用于在真核基因组中置换、转移和富积dna的方法

文档序号:588246阅读:744来源:国知局
专利名称:用于在真核基因组中置换、转移和富积dna的方法
技术领域
001本发明属于将核酸引入真核生物染色体上,以获得特异和稳定的整合的方法领域。更具体地,本发明涉及在目的结构中获得核酸的位点特异性置换的方法。本发明利用了使用原核重组酶多肽如ΦC31整合酶的位点特异性重组系统。
背景技术
002自从20世纪80年代早期开创转化技术的进展,其中的许多研究成果被恰当地直接用于该技术的横向发展。值得强调的是,现在已能在广泛的植物品种中进行转化。但是,贸易下滑使得转化过程效率的研究进展得到较少的关注。与许多微生物系统相比,植物转化显得有些陈旧。常规地利用许多微生物系统可获得数百万独立的转化体,而在植物中,这些数量一般在一到两位数的范围。因此,用散弹转化方法来发现基因不是一个可取的选择。
003由于表型高度一致性,微生物基因转移只需要分析相对极少数的代表性克隆,与此不同,植物基因转移的独立转化体表现出高度可变的表达水平和模式。因此,对一个典型的DNA构建体,二十至五十个独立的初级转化体是必需的。对于一个新特征的商业开发,要筛选成百上千的独立转化体,以得到少数几个具有合适的转基因结构和表达的转化体。
004植物中转基因表达的高度多样性的根本原因还没有被完全理解,但是至少有四个因素与这个现象有关。(1)组织培养体细胞克隆变异长期与组织培养再生植物有关。在体细胞克隆变异体中,染色体结构和倍数、DNA序列、DNA修饰和转座子活性发生改变都被报道过(Peschke和Phillips,1992遗传学进展(Advancesin Genetics),3041-75;Kaeppler等人,2000植物分子生物学(Plant Mol.Biol.),43;179-88)。(2)整合位点染色体的结构,如端粒体或异染色质被认为会影响相邻基因的表达(Stavenhagen和Zakian,1994基因和发育(Genes and Dev.),81411-22;Howe等人,1995遗传学(Genetics),1401033-45;Wallrath和Elgin,1995基因和发育,91263-77)。当一个转基因整合在随机位点上,可以预计染色体对转基因表达的影响在各独立的转化体之间是不同的(Meyer,2000植物分子生物学,43221-34)。(3)转基因冗余被转化的植物常常包含可变数量的转基因。基因表达和拷贝数之间很少有正相关。相反,许多例子显示多余的全部或部分转基因拷贝与转录后和转录水平的基因沉默有关(Muskens等人,2000植物分子生物学,43243-60;Matzke等人,2000植物分子生物学,43401-15)。(4)遗传突变如对于任何遗传学操作所预计的,往往都有获得点突变、缺失或重排的可能性(Battacharyya等人,1994 Plant J.,6957-68)。
005植物基因转移的现有方法常常在插入基因座产生一个复合体整合结构。一般的,被引入的分子的多个整体和/或部分拷贝排成直接和/或间接的重复。同样还插入可选择性标记以及在选择到含有该构建体的预期有机体或植物后并不需要的其它调控区域。这些复杂模式并不是研究的障碍,但它们在商业用途上不是令人合意的。结构上的证实是得到主管机构批准的一个先决条件,并且简单的整合模式更容易被表征。重复DNA也易于在结构上和功能上不稳定。重复序列能参与染色体内和染色体间的重组。即使复合整合基因座产生了合适的表型,在经历了无数有关繁殖和种子形成的杂交程序后,它可能难于保持最初的结构以及它的特定表达模式。多基因拷贝,特别是如果某些被排成间接重复,常常与同源性依赖的基因沉默有关(Iyer等人,2000植物分子生物学,43179-88;Muskens等人,2000同上)。
006基于位点特异性的重组系统的方法已被描述可用于通过删除基因组中多余的相关拷贝,得到随机整合的单拷贝转基因(Srivastava和Ow,1999美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),9611117-11121;Srivastava和Ow,2001植物分子生物学,46561-566)和用于在基因组中已知的染色体位置上插入DNA(O’Gorman等人,1991科学(Science),2511351-55;Baubonis和Sauer,1993核酸研究(Nucl.,Acids Res.),212025-29;Albert等人,1995植物杂志(Plant J.),7649-590)。这些方法利用了完全可逆的位点特异性重组系统。这些可逆系统包括以下来自于噬菌体P1的Cre-lox系统(Baubonis和Sauer,1993,同上;Albert等人,1995植物杂志,7649-59),酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)的FLP-FRT系统(O’Gorman等人,1991,同上),Zygosaccharomyces rouxii的R-RS系统(Onouchi等人,1995分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)247653-660),来自于噬菌体Mu的被修饰的Gin-gix系统(Maeser和Kahmann,1991分子基因遗传学,230170-76),来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)质粒的β-recombinase-six系统(Doaz等人,1999生物化学杂志(J.Biol.Chem.),2746634-6640),和来自于细菌转座子Tn1000的γδ-res系统(Schwikardi和Dorge,2000 FEBS let.471147-150)。Cre,FLP,R,Gin,β-recombinase和γδ是重组酶,而lox,FRT,RS,gix,six和res是各自的重组位点(由sadowski综述,1993 FASEB J.,7750-67;Ow和Medberry,1995 Crit.Rev.Plant Sci.14239-261)。
007上述重组系统在性质上的共同点是,单个多聚重组酶催化两个相同或几乎相同的序列位置之间的重组。每个重组位点由发生链交换的一段短的不对称间隔序列和两侧的用于重组酶结合的反向重复序列组成。间隔序列的不对称性使重组位点有方向性,并且确定了重组反应的结果。在直接或间接定位的顺式位点之间重组,分别删除或反转插入的DNA。在反式位点之间重组,导致两个线性DNA分子相互易位,或者共整合(如果这两个分子中至少有一个是环状的)。因为重组产生的产物位点自身是随后重组的底物,故该反应是完全可逆的。但是,在实践中,删除基本上是不可逆的,因为发生两个重组位点紧密相连的分子内反应的可能性比未相连的位点之间发生分子间反应的可能性高得多。必然的结果是插入到基因组重组位点的DNA分子很容易被切除。
008与完全可逆的重组系统相比,有重组系统能催化不可逆的反应。这些系统中的一个是来自噬菌体λ,λ整合酶使被称为attB和attP的非相似序列发生重组,形成attL和attR。这个反应需要目的位点的DNA超螺旋和辅助蛋白质IHF和FIS。逆向反应,即从attL和attR形成attB和attP,需要另外一个被称为XIS的切除特异性蛋白质。缺乏这些必要条件时,突变的整合酶蛋白质能执行分子内的反应,但不能执行分子间的反应。利用这些突变λ整合酶,Lorbach等人(2000分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),2961175-81)显示在导入人类基因组的重组靶点中发生了DNA倒置。
009现有技术中描述过的一个更有用的不可逆的重组系统是链霉菌属噬菌体ΦC31重组系统。68kDa整合酶蛋白质重组attB位点和attP位点。这些位点在交换位点上仅有三个碱基的同源性。同源序列的两侧是反向重复序列,很可能是整合酶蛋白质的结合位点。ΦC31attB和attP两者中最小的已知功能大小大约是30到40个碱基对。ΦC31整合酶重组它的同类附着位点的功效在recA突变的大肠杆菌(Escherichia coli)的体外和体内实验中都被展示过(Thorpe和Smith,1998美国国家科学院院刊,955505-10)。不像噬菌体λ系统,ΦC31整合反应简单,因为它不需要任何宿主因子。不像噬菌体λ突变整合酶系统,它能执行分子间和分子内的反应。
0010现有技术中利用可逆的重组系统的技术需要复杂的策略来防止DNA被切除或从基因组中交换回去。现有技术中需要能获得转基因的稳定的位点特异性整合的组合物和方法,以便1)将DNA分子作为单拷贝被引入;2)插入的DNA不容易发生切除,3)与基因整合过程相关,但之后不再需要的过剩的DNA能被除去,和/或4)另外的DNA能与先前插入DNA相邻的现有位点相连。
发明概述0011本发明提供了这样的组合物和方法,能用于经有限的整合和/或切除步骤得到转基因的稳定的位点特异性整合。这些整合和切除步骤导致1)DNA分子作为单拷贝被引入;2)插入的DNA不容易发生切除,3)与基因整合过程相关,但之后不再需要的过剩的DNA能被除去,和/或4)另外的DNA能与先前插入DNA相邻的现有位点相连。
0012特别是,本发明提供了一种在真核细胞中进行基因置换的方法,包括使用不可逆的重组位点和不可逆的重组酶,如来自噬菌体ΦC31的重组酶。本发明不仅提供了被引入基因的单拷贝的稳定整合,而且本发明首次描述了使用不可逆的重组酶,经一到两步使供体构建体与受体构建体置换。因此,在此描述的置换方法优于现有技术中的整合和切除方法。
0013本发明具体地提供了一种在真核细胞中获得位点特异性基因置换的方法,包括以下步骤1)提供包括受体构建体的真核细胞,该受体构建体的受体多核苷酸两侧是两个不可逆的重组位点(在此之后称为“IRS”);2)向细胞中引入供体构建体,该供体构建体的供体多核苷酸两侧是两个不可逆的互补重组位点(在此之后称为“CIRS”);和3)用不可逆的重组酶多肽接触受体构建体和供体构建体。优选地,不可逆的重组酶多肽是一种ΦC31重组酶,并且重组酶催化第一种(IRS)和第二种(CIRS)重组位点之间的重组反应,导致供体多核苷酸置换受体多核苷酸,并形成置换构建体(

图1A)。在ΦC31重组位点的情况下,如果IRS是attP,那么CIRS是attB,或者如果IRS是attB,那么CIRS是attP。
0014本发明的方法可用于从多种供体构建体转移多核苷酸到多种受体构建体。例如,本发明可用于从环状载体,如质粒,转移多核苷酸到染色体,或将DNA区段从一个染色体转移到另一个染色体。本发明也能用于转移任何长度的线性多核苷酸,只要该多核苷酸位于两个CIRS之间即可。优选的,被转移的DNA的范围是1000-2000个碱基对。本发明的这一方面允许将来自cDNA文库的多核苷酸直接转移到诸如染色体的受体构建体中,并且不需要克隆多核苷酸到质粒载体的额外步骤。
0015本发明也包括删除置换构建体中不希望有的核苷酸序列的方法,包括使置换构建体与可逆的重组酶接触。在这些方法中,每个供体构建体和受体构建体都含有两个或更多的可被可逆重组酶识别的可逆重组位点(在此之后提到“RRS”)。在一个实施例中,可逆重组酶是Cre,重组位点是lox位点。
0016结合置换和删除策略,本发明提供了在真核细胞中富积基因的方法。本发明的方法导致在基因组位点准确地富积一系列特征基因,而不会插入可能会导致额外担心的其它不需要的DNA,例如抗生素抗性标记。该方法在下面有更详细的描述。
0017以上和以下描述的方法可用于稳定地整合一段多核苷酸到任何能被多核苷酸转化的真核细胞中。在一个优选的实施例中,真核细胞是植物或动物细胞。因此,本发明又包括制备转基因哺乳动物和植物的方法。在此描述的一个用于制造转基因植物的方法包括步骤1)提供包括染色体受体多核苷酸的受体植物,该受体多核苷酸两侧是两个不可逆的重组位点(IRS);2)提供包括染色体供体多核苷酸的供体植物,该供体多核苷酸两侧是两个不可逆的互补重组位点(CIRS);和3)使供体植物和受体植物杂交,产生杂合转基因植物。根据本发明,通过该方法产生的转基因植物表达不可逆的重组酶多肽,能催化IRS和CIRS重组,使受体多核苷酸被供体多核苷酸置换,因此在转基因植物中形成染色体置换构建体。在一个优选的实施例中,受体植物是单拷贝的受体品系。在进一步的实施例中,选择出含有置换构建体、但不表达不可逆的重组酶多核苷酸的转基因植物后代。
图表的简要描述0018描述的所有图是示意图(不是按比例的)。为简单起见,基因转录的启动子在图中清楚地标出,而促进转录终止,位于每个编码序列下游的终止子没有作为独立的成分表示出来。
0019图1A和图1B表示利用可逆的或不可逆的重组系统进行的DNA交换反应。在不可逆的重组系统中(图1A),在IRS和CIRS之间重组,形成不能再被不可逆重组酶识别的杂合位点。在可逆的重组系统中(图1B),在RRS和RRS之间的重组将产生两个RRS位点产物,它们能继续相互重组。因此,交换入位点的DNA也可以被交换出来。这个例子显示了两个不同的RRS位点,叫做RRS-1和RRS-2。
0020图2A-G表示在粟酒裂殖酵母leu1基因座的双重位点重组策略。从pLT50(图2A-B)得到的线性attB-ura4+-attB DNA在分子的两端发生重组,产生准确的基因置换(图2C,一类)。另外,可以观察到一些副反应,其中通过同源重组使线性分子重新环化形成环状中间前体(图2D),之后插入目标基因座的5’attP(图2E,二类)或者3’attP位点(图2F,三类)。当用环状pLT50作转化底物时,回收一个克隆,其中在pLT50的5’attB位点和leu1的5’attP位点之间发生一次重组,得到如图所示的结构。(图2G,四类)。预计的内切核酸酶XbaI(X)或NdeI(N)裂解产物的大小如图所示。
0021图3用整合酶-DNA浓度的函数来表示转化效率(C区)。分别用1μg的pLT45或pLT50 DNA以及各种量的pLT43 DNA转化FY529attP(A区)或FY529attPx2(B区)。
0022图4表示整合线性cDNA分子到哺乳动物细胞的染色体的策略。在这个例子中,每对IRS或者CIRS排成正向重复序列。
0023图5A和5B表示环状cDNA分子整合到哺乳动物细胞中后的有义和反义表达的策略。在这个例子中,每对IRS或者CIRS排成间接重复序列。图5C-D表示通过引入报告基因hpt来展示有义表达的DNA底物。图5E表示人类基因组中的单拷贝受体构建体。图5F显示DNA交换的PCR检测策略。
0024图6A和B表示cDNA分子整合到植物细胞中后的有义和反义表达的策略。在这些方法的实际操作中,没有可选择的标记连接在cDNA上。
0025图7表示仅加入一段想要的多核苷酸的一般策略。无关的DNA如选择性标记被除去。空箭头的方向代表可逆重组酶的重组位点;“int”是编码重组酶的基因,“sel1”和“sel2”是选择性标记,“P”是启动子,和“trait”是目的多核苷酸,表达时可赋予细胞以期望的特征。
0026图8A-J表示用于富积基因的一般策略。“trait 1”,“trait 2”等是独立的目的基因,表达时,可赋予细胞以期望的特征。
0027图9A-J表示用于富积基因的另一个策略。在这个例子中,利用了反向重组位点。
0028图10A-C表示单组DNA连接子通过基因置换插入基因组中的策略。在这个例子中,使用了直接定位的双重重组位点。
0029图11A-C表示在单组DNA连接子通过基因置换插入基因组中的策略。在这个例子中,使用了间接定位的双重重组位点。
0030图12A-C表示一段多核苷酸在植物染色体间的位点特异性置换(称为“DNA片段转移”事件),及随后除去特征基因表达不再需要的DNA(用P3-gus举例)的策略。
0031图13表示用可逆重组酶完成一段多核苷酸在植物染色体间的位点特异性置换的策略,其中使用Cre-lox将特征基因(P2-gus)从供体转移到受体染色体,并且利用第二个可逆重组系统,如FLP-FRT,随后除去不需要的DNA。
详细描述0032本发明提供了在真核细胞中获得稳定的位点特异性多核苷酸置换或插入的方法。例如,本发明提供了通过位点特异性的方式用一基因置换另一基因的方法。本发明的方法具有几个超过以前任何方法的优点。例如,本发明的方法可以在不需选择性标记的情况下引入一段环状DNA分子到真核细胞的基因组中。因此,例如,可以在不需要将cDNA克隆到质粒载体的中间步骤的情况下,将cDNA分子引入真核细胞。本发明也提供将想要的多核苷酸引入真核细胞染色体、并且随后除去不需要的DNA如选择性标记等用于将DNA引入细胞的成分的方法。另外,可以使用本发明的方法富积,或者在一个染色体基因座上顺次引入两个或更多的基因。
0033在一个优选的实施例中,本发明的方法利用重组酶系统得到多核苷酸在真核细胞染色体上稳定的位点特异性的置换。在此使用的术语“重组酶系统”是指重组酶(可逆的和不可逆的)和在重组反应中作为底物的重组位点。尽管如此,在此描述的方法用于将多核苷酸从多种类型的供体构建体中转移到多种类型的受体构建体中。例如,本发明能用于将多核苷酸从环状载体如质粒转移到染色体,从一个环状载体转移到另一个载体,或者从一条染色体转移到另一条。更重要地,本发明能用于转移环状多核苷酸到染色体或环状载体。更优选地,环状多核苷酸大约与被置换的受体位点DNA的长度相同。应理解,术语环状载体包括环状染色体。
0034在本发明的一个实施例中,获得真核细胞中位点特异性置换的方法包括提供含有不可逆重组酶和供体构建体以及受体构建体的细胞,其中供体构建体包括两个或更多IRS,受体构建体包括两个或更多CIRS。不可逆的重组酶催化IRS和CIRS间的重组,用供体多核苷酸取代受体多核苷酸,因此形成置换构建体(见图1)。在一个优选的实施例中,受体构建体包括两个IRS,供体构建体包括两个CIRS。在另一个实施例中,受体构建体包括三个IRS,供体构建体包括三个CIRS。
0035在此所用的术语“不可逆重组酶”是指这样的多肽,其能催化两个互补的不可逆重组位点之间重组的多肽,但在没有额外因子帮助时,该多肽不能催化通过重组产生的杂合位点之间的重组。不可逆重组酶多肽和编码重组酶多肽的核酸在现有技术中有描述,并能通过常规方法获得。例如,在美国专利号5190871中描述了包括编码ΦC31整合酶的核酸片段的载体,并且可以通过编号B-18477从北方地区研究实验室,Peoria,伊利诺伊斯州61604得到。其它不可逆重组酶的例子包括,大肠杆菌P4噬菌体重组酶(Ow和Ausubel,1983,细菌学杂志(J.Bacteriol.)155704-713),大肠杆菌λ噬菌体重组酶(Lorbach等人,2000分子生物学杂志,2961175-81),和李斯特氏菌属(Listeria)A118噬菌体重组酶(Loessner等人,2000分子微生物学(Mol.Micro.)35324-340),放线菌噬菌体R4 Sre重组酶(Matsuura等人,1996细菌学杂志,1783374-3376)。
0036所以,术语“不可逆重组位点”和“IRS”是指可作为不可逆重组酶的两种底物中的第一种的重组位点,该位点在重组后被修饰成杂合重组位点。术语“互补不可逆重组位点”和“CIRS”是指作为不可逆重组酶的两种底物中的第二种的重组位点,该位点在同源重组后被修饰成杂合重组位点。因此,本发明的一个实施例中,载体供体构建体包括一个或更多的CIRS,染色体受体构建体包括一个或更多的IRS。在另一个实施例中,染色体供体构建体包括两个CIRS,并且染色体受体构建体包括两个IRS.
0037例如,不可逆重组酶和它对应的IRS是ΦC31整合酶和attB和attP位点。应当理解attB位点和attP位点可以用来指IRS或者CIRS。如果attB是IRS,那么attP必须是CIRS。相反,如果attP是IRS,那么attB必须是CIRS。当缺乏真核细胞不存在的额外因子时,ΦC31整合酶仅仅催化attB和attP的重组。这个整合酶不能介导attB和attP重组时形成的attL和attR杂合重组位点之间的重组。因为诸如ΦC31整合酶之类的整合酶不能单独催化逆向反应,所以ΦC31整合酶催化的attB×attP重组是稳定的。因此,这些重组酶的使用不像其它重组系统,如Cre-lox或FLP-FRT系统,后者中杂合位点能作为重组酶的底物,从而产生重组反应的逆转。例如,环状分子插入目的位点能产生同一被引入DNA的逆向切除。不可逆的重组酶不能催化逆向反应,因此整合是稳定的。
0038更一般地,术语“重组位点”是指被重组酶识别的并能作为重组事件的底物的一段核苷酸序列。虽然“假重组位点”不包括在“重组位点”的范畴内,本发明也包含使用“假重组位点”。假重组位点是在真核细胞染色体上自然产生的、能作为重组酶的底物的多核苷酸序列。例如,假重组位点在PCT申请号PCT/US99/18987(WO00/11155)中有描述。
0039可以理解,重组位点一般有方向性,或者换句话说,它们不是回文序列。重组位点一般包括被核心或间隔区域分开的左右臂。因此,attB重组位点由BOB’组成,在此B、B’和O分别是左臂、右臂和间隔区域。同样地,attP是POP’,在此P和P’是臂,O也是间隔区域。attB和attP位点之间发生重组、在靶位点发生核酸整合后,整合DNA两侧的重组位点被称为“attL”和“attR”。使用上面的术语学,attL和attR位点分别包括BOP’和POB’。在此的大部分代表中,“O”被省略,例如attB和attP分别叫做BB’和PP’。重组位点之间的相对位置能决定发生何种重组事件。重组位点可以有两种不同的定位直接定位(相同方向)或反向定位。当重组位点位于同一个核酸分子,并相互直接定位,那么重组酶催化的重组事件一般是去除插入的核酸。当重组位点是反向定位,那么一般地,任何插入的序列通常被倒转。
0040可通过任何合适的方法将重组酶引入含有重组位点的真核细胞。例如,以多肽形式引入重组酶,比如,通过微注射或其它方法。但是,在优选实施例中,将编码重组酶的基因引入细胞中。基因表达产生重组酶,然后催化相应重组位点间的重组。另外,受体和供体构建体能用常规的转化方法引入真核细胞。如果愿意,用反向重组位点能促进通过复杂整合模式的拆分构建单拷贝的转基因,例如,所提到的方式在美国专利号6114600中有描述。或者,单拷贝转基因受体能通过分子筛选方法获得。
0041本发明的方法可用于稳定地整合多核苷酸到宿主生物体的基因组中。如上面提到的,本发明提供了在真核细胞中获得位点特异性基因置换的方法,包括步骤1)提供包括受体构建体的真核细胞,该受体构建体含有两侧是两个IRS的多核苷酸;2)向细胞中引入供体构建体,该供体构建体包含两侧是两个CIRS的多核苷酸;和3)用不可逆的重组酶多肽接触受体构建体和供体构建体。图1A例示该过程的方案。注意可逆重组酶系统的使用(见图1B),如用Cre-lox重组(其中Cre使loxP重组loxP,使lox511重组lox511),也将导致DNA交换反应(lox511是野生型loxP序列的一种变体)。但是,交换反应将是可逆的,因此比不可逆重组酶系统催化的不可逆反应低效。优选地,不可逆重组酶多肽是ΦC31重组酶,并且重组酶催化IRS和CIRS之间的重组,导致用供体多核苷酸置换受体多核苷酸。
0042在本发明的一个实施例中,供体多核苷酸包括可操作地连接在目的基因上的启动子。启动子是指参与RNA聚合酶结合的DNA区域,起始转录。可诱导的启动子是指指导基因表达的启动子,其中基因的表达水平可被诸如环境或发育因子改变,如温度、pH、转录因子和化学试剂。当一个DNA片段与另一个DNA片段对于有功能的关系时,该DNA片段是“可用作连接的”。例如,作为信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质形式时,该DNA即可操作连接到编码多肽的DNA上。若启动子或增强子促进编码序列的转录,则它可操作连接该编码序列。一般的,可操作连接的DNA序列是毗邻的,在信号序列的情况下,是相邻的,并处于阅读框中。但是,例如增强子不需要与它控制转录的编码序列相邻。连接是通过在方便的限制性位点或其位点插入的接头或连接子的连接来完成的。
0043在此所用的“目的基因”编码能赋予宿主细胞或宿主生物体以所期望的特征的一段多肽。例如,所期望的特征可以是增加油或脂肪酸的产量,或者更简单的,增加宿主细胞或宿主生物体中目的基因编码的多肽的产量。本领域的技术人员可以理解,“目的基因”不限于本发明中的,而包括能在真核细胞中表达的任何基因。
0044除将目的基因与供体构建体、更特别的供体多核苷酸上的启动子,可操作连接之外,在受体构建体中包括一个或更多个启动子也是所期望的。在一个优选的实施例中,受体构建体包括一个启动子,该启动子与两个IRS中的一个相邻。更优选的,启动子位于两个IRS中的一个的5’方向。在受体构建体中使启动子与IRS相邻,可使得重组事件发生后供体多肽发生表达。在进一步的实施例中,受体构建体包括与选择性标记或与重组酶基因自身可操作连接的另外的启动子。
0045启动子可能是天然地与目的基因相连,或者可能是来自不同基因或不同物种的异源启动子。在需要指导转基因植物或其它生物体的全部组织中表达基因时,可以使用“组成型”启动子,该启动子在大部分环境条件和发育或细胞分化状态下,一般是有活性的。在植物中使用的合适的组成型启动子包括,例如,花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域和启动子区域VI来自根瘤土壤杆菌的T-DNA的1’-和2’-启动子,以及本领域的技术人员所熟知的其它植物细胞中有活性的启动子。其它合适的启动子包括来自玄参花叶病毒的全长转录启动子,肌动蛋白启动子,组蛋白启动子,微管蛋白启动子,甘露碱合成酶启动子(MAS),尤其是来自拟南芥属的多种泛素或多聚泛素启动子(Sun和Callis,1997植物杂志,11(5)1017-1027),mas,Mac或DoubleMac启动子(在美国专利号5106739有描述,以及Comai等人,1990植物分子生物学,15373-381),和其它本领域的技术人员所知的来自多种植物基因的转录起始区域。例如,这些基因包括拟南芥属的ACT11(Huang等人,1996植物分子生物学,33125-139),拟南芥属的Cat3(基因银行(GenBank)号U43147,Zhong等人,1996分子基因遗传学,251196-203),油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰载体蛋白质去饱和酶的基因(GenBank No.X74782,Solocombe等人,1994植物生理学(PlantPhysiol.),1041167-1176),玉米的GPc1(GenBankNo.X15596,Martinez等人,1989分子生物学杂志,208551-565),和玉米的GPc2(GenBank No.U45855,Manjunath等人,1997植物分子生物学,3397-112)。
0046其它对植物有用的启动子也包括从Ti-或Ri-质粒,植物细胞,植物病毒或其它宿主中得到的启动子,这些启动子在植物中是有功能的。因此,在植物中发挥功能、适合在本发明的方法中使用的细菌启动子,包括章鱼氨酸合成酶启动子和胭脂氨酸合成酶启动子。合适的内源植物启动子包括1,6-二磷酸核酮糖(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)启动子,α-大豆伴球蛋白(α-conglycinin)启动子,菜豆蛋白启动子,ADH启动子和热休克启动子。
0047一般的,被表达的一段多核苷酸(如目的基因)将存在在表达盒中,意谓着该多核苷酸可操作连接表达控制序列,如启动子和终止子,它们在目的宿主细胞中是有功能的。大肠杆菌中使用的表达盒包括T7,色氨酸,或λ启动子,核糖体结合位点和优选的转录终止信号。对真核细胞而言,控制序列一般包括启动子,该启动子任选地包括来自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子,和聚腺苷酸化序列,并可能包括剪接供体和受体序列。在酵母中,方便的启动子包括GAL1-10(Johnson和Davies,1984分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),41440-1448)、ADH2(Russell等人,1983生物化学杂志,2582674-2682),PHO5(Meyhack等人,1982EMBO J.,6675-680),和MFα(Herskowitz和Oshima,1982,冷泉港实验室的酵母子生物学(编者Strathern,Jones和Broach),冷泉港,纽约,页数181-209)。
0048或者,可以使用指导目的基因在特定的组织中表达,或受更精确的环境或发育控制的启动子。这样的启动子在此称为“可诱导的”或“可抑制的”启动子。可以通过可诱导的启动子实现转录的环境条件的例子包括病原体攻击,厌氧条件,乙烯,提高温度或光照。受发育控制的启动子包括仅在某些组织中,如叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。启动子的作用可能也随着它在基因组中的位置而变化。因此,可诱导的启动子在某些位置上可能成为全部或部分组成型启动子。可诱导的启动子常常用于控制重组酶基因的表达,这样能够控制重组反应的时间。
0049西红柿的组织特异性E8启动子可用于指导基因表达,使目的基因产物定位在果实中。见,如Lincoln等人,1998美国国家科学院院刊,842793-2797;Deikman等人,1988 EMBO.J,73315-3320;Deikman等人,1992植物生理学,1002013-2017。其它合适的启动子包括那些来自编码胚胎贮藏蛋白质的基因的启动子。也已知另外的器官特异性、组织特异性和/或可诱导的外源启动子(见,如Kuhlemeier等人,1987 Ann.Rer.PlantPhysiol.,38221的参考文献),包括拟南芥的光诱导的、仅在光合成组织中有活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子(“ssu”启动子),又如拟南芥的花粉囊特异性启动子(EP344029)和种子特异性启动子(Krebbers等人,1988植物生理学,87859)。典型的绿色组织特异性启动子包括玉米的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子,二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子(ssRUBISCO)和叶绿素a/b结合蛋白质启动子。启动子也可以是髓部特异性启动子,例如在国际出版号WO/93/07278中描述的从植物TrpA基因中分离的启动子。
0050用于其它生物体的可诱导启动子包括,例如,阿拉伯糖启动子,lacZ启动子,金属硫蛋白启动子和热休克启动子,以及本领域的技术人员所知的许多其它的启动子。在酵母如粟酒裂殖酵母中可使用的可抑制性启动子的一个实施例是可被维生素B1抑制的Pmnt启动子。
0051利用本发明,可将与一个或更多个上述启动子连接的目的基因转移入受体细胞,并且更特别地,整合到受体构建体中。另外,当目的基因整合到受体构建体中后,目的基因也可与受体构建体中的启动子可操作相连。本发明的一个优点是目的基因能以有义或反义方向插入受体构建体中,从而转录成有义或反义mRNA。通过在目的基因的两侧放置两个相互反向的IRS,在受体多核苷酸的两侧放置两个相互反向的CIRS,能得到目的基因的有义和反义表达(以图5为例)。这个策略在供体构建体是环状DNA构建体,如来自cDNA文库的cDNA时特别有用。因此,本发明包括真核细胞,其中包括1)含有两侧是两个相互反向的IRS的目的基因的供体构建体,2)包括启动子的受体构建体,该启动子与受体多核苷酸相邻,所述受体多核苷酸两侧是两个相互反向的CIRS,和3)不可逆的重组酶多肽,其中与供体构建体和受体构建体相接触导致在IRS和CIRS之间重组,并用供体多核苷酸置换受体多核苷酸。本发明进一步涉及获得目的基因的反义表达的方法,包括1)向真核细胞中引入a)含有侧翼与两个相互反向的IRS相连的目的基因的供体构建体,b)包括与受体多核苷酸相邻的启动子的受体构建体,该受体多核苷酸的侧翼与两个相互反向的CIRS相连,和c)不可逆的重组酶多肽,和2)使不可逆的重组酶多肽接触供体构建体与受体构建体,从而使IRS和CIRS之间重组,发生供体多核苷酸置换受体多核苷酸。然后,根据本领域的技术人员所熟知的方法选择含有目的基因处于反义定位的置换构建体的真核细胞。
0052本发明特别可用于将串联DNA分子的单拷贝整合入真核宿主细胞。引入DNA入细胞的某些方法,如生物弹投递法,常常伴随着插入大量的相连DNA分子。估计这是由于被引入的环状质粒DNA断裂后产生的环状DNA分子事先连接引起的。本发明提供了整合串联DNA的单拷贝到受体靶位点而没有串联体的其余部分的方法。这个策略有时比图3A例示的完整环状DNA的整合更有效。更高的效率归于底物的可利用性。直接DNA投递的方法产生高百分率的染色体外分子的连环化,这减少了参与共整合反应的单拷贝环状底物的数量。对交换反应而言,串联体仍是有效的,因为对底物唯一需要的是供体多核苷酸侧翼的两个CIRS,如图3B,或图10和11所示。
0053为了在本发明宿主细胞中产生位点特异性基因置换,细胞中必须有重组酶多肽。在本发明的一些实施例中,重组酶的引入通过在细胞中引入编码重组酶的核酸来完成的。编码重组酶的基因可以在细胞中或者是瞬时地或稳定地表达。可以在引导重组酶进入细胞之前,之后,或者同时引入供体构建体。重组酶基因可以位于供体构建体中,或在分开的载体上。图5A-B表示本发明的一个实施例,在此重组酶位于分开的载体上。但是,优选的是重组酶存在于受体构建体中,并且更优选的,在受体多核苷酸上。图6A-B表示一个更优选的位点特异性置换策略,在此重组酶基因存在于受体多核苷酸中。在其它的实施例中,重组酶基因被引入转基因真核生物体中,如转基因植物、动物、真菌或诸如能与含有具有IRS和CIRS的供体和受体构建体的生物体产生杂交的生物体。因此,本发明提供了包括重组位点的核酸,以及其中编码重组酶的多核苷酸序列可操作连接到在目的真核细胞中发挥功能的启动子上的核酸。
0054为了方便选择发生了期望的基因置换的细胞,目的构建体可以包括(优选的是在重组位点间)负选择标记。在整合构建体引入并与重组酶接触后,对细胞进行负选择,以除去那些保留了负选择标记的细胞。本领域的技术人员知道合适的负选择例子,包括,如与更昔洛韦接触能杀死哺乳动物细胞的单纯性疱疹病毒胸苷激酶基因。通过这个方法,可以选择出期望的基因置换事件,而不产生含有外源DNA如抗生素抗性基因或其它选择性标记的转化细胞。图4表示一个优选的利用此负选择标记的位点特异性置换的策略。
0055本发明也包括在置换构建体中删除不想要的核苷酸序列的方法,包括使另一种重组酶接触置换构建体。在这些方法中,供体构建体和受体构建体都含有两个或更多的能被可逆重组酶识别(或兼容的)的可逆重组位点(在此之后成为“RRS”)。但是,如果第二个重组酶是不可逆的重组酶,该方法也起作用。图7图示了用第二个可逆的(图7A)或者不可逆的(图7B)重组酶系统删除不再需要的DNA,图中对应的IRS和CIRS表示为attP-2和attB-2。与不可逆重组酶相似,可逆重组酶催化两个互补RRS间的重组。重组酶和重组位点所以被称为“可逆的”,是因为重组产生的产物位点自身是后续重组的底物。合适的重组酶系统被本领域的技术人员所知,包括,例如,Cre-lox系统。在Cre-lox系统中,重组位点被称为“lox位点”,重组酶被被称为“Cre”。当lox位点是平行定位时(也就是在同一个方向),那么Cre催化间插多核苷酸序列的删除。当lox位点是相反定位时,Cre重组酶催化间插多核苷酸序列的倒转。该系统在多种宿主细胞中起作用,包括酿酒酵母(Sauer,B.,1987分子细胞生物学,72087-2096);哺乳动物细胞(Sauer等人,1998美国国家科学院院刊,855166-5170;Sauer等人,1989核酸研究,17147-161);以及植物如烟草(Dale等人,1990基因(Gene),9179-85)和拟南芥属(Osborne等人,1995植物杂志,7(4)687-701)。Cre-lox重组酶系统在植物中的使用在美国专利号5527695和PCT申请号WO93/01283中也有描述。有几个不同的lox位点是已知的,包括lox511(Hoess R等人,1986核酸研究,142287-2300),lox66,lox71,lox76,lox75,lox43,lox44(Albert H等人,1995植物杂志,7(4)649-659)。
0057其它几种重组系统在这些申请中也适合使用。这些包括,例如酵母的FLP/FRT系统(Lyznik,L.A.等人,1996核酸研究,24919)3784-9),噬菌体Mu的Gin重组酶(Crisona,N.J.等人,1994分子生物学杂志,243(3)437-57),大肠杆菌的Pin重组酶(见,如Kutsukake k等人,1985基因,34(2-3)343-50),志贺菌属(Shigella)的PinB,PinD和PinF(Tominaga A等人,1991细菌杂志,173(13)4079-87),和pSR1质粒的R/RS系统(Araki.H等人,1992分子生物学杂志,225(1)25-37)。因此,重组酶系统可从大量和数量不断增多的来源中得到。本发明的一个实施例中,可逆重组酶是Cre,RRS是lox位点。
0058可逆重组系统中,在供体构建体和受体构建体中的RRS是相同或几乎相同的。优选的是,供体构建体的RRS是相反定位的,并且受体构建体的RRS是相反定位的。在这些实施例中,供体构建体对受体构建体进行位点特异性置换,导致含有直接定位的RRS对的置换构建体。因此,置换构建体中直接定位的可逆重组位点中的一对或多对成员之一来源于受体构建体,而另一成员来源于供体多核苷酸。将可逆的重组酶接触置换构建体,导致直接定位的RRS间的多核苷酸序列被切除。图7-13表示含有RRS的示范性构建体。
0059在本发明的另一个实施例中,期望的最终构建体中不再必要的置换构建体的多核苷酸序列用上述的方法删除。(见图7-13)。更特别的,如图10中所示,供体构建体包括选择性标记、可操作连接了在两侧有两个RRS的目的基因的启动子,这一完整区段在两侧是两个IRS。供体构建体的两个RRS是相反定位的。受体构建体包括包含整合酶编码区域、启动子和选择性标记的受体多核苷酸,在此受体多核苷酸两侧是两个CIRS,和启动子,在此受体多核苷酸和启动子的两侧是两个RRS。受体构建体的两个RRS是反向定位的,受体构建体的每个RRS与供体构建体的RRS可发生重组。(例如,见图9)。在另一个实施例中,IRS相互反向,并且CIRS相互反向。(见图11)。
0060除上述的方法,本发明也提供在特定的染色体基因座上按顺序地“富积”多种目的多核苷酸的方法。完成富积不必加入不需要的DNA到最终的产物中。图8和9表示本发明的两个实施例的示意性图表。本发明的富积方法中,受体构建体与前面描述的一样(表示在图7A中)。这些方法使用的供体构建体(图8A)包括目的基因和单个CIRS(如ΦC31系统的attB);这些成分的侧翼是一对反向的RRS(如lox位点)。在供体构建体中也存在的是选择性标记编码区域,但没有用于选择性标记的启动子。优选的,该标记与用在受体构建体中的不同。选择性标记编码区的上游序列是另一个CIRS(如ΦC31系统的attB)。
0061如上所述,使用常规方法整合受体构建体到宿主细胞的染色体中。再一次,如果愿意,用位于侧翼的反向重组位点能促进通过复杂整合方式的拆分构建单拷贝的转基因,例如,所提到的方式在美国专利号6114600中有描述。作为选择,单拷贝转基因受体能通过分子筛选的方法获得。
0062然后,供体构建体被引入到染色体上整合了受体构建体的细胞中。当与不可逆重组酶(如ΦC31)接触时,供体构建体上的attB位点和受体构建体上的attP位点之间发生重组。(图8A-B)。因为在供体构建体中有两个attB位点,任一位点可与基因组的attP位点重组。如果目的多核苷酸下游的attB序列与attP重组,那么产生的整合事件将不会激活选择性标记sel2的表达(没有标出)。另一方面,如果选择性标记编码区域上游的attB序列与attP重组,那么,与受体构建体的attP位点相邻的启动子将可操作连接选择性标记的编码区域(图8B)。这使得能够选择后一类型的整合事件。产生的结构在特征基因发挥功能不再需要的两个DNA片段之间含有目的多核苷酸及与之相关的attB位点。因此,能通过重组酶介导,删除被直接定位的RRS(如lox)括在一起的DNA的方法(图8B-C),来除去这些多余片段。
0063除去多余片段后,宿主细胞仅保留了期望的多核苷酸和CIRS(如attB),侧翼是一对反向定位的RRS(如lox)。因此,attB位点能作为与含有第二目的基因的第二供体构建体进行另一轮重组(图8C-E)。因为两个选择性标记已经从染色体上切除,所以这两个标记中的任何一个都可以用于第二轮的重组。使用第二个、第三个以及之后的整合构建体,按需要重复整合和切除反应。(图8D-J)。这使得一系列的多核苷酸相互邻近。同样,利用反向定位的不可逆重组位点能完成基因的富积。该策略的一个实施例图示在图9A-J中。
0064一般地,用于引入真核细胞的受体和供体构建体以及其它构建体用重组表达技术制备。重组表达技术包括重组核酸的构建和被转染的细胞中的基因表达。达到这些目的的分子克隆技术在本领域是已知的。本领域的技术人员熟知多种克隆和体外扩增的方法适用于构建重组核酸。从Berger和Kimmel,分子克隆技术指导,酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology)152卷,学术出版公司,(Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger);和现代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology),F.M.Ausubel等人编,现代方法(Current Protocols),Greene出版联合公司(GreenePublishing Associates,Inc.)和John Wiley和Sons,公司合作,(1998增刊)(Ausubel)中找到许多克隆练习,这些技术和指导的例子足以指导技术人员。
0065多核苷酸构建体的构建一般需要使用能在细菌中复制的载体。用于从细菌中纯化质粒的大量试剂盒可以购买得到。为了正确使用,遵循制造商的说明书(见,如Pharmacia Biotech的EasyPrepJ,FlexiPrepJ;Stratagene的StrataCleanJ;和Qiagen的QIAexpress表达相同)。被分离和纯化的质粒可被进一步操作,生产其它用于转染细胞或掺入到根瘤土壤杆菌中感染和转化植物的质粒。使用土壤杆菌属进行转化时,构建穿梭载体。在链霉菌属或芽孢杆菌属中克隆也是可行的。
0066如上所述,选择性标记常常被掺入到多核苷酸构建体中和/或到载体中,该载体用于引导构建体进入真核细胞。这些标记可用于选择含有目的多核苷酸的细胞集落。通常,载体供体构建体将有一个在如大肠杆菌或其它细胞中有功能的选择性标记,其中载体在所述细胞中复制后被引入目的细胞中。第二个选择性标记也可包含在整合构建体中;但是,如果期望除去选择性标记,那么标记被置于目的多核苷酸侧翼重组位点对之外。
0067用于E.coli的选择性标记的实施例,包括对抗生素的特异性抗性的基因,也就是,氨卡青霉素、四环素、卡那霉素、红霉素,或者赋予其它可选择的酶活性的基因,如β-半乳糖苷酶,或者乳糖操纵子。用于哺乳动物细胞中的合适的选择性标记包括,如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、胸苷激酶基因(TK)、或赋予药物抗性的原核生物的基因、可用霉酚酸筛选的gpt(黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶);可用G418、潮霉素或嘌呤霉素筛选的neo(新霉素磷酸转移酶);以及可用氨甲蝶呤筛选的DHFR(二氢叶酸还原酶)(Mulligan和Berg,1981美国国家科学院院刊,782072;Southern和Berg,1982分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Genet.),1327)。
0068用于植物细胞的选择标记常常赋予对杀虫剂或抗生素,例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或氯霉素的抗性,或者对除草剂的抗性,如对氯磺隆或Basta的抗性。选择性标记的编码序列的合适的例子是编码新霉素磷酸转移酶,赋予抗生素卡那霉素抗性的neo基因(Beck等人,1982基因,19327);编码潮霉素磷酸转移酶,具有抗生素潮霉素抗性的hpt基因(Grizt和Davies,1983基因,25179);编码膦丝菌素乙酰转移酶,具有除草剂成分膦丝菌素和双丙氨膦抗性的bar基因(EP242236)。
0069如果多个目的基因要被引入真核细胞,通常对每个外源核酸使用不同的选择性标记较好。这样允许同时选择含有所有期望的外源核酸的细胞。
0070上述成分和方法可用于稳定地整合多核苷酸到任何真核细胞。本发明中非限制性的真核细胞的例子包括,动物、植物、真菌、细菌和其它微生物的细胞。在一个实施例中,真核细胞是哺乳动物细胞。图4和5是可用于哺乳动物细胞中的位点特异性置换方法的例子。在另一个实施例中,真核细胞是植物细胞。图6是可用于植物细胞的位点特异性置换方法的例子。在一些实施例中,细胞是多细胞生物体的一部分,如转基因植物或动物。本发明的方法对难以获得转基因材料的情况特别有用,如转基因小麦、玉米和动物。在这些情况下,发现少数单拷贝插入需要先得到大量的独立转基因克隆,而获得大量的独立转基因克隆需要很大的努力。特别感兴趣的植物靶点是单子叶植物,包括,如水稻、玉米、小麦、黑麦、大麦、香蕉、棕榈、百合、兰花和莎草。双子叶植物也适合做目标,包括,如烟草、苹果、土豆、甜菜、胡萝卜、柳树、榆树、枫树、蔷薇、毛茛、矮牵牛、phloxes、紫罗兰和向日葵。
0071因此,本发明也包括制造转基因植物的方法,包括步骤1)提供含有侧翼是两个IRS的染色体受体多核苷酸的受体植物;2)提供含有侧翼是两个CIRS的染色体供体多核苷酸的供体植物;和3)杂交供体植物和受体植物,产生转基因植物,在此供体植物或受体植物含有不可逆重组酶多肽。供体和受体植物可以是相同或不同的属或种。图12表示本发明的这个方面的一个实施例。
0072通过这个方法产生的转基因植物表达不可逆重组酶多肽,该多肽催化IRS和CIRS间的重组和供体多核苷酸置换受体多核苷酸,因此在转基因植物中形成染色体置换构建体。在一个优选的实施例中,受体植物是单拷贝受体株。在进一步的实施例中,选择不表达不可逆重组酶多肽的转基因植物后代。在另一个优选的实施例中,染色体置换构建体包括可操作连接供体多核苷酸的启动子,更优选的,启动子来自受体构建体。本发明也包括用含有编码可逆重组酶的核酸的植物杂交上述转基因植物,其中染色体置换构建体进一步包括一对或多对与可逆重组酶兼容的直接定位的可逆重组位点(RRS)。(见图12B和C)。
0073包括重组位点和/或重组酶编码基因的多核苷酸构建体能通过本领域的技术人员所知的几种方式中的任何一种引入靶细胞和/或生物体内。例如,通过多种常规技术,可将DNA构建体引入培养物或植物器官中的植物细胞内。例如,使用生物弹方法,如DNA颗粒轰击,可将DNA构建体直接引入植物细胞,或者使用如植物原生质的电穿孔和微注射技术,引入DNA构建体。颗粒介导的转化技术(也叫做“生物弹”)在Klein等人,1987自然(Nature),32770-73;Vasil,V等人,1993生物技术(Bio/Technol),111553-1558;和Becker,D等人,1994植物杂志,5299-307中有描述。这些方法包括用小颗粒渗透细胞,其中核酸包含在小珠或小颗粒基质的内部,或者包含在表面上。Biolistic PDS-1000基因枪(Biorad,Hercules,CA)用氦压推进DNA包被的金或钨微载体进入靶细胞。该过程适用于生物体的大范围的组织和细胞,包括植物、细菌、真菌、藻类、完整的动物组织、组织培养细胞和动物胚胎。可以使用电脉冲递送,该方法实质上是对动物和病人的活体组织适用的温和电穿孔形式。Zhao,1995高级药物递送综述(Advanced Drug DeliveryReviews),17257-262。
0074其它转化方法也被本领域的技术人员所知。微注射技术在本领域公知,并在科学和专利文献中有很好的描述。在Paszkowski等人,ENBO J.32717(1984)中描述了利用聚乙二醇(PEG)沉淀引入DNA构建体。在Fromm等人,美国国家科学院院刊,825824(1985)中描述了电穿孔技术。在Lazzeri,P,分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)4995-106(1995)中讨论了PEG介导的转化和植物原生质体的电穿孔。已知的用于在单子叶和双子叶植物中引入和表达异源基因的方法见,如美国专利号5633446,5689052,5159135和5679558;Weising等人,1988Ann.Rev.Genet,22421-477。特别的,使用多种技术能完成单子叶植物的转化,包括电穿孔(如Shimamoto等人,自然(1992),338274-276);生物弹(如欧洲专利申请270356);和土壤杆菌属(如Bytebier等人,美国国家科学院院刊(1987)845345-5349)。
0075为了转化植物,DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区域连接,引入到常规的根瘤土壤杆菌宿主载体。当细胞被细菌感染时,根瘤土壤杆菌宿主的毒性功能将引导转基因和邻近的标记基因(如果存在)插入植物细胞DNA。根瘤土壤杆菌-介导的转化技术在科学文献中有很好的描述。见,如Horsch等人,科学,233496-49891984),Fraley等人,美国国家科学院院刊,804803(1983),和Hooykaas,植物分子生物学,13327-336(1989),Bechtold等人,Comptes Rendus De L Academie DesSciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences,3161194-1199(1993),Valvekens等人,美国国家科学院院刊,855536-5540(1988)。用于植物和细胞培养的基因转移的方法的综述,见Fisk等人,Scientia Horticulturae 555-36(1993)和Potrykus,CIBA Found Symp.154198(1990)。
0076递送多核苷酸序列进入细胞的其它方法包括,如基于脂质体的基因递送(Debs和Zhu(1993)WO93/24640;Mannino和Gould-Fogerite(1988)生物技术6(7)682-691;Rose美国专利号5279833;Brigham(1991)WO91/06309;和Felgner等人,(1987)美国国家科学院院刊847413-7414),也使用病毒载体,如乳头瘤病毒、逆转录酶病毒和腺伴随病毒载体(如Berns等人,(1995)Ann.NY Acad.Sci.77295-104;Ali等人,(1994)基因治疗(Gene Ther.)1367-384;和Haddada等人的综述,(1995)Curr.Top.Microbiol.Immunol.199(Pt3)297-306;Buchscher等人,(1992)病毒学杂志(J.Virol.)66(5)2731-2739;Johann等人,(1992)病毒学杂志66(5)1635-1640(1992);Sommerfelt等人,(1990)病毒学(Virol.)17658-59;Wilson等人,(1989)病毒学杂志,632374-2378;Miller等人,病毒学杂志,652220-2224(1991);Wong-Staal等人,PCT/US94/05700,和在基础免疫学(Fundamental Immunology)Rosenburg和Fauci(1993),第三版Paul(编辑),Raven出版有限公司,纽约和它的参考文献;Yu等人,基因治疗(1994)同上;West等人,(1987)病毒学16038-47;Carter等人,(1989)美国专利号4797368;Carter等人,WO93/24641(1993);Kotin(1994)人类基因治疗(Human Gene Therapy)5793-801;Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.941351和Samulski(同上)对AVV载体的总的看法;Lebkowski,美国专利号5173414;Tratschin等人,(1985)分子细胞生物学5(11)3251-3260;Tratschin等人,(1984)分子细胞生物学42072-2081;Hermonat和Muzyczka(1984)美国国家科学院院刊,816466-6470;McLaughlin等人,(1988)和Samulski等人,(1989)病毒学杂志,6303822-3828)。
0077能分析引入的供体多核苷酸的整合模式的方法对本领域的技术人员是熟知的。例如,可以从转化的细胞中提取DNA,用一种或更多的限制酶消化DNA,与多核苷酸构建体的被标记片段杂交。使用聚合酶链式反应(PCR)也能鉴定插入序列。(见,如Sambrook等人,分子克隆-实验室手册,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1989,用于描述这些和其它合适的方法)。
0078通过以上任何转化技术得到的转化植物细胞,能经培养再生出具有转化基因型、并因此有期望的表型的整个植株。这些再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作,一般依赖于与期望的核苷酸序列一起引入的杀虫剂和/或除草剂标记。从培养的原生质中再生植物被描述在Evans等人,原生质分离和培养(Protoplasts Isolation and Culture),植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Culture),页数124-176,Macmillian出版公司,纽约(1983);和Binding,植物的再生(Regeneration of Plants),植物原生质(Plant Protoplasts),页数21-73,CRC出版社,Boca Raton,(1985)。再生也能从植物愈伤组织、外植体、体细胞胚(Dandekar等人,组织培养方法杂志(J.Tissue Cult.Meth.),12145(1989);McGranahan等人,Plant Cell Rep.,8512(1990)),器官、或它的部分中获得。这些再生技术一般被描述在Klee等人,Ann.Rev.of PlantPhys.,38467-486(1987)。
0079这些方法对制造大部分脊椎动物种类的转基因和嵌合动物也有用。这些物种包括,但不限于,非人类哺乳动物,包括啮齿动物如小鼠和大鼠、兔子、绵羊科动物如绵羊和山羊、猪科动物如猪,和牛科动物如牛和水牛。获得转基因动物的方法被描述在,如Puhler,A.Ed.,转基因技术原则和方案(TransgenesisTechniquesPrinciples and Protocols)(分子生物学中的方法,卷18)(Methods in Molecular Biology,Vol.18),1993;和Pinkert,CA,Ed.,转基因动物技术实验室手册(TransgenicAnimal TechnologyA Laboratory Handbook),学术出版社,1994。利用要求保护的方法也能制造有特定遗传修饰的转基因鱼。见,如Iyengar等人,(1996)转基因研究(Transgenic Res.5147-166)中关于制造转基因鱼的一般方法。
0080获得在基因组中有特定修饰的转基因或嵌合动物的一个方法是用含有侧翼有重组位点的目的多核苷酸的载体与已受精的卵母细胞接触。对一些动物如小鼠,体内完成受精,受精卵用手术方法取出。在其它动物中,特别是牛,优选的是从活体或屠宰场动物中取出卵细胞,并在体外使卵细胞受精。见DeBoer等人,WO91/08216。体外受精可以使修饰引入基本同步化的细胞。然后,体外培养受精卵母细胞,直至获得含有16-150个细胞的植入前胚胎。胚胎的16-32个细胞的阶段被描述成桑椹胚。含有多于32个细胞的植入前胚胎被称为胚泡。这些胚胎表示囊胚腔的发育,一般在64细胞阶段。如果想要,胚胎细胞中期望的外源多核苷酸的存在能通过本领域的技术人员所知的方法检测。培养已受精的卵母细胞至植入前的阶段的方法被描述在Gordon等人,(1984)酶学方法(Methods Enzymo.)101414;Hogan等人,小鼠胚胎的操作实验室手册(Manipulationof the Mouse EmbryoA Laboratory Manual),C.S.H.L.N.Y.(1986)(小鼠胚胎);Hammer等人,(1985)自然315680(兔和猪胚胎);Gandolfi等人,(1987)J.Reprod.Fert.8123-28;Rexroad等人,(1988)动物科学杂志(J.Anim.Sci.)66947-953(绵羊胚胎)和Eyestone等人,(1989)J.Reprod.Fert.85715-720;Camous等人,(1984)Reprod.Fert.72779-785;和Heyman等人,(1987)Theriogenology 275968(牛胚胎)。有时植入前胚胎在植入前冷冻保存一段时间。植入前胚胎被转移到合适的雌性动物中,导致分娩出转基因或嵌合动物,这依赖于转基因整合时的发育阶段。嵌合哺乳动物可被繁殖,形成真正的种系转基因动物。
0081作为选择,可用本方法获得有单拷贝期望的供体多核苷酸的胚胎干细胞(ES)。这些细胞从体外培养的植入前胚胎中获得。见,如Hooper,ML,胚胎干细胞引进计划的改变到动物种系(Embryonal Stem CellsIntroducing Planned Changes intothe Animal Germline)(现代遗传学,卷1)(Modern Genetics,v.1),Iht’1.Pub.Distrib.,Inc.,1993;Bradley等人,(1984)自然309,255-258。将转化的ES细胞与非人类的动物的胚泡合并。ES细胞在胚胎建群,在一些胚胎中,形成产生的嵌合动物的种系。见Jaenisch,科学,2401468-1474(1988)。作为选择,ES细胞或能重新形成生物体的体细胞(“种群恢复体细胞”)能作为用于移植到去核受精卵母细胞中的细胞核来源,产生转基因哺乳动物。见,如Wilmut等人,(1997)自然385810-813。
0082如上面一般的描述,本发明提供了几种获得期望的位点特异性重组的策略。这些策略包括,如获得用第二个多核苷酸置换染色体多核苷酸的方法。在一些实施例中,在没有不想要的DNA、如选择性标记的情况下将目的多核苷酸引入到细胞基因组。其它实施例提供了将不想要的DNA在用来选择含有期望的目的多核苷酸的细胞后,从细胞基因组中删除的方法。这些特定的策略在以下的实施例中有进一步的描述。
0083贯穿本申请,参考了多种出版物。因此,为了更全面的描述本发明所属领域的现有技术,所有这些出版物和出版物中所引的全部参考文献都作为参考文献引入到本申请中。也应理解,前面内容涉及的是本发明的优选的实施例,可以对它们进行无数改变而不脱离本发明的范围。以下实施例进一步说明本发明,它们不以任何方式对它的范围加入限制。相反,读了这里的描述后,能清楚的理解用于多种其它的实施例、修饰和它的相等物,而不脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围。
实施例1使用环状或环状靶向构建体来置换基因0084本实施例展示链霉菌属噬菌体ΦC31位点特异性重组系统在真核细胞基因置换策略中的功能。此策略利用一种位点特异性整合系统,例如从噬菌体ΦC31来源的系统。将环状噬菌体DNA染色体插入细菌基因组染色体需要ΦC31中的一种多肽蛋白质,它是由int基因编码的整合酶,可以使细菌和噬菌体的附着位点attB和attP发生重组,形成新的杂合序列,称为attL和attR。attB和attP位点在以交换位点为中心的一段53bp的序列上只共享16个匹配的碱基对。在此,命名BB’,PP’,BP’和PB’可与attB,attP,attL和attR互换使用。attB,attP,attL和attR的反向定位被分别命名为B’B,P’P,P’B和B’P。
材料和方法重组DNA0085全过程使用标准方法。大肠杆菌菌株XL2-Blue(recA1endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F’proAB laclqzΔM15 Tn10(Tetr)Amy Camr,Strategene])用作DNA构建体的宿主。
培养基0086裂殖酵母菌株生长在按需要提供有225mg/l的腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的基本培养基中(EMM-低葡萄糖,来自Bio101)。按照Grimm等人的方法((1998)分子基因遗传学,21581-86)制备含有5-FOA(Zymo研究公司的5-氟乳清酸)的基本平板,并补充腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸。使用时,加入硫胺素至5μg/ml。
具有两个ΦC31 attP靶位点的粟酒裂殖酵母从pHS282中以ApaI-SacI片段(Thorpe和Smith(1998)美国国家科学院院刊955505-5510)分离的84bpΦC31attP位点(缩写为PP’),被克隆到粟酒裂殖酵母整合载体pJK148中的相同位点(Keeney和Boeke(1994)遗传学136849-856),形成pLT44。通过用乙酸锂介导的转化,用经NdeI酶切的DNA,将pLT44质粒打靶到粟酒裂殖酵母Leu1-32等位基因上。通过与pLT44同重组而转变为Leu+的受体宿主FY527(h-ade6-M216 his3-D1 leu1-32ura4-D18),用DNA印迹杂交分析的方法检测。发现一种命名为FY527attP(图3A)的Leu+转化子具有单一拷贝的pLT44。另一命名为FY527attPx2的转化体(图3B)含有串联插入的pLT44,因此它具有两个attP位点。
含有两个ΦC31 attB位点的整合型ura4+载体0088将从pTZura4(S.Forsburg)上以1.8kb的EcoRI-BamHI片段切下的粟酒裂殖酵母ura4+基因插入到用相同酶切过的pJK148,产生pLT40。将从pHS21中作为500bp的BamHI-XbaI片段分离的ΦC31 attB位点(缩写为BB’),连接到用相同的酶切过的pLT40中,产生pLT42。通过从pLT42中删除XhoI片段而除去大部分leu1基因,产生pLT45。这样在pLT45上留下了229bp的leu1,并降低了它对不具有任何leu1同源性的质粒的转化效率。pLT50具有紧靠在ura4另一侧处于相同方向的第二个attB位点,该质粒的构建是通过首先将attB BamHI-SacI片段从pLT42亚克隆到pUC19上,再用EcoRI和SalII酶切,随后将它插入到用EcoRI和XhoI切过的pLT45中。位于最终构建体上的第二个attB位点通过对每条链进行一次测序,发现与第一个attB位点一致。
环状DNA的转化0089以从pLT50中纯化的AttII-AlwNI片段,或pLT50为模板的PCR产物形式制备attB-ura4+-attB环状DNA。PCR反应在标准条件下进行,使用T3引物和与pJK148质粒骨架相应的另一个引物(5’ggccctgaaattgttgcttctgcc3’;SEQ ID NO1)。
ΦC31整合酶的阻遏合成
0090能被维生素B1阻遏的粟酒裂殖酵母Pmnt启动子,以1.2kb PstI-SacI片段的形式从pMO147中切下,并插入用相同酶切的his3+,ars1载体pBG2(Ohi等人,(1996)基因174315-318),产生pLT41。含有ΦC31 int编码区的2.0kb的SacI片段从pHS33(Thorpe和Smith(1998)同上)转移到pLT41的SacI位点。将Int编码区的定向使其表达处于Pmnt的控制下的克隆命名为pLT43。
分子分析0091DNA印迹分析使用Boehringer Mannheim的Genius系统。998bp的leu1内部EcoRV片段,1.8kb的ura4片段,2.0kb的ΦC31 int基因通过随机引物的方法被地高辛标记,并被用作探针。聚合酶链式反应用Perkin Elmer Cetus Gene Amp PCR9600进行,使用Stratagene Turbo PFU酶或VENT聚合酶。尽可能使用T3和T7标准引物。ura4引物(5’gtc aaa aag ttt cgt caa tat cac3’(SEQID NO2)),和pJK148引物从Operon Technologies购买。所有PCR反应都使用51℃的退火温度和30秒的延伸时间。
结果和讨论通过环状DNA的基因置换0092本实验说明了ΦC31位点特异性重组系统是一种高效的将环状DNA传递到靶细胞的方式。为了制备cDNA底物,环状分子可通过连接反应连接起来,或者用PCR反应在两端合成粘性位点,然后与染色体定位的串联靶位点对重组,并用插入的cDNA置换目的DNA。为了测试这种基因置换反应是否高效,一种具有pLT44的串联插入的FY527衍生物被分离出来。这一株系被命名为FY527attPx2,它在leu1基因座上有直接定向的两个attP位点,被leu1基因和载体序列隔开(图2B)。FY527attPx2用含有两侧是attB位点的ura4+的环状DNA转化。环状底物来自凝胶纯化的pLT50片段(图2A)或该质粒的PCR扩增产物。pLT50质粒来自于pLT45,它在ura4+基因的另一侧具有另一个直接定位的attB位点。当与pLT43共转化时,两种环状底物具有相似的转化效率,促进ura4+转化子的增加(表1)。在一些实验中,这一频率与复制型质粒对照一样高。
0093图2B示意了重组发生在两个5’位点和两个3’位点之间的目的基因置换事件。虽然两个交换可能是依次而不是发生,但最终的目的产物是一样的(图2C,类1)。检测8个代表性的ura+his-克隆的XbaI酶切模式时,发现有7个克隆的模式可以归为3类。有3个属于第一类,其中leu1探针与3kb和20kb的条带杂交,ura4探针与20kb的条带杂交(图2C)。第二、三类模式代表了似乎是由于环状片段在位点专一性插入attP靶点之前发生环化产生的事件。图2D描述了由于重复attB位点之间进行重组引起的环化反应。环化DNA整合到5’attP位点使得5.5kb的质粒条带增长到7.4kb,该条带应能与ura4和leu1探针都杂交上(图2E,类2)。这种模式发现于一个转化子中。向3’attP位点的整合使18kb的条带增长为20kb,该条带也能被两种探针所检测(图2F,类3)。这种模式发现于三个转化子中。剩下的一个克隆具有两个拷贝的ura4和一个附加拷贝的leu1,说明在leu1基因座发生了基因扩增。它没有被进一步分析。
表1粟酒裂殖酵母FY527attPx2中的整合酶依赖性基因置换DNA选择 转化体/107细胞 相对值1类 2类 3类 其它(1μg) §(±sd)*pLT43 His+4106(±331)100线性片段Ura+19(±27) 0.46线性片段和 Ura+1568(±495)3838%12%38%12%pLT43pLT50 Ura+63(±52) 1.5pLT50和 Ura+2560(±919)6238%12%25%25%pLT43pLT45 Ura+66(±46) 1.6pLT45和 Ura+683(±298) 17pLT43*来自3个独立的实验§(目的DNA的转化效率)/(pLT43的转化效率)×100+n=8经由环状DNA的基因置换0094从环状DNA转化中发现的第2和3类结构表明具有环状中间体。但是,环状DNA并不具有易于退火的互补单链末端。其分子结构既满足分子内attB位点间的重组,又支持两末端间某种类型的连接。也许环状DNA末端促进了高比例的环化。环状末端可能更易于链入侵,或末端连接,因为在酵母中,双链裂口可促进重组(Szostak等人,(1983)细胞(Cell)3325-35)。如果事实如此,2和3类整合子将因利用环状DNA而减少。
0095FY527attPx2转化的测定使用pLT50质粒DNA(见表1)。分析这一转化中8种代表性的ura+His-克隆的整合结构。其中有6个克隆属于同样的三种类型三种属于类1;一种属于类2;两种属于类3。2和3类整合子占主要,说明重复attB位点之间的重组并不需要环状底物。现在不能确定的是这一事件是由粟酒裂殖酵母还是由ΦC31整合酶引发的。一种可能是整合酶在甚至不具有attP的情况下与attB反应。ΦC31整合酶是整合酶-解离酶类中的成员,这类酶通过使各DNA底物的双链破坏而催化重组。如果此情况发生在attB位点,则双链裂口有可能募集同源重组系统。但是,这类重组并没有在使用纯化的组分进行的体外实验中被发现(Thorpe,H.M.和Smith,M.C.M.(1998)美国国家科学院院刊955505-5510)。另一种可能是,内源粟酒裂殖酵母重组基因能够促使该质粒重排。将质粒上的直接重复用序列间的同源性减小到最小,attB为34bp,attP为39bp(Groth等人,(2000)美国国家科学院院刊975995-6000),可以减小此种不需要的副反应的频率。
0096除了这三类整合结构之外,还存在attB x attP不完全重组产生的整合模式的可能性。这可能发生在整合酶蛋白质数量有限的情况下,例如pLT43从细胞中丢失时即可能如此。如果不筛选His+表型,则His-克隆就易于发现。四个位点间的一次重组可能产生四种结构5’attB x 5’attP,3’attB x 3’attB,3’attB x 5’attP和5’attB x 3’attP。如果紧接一次attB x attP反应,则5’attB x5’attP和3’attB x 3’attB整合子可能转变为1类结构,3’attB x5’attP和5’attB x 3’attP整合子则可能因为ura4+标记的去除而不被发现。8个克隆中的一个具有一与通过5’attB x 5’attP反应掺入完整pLT50相一致的模式。这第4类结构展示于图1G。ura4探针检测到了2.3kb的条带,leu1探针检测到了3kb,5.6kb,18kb的条带。用NdeI酶切之后产生一条与leu1和ura4两探针都杂交的12kb条带,这与两标记的物理连锁相一致。剩下的克隆也掺入了完整的质粒,但是却得到了额外的与leu1和ura4杂交的条带。这代表了一种更复杂的事件,或许表明在基因座有基因扩增。
0097整合进入FY527attPx2系的检测还使用了完整的pLT45(图3A),它能在5’attP或3’attP位点插入染色体。染色体上额外的attP位点并不显著改变转化效率。当对用pLT43获得的His+转化子的数量标准化后,ΦC31整合酶介导的FY527attPx2的转化效率与用pLT45转化FY527attP的效率相当。从基因置换策略中观察到,靶分子和供体分子中的重复位点似乎对于增加转化效率都是必须的。
确定整合酶DNA的最佳浓度0098用浓度范围(0,0.1,1,5,10mg)的pLT43 DNA完成了pLT50对FY527attPx2的转化(图3B)和pLT45对FY527attP的转化(图3A)。图3显示两套转化产生的ura+克隆的数量都在pLT43 DNA为5mg时达到最大。pLT50/FY527attPx2转化产生的转化子的数量是pLT45/FY527attP转化的4到14倍。这一观察与以上讨论的结果一致。然而,较高的转化效率被较低的准确事件频率所抵消,与pLT45的88%相比,pLT50是38%。
总结0099本实施例说明了双重位点重组反应是十分有效的。精确基因置换事件的频率是复制型质粒载体转化效率的14-24%(表1)。图3C表明当整合酶基因的浓度适当时,转化效率可增加到与复制型质粒相近的水平。复制型质粒的高转化率使它可以通过功能性选择在细菌和酵母中克隆。这些结果说明,由直接选择进行的克隆也可通过双重位点的ΦC31重组系统完成。环状cDNA文库不必通过克隆载体系统传递。相反,它可以在侧翼连接上attB位点,并直接导入动物或植物细胞的基因组att-att靶点。
00100虽然观察到了包括来自于环状DNA的环状分子的整合的竞争性副反应,但这些不期望的事件可以通过使用最小的功能性附着位点使之最小化。另外,如果两attP位点间的靶位点DNA编码具有负选择的标记,那么只能检测到对该标记的完全置换。
实施例2在基因组启动子后插入用于表达的编码区00101本实施例举例说明通过一个不需要共引入选择性标记的基因置换策略,递送DNA片段到指定的动物染色体靶点的一般策略。因为置换策略导致宿主DNA的对应片段丢失,反选择性标记可作为基因置换的选择标准。该方法得到特征基因的准确整合,而不掺入额外的不需要的DNA。
00102本实施例也举例说明对检测直接位于宿主细胞的基因组启动子之后的cDNA分子的功能表达有用的方法。该方法不需要先克隆cDNA到载体中以便在大肠杆菌中增殖,如克隆入质粒或噬菌体载体。研究者可以从数据库中选择基因序列,设计与该基因序列对应的合适的引物,选择性地反转录所选的mRNA序列,并扩增它的cDNA到转化的足够数量。可将从mRNA得来的cDNA连接合成的attP或attB位点,并被直接用于基因置换策略。在本说明中,attB合成寡聚物被设计为在相同方向上位于cDNA的两侧。
方法00103靶构建体包括Pc-attP-tk-Ps-zeo-attP片段(图4)。所用省略Pc,人类巨细胞病毒启动子;tk,胸苷激酶编码区;Ps,SV40早期启动子;zeo,zeomycin抗性编码区。本例中的attP位点是属于不可逆重组系统类型,如ΦC31系统的重组位点。Ps-zeo片段允许在宿主基因组中选择靶构建体。Tk基因是反选择标记。在合适的培养条件下,丢失功能性tk基因的细胞将大量繁殖,而那些保留tk基因功能的不会如此。使用其它选择性标记、反选择性标记和启动子都是可能的。
00104整合构建体包括基因片段,在本例中,是侧翼为一组相同方向的attB位点的cDNA(图4)。如果tk上游的attP序列与cDNA 5’末端上游的attB序列重组,并且zeo下游的attB序列与cDNA 3’末端下游的attB序列重组,那么该双重重组事件将从基因组中除去tk基因。选择Pc-attR-cDNA连接的基因置换,导致cDNA的表达。其它可能的成对重组将断裂染色体。
实施例3人类基因组中的基因置换00105本实施例说明一个较实施例2更特异性的递送DNA片段到指定的哺乳动物染色体靶点的策略。优选地,哺乳动物染色体靶点是人染色体靶点。本实施例表示cDNA分子能位点特异性地插入基因组靶启动子之后,用于有义或反义方向表达。因为根据cDNA的表达所赋予的表型可以揭示基因功能的线索,所以该cDNA整合策略能作为功能基因组分析的工具。
方法重组DNA00106从头到尾都用到标准克隆方法。用于DNA克隆的大肠杆菌菌株JM109[F’traD36 lacIq D(lacZ)M15 proA+B+/e14-(McrA-)D(lac-proAB)thigyrA96(Nalr)endA1 hsdR17(rk-mk+)relA1supE44],在Luria Broth上生长。
控制hpt表达构建体00107hpt片段,即潮霉素抗性基因的编码区,通过从p35S-hpt上用SaII裂解得到(Albert等人,1995植物杂志,7649-59),将其亚克隆到pBluescriptII KS(+/-)的SalI位点。该质粒中含有hpt基因的NotI-KpnI片段随后被亚克隆到cDNA表达载体pcDNA3.1/zeo(Invitrogen,Carlsbad,CA)的NotI-KpnI位点。产生的质粒,即pcDNA3.1,从Pc(人类巨细胞病毒启动子)表达hpt。
ΦC31整合酶表达载体00108pJHK1(图5A)有Pc-int片段,在此int是ΦC31整合酶编码区用NsiI和BsmI裂解载体pcDNA3.1/zeo,除去含有大部分zeocin抗性编码区的片段(1800bp至2767bp)。剩下的载体通过平端连接重新环化。将含有ΦC31整合酶基因的1.9kb的NheI-BamHI片段插入到zeocin-敏感型pcDNA3.1衍生物的NheI-BamHI位点,产生pJHK1。ΦC31整合酶片段的NheI的近端有合成的Kozak序列(5’-GGGCCCGCCACGATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGTCAGTCGCGCGAGCGCGAGAATTC-3’;SEQ ID NO3)。
侧翼是相反定位的ΦC31attB位点的hpt载体的整合00109pJHK2(图5C)含有在pBluescriptII KS(+/-)(Stratagene,La Jolla,CA)骨架中的BB’-hpt-B’B片段,其中BB’和B’B分别是直接和间接定向的ΦC31attB位点。hpt片段通过从p35S-hpt上用SalI裂解得到(Albert等人,1995同上),将其亚克隆到pBluescriptII KS(+/-)的SalI位点,产生pBluescript-hpt。将53bp的KpnI-BB’-XhoI寡聚物(5’-GCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCACCT-3’;SEQ ID NO4)被插入到pBluescript-hpt中的对应位点,产生pBluescript-BB’-hpt。在获得用于插入到pBluescript-BB’-hpt中以产生pJHK2的SpeI-HindIII片段之前,将KpnI-BB’-XhoI接头亚克隆到pMECA中(生物技术,卷246,922-925,1998)。
含有侧翼是反向attP位点的tk的基因组靶点00110pJHK3(图5A)含有在pcDNA3.1/zeo骨架中的Pc-PP’-tk-P’P片段,在此tk是人类单纯性疱疹病毒胸苷激酶的编码区,PP’和P’P分别是直接和反向定位的ΦC31 attP位点。合成两个53bp的ΦC31 attP位点(5’-AGTAGTGCCCCAACTGGGGTAACCGGGCAGTTCTCTCAGTTGGGGGCGTAGGG-3’SEQ ID NO5),两侧有合适的限制酶位点。将EcoRI-HindIII-P’P-AflII寡聚物插入到pcDNA3.1/zeo中的对应位点,产生pcDNA3.1-tk-P’P。将1.85kb来自pIC19R/MC1-TK(Kirk Thomas博士,犹他州大学)的XhoI-HindIII tk片段连接到对应的位点,产生pcDNA3.1-tk-P’P。在tk基因的5’末端含有147bp的增强子。将NheI-PP’-XhoI寡聚物插入到pcDNA3.1-tk-P’P的对应位点,形成pJHK3。
靶细胞株00111根据制造商的说明书,用lipofectamineTM(生命技术(Life Technologies),Gaithersburg,MD)将pJHK3构建体转染到人类细胞株293T(美国典型培养物中心(American Type CultureCollection),Rockville,MD)。细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基上生长。pJHK3含有位于tk基因上游的单一XhoI位点和位于tk基因下游的单一的HindIII位点。来自32个稳定转染的细胞株的DNA用XhoI或HindIII裂解,与tk探针进行DNA印迹杂交。两个细胞株显示单一的与XhoI或HindIII裂解的DNA的杂交条带,这表明被整合的分子是单一拷贝。与应该在attP位点断裂的经BstEII裂解的DNA杂交,表明存在预期的2kb内部tk片段。
丙氧鸟苷抗性分析00112tk基因的功能性表达用丙氧鸟苷(Sigma公司)处理来检测。将细胞接种在24-孔组织培养板(1×103个细胞/孔)上,并过夜生长。每个孔中加入丙氧鸟苷(从0到50mM),观察细胞生长数天。野生型293T细胞对丙氧鸟苷所试的最高浓度(50mM)不敏感,而有单一Pc-PP’-tk-P’P片段的两个细胞株对丙氧鸟苷敏感。
ΦC31整合酶介导的重组00113将pJHK1和pJHK2各4μg共同转染到1×106含有单拷贝的pJHK3的293T细胞中。转染3天后,细胞被系列稀释,并转移到含有50mM潮霉素(Boehringer Mannheim)或丙氧鸟苷的新鲜DMEM中。大约转染后14天,分离抗性细胞,并进一步分析。对于环状DNA的转染,作为从pJHK2中纯化的KpnI片段制备BB’-hpt-B’B环状片段。
分子分析
根据制造商手册,用QIAampR DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从293T细胞中分离基因组DNA。用标准流程完成基因组DNA印记杂交,所用的DNA探针用BoehringerMannheim的随机引物DNA标记试剂盒(Cat# 1004760)制造。
结果和讨论
mRNA,如通过比较基因组或转录图谱分析暗示的mRNA,能用有attP末端的引物通过PCR选择性的扩增。如在图5A中所描述的,attP末端位于相反方向,使得cDNA能以任一种方向插入靶点。双重重组反应将cDNA连接在目标启动子之后用于有义(图5A)或反义表达(图5B),预期启动子导致基因产物的高或低产量。伴随地,反选择基因的丢失将提供位点特异性基因置换的检测方法。在以下的图示中,虽然清楚的标出启动子,为简单起见,终止子,即启动转录终止并位于每个编码区下游的序列没有作为独立的元件标出。
单拷贝的靶细胞株
为了在人基因组中产生靶位点用于环状DNA片段的定点插入,将在pcDNA3.1/zeo载体骨架中含有Pc-PP’-tk-P’P片段的构建体pJHK3转染到人类细胞株293T中。tk基因的表达提供对核苷类似物丙氧鸟苷的敏感性。因为载体骨架含有zeocin抗性基因,所以由随机整合pJHK3产生的zeocine抗性克隆通过DNA印记杂交纯化和分析。
靶细胞株的分子分析
32个细胞株的基因组DNA用XhoI或HindIII处理,并用tk DNA作探针杂交。XhoI或HindIII分别在tk的上游序列或下游序列切割一次。与tk探针杂交应显示在pJHK3插入位置两边的转基因-宿主DNA边界片段。在用XhoI和HindIII处理过的DNA中检测到的单一杂交条带表明插入的单拷贝pJHK3。两个细胞株,JHK3a和JHK3b,符合这一预期的结果。XhoI或HindIII的片段大小不能预测,因为它依赖于最近的XhoI或HindIII宿主裂解位点的位置。细胞株JHK3a分别在经XhoI切割的DNA中显示单一的大约7kb的条带,在经HindIII切割的DNA中显示单一的大约7kb的条带。细胞株JHK3b在用XhoI和HindIII处理的DNA中分别显示单一的大约13kb的条带和单一的大约10kb的条带。结构上,Pc-PP’-tk-P’P片段在两个细胞株中都是完整的。attP序列含有一个BstEII位点。用BstEII裂解,释放出单一的大约2kb的tk片段,该片段能被tk探针检测,并且两个细胞株都显示这个图谱。Pc-PP’-tk-P’P片段在tk的表达方面也是有功能的。将丙氧鸟苷加入到这两个细胞株的培养基中,即使是所测的最低浓度(1mM),也导致代谢活动抑制,这可通过生长培养基中没有颜色变化和显微镜观察确定。相反,母代非转基因株对丙氧鸟苷所测的最高浓度(50mM)有抗性,因为生长培养基从红色变成黄色,并且细胞扩增。为简单起见,图5描述Pc-PP’-tk-P’P片段下游的zeocin抗性标记,但是分子的数据也显示它可能处于上游。因为选择性标记基因的相对位置不重要,所以没有确定它的准确位置。
hpt进入目的基因座的交换
为了检测在基因组靶点引导DNA交换的反应,用有或没有ΦC31整合酶表达构建体pJHK1的pJHK2转染细胞株JHK3a和JHK3b。构建体pJHK2含有BB’-hpt-B’B片段,在此BB’和B’B分别代表53bp attB序列的正向和反向定位(图5C)。hpt 5’-attB和tk5’-attP之间的重组使hpt与Pc相连,hpt表达,具有对潮霉素的抗性。但是,hpt 5’-attB和tk 3’-attP之间的重组使反义定位的hpt与Pc相连,细胞保留对潮霉素的敏感性。因此,发现的潮霉素抗性克隆的数量仅代表全部DNA打靶事件中的一半。表2列出两个细胞株的转染结果。含有能表达hpt基因的Pc-hpt片段的对照质粒pcDNA3.1-hpt(图5D),在每一百万个细胞中产生大约3200个潮霉素抗性克隆。这表明大约0.3%的随机整合频率。当用pJHK1和pJHK2共转染时,发现大约88至550个潮霉素抗性克隆。假定仅有一半的打靶事件获得潮霉素抗性,推测有大约180至1100个定位事件,或者随机转化频率的大约2.8%至17%。相反,当pJHK1或pJHK2作为单独转染底物时,没有发现潮霉素抗性克隆。
00122潮霉素抗性的表型表示hpt已经整合在基因组启动子的后面。因为潮霉素抗性克隆没有从对照转染(没有pJHK1的情况下,用pJHK2转染)中发现,抗性的表型肯定归功于hpt 5’-attB和tk 5’-attP位点之间的重组,形成Pc-hpt连接。为了检测重组是否也在hpt 3’-attB和tk 3’-attP位点之间发生,代表性克隆通过PCR分析。对应于hpt和与tk 3’attP序列相邻的DNA的引物被用在代表性潮霉素抗性克隆的PCR反应中(图5F)。在所有的8个代表克隆中,都检测到预期的1.2kb PCR产物,但在起始的JHK3a或293T中未检测到。这表明hpt 3’-attB和tk 3’-attP之间重组可能伴随着hpt 5’-attB和tk 5’-attP序列间的重组(有义定位)。同样地,预期hpt 3’-attB和tk 5’-attP之间的重组可能伴随着hpt 5’-attB和tk 3’-attP序列间的重组(反义定位)。这些双重重组反应将交换出tk DNA。
来自DNA打靶的丙氧鸟苷抗性00123hpt 5’-attB和tk5’-attP之间的重组不仅使hpt与Pc相连,而且从Pc中置换掉tk。因此,预期打靶事件能产生丙氧鸟苷抗性表型。当转移将潮霉素克隆转移到含有的50μM丙氧鸟苷的培养基上,一周之后,12个克隆中有9个表现出对这个核苷类似物的明显抗性。其它克隆表现对丙氧鸟苷敏感或低水平的耐受。敏感或低抗性表型可能有多种原因。例如,依赖于细胞的代谢状态,可能细胞需要更长的时间消耗以前合成的tk蛋白质。或者,交换出靶基因座的tk基因可能整合到基因组的其它地方。
00124综上所述,发现显示对潮霉素的抗性、对丙氧鸟苷的敏感性和正确的分子连接的克隆,与图5A所示的DNA交换事件相符合。
表2以每一百万个细胞中获得R潮霉素抗性克隆评定的转染结果细胞系 JHK3a JHK3bHygR频率(%)HygR频率(%)转染底物No DNA 0 <1.00E-06 0 <1.00E-06pJHK1 0 <1.00E-06 0 <1.00E-06pJHK2 0 <1.00E-06 0 <1.00E-06pJHK1+pJHK2 5505.50E-04 88 8.80E-05pcDNA3.1-hpt3200 3.20E-03 35003.50E-03实施例4在植物细胞中用环状DNA分子置换基因00125本实施例展示在植物细胞中使用环状DNA分子置换基因的一个策略。与实施例2相比,本实施例合并另外两个特点第一,宿主细胞产生整合酶或重组蛋白质,所以不需要共转化整合酶或重组酶表达构建体,第二,特征基因的两侧是反向attB位点。这使得被置换的基因片段能以任一方向位于基因组启动子之后。一个方向将产生有义转录物,另一个方向则产生反义转录物。有义表达将导致基因的高表达,而反义表达将导致对应的宿主基因或基因家族被抑制。
00126图6描述使用两种特异性构建体的一般策略。靶构建体含有RB-P-attP-int-35S-codA-35S-npt(反向的attP)-LB片段。所用的缩写P,启动子;35S,CaMV 35S启动子,codA,胞嘧啶脱氨酶基因编码区,npt,卡那霉素抗性基因编码区。attP位点和对应的int基因属于不可逆重组系统类型,如ΦC31系统。RB和LB是来自土壤杆菌属介导的基因转移的右边和左边的T-DNA边界序列。35S-npt片段允许在宿主基因组中进行目的构建体的选择。codA基因是一个反选择性标记,编码能将提供的5-氟胞嘧啶转变为有毒的5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶。如果在培养基中加入5-氟胞嘧啶,只有失去有功能的codA基因的细胞能生长。使用其它选择性标记、反选择性标记和启动子是可能的。
00127整合构建体包括基因片段,在本例中是两侧为反向的一组attB位点的cDNA。可产生两个可能的结构,导致codA反选择性标记丢失。一个结构中,cDNA按有义方向转录(图6A)。另一个结构中,cDNA按反义方向转录(图6B)。
实施例5利用两个重组酶系统引入基因到染色体中并切除无关DNA00128本实施例展示了联合两个不同的重组系统来递送基因到指定的染色体靶点,随后除去不需要的DNA的一般策略。图7图示该策略。
方法00129图7描述了使用两个特定构建体的一般策略。受体构建体包括两侧是一组反向重组位点的P-attP-int-P-sel1片段,该重组位点属于一类重组位点在序列上相同或几乎相同的重组系统。这些重组系统包括,如Cre-lox系统、FLP-FRT系统、R-Rs系统和β重组酶-six系统。P代表启动子,sel1代表选择性标记,int代表整合酶或对应各自的attP位点的重组酶编码区。本例中的attP位点是重组位点,其或者属于在图7A中所示的、如ΦC31系统的不可逆重组系统,或者属于在图7B中所示的、如Cre-lox系统、FLP-FRT系统、R-Rs系统或β重组酶-six系统的可逆重组系统。
00130供体整合构建体包括attB-sel2-P-trait,在此P-trait两侧是一组反向重组位点,该重组位点属于在序列上重组位点相同或几乎相同的重组系统类型。“Trait”是提供设计进入基因组的特征的基因。本例中的attB位点是重组位点,其或者属于如ΦC31系统的不可逆重组系统类型,或者属于如Cre-lox系统、FLP-FRT系统、R-Rs系统和β重组酶-six系统的可逆重组系统类型。
00131步骤1将两侧是反向重组位点的P-attP-int-P-sel1目的构建体通过常规转化插入到宿主基因组中。如果愿意,使用反向重组位点以促进通过复杂整合方式的拆分构建单拷贝的转基因,例如,所提到的方式在美国专利号6114600中有描述。或者,单拷贝转基因受体能通过分子筛选的方法获得。
00132步骤2将整合构建体转化到目的株中,它是含有目的构建体的转基因细胞株。在本实施例中,目的株产生整合酶或重组酶。如果目的株不表达整合酶或重组酶,可将相应的整合酶或重组酶的基因、mRNA或蛋白质与整合构建体一起共同引入。整合构建体将通过attP与attB间的重组整合入基因组靶点。这样把特征基因放置在两组对特征基因的功能不需要的片段之间,该片段能通过重组位点之间的DNA的位点特异性删除而除去。
00133步骤3然后,将对应于两组不需要的DNA两侧的重组位点的重组酶或重组酶基因,mRNA或蛋白质,通过稳定或瞬时方法引入宿主细胞。例如,可通过遗传杂交,或者再一轮的稳定转化,将重组酶基因稳定引入。通过递送蛋白质或mRNA分子,或递送不会引起DNA分子稳定整合的重组酶基因的转化方法,得到重组酶的瞬时引入。
00134步骤4当通过引入的重组酶成功地完成不需要的DNA的位点特异性重组时,宿主细胞将仅仅保留两侧是一组反向的重组位点的期望特征基因。
00135图7B描述除去不需要的DNA的变更策略,该策略由不能识别第一个不可逆重组系统的不可逆重组位点的第二不可逆重组系统完成。受体目的构建体包括两侧是一组不可逆重组位点的P-attP-int-P-sel1片段,来自第二不可逆重组系统的attP-2(PP’-2)。供体整合构建体包括attB-sel2-P-trait,在此P-trait两侧是一组不可逆重组位点,来自第二不可逆重组系统的attB-2(BB’-2)。
00136步骤1两侧是attP-2位点的P-attP-int-P-sel1目的构建体通过常规的转化插入宿主基因组。
00137步骤2将整合构建体转化进目的株,通过attP和attB间的重组整合到基因组靶点。这样把特征基因放置在两组对特征基因的功能不需要的片段之间,该片段能通过attP-2和attB-2间的位点特异性重组而删除。
00138步骤3然后,对应于attP-2和attB-2位点的重组酶通过稳定或瞬时方法引入宿主细胞。
00139步骤4当通过引入的重组酶成功地完成不需要的DNA的位点特异性重组时,宿主细胞将仅仅保留两侧是一组杂合的重组位点PB’-2和BP’-2的期望特征基因。
实施例6基因富积00140本实施例展示了联合使用两个不同的重组系统来递送一系列基因到指定的染色体靶点,随后除去不需要的DNA的一般策略。连续加入特征基因到相同的基因组位点被称为“基因富积”。该方法产生一系列特征基因在基因组位置上的准确堆积,而不掺入其它可能导致额外关系,如抗生素抗性标记的不需要的DNA。本方法对能被DNA转化的所有细胞适用,包括动物和植物细胞。
方法
00141图8描述了使用一系列特定构建体的策略的实施例。除本例中的attP位点必须是来自如ΦC31系统的不可逆重组系统类型外,受体或目的构建体与图7A描述的相同。
00142第一供体或整合构建体含有attB-sel2-P-trait1-attB,其中P-trait1-attB两侧是一组反向重组位点,该重组位点属于在序列上重组位点相同或几乎相同的可逆重组系统类型。为了说明的目的,在此用Cre-lox系统作为这类重组系统的一个实施例;但是,其它可逆重组酶也合适。基因trait1是设计进入基因组的特征基因,P代表启动子,以及sel2是选择性标记编码区。本例的attB位点必须是来自属于如ΦC31系统的不可逆重组系统类型的重组位点。
00143步骤1将两侧是反向的lox位点的P-attP-int-P-sel1的目的构建体通过常规的转化引入宿主基因组(图8A)。
00144步骤2将整合构建体转化入目的株,即含有目的构建体的转基因株(图8A)。在本实施例中,目的株产生整合酶或重组酶。如果目的株不表达整合酶或重组酶,可将对应于整合酶或重组酶的基因、mRNA或蛋白质随着整合构建体共同引入。整合构建体将通过attP与attB间的重组整合入基因组靶点。因为在整合构建体中有两个attB位点存在,任何一个位点能与基因组attP位点重组。如果trait1下游的attB位点与attP重组,那么产生的重组事件将不会激活选择性标记sel2的表达。另一方面,如果sel2上游的attB位点与attP重组,那么将形成P-attR-sel2连接。通过上游启动子转录sel2,将赋予选择性表型。这类整合事件能被选择出来。所产生的结构把P-trait1-attB片段放置在两组对特征基因的功能并不需要的片段之间,该片段能通过被直接定位的lox位点之间的DNA的位点特异性删除而除去(图8B)。
00145步骤3然后,将对应于括住两组不需要的DNA的重组位点的重组酶基因,mRNA或蛋白质,通过稳定或瞬时方法引入宿主细胞。例如,可通过遗传杂交,或者再一轮的稳定转化,得到重组酶基因的稳定引入。通过递送蛋白质或mRNA分子,或递送不会引起DNA分子稳定整合的重组酶基因的转化方法,得到重组酶的瞬时引入。
00146步骤4当成功地完成不需要的DNA的位点特异性重组时,宿主细胞将仅仅含有期望的trait基因和两侧是一组反向的lox位点的attB位点(图8C)。现在,在染色体目的基因座上的单一attB位点能作为另一轮位点特异性重组的靶点。而且,在宿主基因组中缺乏选择性标记基因,这意味着前面用到的标记sel1和sel2可用于后面的转化。
00147步骤5trait2的引入(图8C)。第二个特征基因,trait2,能通过含有以下片段的整合构建体引入attP-P-trait2-attP-lox-P-sel2。注意sel1或sel2标记能再一次作为选择性标记。两个attP位点中的任何一个都能与基因组attB位点重组,使DNA在目的位点整合,并提供由sel2编码的选择性表型。如果trait2下游的attP位点与attB重组,那么整合结构如图8E所示。如果P-trait2上游的attP位点与attB重组,那么整合结构如图8D所示。这两类整合结构可通过分子分析确定。只有图8D所示的一类对额外基因的富积有用。保留图8D所示的一类,而图8E所示的一类被丢弃。
00148步骤6重复步骤3和4,以便从图8D所示的结构中除去不需要的DNA。这样将产生图8F所示的整合结构。
00149步骤7trait3的引入(图8F)。第三个特征基因,trait3,能通过含有以下片段的整合构建体引入attB-P-trait3-attB-lox-P-sel2。注意sel1或sel2标记能再一次作为选择性标记。两个attB位点中的任何一个都能与基因组attP位点重组,使DNA在目的位点整合,并赋予由sel2编码的选择性表型。依赖于哪一个attB与attP重组,整合结构将不同。这两个整合结构可通过分子分析确定。图8G中显示了从P-trait3上游的attB位点间的重组得到的允许进一步基因富积的结构。
00150步骤8重复步骤3和4,以便从图8G所示的结构中除去不需要的DNA。这样将产生图8H所示的整合结构。
00151步骤9trait4的引入(图8H)。第四个特征基因,trait4,能通过含有以下片段的整合构建体引入attP-P-trait4-attP-lox-P-sel2。注意sel1或sel2能再一次作为选择性标记。两个attP位点中的任何一个都能与基因组attB位点重组,使DNA在目的位点整合,并赋予由sel2编码的选择性表型。依赖于哪一个attP与attB重组,整合结构将不同。这两个整合结构可通过分子分析确定。图8I中显示了从P-trait4上游的attP位点间的重组得到的允许进一步基因富积的结构。
00152步骤10重复步骤3和4,以便从图8I所示的结构中除去不需要的DNA。这样将产生图8J所示的整合结构。
00153步骤11trait5的引入(图8H)。图8J描述了第五个特征基因trait5的富积。原则上,它与就富积基因号3,trait3所述的策略基本相同。同样地,特征基因号6的富积将与特征基因号2和4的富积相同。这个再现模式能被无限地重复,并且同样的标记基因能在每个转化事件中循环使用。
变化00154也可以使用几组反向attB和attP位点,胜于几组直接定向的位点。图9展示这个可能性。这组事件基本上与图8描述的相同,除几对反向的attB和attP位点外。
实施例7从串联DNA进行基因置换00155本实施例展示了通过基因置换策略递送DNA片段到指定染色体靶点的一般策略。与第二重组系统联合使用时,随后能从基因组中除去不需要的DNA。整合DNA是串联形式,能从某些基因转移方法如生物弹中产生。
结果
00156图10描述了使用两个特定构建体的一般策略。受体构建体包括两侧是一组反向重组位点的P-attP-int-P-sel1-attP片段,该重组位点属于在序列上重组位点相同或几乎相同的可逆重组系统类型。这些重组系统包括,如Cre-lox系统、FLP-FRT系统、R-Rs系统和β重组酶-six系统。在图10中,P代表启动子,sel1代表选择性标记编码区,int代表对应各自的attP位点的整合酶或重组酶编码区。本例中的attP位点是一类属于如ΦC31系统的不可逆重组系统类型的重组位点。
00157整合构建体含有attB-sel2-P-trait1-attB,在此P-trait1片段两侧是一组反向重组位点,该重组位点属于在序列上重组位点相同或几乎相同的可逆重组系统类型。为了说明的目的,在此用Cre-lox系统作为这类重组系统的一个实施例,虽然其它可逆重组酶也合适。基因trait1是设计进入基因组的特征基因,P代表启动子,sel2是选择性标记编码区。在本例中attB位点是来自属于如ΦC31系统的不可逆重组系统类型的重组位点。
00158步骤1将两侧是反向的lox位点的P-attP-int-P-sel1-attP的目的构建体通过常规的转化引入宿主基因组(图10A)。如果愿意,可以使用反向lox位点以促进通过复杂整合方式的拆分构建单拷贝的转基因,例如,所提到的方式在美国专利号6114600中有描述。或者,单拷贝转基因受体能通过分子筛选的方法获得。
00159步骤2整合构建体被转化入目的株,即含有目的构建体的转基因株(图10A)。在本实施例中,目的株产生整合酶或重组酶。如果目的株不表达整合酶或重组酶,可将相应于整合酶或重组酶的基因、mRNA或蛋白质与整合构建体共同引入。整合构建体将通过attP与attB间的重组整合入基因组靶点。因为在整合构建体中有两个attB位点存在,在基因组靶点中有两个attP位点存在,任何一个attB位点都能与任何一个基因组attP位点重组。在本例中,仅当sel2上游的attB位点与int上游的attP重组时才形成P-attR-sel2连接。通过上游启动子转录sel2,将赋予选择性表型。这类整合事件能被选择出来,并肯定伴随另一个下游attP与attB的重组。如图10A所示,基因组attP与trait1紧密相连的下游attB间的重组将产生图10A,B所示的结构。但是,即使trait1较远处的另一个下游attB位点与基因组的attP位点重组,最终结果是一样的。也就是说,产生的结构将P-trait1片段放置在两组对特征基因的功能不需要的片段之间,该片段能通过被直接定位的lox位点括在一起的DNA的位点特异性删除而除去(图10B)。
00160步骤3然后,将对应于括住两组不需要的DNA的重组位点的重组酶基因,mRNA或蛋白质通过稳定或瞬时的方法引入宿主细胞。例如,可通过遗传杂交,或者再一轮的稳定转化,得到重组酶基因的稳定引入。通过递送蛋白质或mRNA分子的转化方法,或递送不会引起DNA分子稳定整合的重组酶基因,得到重组酶的瞬时引入。
00161步骤4当成功地完成不需要的DNA的位点特异性重组时,宿主细胞将仅仅含有两侧是一组反向的lox位点的期望特征基因(图10C)。
变化00162也可能使用几组反向attB和attP位点,而不是几组直接定位的位点。图11展示这个可能性。这组事件与图10描述的类似,只是使用几对反向的attB和attP位点。
实施例8在拟南芥属中通过染色体重组进行转基因转位00163本实施例展示了利用噬菌体ΦC31位点特异性重组系统使一个植物株的转基因转移到另一个植物株中的策略。本策略也可联合使用第二个位点特异性重组,来除去不需要的DNA,因此在宿主基因组中仅留下特征基因。
00164实验室株(供体株)被两侧是一组特异性重组位点的转基因转化。相应的一组位点被引入原种品系,期望的野生品种(受体株)。当实验室株与原种品系杂交,在实验室株染色体与原种品系染色体之间发生位点特异性重组。有重组酶存在时,转基因将从实验室株染色体上转移到原种品系染色体上,而不引起相邻DNA的转位。原则上,转位事件可以发生在非同源或同源染色体之间。如果在同源染色体之间,转位事件可以发生在不同的位置之间,或者在同源染色体的相同位置上。
00165图12A描述了用在本说明中的两个植物株。一个目的植物株用pCD426转化。这个“受体”构建体衍生自土壤杆菌属的基因转移载体pPZP211。被插入在RB和LB即土壤杆菌属转移DNA的右和左边界序列间的是以下片段loxP-35S-PP’-npt-35S-int-PP’-(反向loxP),在此35S是花椰菜花叶病毒35S RNA启动子,loxP是野生型Cre-lox重组系统的重组位点,PP’是ΦC31重组系统的attP位点,npt是新霉素转移酶的编码区,int编码ΦC31重组系统的整合酶。虽然启动子在图中被清楚地标出,为了简单起见,促进转录终止、位于每个编码区下游的终止子没有作为独立的元件标出。
00166第二个植物株用从pPZP211衍生得到的“供体”构建体pCD414转化。含有BB’-bar-loxP-P3-gus-(反向的loxP)-35S-BB’-dhlA-35S-aacC1的DNA片段被插入到RB和LB之间,在此bar编码除草剂basta的抗性,P3是sugarcane bacilliformbadnavirus启动子,gus是β-葡糖醛酸酶的编码区,dhlA是haloalkane dehalogenase的编码区(Naested等人,1999植物杂志18571-76),aacC1基因编码庆大霉素抗性。P3-gus片段代表旨在渗透进入受体原种品系的典型特征基因。
00167当将供体株与受体株杂交时,在两个染色体之间预期发生整合酶促进的位点特异性重组。如果npt近端的PP’与bar近端的BB’重组,35S将脱离npt,而融合bar。这个事件将提供对basta的抗性。其它任何PP’与BB’间的组合不能产生bar选择性表型。如果也发生下游PP’与BB’间的重组,35S-dhlA的连接将断开。dhlA的表达赋予对DCE(1,2-二氯乙烷)的敏感性。因此,对basta和DCE都有抗性的植物应含有从供体染色体转移到受体染色体的bar-loxP-P3-gus-(反向的loxP)-35S DNA区段。
00168在这个特定的情况下,因为供体和受体株是通过随机递送T-DNA被独立转化的,供体和受体位点将在不同的基因座上。但是,如果供体和受体位点在相同的基因座上(同源染色体的相同位置),相同的原则仍然适用。在所有的例子中,位于转基因的两侧的位点特异性重组将除去供体转基因侧翼的供体DNA连接物。
结果和讨论供体和受体株00169拟南芥属生态型Columbia通过含有pCD426的土壤杆菌属介导转化。同样,拟南芥生态型Landsberg用pCD414转化。这两个生态型有足够的多态性标记,使得如果需要,可以在受体株背景下估计供体DNA的量。这促进了在实验室供体株和野生原种(分别以Landsberg和Columbia生态型作为代表)之间的典型渗透过程。
00170通过35S-PP’-npt片段提供的卡那霉素抗性Columbia株进行DNA印迹杂交分析。大约10%的卡那霉素抗性植物被发现具有完整的单拷贝的pCD426编码T-DNA,如图12A所描述。由35S-accC1DNA提供的庆大霉素抗性Landsberg株也被进行单拷贝插入筛选。虽然在原则上,供体或受体株是否含有多个转基因拷贝不重要,但是只有所有拷贝的35S-BB’-dhlA连接被破坏,用dhlA标记的反选择才有效。
F1植物00171表3列出了在3个单拷贝pCD426与7个单拷贝或低拷贝pCD414株间的成对杂交。在可能的21个成对组合中有18个杂交,并产生F1后代。对F1后代进行庆大霉素抗性的筛选。用PCR反应来鉴定也含有受体基因座的植物。那些符合这些标准的植物被选来产生F2的种子。另外,这些F1植物进行了一组位点特异性重组的测试。
00172第一个测试是在涂有basta的单个叶子上检测对basta的抗性。在杂交的某些组合中,有些叶子表现出对该除草剂抗性的特征,并且当母代叶子变成黄色时仍保持绿色。第二个测试是用PCR分析叶子DNA中35S-PB’-bar连接的存在。对应于35S和nos3’终止子(在bar和npt的3’末端都存在)的引物应能扩增出一个1.1kb35S-PP’-npt非重组连接和/或0.8kb的重组35S-PB’-bar连接(图12A,12B)。这两个连接条带的相对丰度能表示重组量。在一些F1植物中,发现了0.8kb 35S-PB’-bar的连接。但是,与1.1kb产物相比,0.8kb产物的相对低丰度表明仅有少量细胞发生重组。
00173第三个测试是对F1的花和叶组织进行DNA印迹分析。用EcoRI,HindIII和SacI(图12A,12B,分别描述为E,H,S)联合酶切DNA,并与35S探针杂交。图12A和12B表示母代和重组染色体的预期切割模式。在CD426中,预期杂交探针可检测到单个3.1kb的条带。在CD414中,该探针应能与两个条带杂交,一个预测的大小是2.5kb,另一个是转基因宿主边界条带,大小依赖于最近的宿主裂解位点的位置。在转移指定DNA片段的双重重组事件中,受体染色体应显示2.2和1.1的两个新条带,而在供体染色体中是一个1.9kb的新条带和相同大小的转基因宿主边界片段。
00174在检测到重组的情况下,F1植物对该重组事件是嵌合的。主要的杂交信号是与母代3.1和2.5kb片段的杂交信号。但是,当处理更长的曝光时间时,检测到重组条带。因为在大约2到3.1kb区域有强烈的杂交,所以预期的2.2和1.9kb重组条带在此背景下不能观察到。但是,1.1kb的条带在一些植物的花和叶组织中能清楚的检测到。该杂交模式与其它一些杂交产生的F1后代的相似。DNA印迹和PCR数据都显示重组仅发生在少部分细胞中。
00175低重组率可能是由于35S-int转基因的低表达,两个参与重组的位点的位置效应,和/或常见于不位于同源染色体的相同位置的位点间的低重组率。同样的,由Cre-lox介导的染色体转移产生更低频率的异常染色体重组,以前在烟草中(Qin等人,1994美国国家科学院院刊,911706-10),拟南芥中(该实验室,未发表),和在烟草-拟南芥杂交细胞(Koshinsky等人,2000植物杂志23715-22)观察到。但是,basta抗性表型,35S-PB’-bar连接的PCR检测和1.1kb 35S-BP’-(反向的loxP)连接的DNA印迹数据,均与转基因从供体到受体染色体的转移相一致。
F2后代00176将来自每个杂交的代表性F1植物,包括那些没有检测到重组的杂交,自交产生F2种子。向F2的幼苗喷洒basta。表3表示18个杂交中的5个,至少有一个能产生basta抗性(BarR)的F2后代的F1株。另3个杂交产生显示出对basta有部分抗性的F2植物,而剩下的10个杂交没有产生BarR后代。用叶子喷洒实验显示在F1植物中有相同的抗性模式。
00177尤其重要的是所有三个受体株产生BarR后代。这表明成功的转基因转位不限于基因组中的极少位置。7个供体株中的4个产生BarR后代,其中一些杂交产生部分BarR的植物。这种部分抗性可能是由于bar基因的低表达,如通过基因沉默导致的那样。但是,一个更可能的解释是部分basta抗性是由于之后发生了体细胞重组,而不是35S-PB’-bar连接的生殖传递。预计发育上较晚的重组事件将使更少的细胞有35S-PB’-bar连接。
00178有趣的是,10个杂交中没有产生BarR后代的8个可被追踪到供体株CD414-10,CD414-16和CD414-82。估计所有的这三个株都有单拷贝的供体DNA。但是,这些株可能不含有一个完整的pCD414 T-DNA拷贝。可能是在该DNA片段的重要元件中,如bar或BB’序列中发生的未被检测到的DNA重排或点突变,导致了缺乏可观察的重组。
00179在产生抗性植物的杂交的任何组合中,兄弟植物并不是都相似。一些植物表现出比其它植物对basta更有抗性,因为它们比兄弟植物长得更大。BarR的高水平可能是由于转移事件的生殖传递,或者在母代供体和受体染色体共分离的情况下,来自于发育早期的重组事件。
00180用DNA印迹杂交分析F2幼苗。用EcoRI,HindIII和SacI联合酶切DNA,并与bar DNA探针杂交。与35S探针杂交产生一串条带不同,bar探针预期检测到一个1.1kb的代表供体构建体(图12A)的SacI-HindIII片段的条带。依赖于重组量,2.2kb 35S-PB’-bar条带应是可见的。如果该条带杂交强度较1.1kb母代的条带更低,这表示在体细胞中重组。如果雄性和雌性配子均遗传重组事件,那么仅2.2kb的条带存在,而没有1.1kb的条带。2.2kb的条带在所有8个被检查的F2幼苗中都可见,虽然强度不同。在一个被检查的幼苗中,2.2kb的条带杂交的强度与1.1kb的相同。该条带图谱与幼苗通过雄性或雌性生殖体(但不是两者)来遗传相一致,产生一个转基因转移事件杂合的合子。如果这样,缺乏转基因转移事件的同源染色体能在与非转基因Columbia生态型植物的回交中被分离。从这样的一个回交中产生的BarR后代将在转基因转移受体染色体上是半杂合的;并且多达它们的一半也已与有相互被转移的基因座的供体染色体分离开来。
00181从供体和受体株产生的F2后代表型
BarR表示在F1植物中观测到的basta抗性。
部分BarR表示在F1植物中观测到的部分basta抗性。
0表示在F1植物中未发现basta抗性。
ND表示没有进行该杂交。
不需要的DNA的删除00182转基因转移技术被设计成保证转移之后不再需要的DNA能随后从宿主基因组中删除。供体和受体基因座含有一组来自另一个重组系统的反向重组位点,在本例中,来自Cre-lox系统(图12A)。转基因转移后,在受体染色体上的新结构含有几组直接重复loxP位点,它们位于不同于特征基因(以P3-gus片段为例)的DNA片段的两侧(图12B)。图12C显示了当与表达cre基因的植物杂交时,Cre重组酶介导的loxP特异性重组删除不需要的DNA,仅留下两侧是一组反向loxP位点的特征基因。因为反向loxP位点能互相重组使插入DNA反向,故特征基因将以相对着丝粒的任一方向存在。这可能导致来自一个给定的目的位点的两个截然不同的表达模式。
可能的变化00183这些实验中所示的特异性设计可以为使用其它不同于ΦC31的重组系统而进行修改。图13表示了一个实施例,在此Cre-lox被用于将特征基因(P2-gus)从供体转移到受体染色体。第二个重组系统,如FLP-FRT,被用于随后除去不需要的DNA。
00184供体构建体pVS78被转化到基因组的随机位置上。P1-bar选择性标记两侧是直接定位的loxP位点,而供体构建体片段两侧是一组反向的lox511位点。lox511等位基因不与loxP重组。因此,如果cre基因被引入基因组,loxP×loxP重组事件和lox511×lox511重组事件将把复杂基因座分离成单拷贝,并删除P1-bar标记。可在与供体株杂交进入受体株同时或之前,完成该分离步骤。这类受体株的一个例子是VS11。如图13所示,供体和受体染色体之间的双重位点特异性重组,loxP之间和lox511之间,将形成P1-aha连接,在此P1是水稻肌动蛋白启动子,aha是乙酰羟酸合成酶编码区。aha的表达提供imazethapyr抗性。如前,因为P1-loxP-aha片段两侧是直接定位的FRT位点,所以它能通过FLP重组酶的引入随后被除去(图13中未表示)。
总结00185当前的转化方法导致被引入DNA的位置、模式和拷贝数不可预测地整合。可以预想使用现有的转化方法,随机地将目的位点放入基因组中,产生目的受体株。单拷贝的目的株将优于那些有复杂多拷贝的。转基因的转移策略引入了侧翼反向重组位点,因此,与基于获得单拷贝转化子的策略一致(Srivastava等人,1999美国国家科学院院刊,9611117-11121;Srivastava和Ow,2001植物分子生物学46561-566;美国专利号6114600)。
00186一旦获得目的株,它们能就位点整合和表达模式进行表征。那些被认为是合适的可以作为用于随后DNA插入的目的位点。然后,目的位点可以被繁殖到原种品系中。随后特征基因(或一个DNA片段中的多个特征基因)的传递可以通过位点特异性整合进入实验室株的目的位点或通过DNA的随机整合进入实验室株基因组而进行。然后,特征基因区段能从供体株染色体转移到原种品系受体染色体,如本实施例中所展示的。
00187将目的位点引入原种品系的背景时,应当认为优良品种在不断地发展。例如,目的位点可能是随机插入,并与基因X相邻。那么,X-target被广泛地回交,例如,原种品系A代表Texas,原种品系B代表Nebraska,以及原种品系C代表Argentina。随着时间的过去,原种品系A,B和C发展为新的原种品系A2,B2和C2。但是因为这些新的原种品系并非全新的,它们分别起源于A,B和C,它们很可能都有X-target基因座。因此,一个新的转基因,可能是以前转基因的改良品,或者一段含有多个转基因的DNA片段,能再一次通过位点特异性重组从实验室株的该基因座转移到原种品系A2,B2和C2的该基因座。一旦目的株在原种品系背景中建立起来,该转基因转移技术将促进转基因从实验室株到原种品系之间的穿梭,并且这将在转基因特征的商品化中节省相当的劳力和时间。
序列表<110>THE UNITED STATES OF AMERICA,AS REPRESENTED BYTHE SECRETARY OF AGRICULTURE<120>用于在真核基因组中置换、转移和富积DNA的方法<130>16313-0054<140>PCT/US01/23049<141>2001-07-23<150>60/220,062<151>2000-07-21<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ggccctgaaa ttgttgcttc tgcc 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2gtcaaaaagt ttcgtcaata tcac 24<210>3<211>89<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成寡核苷酸<400>3gggcccgcca cgatgacaca aggggttgtg accggggtgg acacgtacgc gggtgcttac 60gaccgtcagt cgcgcgagcg cgagaattc89<210>4<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成寡核苷酸<400>4gcggtgcggg tgccagggcg tgcccttggg ctccccgggc gcgtactcca cct 53<210>5<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成寡核苷酸<400>5agtagtgccc caactggggt aacctttgag ttctctcagt tgggggcgta ggg 5权利要求
1.在真核细胞中获得位点特异性基因置换的方法,包括a)提供含有受体构建体的真核细胞,其中受体构建体包括侧翼是两个或更多个的不可逆重组位点(IRS)的受体多核苷酸。b)向细胞中引入包含侧翼是两个或更多个不可逆互补重组位点(CIRS)的供体多核苷酸的供体构建体;和c)用不可逆的重组酶多肽接触受体构建体和供体构建体;d)其中不可逆重组酶催化第一和第二类型重组位点间的重组和供体多核苷酸置换受体多核苷酸,因此形成置换构建体。
2.权利要求1的方法,其中供体构建体是环状的。
3.权利要求1的方法,其中供体构建体是环状载体。
4.权利要求1的方法,其中供体构建体是染色体。
5.权利要求1的方法,其中受体构建体是染色体。
6.权利要求1的方法,其中受体构建体包括两个IRS,供体构建体包括两个CIRS。
7.权利要求6的方法,其中IRS是相互反向的,CIRS是相互反向的。
8.权利要求6的方法,其中供体多核苷酸进一步包括可操作连接了目的基因的启动子。
9.权利要求6的方法,其中受体构建体进一步包括与一个IRS相邻的启动子。
10.权利要求9的方法,其中启动子位于IRS的5’方向。
11.权利要求9的方法,其中受体构建体进一步包括可操作连接选择性标记的第二启动子。
12.权利要求9的方法,其中受体多核苷酸或供体多核苷酸进一步包括负选择性标记。
13.权利要求9的方法,其中受体多核苷酸或供体多核苷酸进一步包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
14.权利要求13的方法,其中受体多核苷酸包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
15.权利要求14的方法,其中不可逆重组酶多肽是ΦC31整合酶、大肠杆菌P4噬菌体重组酶、大肠杆菌λ噬菌体重组酶、李斯特氏菌属U153或A118噬菌体重组酶,或放线菌噬菌体R4 Sre重组酶。
16.权利要求15的方法,其中不可逆重组酶是ΦC31噬菌体整合酶。
17.权利要求1的方法,其中进一步包括通过将置换构建体与可逆的重组酶接触而缺失不希望有的核苷酸序列,其中置换构建体包括一对或更多对直接定位的与可逆重组酶相容的可逆重组位点(RRS)。
18.权利要求17的方法,其中可逆重组酶选自由噬菌体P1的Cre,酵母的FLP,噬菌体Mu的Gin重组酶,pSR1质粒的R重组酶,和芽孢杆菌属噬菌体的β重组酶组成的组。
19.权利要求17的方法,其中受体构建体包括两个IRS,供体构建体包括两个CIRS。
20.权利要求19的方法,其中供体多核苷酸包括两个相互反向定位的RRS。
21.权利要求20的方法,其中RRS位于启动子和目的基因的侧翼。
22.权利要求21的方法,其中受体构建体进一步包括两个相互反向定位的RRS。
23.权利要求22的方法,其中RRS位于启动子和侧翼是所述两个IRS的受体多核苷酸的侧翼。
24.权利要求17的方法,其中受体构建体包括三个IRS,供体构建体包括三个CIRS。
25.权利要求24的方法,其中所述三个IRS包括两个相同的IRS和一个不同的IRS,其中三个CIRS包括两个相同的CIRS和一个不同的CIRS。
26.权利要求25的方法,其中供体构建体进一步包括可操作连接了目的基因的启动子。
27.权利要求25的方法,其中受体构建体进一步包括与一个IRS相邻的启动子。
28.权利要求27的方法,其中启动子位于IRS的5’方向。
29.权利要求27的方法,其中受体构建体进一步包括可操作连接了选择性标记的第二个启动子。
30.权利要求27的方法,其中受体多核苷酸或供体多核苷酸进一步包括负选择性标记。
31.权利要求27的方法,其中受体多核苷酸或供体多核苷酸进一步包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
32.权利要求31的方法,其中受体多核苷酸包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
33.权利要求32的方法,其中不可逆重组酶多肽是ΦC31整合酶、大肠杆菌P4噬菌体重组酶、大肠杆菌λ噬菌体重组酶、李斯特氏菌属U153或A118噬菌体重组酶,或放线菌噬菌体R4 Sre重组酶。
34.权利要求33的方法,其中不可逆重组酶是ΦC31噬菌体整合酶。
35.权利要求1或17的方法,其中真核细胞选自哺乳动物细胞或植物细胞。
36.权利要求35的方法,其中真核细胞是植物细胞。
37.通过权利要求36的方法产生的植物细胞。
38.包括权利要求37的植物细胞的植物。
39.权利要求35的方法,其中真核细胞是人类细胞。
40.生产转基因植物的方法,包括步骤a)提供包括侧翼是两个不可逆重组位点(IRS)的染色体受体多核苷酸的受体植物;b)提供包括侧翼是两个互补不可逆重组位点(CIRS)的染色体供体多核苷酸的供体植物;c)使供体植物与受体植物杂交,产生转基因植物,其中转基因植物表达催化IRS与CIRS的重组,和供体多核苷酸对受体多核苷酸的置换的不可逆重组酶多肽,因此在转基因植物中形成染色体置换构建体。
41.权利要求40的方法,其中受体植物是单拷贝受体株。
42.权利要求40的方法,其中受体植物和供体植物是相同的物种。
43.权利要求40的方法,其中受体多核苷酸进一步包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
44.权利要求43的方法,其中进一步包括选择不表达不可逆重组酶多肽的转基因植物后代。
45.权利要求40的方法,其中染色体置换构建体包括可操作连接了供体多核苷酸的启动子。
46.权利要求45的方法,其中启动子来自受体植物。
47.权利要求40的方法,其中受体多核苷酸或供体多核苷酸进一步包括负选择性标记。
48.权利要求40的方法,其中IRS是相互反向的,CIRS是相互反向的。
49.权利要求40的方法,其中不可逆重组酶多肽是ΦC31整合酶、大肠杆菌P4噬菌体重组酶、大肠杆菌λ噬菌体重组酶、李斯特氏菌属U153或A118噬菌体重组酶,或放线菌噬菌体R4 Sre重组酶。
50.权利要求49的方法,其中不可逆重组酶是ΦC31噬菌体整合酶。
51.权利要求40的方法,其中进一步包括使转基因植物与含有编码可逆重组酶的核酸的植物杂交,其中染色体置换构建体进一步包括一对或更多对直接定位的与可逆重组酶相容的可逆重组位点(RRS)。
52.通过权利要求40-51的方法产生的转基因植物。
53.在细胞中富积基因的方法,包括a)提供染色体中含有目的构建体的细胞,其中目的构建体包括目的多核苷酸,两个相互反向定位的可逆重组位点(RRS),并且其中目的多核苷酸包括至少一个不可逆重组位点(IRS);b)向细胞中引入包括第一供体多核苷酸、两个互补不可逆重组位点(CIRS)和两个相互反向定位的RRS的第一供体构建体;c)使与每个IRS和CIRS相容的不可逆重组酶多肽接触目的构建体和第一供体构建体,其中不可逆重组酶整合第一供体多核苷酸到目的构建体中,因此形成第一染色体整合构建体;d)通过使与每个RRS相容的可逆重组酶多肽与基因座接触,删除在第一染色体整合构建体中不希望有的核苷酸序列,因此形成第一染色体特征构建体;e)向细胞中引入包括两个IRS、第二供体多核苷酸和一个RRS的第二供体构建体;f)使不可逆重组酶多肽与第一染色体特征构建体和第二供体构建体接触,其中不可逆重组酶整合第二供体多核苷酸到第一染色体特征构建体中,因此形成第二染色体整合构建体;g)选择含有第二染色体整合构建体的细胞,其中第一供体多核苷酸与第二供体多核苷酸相邻;h)通过使与每个RRS相容的可逆重组酶多肽与被选择的第二染色体整合构建体接触,删除在所选的第二染色体整合构建体中不希望有的核苷酸序列,由此形成第二染色体特征构建体;i)向细胞中引入包括两个CIRS、第三供体多核苷酸和一个RRS的第三供体构建体;j)使不可逆重组酶多肽接触第二染色体特征构建体和第三供体构建体,其中不可逆重组酶整合第三供体多核苷酸到第二染色体特征构建体中,由此形成第三染色体整合构建体;k)选择含有第三染色体整合构建体的细胞,其中第二供体多核苷酸与第三供体多核苷酸相邻;和l)通过使与每个RRS相容的可逆重组酶多肽与被选择的第三染色体整合构建体接触,删除在所选的第三染色体整合构建体中不希望有的核酸序列,由此形成第三染色体特征构建体。
54.权利要求53的方法,其中任何一个供体构建体是环状载体。
55.权利要求53的方法,其中受体构建体是染色体。
56.权利要求53的方法,其中任何一个供体多核苷酸包括可操作连接了启动子的目的基因。
57.权利要求56的方法,其中供体多核苷酸进一步包括选择性标记。
58.权利要求57的方法,其中受体构建体进一步包括编码不可逆重组酶多肽的多核苷酸。
59.权利要求58的方法,其中受体多核苷酸包括编码不可逆重组酶多肽的核酸。
60.权利要求59的方法,其中不可逆重组酶多肽是ΦC31整合酶、大肠杆菌P4噬菌体重组酶、大肠杆菌λ噬菌体重组酶、李斯特氏菌属U153或A118噬菌体重组酶,或放线菌噬菌体R4 Sre重组酶。
61.权利要求60的方法,其中不可逆重组酶是ΦC31噬菌体整合酶。
62.权利要求56的方法,其中受体构建体进一步包括可操作连接了选择性标记的启动子。
63.权利要求62的方法,其中选择性标记是负选择标记。
64.权利要求53的方法,其中真核细胞是植物细胞或哺乳动物细胞。
65.权利要求64的方法,其中真核细胞是植物细胞。
66.权利要求64的方法,其中真核细胞是人类细胞。
全文摘要
本发明包括可用于真核细胞中位点特异性多核苷酸置换的组合物和方法。这些方法包括单一多核苷酸置换和基因富积方法。用本发明优选使用的真核细胞是植物细胞和哺乳动物细胞。
文档编号C12N15/90GK1455817SQ01815451
公开日2003年11月12日 申请日期2001年7月23日 优先权日2000年7月21日
发明者D·W·欧 申请人:(由农业部部长代表的)美利坚合众国
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