯化。或者，所释放的多糖酶不必从其它细胞组分中纯化或分离，而可以直接用于所述糖底物。
因此，技术人员会认识到，可以根据其活性选择一种或多种多糖酶，并且可以配制在降解复合糖方面具有优化活性、最好是协同活性的组合物。所述组合物可以采用例如未经纯化、半纯化或经纯化的内切葡聚糖酶活性形式，将其与一种或多种内切葡聚糖酶活性混合，其混合比率提供复合糖的最佳降解。另一方面，可以根据使用说明，分别配制每种酶活性，即以优选的顺序和/或比率混合或应用，以便达到复合糖的最佳降解。
在另一个实施方案中，使用共表达一种或多种多糖酶和一种分泌型蛋白的宿主细胞，使得所述多糖酶被分泌到生长培养基中。这消除了上述必须从宿主细胞中释放多糖酶的步骤。当使用这种类型的宿主时，所述宿主可以直接用于含有寡糖的水溶液中。
在另一个实施方案中，一种本发明的宿主细胞被设计为表达不止一种多糖酶，或者将其与表达一种不同多糖酶的另一种宿主混合，其混合比率足以使寡糖的协同降解发生。例如，一种宿主细胞可以表达一种异源内切葡聚糖酶(例如EGY)，而另一种宿主细胞可以表达另一种内切葡聚糖酶(例如EGZ)，可以将这些细胞混合，形成在寡糖降解方面具有协同活性的不均一培养物。或者，在一个优选实施方案中，将一种宿主菌株工程化，使其产生所有上述多糖酶。在任一种情况下，产生具有高表达所需多糖酶的重组宿主的培养物，以供应用于寡糖。如果需要，可以将这种混合物与另外一种纤维素酶例如外源纤维素酶(诸如真菌纤维素酶)混合。然后用这种混合物来降解复合底物。或者，在添加复合糖底物之前，采用标准生物化学技术从细胞和/或培养基中纯化出所述多糖酶，将其作为纯酶源用于使糖底物解聚。
技术人员会认识到，本发明的产乙醇细菌菌株是用于生产重组蛋白的优良宿主，因为在厌氧条件下(例如在无氧的情况下)，蛋白质不当折叠(例如由于不当的二硫键形成)的机会很少。因此，本发明的宿主和培养条件潜在导致生物活性产物的回收率更高。
复合糖的发酵在本发明的一个优选实施方案中，具有上述特性的宿主细胞也是产乙醇的。因此，这样一种宿主细胞可以用来使复合糖协同降解或解聚为单糖。随后，所述细胞可以通过发酵将所述单糖分解代谢为乙醇。这种同时复合糖解聚为更小的糖残基然后进行发酵的方法，被称为同时糖化发酵(SSF)。
通常，选择提供有利于所述生产者宿主细胞菌株最佳生长动力学以及所述培养物产生的所述酶催化条件的最适pH和最适温度的发酵条件(Doran等，(1993)Biotechnol.Progress.9533-538)。例如对于克雷伯氏菌属例如所述P2菌株而言，最适条件测定为35-37℃和pH5.0-pH5.4。在这些条件下，甚至外源加入的真菌内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶也相当稳定，并且在长时间内持续发挥作用。其它条件在实施例中有论述。此外，技术人员会认识到，为了优化本发明的给定发酵反应，仅需要采用本领域已知的技术进行常规实验。
目前，复合糖例如木素纤维素的转化是一个非常复杂的多步骤过程。例如，必须首先用酸解来使木素纤维素降解或解聚。然后进行以下步骤将液体与固体分离，随后洗涤这些产物并将其解毒，以产生可以被进一步解聚(使用添加的纤维素酶)的纤维素，最后用合适的产乙醇宿主细胞发酵。相比之下，玉米的发酵要简单得多，因为可以用淀粉酶来分解玉米淀粉，以供用基本为一步的方法用产乙醇宿主进行直接生物转化。
因此，技术人员会认识到，本发明的重组宿主和方法提供了应用同样更为简单和更有效的方法来发酵木素纤维素。例如，本发明的方法意指包括完全避免酸解的方法。此外，本发明的宿主具有以下优点1)有效的戊糖和己糖共发酵；2)抗毒性；3)产生可供用于复合糖解聚的酶；和4)环境适应性强。因此，使木素纤维素解聚的复杂性可以采用本发明的改良生物催化剂来简化。实际上，在本发明的一个优选实施方案中，所述反应可以在单一的反应容器中在无酸解的情况下进行，例如作为SSF法进行。
可供生物转化为乙醇的潜在底物本发明的一个优点是利用迄今为止利用不足的糖源的能力。因而，可以用许多复合糖底物作为用本发明的宿主细胞和方法进行解聚和随后发酵的原料来源。理想的是，在所述SSF法中可以使用一种可再循环资源。混合的废办公用纸是一种优选的底物(Brooks等，(1995)Biotechnol.Progress.11619-625；Ingram等，(1995)U.S.P.N.5,424,202)，并且其消化比酸预处理的甘蔗渣(Doran等，(1994)Biotech.Bioeng.44240-247)或高纯化的晶态纤维素(Doran等(1993)Biotechnol.Progress.9533-538)要容易地多。葡聚糖酶-内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，都含有一种纤维素结合结构域，通过利用离心收集未经消化的纤维素残余物可以容易地将这些酶再循环用于随后的发酵(Brooks等，(1995)Biotechnol.Progress.11619-625)。通过添加这种残余物与结合酶作为引子，乙醇的产量(每单位底物)增至超过理论产量的80％，同时真菌酶用量降低60％(图2)。这些方法用纯化的纤维素可很好地运作，尽管用较高木质素含量的底物，可使多个再循环步骤受到限制。在本发明范围内的其它底物来源包括任何类型的经加工或未经加工的植物材料，例如剪草机剪下的草料(lawn clippings)、壳、穗轴、茎、叶、纤维、纸浆(粕)、大麻纤维、锯末、报纸等。
本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应解释为是限制性的。
实施例1制备适用于将寡糖发酵为乙醇的重组埃希氏菌属宿主的方法在该实施例中，描述了用于开发和应用适用于将寡糖发酵为乙醇的埃希氏菌属宿主的方法。具体地说，鉴定可以用来增强多糖酶(例如葡聚糖酶)表达的强启动子。另外，使用得自菊欧文氏菌的基因来促进多糖酶分泌，从而消除了对细胞破碎以释放所需多糖酶活性的需要。
在整个该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法生物和培养条件在以下表1中列出了用于该实施例的细菌菌株和质粒。
关于质粒构建，使用宿主细胞大肠杆菌DH5α。所用的编码多糖酶(例如葡聚糖酶)的特定基因是得自菊欧文氏菌P86021的celZ基因(Beall，(1995)Ph.D.Dissertation，University of Florida；Wood等，(1997)Biotech.Bioeng 55547-555)。用来改进分泌的特定基因是得自菊欧文氏菌EC16的out基因(He等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.881079-1083)。
通常，让宿主细胞培养物在Luria-Bertani肉汤(LB)(10g L-1Difco胰蛋白胨、5g L-1Difco酵母膏、5g L-1氯化钠)中或Luria琼脂(补充15g L-1琼脂的LB)上生长。为了筛选具有葡聚糖酶celZ活性(EGZ)的宿主细胞，使用CMC平板(含有羧甲基纤维素(3g L-1)的Luria琼脂平板)(Wood等，(1988)Methods in Enzymology 16087-112)。合适时，加入抗生素氨苄青霉素(50mg L-1)、壮观霉素(100g L-1)、卡那霉素(50g L-1)至培养基中，以供选择含有抗性标记的重组宿主或整合型宿主细胞。让含有具有温度条件型pSC101复制子(Posfai等，(1997)J.Bacteriol.1794426-4428)的质粒的构建体于30℃生长，除非另有说明，让具有基于pUC的质粒的构建体于37℃生长。
表1. 所用的菌株和质粒
遗传方法对于所有的质粒构建，使用标准技术(Ausubel等，(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.；.Sambrook等，(1989)Molecular cloningLa laboratory manual，2nd ed.C.S.H.L.，ColdSpring Harbor，N.Y)。为了进行小规模质粒分离，进行TeLT法。对于大规模质粒分离，使用PromegaWizard试剂盒。为了从胶凝中分离DNA片段，使用Qiagen的QiaquickGel Extraction试剂盒。为了从大肠杆菌和运动发酵单胞菌中分离染色体DNA，使用Cutting和Yomano的方法(Cutting等，(1990)，Genetic analysis，第61-74页，载于Molecular biological methods for Bacillus，John Wiley & Sons，Inc.；Yomano等，(1993)J.Bacteriol.1753926-3933)。
为了分离本文描述的两种糖酵解基因启动子(例如gap和eno)，用得自大肠杆菌DH5α的经纯化的染色体DNA作为模板，以供采用以下引物对PCR(聚合酶链式反应)扩增这些核酸gap启动子，5′-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3′(SEQ ID NO3)和5′-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3′(SEQ ID NO4)；eno启动子，5′-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3′(SEQ IDNO5)和5′-CAGGATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3′(SEQ IDNO6)。用pRK2013进行带动转移，将编码得自菊欧文氏菌(PCPP2006)分泌型蛋白的out基因接合到大肠杆菌中(Figurski等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.761648-1652；Murata等，(1990)J.Bacteririol.1722970-2978)。
为了测定感兴趣的各种DNA的序列，在LI-COR 4000-L型DNA测序仪上进行用荧光引物的双脱氧测序法。用T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO7))，以一个方向对基于pST76-K的质粒测序。用或者正向引物(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′(SEQ ID NO8))或者反向引物(5′-TAACAATTTCACACAGGA-3′(SEQ ID NO9))，以两个方向对基于pUC18和基于pUC19的质粒测序。用Perkin Elmer GeneAmpPCR 9600和SequiTherm Long-Read Sequencing Kit-LC进行所述测序法的延伸反应。所得的序列随后用Wisconsin Genetic Computer Group(GCG)软件包(Devereux等，(1984)Nucleic Acids Rev.12387-395)分析。
为了确定上述启动子中转录起始的起始点，用标准技术进行引物延伸分析。具体地说，通过用一种在用Qiagen RNeasy试剂盒从晚期对数期细胞分离的celZ基因RNA中发现相应物的引物，对转录起始位点作图，鉴定启动子区。简而言之，用含有0.2M蔗糖的溶菌酶(400μg/ml)的TE溶液(Tris-HCI，EDTA)处理细胞，于25℃温育5分钟，然后裂解。所释放的RNA经过乙醇沉淀，随后溶于20μl PromegaAMV逆转录酶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM spermadine，10mM DTT)中。然后加入一种得自LI-Cor Inc.的IRD41-标记引物(5′-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3′(SEQ ID NO10))，让样品于80℃变性5分钟，于55℃退火1小时，然后通过乙醇沉淀来纯化。将退火的样品溶于19μl含有500μMdNTPs和10单位AMV逆转录酶的AMV逆转录酶缓冲液中，然后温育进行延伸(42℃1小时)。产物用0.5μg/ml无DNA酶的RNA酶A处理，沉淀，溶于加样缓冲液中，然后与采用LI-COR 4000-L型DNA测序仪获得的平行双脱氧启动子序列比较。
多糖酶活性为了测定由于celZ基因表达产生的多糖酶活性(例如葡聚糖酶活性)的量，使用刚果红法(Wood等，(1988)Methods in Enzymology 16087-112)。具体地说，将所选克隆转移至有网格的CMC平板上，于30℃温育18小时，然后染色，表达葡聚糖酶的重组宿主细胞在红色背景下形成黄色区带。因此，这些显色区带的直径记录为celZ表达的相对测量结果。
也用羧甲基纤维素作为底物测量葡聚糖酶活性(EGZ)。在该试验中，在含有羧甲基纤维素(20g L-1)的50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.2)中于35℃分析适当稀释的无细胞培养肉汤(胞外活性)和含有用超声处理的细胞的肉汤(总活性)。3-4ml样品的最适酶释放的条件测定为用细胞破碎器(W-220F型，Heat System-Ultrasonics Inc.，Plainview，NY)在最大功率下4个脉冲，每个脉冲1秒。为了终止该测定的酶反应，在沸水浴中加热样品达10分钟。为了测量所述葡聚糖酶酶促释放的还原糖，使用二硝基水杨酸试剂，用葡萄糖作为标准(Wood等，(1988)Methods inEnzymology 16087-112)。酶活性(IU)的量以每分钟释放的还原糖的μmol数或者以得自两次或更多次测定的平均值的总活性百分比来表示。
超微结构分析为了测定各种重组宿主细胞的超微结构，制备得自Luria琼脂平板的新鲜菌落，以便通过在含2％戊二醛的0.2M二甲基胂酸钠缓冲液(pH7)中固定、然后于1％四氧化锇中温育、然后在含1％醋酸双氧铀的蒸馏水中温育，进行分析。使样品在乙醇中脱水、包埋在Spurr′s塑料中，制备超薄切片，并用ZeissEM-IOCA电子显微镜(Spur(1969)J.Ultrastruct.Res.2631)检查。
用celZ作为报道基因构建低拷贝启动子探针载体为了便于分离强启动子，构建具有一个pSC 101复制子和一个紧接无启动子celZ基因的BamHI位点的低拷贝载体(pL012171)。因此，该无启动子质粒用作阴性对照。用质粒pLOI1620作为celZ来源，这是一种从连续的lac和celZ启动子表达的pUC18衍生物。通过消化和Klenow处理，消除该质粒的BamHI位点(pLOI2164)。celZ基因在Klenow处理后作为无启动子NdeI片段分离。所得的平端片段用HindIII消化，以除去下游的DNA，将其连接到pUC19(HindIII至HincII)，产生pLOI2170。在该质粒中，celZ以与lacZ转录方向的相反方向取向，并且仅为弱表达。然后将得自pLOI2170含有celZ的BamHI(氨基端)-SphI(羧基端)片段克隆到具有温度敏感型复制子的低拷贝载体pST76-K的相应位点，产生pLOI2171(图3)。在该载体中celZ的表达极其低，有助于其用作候选强启动子的探针。
来自两种大肠杆菌糖酵解启动子(gap和eno)的celZ表达的分析检查在大肠杆菌中驱动糖酵解基因(gap和eno)的两种示例性启动子驱动编码葡聚糖酶的异源celZ基因表达的能力。用得自大肠杆菌DH5α的染色体DNA作为模板，通过聚合酶链式反应扩增gap和eno启动子区。所得的每种约400bp的片段用EcoRI和BamHI消化，克隆到pLOI2171中无启动子celZ基因之前的相应位点中，产生pLOI2174(gap启动子)和pLOI2175(eno启动子)。作为对照，将得自pLOI2164含有完整celZ基因和天然菊欧文氏菌启动子的EcoRI-SphI片段克隆到pST76-K的相应位点，产生pLOI2173。将这三种质粒转化到大肠杆菌菌株B和DH5α中，比较葡聚糖酶活性(EGZ)。至于两种大肠杆菌菌株，在CMC平板上，具有大肠杆菌糖酵解启动子的葡聚糖酶活性低于具有含天然菊欧文氏菌启动子的pLOI2173的活性(表2)。假定的活性与每个区带半径的平方相关(Fick的扩散法则)，用糖酵解启动子(pLOI2174和pLOI2175)的EGZ产量估计为比天然启动子构建体(pLOI2373)中低33％-65％。因此，调查用于驱动高水平celZ基因表达的其它候选启动子。
适合用作异源基因表达的启动子的随机DNA片段的鉴定和克隆得自运动发酵单胞菌的随机片段可以作为供在大肠杆菌中高水平表达异源基因用的替代启动子的有效来源(Conway等，(1987)J.Bacteriol.1692327-2335；Ingram等，(1988)Appl.Environ.Micro.54397-404)。因此，为了鉴定供欧文氏菌属celZ表达用的替代启动子，运动发酵单胞菌染色体DNA用Sau3AI充分消化，将所得的片段连接到pLOI2171的BamHI位点，然后转化到大肠杆菌DH5α中，产生一个潜在的候选启动子文库。为了快速鉴定能够在大肠杆菌中驱动celZ基因表达的优良候选启动子，使用以下生物筛选。将用具有不同随机候选启动子的celZ质粒转化的菌落，转移到有网格的CMC平板上，在温育后染色以检查葡聚糖酶活性(表2)。在所测试的18,000个克隆中约20％是CMC阳性。用另一种菌株-大肠杆菌B，检查所产生的区带大于对照pLOI2173的75个克隆。
表2.用CMC指示平板评估对于celZ在大肠杆菌表达的启动子强度。
a具有指定活性范围的克隆数。
b得自三个CMC消化区带直径的平均大小。
cR2x是试验质粒的透明区带半径的平方；R2C是对照(pLOI2173)的透明区带半径的平方。
因此，在两种不同菌株中证实了所选候选启动子的启动子强度，一般而言，DH5α的重组体比菌株B的重组体产生更大的区带(例如更多的葡聚糖酶)。然而，在每种宿主中的相对启动子强度对于大多数克隆而言是相似的。基于通过这些用CMC平板根据区带大小测量的葡聚糖酶产生的分析，4个克隆看来表达以约6倍于具有原始菊欧文氏菌celZ基因的构建体(pLOI2173)的水平、以及10倍于大肠杆菌糖酵解启动子的水平表达celZ。因此，选择这些同样强的候选启动子供进一步研究用。
葡聚糖酶的产生和分泌从上述筛选(参见组I和组II(表2))中选择8个pST76-K的质粒衍生物(pLOI2177至pLOI2184)，分析其在大肠杆菌菌株B中的总葡聚糖酶活性(表3)。也证实在CMC平板上产生最大区带的4种质粒具有最高的葡聚糖酶活性(pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182和pLOI2183)。所述活性约6倍于未经修饰的celZ(pLOI2173)的活性，与我们根据CMC平板上透明区带的半径平方估计的非常一致。图4显示了得自在加入和未加入编码分泌型蛋白的out基因的情况下CMC平板和含有各种各样不同启动子的菌株B的体外酶测定的活性估计的比较。虽然有一些分散，但直接关联是显而易见的，验证了用于估计相对活性的平板法。也包括高拷贝质粒pUC18中的原始构建体以供比较用(pLOI2164)。具有连续lac和celZ启动子的该构建体产生的EGZ活性低于三种具有替代启动子的低拷贝质粒(pLOI2177、pLOI2182和pLOI2183)的活性。因此，为了再增强葡聚糖酶的celZ表达，从pLOI2183中分离出含有celZ和最有效的替代启动子的DNA片段(作为EcoRI-SphI片段)，将其插入到pUC19中，其转录方向与lac启动子的方向相反(pLOI2307)。因此，上述经鉴定的强替代启动子当加入到高拷贝质粒中时，再将葡聚糖酶活性增强2倍。
工程化增强的葡聚糖酶的分泌为了在上述结果上进一步改进，以便增强celZ编码的葡聚糖酶的表达，将上述宿主细胞工程化，以便增加分泌。用得自菊欧文氏菌EC16的编码分泌型蛋白的基因(例如out基因)，利用He等描述的含有out基因的质粒(pCPP2006)(He等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.881079-1083)，改善所述葡聚糖酶的输出。研究在大肠杆菌B中EGZ分泌的增加，结果示于表3中。
表3.供在大肠杆菌B中产生和分泌EGZ用的启动子的比较
a质粒pLOI2173和pLOI2164含有celZ天然启动子；pLOI2307含有得自pLOI2183的强启动子。
质粒pLOI2164和pLOI2307是基于pUC的质粒(高拷贝数)。所有其它的质粒都是pST76-K的衍生物(低拷贝数)。
b葡聚糖酶活性在于30℃生长16小时后测定。
c胞外活性(分泌的或释放的)。
在未加入异源分泌型蛋白(由质粒pCPP2006编码的out蛋白)的情况下，具有低拷贝质粒的重组宿主在胞外仅产生总EGZ的7-17％(在生长16小时后)。使用高拷贝基于pUC的质粒，在宿主细胞周围的胞外肉汤中，发现比使用含有相同启动子的低拷贝基于pST76的质粒所发现的更大比率(fraction)的EGZ(20-28％)。然而，在两种情况下，加入编码分泌型蛋白的out基因(例如pCPP2006)将表达的总水平增加至多2倍，将胞外酶的比率(38-74％)提高约4倍。具有由强替代启动子驱动的编码celZ的pLOI2307和编码out分泌型蛋白的pCPP2006两者的菌株B，产生最高活性，总葡聚糖酶为13,000IU/L，其中在无细胞上清液中发现7,800IU/L。
据报道，在某些条件下(pH7，37℃)，纯EGZ酶的比活为419IU(Py等，(1991)Protein Engineering 4325-333)，已经测定，在这些条件下产生的EGZ比在上述条件下(pH5.2柠檬酸缓冲液，35℃)的活性高25％。因此，假定在pH5.2(35℃)下纯酶的比活为316IU，则大肠杆菌B(含有pLOI2307和pCPP2006，例如编码葡聚糖酶和分泌型蛋白的质粒)的培养物每升产生约41mg活性EGZ，或者宿主细胞总蛋白的4-6％是活性葡聚糖酶。
得自运动发酵单胞菌的最强启动子的序列分析测定了4个最强替代启动子(pLLOI2177、pLOI2180、pLOI2182和pLOI2183)的序列。为了简化这种方法，将每种启动子在PstI位点与pUC19融合。所得的质粒pLOI2196、pLOI2197、pLOI2198和pLOI2199以高拷贝数(ColEI复制子)产生，并且可以用M13和T7测序引物以两种方向测序。所有4种质粒都含有相同的运动发酵单胞菌DNA片段，并且是姊妹构建体。每种质粒长1417bp，并且含有4个内部Sau3AI位点。将每个片段的DNA序列和翻译的蛋白质序列(6个读框)与目前的数据库比较。仅一个片段(281bp的内部片段)在BLAST搜索(Nationa1Center for Biotechnology Information；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中显示出一个强匹配，并且该片段在DNA序列中与运动发酵单胞菌hpnB基因的部分有99％相同，据认为hpnB基因在胞外被膜生物合成中起作用(Reipen等，(1995)Microbiology 141155-161)。引物延伸分析揭示出一个位于与celZ的Sau3AI/BsmHI接点上游67bp的单一主要起始位点、和一个更远上游的第二个次要起始位点(图5)。将-10和-35区内的序列与大肠杆菌σ因子的保守序列(Wang等，(1989)J.Bacteriol.1805626-5631；Wise等，(1996)J.Bacteriol.1782785-2793)比较。主要启动子区(约总起始位点的85％)看来与σ70启动子相似，而所述第二个启动子位点类似σ38启动子。
产生葡聚糖酶的重组宿主细胞的显微镜分析用光学显微镜在重组体和亲代生物之间观察到细胞形态上几乎没有差异。然而，在电子显微镜下，小的极性内涵体在表达大量葡聚糖酶的菌株B(pLOI2164)的周质中清楚可见，推测这些内涵体含有EGZ(图6)。在产生2倍葡聚糖酶活性的菌株B(pLOI2307)中，所述内涵体甚至更大，占总细胞体积的至多20％。这些极性内涵体的尺寸大，提示葡聚糖酶活性的测量结果可能低估了总EGZ产量。通常，极性内涵体在也具有编码out分泌型蛋白的构建体的宿主细胞中较小，所述分泌型蛋白使得蛋白质从壁膜间隙分泌增加。正如所预期的，在不产生葡聚糖酶的阴性对照菌株B(pUC19)中，没有明显见到周质内涵体。
实施例2适用于将寡糖发酵为乙醇的重组克雷伯氏菌属宿主在该实施例中，描述了适合用作将寡糖解聚并发酵为乙醇的生物催化剂的重组克雷伯氏菌属宿主。
在整个该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法细菌、质粒和培养条件在以下表4中总结了用于该实施例部分的菌株和质粒。
表4. 所用的菌株和质粒
用于培养大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌M5A1的培养条件通常使用Luria-Bertani肉汤(LB)，每升含有10g Difco胰蛋白胨、5g酵母膏和5g氯化钠，或者使用Luria琼脂(补充15g琼脂的LB)(Sambrook等，(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual，C.S.H.L.，ColdSpring Harbor，N.Y.)。
为了在选择性条件下筛选细菌菌落，用CMC平板(含有3g L-1羧甲基纤维素的Luria琼脂平板)来测定给定细菌菌株表达的葡聚糖酶活性的水平(Wood等(1988)Enzymology，16087-112)。为了培养产乙醇菌株，加入葡萄糖至固体培养基(20g L-1)和肉汤(50g L-1)中。在测定葡聚糖酶活性时，生长培养基中的葡萄糖用非还原糖-山梨醇(50g L-1)取代。为了培养制备供通过电穿孔导入核酸用的各种菌株或培养物，使用改良的SOC培养基(例如20g L-1Difco胰蛋白胨、5g L-1Difco酵母膏、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2和50g L-1葡萄糖)。适当加入抗生素氨苄青霉素(50mg L-1)、壮观霉素(100mg L-1)、卡那霉素(50mg L-1)、四环素(6或12mg L-1)和氯霉素(40、200或600mg L-1)，以便选择带有抗生素抗性标记的重组宿主。除非另有说明，培养物于37℃生长。产乙醇菌株和含有带有温度敏感型pSC101复制子的质粒的菌株于30℃下生长。
遗传方法至于质粒的构建、克隆和转化，使用标准方法和大肠杆菌DH5α宿主(Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology.JohnWiley & Sons，Inc.；Sambrook等，(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，C.S.H.L.，Cold Spring Harbor，N.Y.)。celZ整合型载体pLOI2306的构建如图7中所示进行。用Bio-Rad基因脉冲仪(GenePulser)，使用以下条件，将缺乏得自pLOI2306的复制子的环状DNA片段(参见图7)电穿孔到产乙醇产酸克雷伯氏菌P2中2.5kV和25μF，测量时间常数为3.8-4.0msec(Comaduran等(1998)Biotechnol.Lett.20489-493)。用pRK2013带动转移，将菊欧文氏菌EC 16分泌系统(pCP2006)接合到产酸克雷伯氏菌中(Murata等(1990)J.Bacteriol.1722970-2978)。小规模和大规模质粒分离分别采用TELT法和PromegaWizard试剂盒进行。用得自Qiagen(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)的QiaquicKGel Extraction试剂盒，从凝胶中分离DNA片段。如Cutting和Yomano所述，分离得自产酸克雷伯氏菌M5A1和运动发酵单胞菌CP4的染色体DNA(参见实施例1)。感兴趣的DNA用LI-COR 4000-L型DNA测序仪测序(Wood等(1997)Biotech.Bioeng.55547-555)。celZ的染色体整合使用两种方法进行celZ的染色体整合，采用先前描述的用于大肠杆菌的方法(Hamilton等，(1989)J.Bacteriol.1714617-4622)和缺乏功能复制子的环状DNA片段直接整合，用温度条件型质粒(pLOI2183)进行选择。这种相同方法用来将编码所述乙醇途径的运动发酵单胞菌基因整合到大肠杆菌B(Ohta K等，(1991)Appl.Environ.Microbiol.57893-900)和产酸克雷伯氏菌M5A1(Wood等(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)的染色体中。通常，用Bio-Rad基因脉冲仪将环状DNA通过电穿孔转化到P2中。接着，在含有四环素(6mg L-1)的固体培养基上选择转化子，并让其在CMC平板上生长，以测定葡聚糖酶活性水平。
葡聚糖酶活性通过如实施例1中所述，通过染色CMC平板，评估由于不同试验启动子控制下的celZ基因产物(即葡聚糖酶)表达而产生的葡聚糖酶活性。这种比色测定产生指示葡聚糖酶活性的黄色区带，用所述区带的直径作为celZ多肽表达的相对测量结果。用羧甲基纤维素作为底物(20g L-1，溶于50mM柠檬酸缓冲液，pH5.2)，进一步评估表现出最大黄色区带的克隆于35℃的葡聚糖酶活性(Wood等(1988)Methods inEnzymology 16087-112)。为了测量胞内葡聚糖酶的量，通过用超声处理4秒(W-290F型细胞破碎仪，Heat System-Ultrasonics Inc.，Plainview，NY)，从培养物中释放酶活性。测量所表达的葡聚糖酶活性的量，所述量在本文中以每分钟释放的还原糖的μnol数(IU)表示。如Wood所述(Wood等(1988)Methods in Enzymology 16087-112)，使用葡萄糖标准，测量还原糖。
底物解聚为了进一步测定各种宿主细胞产生的葡聚糖酶活性的量，将不同糖类底物(20g L-1，悬浮于50mM柠檬酸缓冲液，pH5.2)与各种细胞提取物一起温育。在一个实施例中，如Wood所述(Wood等(1988)Methodsin Enzymology 16087-112)，制备包含酸胀纤维素和球磨纤维素(ball-milled cellulose)的试验底物。通过在补充一种非还原糖山梨醇的LB中于30℃培养宿主细胞16小时，制备典型的多糖酶提取物(即得自产酸克雷伯氏菌SZ6(pCPP2006)的EGZ(葡聚糖酶))。加入无细胞肉汤的稀释液至底物中，于35℃温育16小时。加入几滴氯仿，以防止温育期间意外污染物生长。在温育之前和之后取出样品，通过DNS法(参见Wood等(1988)Methods in enzymology16087-112)测量还原糖。通过将所述聚合物中存在的计算的总糖残基除以还原末端数，评估聚合程度(DP)。
发酵条件在含有补充50g L-1糖的100ml Luria肉汤的250ml烧瓶中进行发酵。分别将试验糖类灭菌，在冷却后加入。为了将底物变化减至最小，酸胀纤维素、球磨纤维素和木聚糖不经高压灭菌。加入抗生素氯霉素(200mg L-1)，以防止污染生物生长。向烧瓶中接种(10％v/v)24-h肉汤培养物(50g L-1葡萄糖)，然后在搅动(100rpm)下于35℃温育24-96h。为了监测培养物，每日取样，以通过气相色谱法测定乙醇浓度(Dombek等(1986)Appl.Environ.Microbiol.52975-981)。
分离和鉴定替代启动子的方法为了鉴定可能用作可供用于在克雷伯氏菌属和其它宿主细胞中表达异源基因的替代启动子的运动发酵单胞菌的随机片段，如实施例1中所述，构建用于有效克隆候选启动子的载体(也参见Ingram等(1988)Appl.Environ.Microbiol.54397-404)。
接着，将经Sau3AI消化的运动发酵单胞菌DNA片段连接到pLOI2171的BamHI位点，产生一个潜在启动子的文库。将这些质粒转化到大肠杆菌DH5α中，共初步筛选用。在于CMC平板上分别测试的18,000个克隆中，75个克隆产生比对照(pLOI2173)大的黄色区带。然后将得自这75个克隆的质粒转化到产酸克雷伯氏菌M5A1中，再测试，发现在这第二种宿主中表达高水平的celZ。用于生产多糖酶的重组克雷伯氏菌属宿主让在指示celZ表达的CMC平板上具有最大区带的高表达克隆(PLOI2177至pLOI2194)在LB肉汤中生长，并分析其葡聚糖酶活性(表5)。
表5.供在产酸克雷伯氏菌M5A1中celZ表达和分泌用的启动子的评估
apLOI2173含有具有原始启动子的celZ基因，所有其它质粒含有具有用作替代启动子的运动发酵单胞菌DNA片段的celZ基因。
b葡聚糖酶(CMC酶)活性在于30℃生长16小时后测定。
用这些质粒获得的活性为用含有天然celZ启动子的对照质粒(pLOI2173)所获得的活性的至多8倍。产生最大区带的4种质粒(pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182和pLOI2183)也产生最高的总葡聚糖酶活性(约30,000IUL-1)。选择其中一种质粒pLOI2183进行染色体整合。
多糖酶基因的染色体整合为了将所需的多糖酶基因稳定加入到合适的宿主细胞例如克雷伯氏菌P2菌株中，构建了一种新载体(pLOI2306)，以便于分离缺乏所有复制功能、但含有具有替代启动子的celZ基因、一个选择标记和一段供整合用的异源DNA片段的DNA片段(图7)。通过将一个接头(GGCGCGCC；SEQ ID NO11)插入到Klenow处理的连接多接头区的NdeI和SapI位点，将两个AscI位点加入到pUC19中，产生pLOI2302。将含有得自pBR322的tet抗性标记基因的平端片段(用EcoRI和AvaI切下，然后用Klenow处理)克隆到pLOI2302的PstI位点(用PstI切割，然后用Klenow处理)，产生pLOI2303。向pLOI2303的SmaI位点连接一个产酸克雷伯氏菌M5A1染色体DNA的平端片段(用EcoRI切割，并用Klenow处理制成平端)，产生(pLOI2305)。将含有替代运动发酵单胞菌启动子和得自pLOI2183的celZ基因的EcoRI-SphI片段(Klenow处理的)，连接到pLOI2305的EcoRI位点(EcoRI、Klenow处理)，产生pLOI2306。用AscI消化pLOI2306产生两个片段，其中较大的片段含有具有替代启动子的celZ基因、tet基因和用于同源重组的染色体DNA片段。该较大的片段(10kbp)通过琼脂糖凝胶电泳纯化，通过自连接环化，将其电穿孔到克雷伯氏菌菌株P2中，随后在四环素抗性选择下生长。纯化所得的21个四环素抗性菌落，然后在CMC平板上测试其葡聚糖酶活性。所有菌落均为阳性，具有指示celZ基因产物功能性表达的大的区带。
通过用质粒DNA制备物转化DH5α和凝胶电泳，测试用来产生所述重组菌株的克隆的不想要的质粒的存在情况。所测试的12个克隆没有获得转化子。然而，随后发现这些菌株中的两个菌株含有可能含有celZ的大的质粒条带，弃去这些菌株。具有大质粒的两个菌株含有可以用T7和M13引物测序证实存在多拷贝质粒的DNA。其余10个菌株含有整合型celZ基因，并且不能用任一种引物测序。
新载体pLOI2306的结构特征图示于图8中，所述载体的核苷酸序列、包括各种编码区(即基因celZ、bla和tet)，示于序列表中的SEQID NO12。代表celZ基因下游非编码序列(得自菊欧文氏菌)的核苷酸碱基对3282-4281、以及代表得自产酸克雷伯氏菌M5A1的非编码靶序列一部分的碱基对9476-11544有待用标准技术测序(例如描述于Sambrook，J.等，T.Molecular CloningA Laboratozy Manual.2nd，ed，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1989)；Currennt Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley & Sons(1992))。例如，提供pLOI2306质粒中上述未经测序区任一侧的足够的侧翼序列，使得可以合成对应于这些已知序列的测序引物，并用所述引物，用pLOI2306质粒作为模板进行标准测序反应。
另一方面，技术人员会认识到，甚至在无用作模板的pLOI2306质粒的情况下，也可以确定这些未测序区。例如，通过用本文提供的序列(例如SEQ ID NO12的核苷酸1452-2735)合成探针和引物，以便分别从包含菊欧文氏菌序列的文库中分离出含celZ的克隆以及用标准DNA测序反应对所分离的克隆测序，可以测定其余的celZ序列。同样，可以采用本文提供的序列(例如SEQ ID NO12的核苷酸8426-9475)合成探针和引物，以便分别包含产酸克雷伯氏菌M5A1 EcoRI片段(例如具有合适大小的片段)的文库中分离出含有靶序列的克隆、以及用标准DNA测序反应对所分离的克隆测序(产酸克雷伯氏菌M5A1的来源可以是例如用标准技术使其无任何质粒的ATCC 68564)，可以测定其余的靶序列。技术人员会进一步认识到，制备代表细菌cDNA序列或基因组序列的文库和从这种文库(例如cDNA文库或基因组文库)中分离所需核酸片段是本领域众所周知的，通常用例如杂交技术或聚合酶链式反应(PCR)来进行，所有这些技术是本领域的标准技术(参见例如Sambrook，J.等，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley & Sons(1992)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编著1984)；和PCR Handbook Current Protocols in Nucleic AcidChemistry，Beaucage编著，John Wiley & Sons(1999)(Editor))。采用替代启动子和整合型构建体或基于质粒的构建体的异源基因表达调查了10个整合型菌株(SZ1-SZ10)在LB山梨醇肉汤中的葡聚糖酶产量(表6)。所有菌株都产生5,000-7,000IUL-1活性酶。虽然这代表从含有天然celZ启动子的质粒pLOI2173表达的活性的两倍，但所述整合型菌株所产生的葡聚糖酶活性仅为含有同样的替代运动发酵单胞菌启动子的P2(pLOI2183)所获得活性的1/3(表5)。整合后葡聚糖酶表达的降低可能归因于拷贝数的降低(即多拷贝质粒相对于一个整合型拷贝)。
葡聚糖酶EGZ的分泌产酸克雷伯氏菌含有一个供支链淀粉酶分泌用的天然II型分泌系统(pgsley(1993)Microbiol.Rev.5750-108)，类似于由菊欧文氏菌的out基因编码的、分泌果胶酸裂合酶和葡聚糖酶(EGZ)的分泌系统(Barras等(1994)Annu.Rev.Phytopathol.32201-234；He等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.881079-1083)。II型分泌系统通常具有非常的特异性，对异源蛋白的功能差(He等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.881079-1083；Py等(1991)FEMSMicrobiol.Lett.79315-322；Sauvonnet等(1996)Mol.Microbiol221-7)。因此，正如所预期的，用或者M5A1(表5)或者P2(表6)作为宿主时，重组celZ主要以细胞相关产物表达。在肉汤中回收约1/4(12-26％)的总重组EGZ活性。用大肠杆菌DH5α，存在约8-12％的总胞外EGZ。因此，产酸克雷伯氏菌中的天然分泌系统可以促进重组EGZ的部分分泌。
为了进一步改进所需产物的分泌，导入(例如用pCPP2006)得自菊欧文氏菌EC16的II型分泌基因(out基因)，以促进从产酸克雷伯氏菌的产乙醇菌株中的菌株P86021分泌重组EGZ(表5和表6)。对于含有具有celZ的质粒的大多数菌株而言，加入所述out基因导致胞外EGZ增至5倍，而总葡聚糖酶活性增至2倍。对于具有整合型celZ的菌株而言，加入所述out基因导致胞外EGZ增至10倍，而总葡聚糖酶活性增至4倍。在这两种情况下，所述out基因促进大约总葡聚糖酶活性的一半被分泌。由于加入所述out基因引起的EGZ活性的增加，可能反映出在质粒和整合型celZ构建体中分泌型产物的折叠都得到改善。用基于pUC的衍生物观察到的增加较小，可能是由于所负载的质粒和在从该高拷贝质粒上的bla基因产生周质β-内酰胺酶期间竞争输出机器所致。
用两种标准来鉴定在含高水平氯霉素(上游pdc和adhB基因高水平表达的一种标记)的固体培养基上生长并且由于所述out基因而有效分泌葡聚糖酶的P2的最佳整合型菌株。选择两种重组菌株以供进一步研究-SZ2和SZ6。两种菌株都产生24,000IUL-1的葡聚糖酶活性，相当于总细胞蛋白质的约5％(Py等(1991)Protein Engin.4325-333)。
底物解聚所述重组EGZ当应用于CMC源时，测量其对底物的解聚极好(表7)。当应用于酸胀纤维素时，所述葡聚糖酶的活性比对CMC活性测量的活性低10％。当将所述多糖酶应用于Avicel或木聚糖时，观察到很低的活性。然而，当允许消化过夜时，所述EGZ多糖酶引起所有底物的平均聚合物长度有可测量的减小。CMC和酸胀纤维素被解聚为平均长度为7个糖残基。这些7个残基的纤维素聚合物勉强可溶，理想的是可以经进一步消化，以便有效地代谢(Wood等(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)。球磨纤维素和Avicel的平均链长被减至原始长度的1/3，而观察到每个木聚糖聚合物有不足一次切割。
表6.含有整合型celZ的产乙醇产酸克雷伯氏菌菌株的培养物生长、葡聚糖酶产生和分泌的比较
葡聚糖酶(CMC酶)活性在于30℃生长16小时后测定。
表7.得自菌株SZ6(pCPP2006)无细胞肉汤的EGZ对各种底物的解聚
菌株SZ6(pCPP2006)在LB-山梨醇肉汤中生长16小时，作为分泌型EGZ源。
生物催化剂的糖化和发酵能力为了成为有用的菌株，将celZ基因和out基因加入菌株P2中，不一定降低所得生物催化剂的发酵能力。用葡萄糖和纤维二糖进行比较(表8)。所有菌株在发酵这些糖的能力方面是等同的，表明没有由于celZ整合或加入pCPP2006引起的有害效应。也检查了这些菌株将酸胀纤维素直接转化为乙醇的能力。最具活性的构建体SZ6(pCPP2006)从非晶形纤维素产生少量的乙醇(3.9g L-1)。所有菌株最初在接种时有约1.5g L-1乙醇。这对于除SZ6(pCPP2006)之外的所有菌株而言，都随时间降低至零。因此，用SZ6(pCPP2006)观察到产生3.9g L-1的乙醇，可能说明低估了乙醇的总产量。然而，最多这说明仅存在的所述聚合物中的一部分被转化。有可能通过EGZ水解酸胀纤维素产生和被发酵的葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的水平低。这些化合物可以被产酸克雷伯氏菌中的天然磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统代谢(Ohta K等，(1991)APPl.Environ.Microbiol.57893-900；Wood等(1992)APPl.Environ.Microbiol.582103-2110)。
表8.含有out基因(pCPP2006)和整合型celZ的菌株SZ6用各种底物(50g L-1)的乙醇产量
所有培养物在接种时的原始乙醇浓度约为1.5g L-1。用酸胀纤维素作为底物，对于除SZ6(pCPP2006)之外的所有菌株而言，这些水平在温育72小时后降至零。
实施例3得自菊欧文氏菌的两种内切葡聚糖酶(EGZ和EGY)对羧甲基纤维素和酸胀纤维素的协同水解该实施例描述了重组大肠杆菌产生内切葡聚糖酶EGY和EGZ，并且这些内切葡聚糖酶协同水解羧甲基纤维素(CMC)和酸胀纤维素。
在整个该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法细菌、质粒和培养条件在表9中列出了该项研究中所用的细菌菌株和质粒。
表9.所用的菌株和质粒
大肠杆菌DH5α和TOPO10F’用作质粒构建的宿主。从菊欧文氏菌P86021(Beall等(1993)J.Indust.Microbiol.11151-155)克隆celZ基因。用Guiseppi等的方法((1991)Gene 106109-114)，从菊欧文氏菌3937克隆celY基因。用He等的方法((1991)Proc.Acad.Sci.USA 881079-1083)，从菊欧文氏菌EC16克隆out基因。
大肠杆菌培养物在Luria-Bertani肉汤(LB)中于37℃生长，所述肉汤每升含有10g Difco胰蛋白胨、5g Difco酵母膏和5g氯化钠，所述培养物或者在含有琼脂(1.5％)的固体LB培养基上生长。采用刚果红法(Wood等(1989)Biochem.J.26037-43)，根据内切葡聚糖酶的产生筛选克隆。通过给LB琼脂补充低粘度CMC(0.3％)，制备指示平板。适当加入氨苄青霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)以便进行选择。
遗传方法用标准方法进行质粒构建和分析(Ausubel等(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology.New YorkJohn Wiley和Sons，Inc)。用pMH18作为模板，使用以下引物对N-末端5′CTGTTCCGTTACCAACAC3 (SEQ ID NO13)′，C-末端5′GTGAATGGGATCACGAGT3′(SEQ ID NO14)，通过聚合酶链式反应扩增celY的编码区。用pRK2013进行带动转移(Zhou等(1999)B.Appl.Environ.Microbiol.652439-2445)，通过接合转移菊欧文氏菌out基因(pCPP2006)。用LI-COR 4000-L型DNA测序仪和荧光引物，采用双脱氧法对DNA测序。
酶测定用CMC作为底物，在体外测定内切葡聚糖酶活性。在含有低粘度CMC(20g/L)的50mM柠檬酸缓冲液(pH5.2)中，于35℃分析适当稀释的无细胞培养肉汤(胞外活性)或含有已经通过超声处理破碎的细胞的肉汤(总活性)。通过在沸水浴中加热10分钟终止反应。用3，5-二硝基水杨酸试剂，用葡萄糖作为标准，测定还原糖(Wood等(1988)Methods Enzymology 16087-112)。酶活性(CMC酶)以每分钟释放的μmol还原糖(IU)表示。结果为两次或更多次测定的平均值。
协同作用如Zhou等所述(1999)(参见上文)，对DH5α(pLOI1620+pCPP2006)和DH5α(pLOI2311)的稳定期培养物进行超声处理和离心，分别作为EGZ和EGY源。必要时将这些EGZ和EGY源稀释，以提供相等的CMC酶活性。在含有CMC(20g/L)或酸胀纤维素(20g/L)的50mM柠檬酸缓冲液(pH5.2)中，于35℃测试EGZ和EGY混合物的协同作用。对于用Avicel(20g/L)的试验，不经稀释而混合酶制剂。在测定还原糖之前，将酸胀纤维素和Avicel的水解样品离心(10,000xg，5min)，以除去不溶性物质。
也调查了顺序加入EGZ和EGY的效应。用单一的酶水解底物4小时，然后通过煮沸20分钟灭活。冷却后，加入第二种酶，再温育4小时。对照实验用两种酶一起(4小时)以及用单独的每种酶(4小时)进行。分析样品的还原糖。在某些情况下，也通过薄层色谱分析产物。
将观测到的活性除以根据预测的单独的EGY和单独的EGZ的作用(Riedel等(1997)FEMS Microbiol.Lett.147239-243)之和，计算酶混合物的协同作用程度。
纤维寡糖的水解通过薄层色谱，分析得自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、酸胀纤维素(Wood等(1988)，参见上文)和Avicel的水解产物。对于这些分析，将15μl1％底物与45μl粗制酶(0.07IU)混合，于35℃温育2小时，然后通过在沸水浴中加热来终止。将水解产物点样至Whatman 250μm Silica-gel 150A平板上，用Kim，(1995)Appl.Environ.Microbiol.61959-965描述的溶剂体系展层约4小时。以体积计，该溶剂含有6份氯仿、7份乙酸和1份水。通过喷洒6.5mM N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐并于100℃加热约10分钟，使糖显现(Bounias，(1980)Anal.Biochem.106291-295)。
材料和化学药品胰蛋白胨和酵母膏是Difco(Detroit，Michigan)的产品。抗生素、低粘度CMC、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。纤维五糖得自V-Lab(Covington，Louisiana)。Avicel购自Fluka Chemika(Buchs，Switzerland)。
重组大肠杆菌的EGY和EGZ产生天然菊欧文氏菌3937和带有质粒pMH18的重组大肠杆菌产生低水平的EGY活性(Boyer等((1987)Eur.J.Biochem.162311-316；Guiseppi等，参见上文)。在大肠杆菌中从高拷贝质粒的表达差，这归因于启动子功能和推测对celY激活蛋白的需求(Guiseppi等，参见上文)。构建一种产生较高水平EGY以供我们的协同研究用的新克隆。用聚合酶链式反应扩增EGY编码区(无启动子)，并将其克隆在pCR2.1-TOPO中lac启动子之后。所得的质粒pLOI2311在CMC酶指示平板上为强阳性。用lac启动子取代天然启动子，将celY表达增加约10倍，从165IU/L增加至1800IU/L(参见以下表10)。
表10.菊欧文氏菌out基因对大肠杆菌DH5α中celY和celZ表达和分泌的影响
a培养上清液中的分泌或释放的CMC酶活性。
b缩写nd，未测定。
在胞外环境中发现约90％的EGY活性。包括celZ的表达，以便进行比较(参见表10)。带有质粒pLOI1620的大肠杆菌产生高水平的EGZ。通过加入如先前报道的菊欧文氏菌out基因(pCPP2006)(Zhou等(1999)Appl.Environ.Microbiol.652439-2445)，进一步提高了胞外EGZ活性和总EGZ活性。然而，与EGZ不同，EGY的活性不受out基因存在的影响。最大EGY活性和EGZ活性得自24小时的培养物。得自含有pLOI2311或pLOI1620和pCPP2006(out基因)的经破碎培养物的上清液，分别用作EGY和EGZ源，以供进一步研究用。EGY和EGZ以CMC作为底物的协同作用用CMC(20g/L)，进行检查EGY和EGZ联合作用的初步研究达一个温育时间(图9)。将含有EGY和EGZ的破碎细胞制剂分别稀释至等活性(CMC酶)，然后以不同比率混合，以维持各种酶活性的总和恒定。单独测试EGY和EGZ作为对照。EGY和EGZ的所有混合物都显著高于所单独分析的任一种酶的活性，表明有协同相互作用。所述协同作用随EGZ的比率而增加。用9∶1和19∶1的EGY与EGY活性之比，观察到最大协同作用(1.42)。
进一步的实验检查了分别用CMC作为底物以及9∶1的EGZ与EGY的活性比时温育时间的影响(图9)。包括单独的EGZ和EGY作为对照。由于水解率和水解程度增加，将EGZ和EGY联合的协同作用是非常明显的。计算的协同作用随温育时间而增加。在温育(4小时)结束时，还原糖的浓度在混合酶制剂中为通过单独的EGZ和EGY活性算术之和预测活性的1.8倍，即有协同活性。
底物(CMC)浓度对协同作用的影响也研究了底物浓度对EGZ和EGY之间协同作用的影响(参见以下表11)。将CMC浓度从2.5g/L增至20g/L，所观察到的协同作用从1.12增至1.89。基于EGZ和EGY的比活以及1.89的最大协同作用，该组合的酶转换率为单独的纯化EGY的8倍，为单独的纯化EGZ的1.5倍。
表11.底物浓度对协同作用的影响
a平均值±标准差。
b将EGZ和EGY稀释至等CMC酶活性。反应物(0.15IU/ml)含有9份EGZ和1份EGY。作为对照，分别单独测试EGZ(0.15IU/ml)和EGY(0.15IU/ml)。
c协同作用以所观测到的活性除以预测的单独的EGY(10％)加上单独的EGZ(90％)的作用之和来计算。
EGY对底物浓度比EGZ更为敏感。增加CMC浓度，导致用EGY使还原糖产物增至8倍，而用EGZ仅增至3倍。基于表11中数据的的双重倒数曲线图(double reciproca1 plot)，估计EGY、EGZ和这两种酶的组合(9份EGZ+1份EGY)的表观Km值分别为104、12和28g/L。
EGY的表观Km较高，符合较长底物分子的需求。
也通过测定水解产物的大致大小，检查了CMC水解的程度。将CMC(1.25g/L)与EGY、EGZ和这两种酶的组合(9份EGZ+1份EGY)一起温育(4小时，0.75IU CMC酶/ml)。根据还原糖测定，估计温育前(250个葡糖基单位)和温育后的链长。所有三种酶制剂都显著减小平均链长。EGZ比EGY更有效地减小链长，分别为3.6个对10.7个葡糖基残基。这两种酶的组合产生协同作用。用这两种酶同时水解，将水解产物的平均大小减小至2.3个葡糖基残基，比单独的EGZ小36％，而比单独的EGY小79％。这些结果证实，EGZ既容易水解大的CMC聚合物，也容易水解较小的糖。EGY的作用看来更为有限，主要水解具有大于10个葡糖基单位的大聚合物。
用EGZ和EGY顺序水解和同时水解CMC通过比较用单独的内切葡聚糖酶顺序水解作用与用两种酶的混合物同时水解作用，进一步研究了EGZ和EGY之间协同作用的机制(参见以下表12)。再次观察到两种酶同时作用的协同作用。当用EGZ作为第一种酶，然后用EGY消化(在热灭活EGZ之后)时，没有观察到CMC顺序水解的协同作用。相反，当CMC首先用EGY处理，然后用EGZ处理(在热灭活EGY之后)，保留了完全的协同作用。这些结果表明，EGY和EGZ的独立活性可以达到协同作用。EGY对所述底物的酶修饰，提高了随后EGZ的水解率和水解程度。这些结果提供了进一步的证据EGY和EGZ的作用相当不同。EGY看来主要减少大聚合物的链长，而EGZ看来作用更随机，既水解大底物分子，也水解小底物分子。
表12.EGZ和EGY对CMC的顺序水解和同时水解
a将EGZ和EGY稀释至等CMC酶活性。用9份EGZ和1份EGY研究同时水解反应和顺序水解反应(0.15IU/ml)。在顺序水解实验中，使第一种酶与底物温育4小时，然后通过煮沸20分钟灭活。冷却后，加入第二种酶，再温育4小时。所有的反应都通过煮沸终止。
b平均值±标准差(3个实验)。
c计算单独的EGY活性与EGZ活性之和。
d协同作用以所观测到的活性除以预测的单独的EGY(10％)加上单独的EGZ(90％)的作用之和来计算。
对酸胀纤维素和晶态纤维素的协同作用用酸胀纤维素作为底物，用基于CMC酶活性(图9)的9∶1的EGZEGY之比，研究潜在的协同作用。由于EGZ和EGY对于酸胀纤维素的活性低于对CMC的活性(Boyer等(1987)Eur.J Biochem.162311-316)，因此增加酶上样量(1.5IU)和温育时间。当用酸胀纤维素单独分析时，EGY的活性大约是EGZ活性的1/3。然而，在所有的时间点，这两种酶的组合的活性都显著高于预测单独活性的算术和。协同作用的程度在36小时的温育期间基本恒定(1.36±0.17)。
通过薄层色谱，分析得自酸胀纤维素的水解产物(6小时)(图10)。在用单独的EGY温育后，没有观察到可溶性糖。纤维二糖和纤维三糖是用单独的EGZ水解以及用EGY和EGZ组合水解的主要产物。用这两种酶的组合，斑点更深更大，表明产物水平更高，证明有协同作用。
也用Avicel(图10)-一种高晶态纤维素，研究了EGZ和EGY的协同作用。观察到少量纤维二糖和纤维三糖为用单独的EGZ以及用EGY和EGZ的混合物的水解产物。由于对于Avicel的活性低，所以在薄层板上需要大加样量(10μl)，以显现产物。注意到，与标准相比，这种额外的盐增加寡糖产物的相对迁移率。用单独的EGY没有观察到纤维寡糖斑点。用EGY和EGZ的组合再次证明协同作用。用所述联合活性比用单独的EGZ观察到较大而更强的对应于纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的斑点。用Avicel作为底物的活性低和产物水平相对低，与对于Avicel的非晶形区的水解一致，而与其晶态区的水解不一致。这些结果表明，EGZ和EGY的协同作用不限于一种模型底物，例如CMC。也观察到对于酸胀纤维素和Avicel的非晶形区的协同水解。
纤维寡糖的水解用可溶性纤维寡糖(纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖)，进一步研究了EGZ和EGY的底物专一性。通过薄层色谱分析水解产物(图11)。纤维二糖不被EGY、EGZ或两种酶的组合水解。纤维寡糖不被单独的EGY水解(图11，图面B)。相反，EGZ水解纤维四糖和纤维五糖，而不水解纤维三糖(图11，图面C)。得自纤维四糖的EGZ水解产生主要是纤维二糖以及较少量的纤维三糖和葡萄糖。用纤维五糖作为底物，EGZ产生大约等量的纤维二糖和纤维三糖，表明优先攻击第二个或第三个糖苷键。通过检查在纤维五糖与EGZ温育期间的不同时间的样品，进一步证实了这一点(图11，图面D)。纤维二糖和纤维三糖在温育期间逐渐积累，纤维五糖相应减少。因此，与EGY要求大底物相反，EGZ水解含有4个或更多个葡糖基单位的可溶性纤维寡糖。
实施例4菊欧文氏菌内切葡聚糖酶EGY(celY)和EGZ(celZ)在产乙醇产酸克雷伯氏菌P2中的整合、表达和胞外分泌在该实施例中，描述了得自菊欧文氏菌的celY和celZ在产酸克雷伯氏菌P2染色体中的功能整合。也描述了在采用同时糖化发酵将纤维素发酵为乙醇期间重组EGY和EGZ以及真菌纤维素酶(Spezyme CE)的协同作用。
在整个该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料材法细菌、质粒和培养条件在以下表13中列出了用于该实施例的菌株和质粒。
表13.菌株和质粒
在质粒构建期间，用大肠杆菌DH5α和TOPO10F’作为宿主。celZ基因、celY基因和out基因如实施例3中所述进行克隆。
大肠杆菌培养物在Luria-Bertani肉汤(LB)中于37℃生长，所述肉汤每升含有10g Difco胰蛋白胨、5g Difco酵母膏和5g氯化钠，所述培养物或者在含有琼脂(1.5％)的固体LB培养基上生长。在肉汤中总是包含糖(5％葡萄糖或山梨醇)，对于产乙醇菌株的生长，使用固体培养基(2％葡萄糖)。采用刚果红法(Wood等(1988)Methods Enzymology16087-112)，根据内切葡聚糖酶的产生筛选克隆。通过给LB琼脂补充O.3％低粘度羧甲基纤维素(CMC)，制备内切葡聚糖酶指示平板。使用氨苄青霉素(50μg/ml)、安普霉素(100μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、氯霉素(40μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)进行选择。产酸克雷伯氏菌的产乙醇菌株在含有葡萄糖(2％)和氯霉素(600μg/ml)的固体LB培养基上于30℃维持。
遗传方法用标准方法进行质粒构建、分析和测序。用pMH18作为模板，使用以下引物对N-末端5′CTGTTCCGTTACCAACAC3′(SEQ ID NO13)，C-末端5′GTGAATGGGATCACGAGT3′(SEQ ID NO14)，通过聚合酶链式反应扩增celY的核糖体结合位点和无启动子编码区。用pRK2013进行带动转移，通过接合转移菊欧文氏菌out基因(pCPP2006)。通过采用双脱氧法，用LI-COR 4000-L型DNA测序仪和荧光引物测序，证实构建体。利用Bio-Rad Gene Pulser，通过电穿孔将菊欧文氏菌celY基因和celZ基因导入产酸克雷伯氏菌P2中。如Martinez-Morales等(1999)J.Bacteriology 1817143-7148和Zhou等(1999)Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607中所述，在含有卡那霉素(50mg/L)的固体培养基上选择重组子。
引物延伸分析通过用所述编码区内的IRD41-标记的引物荧光引物对于celY为5′-ACCATCAGCATCAACGCCCAACAACG-3′(SEQ ID NO15)，而对于celZ为 5′-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3′(SEQ ID NO16)将转录起始位点作图，鉴定启动子区。将延伸产物溶于加样缓冲液中，并与用LI-COR 4000-L型DNA测序仪(Lincoln，Nebraska)获得的平行双脱氧序列进行比较。
酶测定内切葡聚糖酶活性如实施例3中所述方法进行测定。
发酵在含有200ml肉汤的无挡板500ml烧瓶中进行同时糖化发酵(SSF)试验。烧瓶配有胶塞，并用18号针排空。在含有10％Sigmacell 50(晶态纤维素)的LB培养基中，于35℃(120rpm)进行发酵。接种物在含有5％葡萄糖的LB中生长12小时。通过离心收获细胞，将其重悬于LB中。接种每个烧瓶，以提供16mg细胞(干重)的初始密度。
材料和化学药品胰蛋白胨和酵母膏是Difco(Detroit，Michigan)的产品。抗生素、低粘度CMC和Sigmacell50得自Sigma Chemical Company(St.Louis，Missouri)。IRD41标记荧光引物购自LI-COR，Inc.(Lincoln，Nebraska)。celY的启动子-探针载体的构建得自菊欧文氏菌的celY基因在大肠杆菌中从其天然启动子的表达差(参见Guiseppi等(1991)Gene 106109-114)。因此，为了增加表达，用celY作为报道基因，如下构建一种启动子-探针载体(参见图13)。用pMH18作为模板，通过PCR扩增具有核糖体结合位点的无启动子celY编码区(1.2kbp)，然后将其随机插入到拓扑异构酶载体PCR2.1-TOPO中。用内切葡聚糖酶指示平板，证实celY的功能表达。选择出一个定向从lac启动子表达celY的克隆，将其命名为pLOI2311(5.2kbp)。从pLOI2311分离出一个含有无启动子celY基因的EcoRI片段。该片段的末端用Klenow聚合酶平端化，然后连接到pUC18的HincII位点中。选择出一个定向从lac启动子表达celY的克隆(3.9kbp)，用内切葡聚糖酶指示平板证实表达(pLOI2316)。用EcoRI和HindIII从pLOI2316中分离出作为1.2kbp片段的无启动子celY基因，将其插入到pLOI2302(pUC19衍生物)的相应位点中，以逆转celY基因的方向。正如所预期的，所得的构建体DH5α(pLOI2317)由于缺乏启动子，在内切葡聚糖酶指示平板上无活性。为了有利于插入含有启动子区的DNA片段，质粒pLOI2317(3.9kbp)在多接头区中紧接celY基因上游含有一个BamHI位点(参见图13)。
在大肠杆菌DH5α中增强celY表达的质粒的构建用运动发酵单胞菌染色体DNA的Sau3Al片段提供一种异源启动子，该启动子在产酸克雷伯氏菌中可能不经过天然调节机制，或者干扰随后整合到产酸克雷伯氏菌染色体中(Zhou等(1999)J.Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607)。分离0.5-1.5kbp的片段，将其随机连接到pLOI2317的BamHI位点中，产生一个替代启动子文库(参见图13)。在内切葡聚糖酶指示平板上筛选出大约75,000个菌落。其中1/3有效产生celY。通过区带大小鉴定出最具活性的100个菌落，将其纯化，然后再测试。具有最大活性区带的30个克隆在LB中生长过夜，并分析其CMC酶活性。在以下表14中列出5个最具活性的克隆，所述克隆表现出约7倍于原始克隆pMH18的活性。选择质粒pLOI2323以供进一步研究。
表14. 利用以运动发酵单胞菌染色体DNA的Sau3A1消化产物作为替代启动子的片段在DH5α中表达celY
所有质粒都是pUC衍生物。用于37℃生长大约16小时的培养物测量内切葡聚糖酶活性。
以两个方向对pLOI2323中的运动发酵单胞菌Sau3Al片段(937bp)测序(GenBank登记号AF305919)。根据数据库比较，该片段看来得自两个片段一个882bp片段，得自运动发酵单胞菌染色体，对应于先前已测序区域；和一个得自所述载体的55bp片段。已翻译序列的BLAST搜索(National Center for Biotechnology Information；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)并未揭示出与已知基因有同一性。通过引物延伸分析，在DH5α(pLOI2323)中鉴定出涉及三种不同σ因子-δ32、δ38和δ70的4个转录起始位点(参见图14)。虽然强度的差异小于2倍，但最强起始位点上游的序列类似δ32的共有序列(rpoH)-热激启动子(Wang等(1998)J..Bacteriology 1805626-5631；Wise等(1996)J.Bacteriology 1782785-2793)。
用于将celY和celZ整合到产酸克雷伯氏菌P2染色体中的载体的构建构建质粒pLOI2307(7.2kbp)，用来在重组大肠杆菌DH5α(参见Zhou等(1999)B.APPl.Environ.Microbiol.652439-2445)和产酸克雷伯氏菌M5A1(参见Zhou等(1999)Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607)中从替代运动发酵单胞菌启动子以高水平表达celZ。为了便于亚克隆该杂种celZ基因和启动子(4.5kbp)，将一个EcoRI接头插入到pLOI2307的T4聚合酶处理SphI位点中，以便为方便切取提供侧翼EcoRI位点(pLOI2349)。在构建含有celY和celZ的质粒之前，将一个EcoRI消化的产酸克雷伯氏菌M5A1染色体DNA的随机3kbp片段插入到含有celY(和替代启动子)的pLOI2323中，以便用作同源重组的引导序列(guide)(pLOI2348；8kbp)。对这种3kbp M5A1片段部分测序，该片段看来编码完整的M5A1 glgP基因。在pLOI2348(8kbp)中，侧翼AscI位点使得可以切下一个单一的5.5kbp片段，该片段含有M5A1glgP，基因、运动发酵单胞菌替代启动子和菊欧文氏菌celY。
图15总结了从pLOI2349、pLOI2224和pLOI2348开始的celYcelZ整合型载体的构建。用大肠杆菌S17-1作为宿主，将含有替代启动子和所述引导片段的重组celY和celZ基因顺序插入到核心整合型载体pLOI2224(Martinez-Moralez等，参见上文)中，产生pLOI2352(12kbp)。用EcoRI位点将得自pLOI2349、含有celZ的4.5kbpEcoRI片段插入到pLOI2224中，制备pLOI2350(6.4kbp)。将得自pLOI2348、含有celY的5.5kbp AscI片段插入到pLOI2350的AscI位点中，制备pLOI2352(12 kbp)。使含有cel基因的片段定向，使得从替代启动子的表达是不同的。所得的载体含有一个在DH5α或M5A1中不起作用的R6K复制子。pLOI2352中的两个FRT位点有利于在整合后除去卡那霉素基因和复制子(Martinez-Moralez等，参见上文)。
celY和celZ在产酸克雷伯氏菌P2染色体中的功能整合通过电穿孔，将质粒pLOI2352导入P2中，然后根据卡那霉素抗性进行选择。回收约150个菌落，所有菌落在内切葡聚糖酶指示平板上均为阳性。纯化出10个具有最大活性区带的克隆，将其在肉汤中生长，并分析其内切葡聚糖酶活性。这些克隆产生5-6IU/ml的内切葡聚糖酶活性。选择一个克隆用于进一步研究，将其命名为SZ12。
由于产酸克雷伯氏菌对氨苄青霉素有天然抗性，所以在含有flp重组酶的pFT-A质粒中加入一个额外的抗生素抗性标记(tet)，以便于进行选择。从pBR322中以1.4kbp EcoRI-AvaI片段分离出所述四环素基因。在用Klenow聚合酶处理后，将该片段连接到经Klenow处理的pFT-A的ClaI位点中，产生pLOI2353(7.0kbp)。该质粒编码对氨苄青霉素和四环素的抗性、在四环素启动子控制下的FLP重组酶(flp)、和一个温度条件型pSC101复制子。
将质粒pLOI2353转化到SZ12中，于30℃铺平板，并用四环素抗性进行选择。四环素的存在也诱导flp表达，导致从染色体整合型pLOI2353中缺失卡那霉素基因和R6K复制子。在所实测的307个四环素抗性菌落中，超过99％保留所述内切葡聚糖酶基因的表达，并且对卡那霉素敏感。纯化克隆，使其在肉汤中生长，并分析内切葡聚糖酶活性。所有克隆都是相似的，将一个克隆命名为SZ21(pLOI2353)。该辅助质粒在于37℃过夜生长中，从SZ21中消除。
celZ剔除突变的构建为了证实SZ21中存在功能性celY，用质粒pLOI2357，通过双重同源重组，构建染色体整合型celZ的剔除突变(图16)。质粒pUC19用SmaI和HindIII消化，用Klenow聚合酶处理，并自我连接，以消除多接头位点中的许多位点(pLOI2354)。留下的EcoRI位点用来插入一个含有得自pLOI2349的所述启动子和celZ基因的4.5kbp EcoRI片段，制备pLOI2355(7.2kbp)。然后将得自pHPΩ45aac、含有安普霉素抗性基因(aac)的1.8kbp SmaI片段连接到celZ的中心区中，取代小的内部PstI片段(在用T4聚合酶平端化后)，产生pLOI2356(9.0kbp)。分离得自该质粒的6.3kbp EcoRI片段，将其插入到核心整合型载体pLOI2224中，产生pLOI2357(8.2kbp)。除了被安普霉素抗性基因破坏的celZ基因之外，该质粒还含有一个条件R6K复制子和卡那霉素抗性基因。
将质粒pLOI2357电穿孔到SZ21中，用安普霉素进行选择。约10％的重组子是安普霉素抗性和卡那霉素敏感性的，表明发生一个双重同源重组事件。这些克隆在指示平板上显示出低水平的内切葡聚糖酶产生(参见以下表15)。选择一个克隆，将其命名为SZ22。用PharmaciaPhast Gel系统，通过SDS-PAGE证实在SZ22中丧失了EGZ而保留EGY。
有趣的是注意到由于从整合型基因或从质粒功能性表达celZ，消除了在液体培养物、通常为M5A1和P2的液体培养物中的细胞聚集。聚集不受单独的celY的功能表达影响。
产酸克雷伯氏菌SZ21中的转录起始SZ21中celY和celZ的引物延伸分析与在DH5α中所观察到的相似。鉴定出celZ的一个单一的主要转录起始，它准确地对应于DH5α(pLOI2183)中的最主要的起始位点，后者含有相同的启动子片段(Zhou等(1999)J.Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607；Zhou等(1999)B.Appl.Environ.Microbiol.652439-2445)。紧接该位点上游的DNA类似σ70启动子的识别序列(Wang等，参见上文和Wise等，参见上文)。正如用DH5α(pLOI2323)观察到的(参见图14)，celY的引物延伸分析表明，在SZ21中存在多个推定的转录起始位点。虽然位于与DH5α(pLOI2323)中的起始位点相同的区域中，但所有条带具有接近相等的强度。
菊欧文氏菌out基因(pCPP2006)对EGY和EGZ在产酸克雷伯氏菌P2衍生物中胞外分泌的影响表7总结了产乙醇产酸克雷伯氏菌P2的解纤维素衍生物所表现的内切葡聚糖酶活性。菌株SZ6(Zhou等，(1999)J.Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607)含有一个具有用来构建SZ21的相同启动子片段的染色体整合型杂种celZ基因。尽管在SZ21中存在两种内切葡聚糖酶基因，但在该菌株中胞外内切葡聚糖酶活性和总内切葡聚糖酶活性比SZ6中少13％。SZ21所产生的大多数内切葡聚糖酶活性可以归因于celZ。一种SZ21的celZ突变体-SZ22，仅表达含有功能性celY和celZ基因的亲株所产生的内切葡聚糖酶的11％。在含有功能性celZ的菌株SZ6和SZ21中，大多数所述内切葡聚糖酶活性(主要为EGZ)是细胞相关的。在仅含有功能性celY的菌株SZ22中，所述内切葡聚糖酶活性的一半是胞外活性。
表15.out基因(pCPP2006)对产酸克雷伯氏菌P2衍生物的内切葡聚糖酶产量的影响。
a内切葡聚糖酶活性用在含5％山梨醇的LB中于30℃生长24小时的培养物来测定。
b稀释度相当于用于发酵实验中的最高Spezyme水平(表4)。
加入out基因(pCPP2006)至带有celZ的重组大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌M5A1，可以引起celZ功能表达和分泌到胞外环境中的EGZ百分率的显著增加(Zhou等，(1999)J.Indust.Microbiol.Biotechnol.22600-607；Zhou等(1999)B.Appl.Environ.Microbiol.652439-2445)。对于含有celZ和celY的产乙醇产酸克雷伯氏菌SZ21，观察到这些相同的效应(参见表14)。加入out基因至SZ22(无活性的celZ)，对celY的功能表达或EGY分泌程度没有影响。这种celZ突变体SZ22(pCPP2006)产生的总内切葡聚糖酶活性(EGY)仅为含有功能性celY和celZ基因的SZ21(pCPP2006)所产生活性的3％。具有out基因的SZ21所产生的分泌型内切葡聚糖酶显著高于在SZ6(EGZ)和SZ22(EGY)中从相同的对应启动子表达的各种活性之和，这与这两种酶之间有协同作用一致。在该测定中，估计协同作用是SZ21(pCPP2006)所产生的胞外酶组合的各种活性(SZ6(pCPP2006)和SZ22(pCPP2006))的算术和的1.4倍。将纤维素发酵为乙醇期间重组菊欧文氏菌内切葡聚糖酶(EGZ和EGY)和真菌纤维素酶(Spezyme CE)之间的协同作用使用无pH控制下的烧瓶中的SSF试验，来评估真菌纤维素酶(Spezyme)和所述生物催化剂所产生的纤维素酶对从高晶态底物Sigmacell 50生产乙醇的影响。结果示于以下表16中。
表16.最大乙醇产量
a)未加纤维素(100g/升)或Spezyme的培养物产生0.22±0.01g/升的乙醇。Spezyme含有约100FPU/ml。加入5ml和10ml Spezyme分别相当于5FPU/g和10FPU/g纤维素。
b)Studentt检验表明，与每个Spezyme稀释度下相应的P2对照相比，乙醇产量有显著差异。P值≤0.001用两个星号表示。P值≤0.05用一个星号表示。
尽管在无Spezyme的情况下，所有菌株都产生非常低水平的乙醇，但含有功能性celZ基因的菌株SZ6(pCPP2006)和SZ21(pCPP2006)产生的乙醇水平(p≤0.05)高于仅含有功能性celY基因的菌株SZ22(pCPP2006)和缺乏内切葡聚糖酶基因的菌株P2(pCPP2006)的水平。在在缺乏Spezyme和Sigmacell 50的情况下，所有菌株都产生0.22g/L乙醇。在与Sigmacell 50温育期间SZ6(pCPP2006)和SZ21(pCPP2006)所产生乙醇的额外的增量，归因于EGZ水解底物中小部分的非晶形纤维素(Zhou等(1999)J.of Industrial Microbiol.Biotechnol.22600-607；Zhou等(1999)B.Appl.Environ.Microbiol.652439-2445；Zhou，S.等(2000)J.Bacteriol.1825676-5682)。EGY对非晶形纤维素的消化所产生的糖太大，在无进一步水解的情况下不能被转运和代谢(Zhou，S.等(2000)J.Bacteriol.1825676-5682)。
Spezyme CE和Spezyme CP含有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶活性的商业上优化组合(Beguin等(1994)FEMS Microbiol.Rev.1325-58；Boyer等(1987)Eur.J.Biochem.162311-316；Nieves等(1998)World Journal of Microbiology and Biotechnology 14310-314；Ohmiya等(1997)Biotechnol.Genetic Eng.Rev.14365-414)。尽管有这种优化，但补充Spezyme、具有两种产生所述内切葡聚糖酶的生物催化剂SZ21(pCPP2006)和SZ22(pCPP2006)的发酵，产生显著高于缺乏内切葡聚糖酶基因的对照P2(pCPP2006)的乙醇水平。Spezyme与SZ21(pCPP2006)和SZ22(pCPP2006)的组合在乙醇生产方面是协同作用的，比各自单独产生的乙醇之和高至多20％(p≤.005)。用SpezymeCE和Spezyme CP的稀释液都观察到协同作用。这种协同作用可以主要归因于EGY，因为这是SZ22(pCPP2006)所产生的唯一一种内切葡聚糖酶。仅对于产生EGZ的SZ6(pCPP2006)，则没有观察到协同作用。
实施例5无添加纤维素酶时重组产酸克雷伯氏菌SZ21将非晶形纤维素同时糖化发酵为乙醇在该实施例中，证明一种含有得自运动发酵单胞菌用于产生乙醇的染色体整合型基因(pdc，adhB)和得自菊欧文氏菌的内切葡聚糖酶基因(celY，celZ)的产酸克雷伯氏菌M5A1的衍生物，在发酵期间产生超过20,000U/L的内切葡聚糖酶活性。具体地说，证明这种菌株在未加入得自其它生物的纤维素酶的情况下，将其代谢纤维二糖和纤维三糖、发酵非晶形纤维素为乙醇(理论产量的58-76％)的天然能力结合在一起。
在整个该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法细菌、质粒和培养条件在该项研究中使用4种产酸克雷伯氏菌M5A1的产乙醇衍生物。菌株P2含有得自运动发酵单胞菌用于产生乙醇的染色体整合型pdc和adhB基因(Wood等，(1992)Appl.Environ.Microbiol.582103-2110)。这种菌株是含有得自菊欧文氏菌的高表达染色体整合型内切葡聚糖酶基因(Zhou等(2001)Appl.Enzviron.Microbiol.676-14)的3种菌株的亲代生物。菌株SZ6、SZ22和SZ21分别为仅含celZ、仅含celY、以及含有celY和celZ两者。内切葡聚糖酶CelZ的有效分泌需要额外的基因(约15种out基因)(He等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881079-1083；Pugsley等，(1997)Gene 19213-19)，所述额外的基因由质粒pCPP2006供应。为了保持一致性，已经将这种质粒插入到所有菌株中。让重组产酸克雷伯氏菌菌株在含有一种糖的Luria肉汤(每升10g酵母膏、5g胰蛋白胨、5g NaCl)中生长。包括壮观霉素(100mg/L)以维持质粒pCPP2006。种子培养物(5％葡萄糖，12-16h)和发酵物于35℃(120rpm)温育，并用22号针排空。
内切葡聚糖酶活性的测定测定在含5％山梨醇的Luria肉汤中生长24小时的培养物的总内切葡聚糖酶活性(CelY和CelZ)，从而将还原糖测定期间的干扰减至最小(Zhou等(2000)J.Bacteriol.1825676-5682)。肉汤中的细胞悬浮液用超声波短暂处理，以释放结合酶。在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)中，用羧甲基纤维素作为底物(2％)，于35℃分析稀释液。通过加热(10min，100℃)终止反应。活性以用葡萄糖作为标准、每分钟还原糖的μmole数(U)来表示。
纤维二糖苷(cellobioside)的薄层色谱(TLC)分析用Whatman LK5硅胶板(Cat.No.4855-620)分离纤维二糖苷。硅胶板在溶剂(6份氯仿、7份乙酸和1份水)中展层，风干，然后在同一溶剂中进行第二次展层。通过喷洒6.5mM N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐并且加热至100℃达10分钟，显现糖类(Zhou等，参见上文)。
从微晶纤维素制备纤维二糖苷基于Pereira等(1988)的方法，将纤维素转化为纤维二糖苷。缓慢加入Sigmacell 50型纤维素(100g；Cat.No.S-5504)至400g 72％H2SO4(w/w)中，让其于22℃在搅拌下水解18小时。通过将经消化的浆液缓慢加至2.5L冷乙醇(100％)中使其沉淀，离心，用1L冷乙醇洗涤沉淀两次。将沉淀溶于100ml H2O中，调节至pH6，然后以5000xg离心20分钟，以除去不溶性纤维。干燥并分析含有纤维二糖苷的上清液。
纤维二糖苷的HPLC分析用配有折射率监视器和数字积分仪的WatersHPLC分析纤维二糖苷。用蒸馏水作为流动相(0.6ml/min)，使用BioRad HPX-42A柱于65℃进行分离。
纤维二糖苷的发酵初始发酵使用购自Sigma Chemical Company(Cat.No.C-8071)的纤维二糖苷。通常在1.5ml微量离心管中将种子培养物(112.5μL)与37.5μl 4％纤维二糖苷混合，温育36小时(35℃和120rpm)。将样品(每种50μl；0h、10h和36h)加热(100℃，10min)，以灭活酶，然后离心(10,000xg，5min)，除去细胞碎片。然后将上清液(4μl)点样至TLC板上，以进行分析。
小规模发酵(50ml烧瓶，5ml肉汤体积)以与通过硫酸水解制备的纤维二糖苷实验室样品相似的方式进行。纤维二糖苷(6g/L小于7个葡糖基残基的总糖类)在Luria肉汤中过滤除菌。向烧瓶中接种得自种子培养物(干重0.33g/L)的沉淀细胞(5,000xg，10min)，以消除从种子培养基中的葡萄糖产生的乙醇。除去原始样品，然后以24小时的间隔取出样品，以便通过气相色谱确定乙醇的存在(Beall等(1991)Biotechnol Bioeng.38296-303)。
非晶形纤维素的制备采用Wood(1988)所述方法的改良方法，制备磷酸溶胀纤维素。缓慢加入约20g Avicel(Cat.No.PH105，Fluka Chemika)至500ml 85％H3PO4中，于室温搅拌过夜，倾注到4L冰冷的水中，让其在无搅拌下沉降30分钟。倾析出上层液体层后，加入4L冷水，充分混合，用水重复5次，用1％NaHCO3重复1次，然后用水再重复5次(最终pH6-7)。通过离心(5000xg，20min)浓缩纤维素悬浮液，将其用作发酵底物。这种粘性悬浮液含有晶态纤维素和非晶形纤维素的混合物。
磷酸溶胀纤维素中存在的非晶形纤维素的百分率通过用CelY和CelZ内切葡聚糖酶重复消化来评估。将SZ21(pCPP2006)的24小时培养物短暂超声处理，离心(5,000xg，10min)，将上清液作为内切葡聚糖酶源(～20U/ml)。在6个预先称重的离心管的每个离心管中，称量加入约1g所述粘性酸胀纤维素。两个离心管用作对照(无酶)，将其干燥以测量原始干重和含水量。向4个离心管中加入内切葡聚糖酶(9ml)，将其于35℃温育12小时。向每个离心管中加入氯仿(2滴)，以阻止微生物生长。离心(5,000xg，20min)后，在72小时内，该程序用新酶制剂重复总共6次连续处理。在不同时间取出离心管，离心，用蒸馏水洗涤1次，以除去不溶性产物和盐，将其于70℃干燥至恒重。非晶形纤维素以由于内切葡聚糖酶消化产生的干物质的减少来计算。
非晶形纤维素的发酵在125ml烧瓶中，将酸胀纤维素(40 g，未灭菌)与5ml 10XLuria肉汤浓缩液和5ml种子培养物(细胞干重0.33mg/L)混合。加入壮观霉素(100μg/ml)和氯霉素(40μg/ml)，以消除污染。最初用搅棒(applicatorstick)混合所述粘性混合物，然后于35℃温育。由于初始粘性高，所以烧瓶在最初2小时期间以200rpm混合，随后以120rpm混合。通过气相色谱测定乙醇(Beall等(1991)Biotechnol.Bioeng 38296-303)。
粘度通过定时流过一个垂直的10ml玻璃移液管，于22℃估计酸胀纤维素制备物的粘度。使用甘油溶液作为标准。观察到发酵肉汤的流动时间为2秒至75秒，分别相当于1-1,300厘泊的粘度。
结果由产酸克雷伯氏菌的产乙醇衍生物产生的内切葡聚糖酶活性的比较含有得自菊欧文氏菌的内切葡聚糖酶基因的产乙醇菌株，在葡萄糖发酵期间产生显著水平的活性。含有celZ和celY两者的菌株SZ21(pCPP2006)产生最高活性，为29.3±1.6U/ml培养物。仅含celZ的菌株SZ6(pCPP2006)产生22.5±1.7U/ml，而含有celY的菌株SZ22(pCPP2006)(缺失celZ的菌株SZ21)产生1.0±0.1U/ml。每种菌株分泌约60％的所述活性，其余的为细胞相关活性，容易通过温和超声处理而被释放。在亲代菌株P2(pCPP2006)中没有检测到内切葡聚糖酶活性。
纤维二糖苷的分析纤维二糖苷的存在通过薄层色谱和HPLC分析。得自SigmaChemical Company的制剂以及在我们实验室中制备的制剂是相似的。两个薄层色谱图(图17，图面A和B)的第1泳道显示了在发酵开始时Sigma产品的代表性分离。存在少量葡萄糖和纤维二糖、中等量的纤维三糖和纤维六糖以及大量的纤维四糖和纤维五糖。然而，最强区保留在原点。该区含有大于6个残基的纤维二糖苷和其它未鉴定的化合物。
HPLC分析与薄层色谱图一致。所述Sigma产品含有3％葡萄糖、3％纤维二糖、13％纤维三糖、25％纤维四糖、22％纤维五糖和9％纤维六糖。根据峰面积，大约25％的所述糖大于6个残基。在我们实验室中制备的纤维二糖苷含有7％葡萄糖、6％纤维二糖、10％纤维三糖、15％纤维四糖、12％纤维五糖、19％纤维六糖，30％的糖大于6个葡糖基残基。
纤维二糖苷的发酵图17显示了薄层色谱图，比较了菌株P2(pCPP2006)和一种分秘两种内切葡聚糖酶CeIY和CelZ的衍生物SZ21(pCPP2006)的纤维二糖苷(Sigma Chemical Company)的发酵。证实了菌株P2利用葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖，这在36小时后尤其明显。然而，该菌株不能代谢较长的纤维二糖苷。相反，菌株SZ21降解和代谢实际上所有的所述不同的纤维二糖苷和一部分原点处的物质。重要的注意到，在10小时后，SZ21发酵物中的纤维二糖和纤维三糖的水平是原始含量的数倍。这种增加归因于分泌型CelY和CelZ对较长纤维二糖苷的水解。
也检查了从实验室纤维二糖苷生产乙醇期间分泌型内切葡聚糖酶的效力(表17)。虽然由于底物浓度低，仅产生低水平的乙醇，但CelZ内切葡聚糖酶的益处仍是非常明显的。亲代P2(pCPP2006)和菌株SZ22(pCPP2006；仅CelY)产生的乙醇是分泌CelZ的两种菌株SZ6(pCPP2006；仅CelZ)和SZ21(pCPP2006；CelY和CelZ)的一半。用纤维二糖苷作为底物，内切葡聚糖酶CelY没有益处，这与其需要长链底物是一致的。
估计基于含有小于7个葡糖基残基的纤维二糖苷的乙醇产量(表17)。对于产生内切葡聚糖酶CelZ的两种菌株，观察到理论产量的62％的平均值。先前测量菌株P2在发酵100g/L纤维二糖期间产量较高(超过90％)(Wood和Ingram 1992)。有可能用低浓度纤维二糖苷观察到的产量较低部分是由于蒸发损失和较大部分的碳转向细胞生长所致。
磷酸溶胀.纤维素的非晶形纤维素含量酸胀纤维素在除去酸和贮存期间，由于纤维素带状结构之间有大量氢键而部分再结晶。菊欧文氏菌CelY和CelZ水解非晶形纤维素和羧甲基纤维素，但不能水解晶态纤维素。这种晶态纤维素对内切葡聚糖酶水解的抗性用来估计作为不溶性物质损失的仍保持非晶形的经洗涤的酸胀纤维素的比率(干重)。将非晶形纤维素样品重复与新鲜内切葡聚糖酶制剂(～20 U/ml)温育。在最初12小时处理后，28％的干重溶解。在连续4次处理后，43％溶解，并且在最后2次处理期间保持不变。该数值43％代表对保留非晶态的纤维素的百分比的估计值。非晶形纤维素的实际百分率可能略低，因为估计值也包括在离心和洗涤期间可以发生的晶态纤维素的损失。
非晶形纤维素的发酵高水平内切葡聚糖酶的功能表达足以允许非晶形纤维素被两种产酸克雷伯氏菌P2的衍生物直接转化为乙醇(表17；图18)。试验了三种浓度的非晶形纤维素，获得相似的结果。
分泌CelY和CelZ内切葡聚糖酶组合的菌株SZ21(pCPP2006)所产生的水平最高。仅分泌CelZ的菌株SZ6(pCPP2006)产生较低水平的乙醇。亲代菌株P2(pCPP2006；无内切葡聚糖酶)和仅分泌CelY的菌株SZ22(pCPP2006)从种子培养基中的残留葡萄糖产生少量的乙醇。CelY和CelZ的联合效应看来对于乙醇生产和乙醇产量而言是协同的，尽管单独的CelY缺乏效力。菌株SZ21(pCPP2006；两种酶)的乙醇产量范围为最大理论值的58％-76％。这种对乙醇生产的协同作用可能是由于底物专一性差异引起的水解增加所致。
非晶形纤维素发酵期间的粘度变化在分泌内切葡聚糖酶的菌株发酵非晶形纤维素期间，观察到显著的粘度变化(图18)。在SZ6(pCPP2006；仅CelZ)和SZ21(pCPP2006；CelY和CelZ)温育的前2个小时期间显示出最大的粘度降低，从接近纯甘油的粘度降低接近水的粘度。用SZ22(pCPP2006；仅CelY)观察到不太显著的变化，而用作为对照的亲代菌株P2(pCPP2006)没有显示出变化。粘度的变化在12小时后基本完成。
在表17中定量了实验4发酵结束时的粘度之差(图18，图面C)。这些粘度相差三个数量级。观察到不产生内切葡聚糖酶的P2(pCPP2006)的最终粘度最高，为1,300厘泊。在用SZ22(pCPP2006)发酵期间，由于单独的内切葡聚糖酶CelY的水解，粘度降低一半(500厘泊)。在发酵结束时，得自分泌CelZ的两种菌株的肉汤粘度基本上等于水的粘度，SZ21(pCPP2006；CelY和CelZ)的粘度为1厘泊，而SZ6(pCPP2006；仅CelZ)的粘度为2厘泊。显然，单独的CelZ比单独的CelY更有效。当在发酵结束时(96小时)进行比较时，无进一步的益处可归因于联合产生CelY与CleZ，虽然两种酶在乙醇生产中(表17；图18)和糖化期间协同作用。
总之，使用例如产酸克雷伯氏菌菌株SZ21的这些结果表明了朝着下述目标的改进在不加入补充酶的情况下生产足够的纤维素酶，以便直接生物转化纤维二糖苷和非晶形纤维素为乙醇。该菌株产生的内切葡聚糖酶水平超过了先前报道的有关酵母和其它细菌的工程菌株在乙醇发酵期间的水平的10倍(Brestic-Goachet等1989，Cho等1999，Cho和Yoo 1999，Misawa等1988，Su等1993，Van Rensburg等1996，1998)。此外，菌株SZ21产生的内切葡聚糖酶水平大致等于商业纤维素酶浓缩物中存在的内切葡聚糖酶活性的1％(Nieves等1998，Tomme等1995，Wlson等1997)。
菌株SZ21在非晶形纤维素水解方面的效力是由于两种菊欧文氏菌内切葡聚糖酶联合和协同作用所致(Guiseppi等1991，Zhou和Ingram2000)。此外，这些分泌型酶用产酸克雷伯氏菌中的磷酸转移酶系统发挥作用，所述系统提供对纤维二糖和纤维三糖的有效摄取和代谢(Wood和Ingram 1992，Lai等1997)。
表17.用纤维二糖苷和非晶形纤维素的乙醇生产
a通过离心收获用于纤维二糖苷发酵的接种物，以消除作为乙醇源的种子肉汤。从用来接种三种非晶形纤维素发酵物的种子肉汤中残留的糖，产生平均为1.85g/L的乙醇。
b**表示所述数值与缺乏编码菊欧文氏菌内切葡聚糖酶的基因的对照菌株(P2)有显著差异(p＜0.001)。
c产量以最大理论值的百分率计算，假定每克纤维二糖产生0.54g乙醇，而每克非晶形纤维素产生0.56g乙醇。对于非晶形纤维素，在减去从接种物中的糖产生的乙醇之后，计算产量。
d纤维二糖苷(g/L)代表葡萄糖加含有小于7个葡糖基残基的纤维二糖苷之和。
e实验2和实验3中的最高变异系数为平均值的4.5％。假定一个相似的变异系数(实测值的5％)，估计实验3也有显著性。
等同方案本领域技术人员会认识到或者能够仅用常规实验确定本发明具体实施方案的许多等同方案。下面的权利要求书将包括这类等同方案。此外，在美国专利第5,821,093；5,482,846；5,424,202；5,028,539；5,000,000；5,487,989，5,554,520和5,162,516号中描述的任何遗传构建体、宿主细胞和方法可以用来实施本发明，将其通过引用结合到本文中。
序列表<110>BC International<120>用于同时糖化发酵的方法和组合物<130>BCI-024CPPC<140>
<141>
<150>60/214,137<151>2000-06-26<150>60/219,913<151>2000-07-21<160>17<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>450<212>DNA<213>运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)<220>
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<223>人工序列的描述引物<400>13ctgttccgtt accaacac 18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gtgaatggga tcacgagt 18<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15accatcagca tcaacgccca acaacg26<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>16gactggatgg ttatccgaat aagagagagg 30<210>17<211>11772<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成构建体<220>
<223>尚未测序的欧文氏菌属(Erwinia)DNA片段从核苷酸位置1143至144<220>
<223>celz的P1启动子区从核苷酸位置4424至2974<220>
<223>整合的引导片段从核苷酸位置4677至7573<220>
<223>已测序的部分引导片段从核苷酸位置4677至5752<220>
<223>尚未测序的部分引导片段从核苷酸位置5753至7573<220>
<223>celY的P2启动子区从核苷酸位置7585至8576<220>
<223>R6K-Y ori从核苷酸位置10388至10763<220>
<223>FRTF脂酶结合序列从核苷酸位置16至50<220>
<223>FRTF脂酶结合序列从核苷酸位置10058至10092<220>
<223>celz基因产物由核苷酸2973-1690的互补物编码<220>
<223>celY基因产物由核苷酸8576-9574编码<220>
<223>卡那霉素抗性基因产物由核苷酸11621-10827的互补物编码<400>17atcgatgaat tgatccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaattgtcga 60caagcttgat ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc ggaattcccc 120tgcaggtcga ctctagagga tcannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 480nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 540
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1.一种用于降解寡糖的组合物，所述组合物包含一种具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，和一种具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
2.权利要求1的组合物，其中所述第一种内切葡聚糖酶、或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶来源于细胞提取物。
3.权利要求2的组合物，其中所述细胞提取物来源于细菌细胞。
4.权利要求3的组合物，其中所述细菌细胞已经被重组工程化，以表达所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶，或者表达所述第一种和所述第二种内切葡聚糖酶两种酶。
5.权利要求4的组合物，其中所述细菌细胞选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。
6.权利要求5的组合物，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属(Escherichia)或者是克雷伯氏菌属(Klebsiella)。
7.权利要求3的组合物，其中所述细胞提取物包含一种由celZ编码的第一种内切葡聚糖酶和一种由celY编码的第二种内切葡聚糖酶，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属(Erwinia)。
8.权利要求1的组合物，其中所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
9.权利要求7的组合物，其中所述比率的范围为约9∶1至约19∶1。
10.权利要求1的组合物，其中所述第一种内切葡聚糖酶或所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶是经纯化的。
11.权利要求1的组合物，其中所述降解的协同因数范围为约1.1至约2.0。
12.权利要求11的组合物，其中所述因数为约1.8。
13.权利要求1的组合物，所述组合物还含有额外的一种酶。
14.权利要求13的组合物，其中所述额外的酶选自内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。
15.权利要求14的组合物，其中所述葡聚糖酶来源于真菌。
16.权利要求15的组合物， 其中所述真菌是T.longibranchiatum。
17.权利要求13的组合物，其中所述额外的酶是一种产乙醇酶。
18.权利要求17的组合物，其中所述产乙醇酶选自丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
19.权利要求1的组合物，其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶分别包装。
20.权利要求1的组合物，其中所述组合物用于同时糖化发酵。
21.权利要求1的组合物，其中所述寡糖选自纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶和其任何组合。
22.一种降解寡糖的方法，所述方法包括使寡糖与具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
23.权利要求22的方法，其中所述寡糖与所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶的所述接触以任何顺序进行或者同时进行。
24.权利要求22的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶、或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶来源于细胞提取物。
25.权利要求24的方法，其中所述细胞提取物来源于细菌细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述细菌细胞已经被重组工程化，以表达所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶，或者表达所述第一种和所述第二种内切葡聚糖酶两种酶。
27.权利要求25的方法，其中所述细菌细胞选自肠杆菌科。
28.权利要求27的方法，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属或者是克雷伯氏菌属。
29.权利要求25的方法，其中所述细菌细胞提取物包含一种由celZ编码的第一种内切葡聚糖酶和一种由celY编码的第二种内切葡聚糖酶，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
30.权利要求22的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
31.权利要求30的方法，其中所述比率的范围为约9∶1至约19∶1。
32.权利要求22的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶或所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶是经纯化的。
33.权利要求22的方法，其中所述降解的协同因数范围为约1.1至约2.0。
34.权利要求33的方法，其中所述因数为约1.8。
35.权利要求22的方法，所述方法还包括使所述寡糖与一种额外的酶接触。
36.权利要求35的方法，其中所述额外的酶是选自以下的一种葡聚糖酶内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。
37.权利要求36的方法，其中所述葡聚糖酶来源于真菌。
38.权利要求37的方法，其中所述真菌是T.longibranchiatum。
39.权利要求35的方法，其中所述额外的酶是一种产乙醇酶。
40.权利要求39的方法，其中所述产乙醇酶选自丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。
41.权利要求22的方法，其中所述方法用于同时糖化发酵。
42.权利要求22的方法，其中所述寡糖选自纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶和其任何组合。
43.权利要求22的方法，其中所述方法在水溶液中进行。
44.一种适用于降解寡糖的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含一种第一异源多核苷酸区段，编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；和一种第二异源多核苷酸区段，编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，并且其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和所述第二种两种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
45.权利要求44的重组宿主细胞，其中所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。
46.权利要求44的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种细菌细胞。
47.权利要求46的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自肠杆菌科。
48.权利要求47的重组宿主细胞，其中所述宿主是埃希氏菌属或者是克雷伯氏菌属。
49.权利要求48的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)B、大肠杆菌DH5α和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。
50.权利要求44的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞还包含一种额外的酶。
51.权利要求48的重组宿主细胞，其中所述额外的酶选自葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂合酶或它们的组合。
52.权利要求50的重组宿主细胞，其中所述额外的酶是一种产乙醇酶。
53.权利要求50的重组宿主细胞，其中所述酶是选自丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的产乙醇酶。
54.权利要求50的重组宿主细胞，其中所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
55.权利要求44的重组宿主细胞，其中所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
56.权利要求50的重组宿主细胞，其中所述额外的酶是一种分泌型酶。
57.权利要求56的重组宿主细胞，其中所述分泌型酶是一种pul或out基因的产物。
58.权利要求44的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是产乙醇的。
59.权利要求58的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌KO4(ATCC 55123)、大肠杆菌KO11(ATCC 55124)、大肠杆菌KO12(ATCC 55125)和大肠杆菌LY01(ATCC 11303)和产酸克雷伯氏菌P2(ATCC 55307)。
60.一种增强寡糖降解的方法，所述方法包括使寡糖与一种宿主细胞接触，所述宿主细胞包含一种第一异源多核苷酸区段，编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；和一种第二异源多核苷酸区段，所述区段含有编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶的序列，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和所述第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，从而增强所述寡糖的降解。
61.权利要求60的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶、或者所述第一种和所述第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。
62.权利要求60的方法，其中所述宿主细胞是产乙醇的。
63.权利要求60的方法，其中所述方法在水溶液中进行。
64.权利要求60的方法，其中所述方法用于同时糖化发酵。
65.权利要求60的方法，其中所述寡糖选自纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶和其任何组合。
66.一种制备适用于降解寡糖的重组宿主细胞的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入一种第一异源多核苷酸区段，编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；和一种第二异源多核苷酸区段，包含编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶的序列，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和所述第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
67.权利要求65的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶或者所述第二种内切葡聚糖酶或者所述第一种和第二种两种内切葡聚糖酶是分泌型的。
68.权利要求66的方法，其中所述宿主细胞是产乙醇的。
69.权利要求66的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
70.权利要求66的方法，其中所述第一异源多核苷酸区段或者所述第二异源多核苷酸区段、或者所述第一和第二两种多核苷酸区段的所述替代启动子包含一段来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的多核苷酸片段。
71.权利要求68的方法，其中所述重组宿主细胞适用于同时糖化发酵。
72.权利要求70或71的方法，其中所述宿主细胞是产乙醇的。
73.一种制备重组宿主细胞整合体的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入包含pLOI2352(SEQ ID NO17)的多核苷酸序列的载体；并且鉴定稳定整合了所述载体的宿主细胞。
74.一种在宿主细胞中表达内切葡聚糖酶的方法，所述方法包括向所述宿主细胞中导入包含pLOI2306(SEQ ID NO12)的多核苷酸序列的载体；并且鉴定表达所述内切葡聚糖酶的宿主细胞。
75.一种从寡糖源生产乙醇的方法，所述方法包括使所述寡糖源与一种产乙醇宿主细胞接触，所述产乙醇宿主细胞包含一种第一异源多核苷酸区段，编码具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下；和一种第二异源多核苷酸区段，编码具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，其中所述区段处于一种替代启动子的转录控制之下，其中所述第一种内切葡聚糖酶和所述第二种内切葡聚糖酶被表达，使得所述第一种和所述第二种降解活性以一定的比率存在，致使所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，产生被降解的寡糖，所述降解的寡糖被发酵为乙醇。
76.权利要求75的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY基因编码，其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
77.权利要求75的方法，其中所述宿主细胞还包含一种编码至少一种pul基因或out基因的异源多核苷酸区段。
78.权利要求75的方法，其中所述宿主细胞选自肠杆菌科。
79.权利要求75的方法，其中所述宿主细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属。
80.权利要求79的方法，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌KO4(ATCC 55123)、大肠杆菌KO11(ATCC 55124)、大肠杆菌KO12(ATCC55125)和产酸克雷伯氏菌P2(ATCC 55307)。
81.权利要求75的方法，其中所述方法在水溶液中进行。
82.权利要求75的方法，其中所述寡糖选自纤维寡糖、木素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶及其任何组合。
83.权利要求75的方法，其中所述异源多核苷酸区段是pLOI2352(SEQ ID NO17)，或者来源于pLOI2352(SEQ ID NO17)。
84.权利要求75的方法，其中所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
85.权利要求75的方法，其中所述第一多核苷酸区段或者所述第二多核苷酸区段、或者所述第一和第二两种多核苷酸区段的所述替代启动子含有一段来源于运动发酵单胞菌的多核苷酸片段。
86.一种载体，所述载体包含选自以下的一种质粒的多核苷酸序列或其片段pLOI2311、pLOI1620、pLOI2316、pLOI2317、pLOI2318、pLOI2319、pLOI2320、pLOI2323、pLOI2342、pLOI2348、pLOI2349、pLOI2350、pLOI2352、pLOI2353、pLOI2354、pLOI2355、pLOI2356、pLOI2357、pLOI2358和pLOI2359。
87.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一种载体，所述载体具有选自以下的一种质粒的多核苷酸序列或其片段pLOI2311、pLOI1620、pLOI2316、pLOI2317、pLOI2318、pLOI2319、pLOI2320、pLOI2323、pLOI2342、pLOI2348、pLOI2349、pLOI2350、pLOI2352、pLOI2353、pLOI2354、pLOI2355、pLOI2356、pLOI2357、pLOI2358和pLOI2359。
88.权利要求87的宿主细胞，其中所述宿主选自产酸克雷伯氏菌菌株P2(pCPP2006)、产酸克雷伯氏菌菌株SZ6(pCPP2006)、产酸克雷伯氏菌菌株SZ21(pCPP2006)和产酸克雷伯氏菌菌株SZ22(pCPP2006)。
89.一种降解寡糖的方法，所述方法包括获得具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，获得具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，使寡糖与所述第一种和第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解。
90.一种增强寡糖降解的方法，所述方法包括使寡糖与具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶和具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶协同进行所述寡糖的降解，从而增强所述寡糖的降解。
91.权利要求89或90的方法，其中所述寡糖降解伴随有粘度的变化。
92.权利要求91的方法，其中所述变化是降低。
93.权利要求91的方法，其中所述变化是粘度降低至少选自以下的一种量5厘泊、10厘泊、20厘泊、50厘泊、100厘泊、500厘泊和1000厘泊。
94.权利要求91的方法，其中所述寡糖为纤维素。
95.权利要求94的方法，其中所述纤维素来源于选自纸、纸浆或粕、和植物纤维的一种来源。
96.一种降解寡糖的方法，所述方法包括获得具有第一种降解活性的第一种内切葡聚糖酶，获得具有第二种降解活性的第二种内切葡聚糖酶，使寡糖与所述第一种和第二种内切葡聚糖酶接触，其中所述第一种和第二种降解活性以一定的比率存在，使得所述第一种和第二种内切葡聚糖酶降解所述寡糖，导致粘度变化。
97.一种适用于降解寡糖的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段；和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段。
98.一种适用于降低寡糖粘度的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段；和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段。
99.权利要求97或98的重组宿主细胞，其中所述第一异源多核苷酸区段处于一种替代启动子的转录控制之下，而所述第二异源多核苷酸区段处于一种替代启动子的转录控制之下。
100.权利要求97或98的重组宿主细胞，其中所述细胞为细菌细胞。
101.权利要求100的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞选自肠杆菌科。
102.权利要求101的重组宿主细胞，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属。
103.权利要求100的重组宿主细胞，其中所述第一种内切葡聚糖酶由celZ编码，而所述第二种内切葡聚糖酶由celY编码，并且其中celZ和celY来源于欧文氏菌属。
104.权利要求97的重组宿主细胞，其中所述第一种内切葡聚糖酶是EGZ，而所述第二种内切葡聚糖酶是EGY。
105.一种酶提取物，所述酶提取物得自权利要求97的宿主细胞。
106.重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株P2(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)。
107.重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ6(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
108.重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ21(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
109.重组宿主菌株产酸克雷伯氏菌菌株SZ22(pCPP2006)，该菌株以保藏号ATCC＿＿保藏于美国典型培养物保藏中心。
110.一种重组细胞，所述重组细胞包含一种编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段；和一种编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段，其中所述编码第一种内切葡聚糖酶的第一多核苷酸区段、或者所述编码第二种内切葡聚糖酶的第二多核苷酸区段、或者所述编码第一种内切葡聚糖酶的第一异源多核苷酸区段和所述编码第二种内切葡聚糖酶的第二异源多核苷酸区段，在氨基酸序列比对中与得自欧文氏菌属的celY基因产物或者celZ基因产物在享有能够降解多糖的功能活性方面足够同源。
全文摘要
本发明提供用于内切葡聚糖酶协同降解寡糖的组合物和方法。本发明还提供含有一种或多种编码能够协同降解寡糖的内切葡聚糖酶的基因的重组宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是产乙醇的，并且能够进行同时糖化发酵，导致从复合纤维素底物生产乙醇。
文档编号C12P19/14GK1505682SQ01814604
公开日2004年6月16日 申请日期2001年6月19日 优先权日2000年6月26日
发明者L·O·因格拉姆, L O 因格拉姆, S·周 申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司