细胞培养室与动物细胞体外培养用生物反应器的制作方法

专利名称：细胞培养室与动物细胞体外培养用生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养室与动物细胞体外培养用的装有该室的生物反应器。
更具体地，本发明涉及具有至少两个平面过滤膜的细胞培养室，其膜具有由一个有对称轴的外壳所限定的不同断裂阈值(seuil decoupure)，还涉及一种能够在所述培养室中培养动物细胞，同时能够调节和控制培养细胞所处环境的生物反应器。
用于动物细胞体外培养的本发明细胞培养室和生物反应器使得有可能在无菌条件下培养动物细胞。
本发明应用于生产治疗目的的动物细胞，例如像造血细胞、肝细胞、皮肤细胞(称之角蛋白细胞)、胰腺细胞、有组织的或不在组织结构中的神经细胞。
技术状况因此，为了制造生物反应器而研制器官、组织或细胞移植，这种移植代表了研究医学技术的先进水平，在经济上也具有很大的利益，这些生物反应器用于培养具有治疗目的的动物细胞，或者移植所述细胞，或者与病人界面缝合的外部设备中使用它们，作为有器官缺陷的治标办法。
用于真核生物细胞培养的实际生物反应器的主要缺陷在于传质，即营养物质和氧转移直到真核生物细胞，因为这些细胞易碎，还由于在搅拌介质通气时产生的机械压力破坏这些细胞。
US 6 048 721描述了一种用于哺乳动物细胞活体外生长和维持的生物反应器。在这种生物反应器中，使用细胞平面床(lit planaire)和不透气但透液体的膜限定的圆盘状培养室。灌注到生物反应器下室中的有营养的介质快速扩散，吹入上室中空气快速氧化该介质。根据这种生物反应器的运行方式，含有由细胞培养产生的废物的介质直接送到排放管。按照酶处理回收培养后的细胞。在这类设备中，培养室的厚度有产生氧分压梯度的危险，这不太适合良好的细胞存活。
现有技术中已知的用于真核细胞培养的生物反应器的缺陷在于，这些生物反应器以连续灌注培养室的方式运行，有营养的介质流没有回收，直接送到排放管，因此增加了培养液成本。
然而，对于动物细胞的培养，例如像造血细胞或肝细胞，富生长因子的营养液流对于有可能使所述细胞增殖和分化显得是必不可少。所述的生长因子是极昂贵的，不能循环这些因子的生物反应器运行，从临床开发的观点来看占有不相容的很高金融成本。
本发明的目的是克服所有这些缺陷。
本发明的内容本发明的目的是制造动物细胞体外培养的培养室和生物反应器，它们能够保持这些培养细胞周围介质的稳衡过程，因此它们能使在较好条件下增生成为可能。
为了达到这个目标，本发明研制了下面公开的目的。
本发明的一个目的是在所述的培养室和生物反应器中保持良好的细胞生存能力，这样一方面为培养介质的细胞提供足够量的营养，另一方面排出产生的废物和抑制物使细胞群体生长。
本发明的另一个目的是能够循环介质的生长因子，同时从培养介质充分排出细胞废物，这样实现了经济优化的细胞培养。
本发明的另一个目的是能够在培养细胞上进行靶基因转移。
本发明的另一个目的是能够保持培养介质的物理-化学性质，不管细胞生长所诱发的扰动如何。
本发明的另一个目的是能够保证培养室和生物反应器的无菌、防腐，特别在整个细胞培养期间更是如此。
本发明的另一个目的是从本发明的培养室和生物反应器回收培养的细胞。
本发明概述本发明基于观察结果，即动物细胞体外培养的培养室和生物反应器可以克服前面提到的不同缺陷，它们能够同时保持良好的培养细胞的细胞生存能力，同时循环介质的生长因子，因此保证良好的细胞增殖水平。
于是，本发明的目的是动物细胞体外培养的培养室，该室用具有对称轴的外壳限定，该外壳由一个外侧壁，两个端壁和动态液体介质进口和出口构成，这些室的特征在于其包括
a)至少两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜，这些膜与该对称轴垂直；b)在这些膜之间，构成生物相容培养物支持体的装置，其能够粘附培养状态下的细胞；c)两个端壁构成分配动态液体介质的装置；d)三对动态液体介质的进口和出口(F1、F2、F3)，它们用于供给培养室细胞和用于选择性提取所培养的细胞，由它们培养所得到的废物和过量营养物，两对中，其中每对都是在其中一个端壁与其中一个膜之间连接，第三对是在两个平面过滤膜之间连接。
本发明还有一个目的是动物细胞体外培养的生物反应器，该反应器包括培养室，该室由具有对称轴的外壳限定，其外壳由一个外侧壁、两个端壁和动态液体介质进口和出口构成，还包括所述介质在所述室中循环的装置，这种生物反应器的特征在于它包括a)一个所述细胞培养的室，该室包括至少两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜，这些膜与该对称轴垂直，在所述的具有不同断裂阈值的膜之间，有一个构成支持生物相容培养物的装置，该装置能够粘附培养状态下的细胞，所述的室是用具有对称轴的外壳限定，其外壳包括两个构成动态液体介质分配装置的端壁，和三对动态液体介质的进口和出口F1、F2、F3，它们用于供给培养室细胞和用于选择性提取培养的细胞，由它们培养所得到的废物和过量营养物，两对中每对都是在其中一个端壁与其中一个膜之间连接，第三对是在两个过滤膜之间连接；b)按照在封闭回路中循环和装有所述介质的膨胀瓶R1的第一种动态液体介质F1循环装置，这些装置与所述的培养室相连；c)根据在封闭回路中或开放回路中，第二动态液体介质F2的循环装置，其取决于提供给所述介质的运行情况，和含有所述介质的容器R2，这些装置与所述的培养室相连；d)按照在开放回路中循环的第三动态液体介质F3的循环装置，和含有所述介质的容器R3，这些装置与所述的培养室相连；e)控制、调整与调节动态液体介质的与调节-指令模块相连的装置。
通过下面的附图，借助对培养室和生物反应器的非限制的说明性描述可更好地理解本发明，该生物反应器包括所述的室-

图1表示用具有对称轴的六角形外壳限定的细胞培养室的示意图。
-图2以示意图形式表示在本发明的生物反应器的培养室中，在《下降段》压力梯度p1＞p3时液体介质动态循环F1和F3，其中在具有两个不同断裂阈值的膜之间构成支持生物相容培养的装置是宏观支持床。
-图3以示意图形式表示在本发明的生物反应器的培养室中，在《上升段》压力梯度p3＞p1时液体介质动态循环F1和F3，其中在具有两个不同断裂阈值的膜之间构成支持生物相容培养的装置是宏观支持床。
-图4以示意图形式表示在生物反应器的培养室中，在《下降段》压力梯度p1＞p3。
-图5以示意图形式表示在本发明生物反应器的培养室中，在《上升段》压力梯度p3＞p1。
-图6表示生物反应器的装配图，其中未表示出调节-指令模块。
-图7以示意图形式表示在本发明的生物反应器的培养室中，在《下降段》压力梯度p1＞p3时液体介质动态循环F1和F3，其中构成支持生物相容培养的装置是所述的培养液过滤膜。
-图8以示意图形式表示在本发明的生物反应器的培养室中，在《上升段》压力梯度p3＞p1时液体介质动态循环F1和F3，其中构成支持生物相容培养的装置是所述的培养液过滤膜。
本发明的详细描述本发明涉及具有对称轴的细胞培养室，该室同时含有细胞和培养介质，包括至少两个具有不同断裂阈值的过滤膜和构成支持生物相容培养的装置，其装置置于两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜之间，所述的室由具有对称轴的外壳限定，其外壳由一个外侧壁和两个端壁构成。
第一膜，所述的加料膜具有选自0.01-7微米的断裂阈值，这样可能在培养室中允许例如蛋白质和大分子之类的营养介质分子通过进行生物化学交换，同时进行细胞约束，阻止培养的细胞离开稳态区，还阻止污染颗粒通过，特别用来阻止可能污染所述室的细菌。
另一个过滤膜，所谓的渗析膜，具有至多15千道尔顿(KDa)断裂阈值，允许分子约束分子量高于15KDa的分子。在培养室中这种过滤膜的存在与第一膜确定了约束(限制)培养细胞的空间。这时，具有至多15千道尔顿(KDa)断裂阈值的平面过滤膜规定了培养室中培养细胞，以及生长因子和大蛋白。
根据本发明的一个特征，至少一个膜具有的断裂阈值优选地是0.2-4微米，另一个膜具有的断裂阈值优选地是10-12KDa。
根据本发明，在细胞室中存在的膜数可以高于2。在这种情况下，补充的膜具有与上述两个膜相适应的断裂阈值。
根据本发明，在细胞室中具有不同断裂阈值的平面过滤膜以与所述培养室的对称轴的垂直方式放置。
根据本发明，具有不同断裂阈值的平面过滤膜可以是无机或有机膜。作为实例，可以列举由生物相容的有机聚合物，纤维素或聚砜构成的膜。
此外，这两种过滤膜彼此相距至多约25毫米，优选地至多20毫米，即显得有利于细胞良好繁殖的距离，因为它们实际上总是与营养物和氧气源接触。
构成支持能够在培养时粘附细胞的生物相容培养物的装置，放在两个具有不同断裂阈值的过滤膜之间。
根据本发明，其中一个构成支持生物相容培养物的装置可以是生物相容的宏观支持床，该床由不同尺寸的微粒构成，其微粒可以任选地通过烧结颗粒元件聚结成连续块状。这种床的厚度至多等于两个具有不同断裂阈值的过滤膜之间的距离。所述的宏观支持床在培养时起着支持细胞的作用，还起着保持两个具有不同断裂阈值的过滤膜之间细胞约束空间的机械作用。根据在本发明培养室中培养细胞类型，生物相容宏观支持物(macrosupport)的类型和合适尺寸应以适当方式进行选择。
在两个培养室膜之间使用的宏观支持物可以具有圆柱或球的或多形的形状，例如像加工块。
根据本发明，这些宏观支持物可以是无机源的(例如像珊瑚)，金属源(例如像钛及其合金)或由生物相容聚合物构成。
作为说明性的，在为了应用于移植骨髓而培养造血细胞的情况下，与在其目的是再造骨而培养造骨细胞的情况下，宏观支持物可以是珊瑚微珠。具有希望粒度的这种珊瑚微珠对于上述应用是合适的宏观支持物，特别地因为它们具有通过造血先祖(细胞)集群(colonisé)的能力。在骨前体的情况下，这些珊瑚珠还可以是代谢的，这样有利于在再造外科中使用它们。
这时，例如在为了通过肝细胞体外生物量，肝-不足病人在活体外应用血液解毒培养肝细胞的情况下，最适合的宏观支持物可以是聚酰胺珠，例如尼龙，氟化聚合物珠，例如特氟隆。
于是，在所述膜之间有宏观支持物和具有至多15千道尔顿(KDa)断裂阈值的过滤膜不允许培养物中的细胞通过，生长因子同样不允许通过，这样能够将培养物中的细胞约束在位于两个具有不同断裂阈值膜之间的这个细胞约束空间里，而这些细胞粘附在所述的生物相容宏观支持物上。
构成支持本发明生物相容培养物的另一装置可以是所谓培养M2的过滤膜，这种膜具有与前面提到其它膜不同的特别特征，即具有断裂阈值在0.01-7微米之间的所述加料过滤膜和断裂阈值至多15KDa的所述渗析膜。
置于这两个所述膜之间的这个培养膜可以置于断裂阈值至多15KDa的所述渗析膜上。
所述的培养膜可以是无机或有机源的膜，其膜组成可以根据不同的培养类型和培养条件进行改变。
因此，能使培养细胞繁殖的所述培养膜可以采用基体接枝或采用细胞共培养进行修饰。
作为非限制性的说明实例，可以提到各种修饰类型，它们是-固定粘附糖蛋白类分子的配位体-或固定抗体，-或用第一类细胞生成基层，其基层构成了在其它生物反应器中或在通常的培养中操作的第一粘附细胞培养物，然后在转移到所述基层培养室中之后放入第二类细胞，并且优化共培养条件。然而，也可以在本发明的培养室中用第一类细胞生成所述的基层，接着漂洗所述的基层，放入第二类细胞，并且优化共培养条件。
-或固定蛋白质分子。
亦为过滤的培养膜具有选自0.01-7微米之间的断裂阈值。
在使用所述这种培养膜的情况下，其膜作为构成本发明生物相容培养物支持物的装置，置于具有选自0.01-7微米之间断裂阈值的所述加料过滤膜与断裂阈值至多15KDa的所述渗析膜之间，这两种膜可以采用具有适当网眼的支持物支持，让用于往细胞培养室加料的动态液体介质F1、F2、F3通过，并且选择性提取培养的细胞，培养它们得到的废物以及过量营养物。
根据这种必要性，用于支持上述这些膜的所述具有网眼的支持物可以置于与所述膜的一个面或另一个面，或两个面接触，以及与培养膜的一个面和/或其它面接触。
如前面提到的一样，细胞培养室包括具有对称轴的外壳，其外壳由一个外侧壁和两个端壁构成，可以与位于所述侧壁每个端部的两个板底相似。
这个具有对称轴的外壳例如可以由生物相容的聚合物材料或不锈钢构成。作为生物相容的聚合物材料，可以列举聚烯烃、聚酰胺、聚酯或含氟聚合物等。
以均匀方式往培养室加入动态液体介质，因为由外壳端壁内表面极好分配所述介质，和借助这些合理配置的介质进口和出口极好地将所述介质分布在所述室中。
根据本发明，两个端壁的内表面构成动态液体介质的分布装置。
根据第一类，具有对称轴的外壳端壁内表面是光滑的，以便与加料膜和渗析膜接触的培养室中加料动态液体介质的分配以均匀方式没有应力自然地进行。
根据第二类，这类可保证在与加料膜和渗析膜接触时在加料液体介质中培养室的有条理加料，具有对称轴的外壳两个端壁内表面备有分布条纹(stries)，这样能够用三种动态液体介质中的两种供给所述的培养室。这些分布条纹由所述基本条纹构成了主要网。这种位于两个端壁中每个端壁内表面上的基本条纹网，对着细胞培养空间，可以从装在所述壁中的进口管道分散。
根据本发明，所述基本条纹的主要网，也称之分布网，有可能将两种动态液体介质进行均匀分配，这些介质借助生物相容管路送到培养室，其管路一端或多端与端壁处相连。应确定在对着两个端壁中每个端壁的细胞培养空间的面上分布条纹数量，以便达到动态液体介质在培养室中良好分散，其数量可根据具有对称轴的外壳形状进行确定。
所述的主要网用副网补充，副网由所述的副条纹构成，这种条纹较浅，与主要网呈基本直角取向，以便有利于在由主要网限定的分布区域间循环。因此，副网的副条纹与主要网的条纹基本垂直。这种副网可以有其可改变的空间，以便在与介质流进口相反一侧副条纹比较靠近，数量较多，从而有利于所述介质的排掉和除去。
主要网中两个相邻条纹构成了分布区域，与两个副网相邻条纹相交的两个主要网相邻条纹构成了分布孔(alvéole)。
主要网和副网构成了动态液体介质扩散的“方格”网端。这两种网一起例如可以构成蜂窝饼状类网眼的网。
在对着细胞培养空间的面上的主要网具有一定的高度和一定的宽度，已知这种条纹网应该与平面过滤膜接触以保证整体粘着，本技术领域的技术人员完全有能力确定。事实上，由条纹网和膜连接一起所构成的体积形成液体流分布格网，它可占膜表面的50％。
因此，例如，主要网可以由深度至多5毫米和宽度至多2毫米的基本条纹构成，在两个所述主要网相邻条纹之间的间距可以是至多2毫米。同样地，副网可以由深度至多2毫米和宽度至多2毫米的副条纹构成，在两个所述网相邻条纹之间的间距可以从介质流进口侧到所述介质流的出口逐渐降低。因此，在其远侧部分，即介质出口侧的部分，副网间距是至多2毫米。
自此，这些端壁可以希望作为例如蜂窝类孔的精细图案(finmotif)，具有不同断裂阈值的膜靠在或用聚合物粘胶类的生物相容粘胶粘在精细图案上。
关于培养室的具有对称轴的外壳，该外壳由一个外侧壁和两个端壁构成。
该外侧壁可以是由至少三个具有同样截面的部分构成，每个具有适当的高度，其高度可以相同。壁的这至少三个部分构成了至少三个可叠加模块(C1、C2、C3)的外壁，其中两个(C1和C3)接受培养室具有对称轴外壳的端壁，第三个模块(C2)夹在前两个之间，在其一端接受断裂阈值在0.01-7微米的所述加料平面过滤膜(M1)，另一端接受断裂阈值为至多15KDa的所述渗析平面过滤膜。
这至少三个模块是可叠加的，并且借助密封垫圈，使用适当的固定办法，例如像通过胶粘，采用螺钉等机械安装方法，将彼此以密封方式连接起来。
本发明培养室具有对称轴的外壳形状可以适当加以选择，以便例如有利于在支持物上叠放多个培养室。本技术领域的技术人员可以根据将要使用的情况选择所述室的具有对称轴的外壳形状。作为实例，可以期望具有对称轴的外壳，其形状截面为圆形或多角形。
应该强调指出，可以实施培养室的模块堆叠，其条件是所述的模块具有同样的形状，以便这些模块在适当支持物上稳定堆叠。
例如，根据一种采用多模块堆叠的培养室实施方式，例如六角形可能有利于在例如具有六柱的适当基座上相继堆叠这些模块。在这种情况下，起作支持堆叠这些模块作用的六个基座柱还可以例如用作动态液体介质的加料和排除管道。
关于本发明动态液体介质加料，采用三种动态液体介质系统，即具有三种不同介质流的系统(图1-8)进行加料。
第一种动态液体介质(F1)通过生物相容管道加入和排出，这些管道与靠近具有对称轴外壳的端壁(例如上端壁)的模块(C1)侧壁相连，提供含有营养介质的培养介质(还称之富营养介质)，这种介质富含生长因子。这第一种动态液体介质由细胞培养所必需的元素组成，例如像蛋白质、痕量元素、葡萄糖、水和生长因子，并且给培养介质提供新的营养介质。
第二种动态液体介质(F2)通过生物相容管道加入和排出，这些管道与模块(C2)外侧壁相连，其壁构成培养室的具有对称轴外壳部分，根据将要使用的情况，这种动态液体介质可以具有三种不同的功能。
根据第一种功能，这第二种动态液体介质(F2)通过生物相容管道加入，其管道与模块(C2)培养室的侧壁处相连，用于往所述室的所述模块加入用来培养的细胞，以及用于在培养后回收在所述的培养室模块中所述培养的细胞(例如造血细胞和肝细胞)。
根据第二种功能，这第二种动态液体介质可以起到转移基因的作用。事实上，通过这第二种动态液体介质往培养室模块(C2)中加入培养细胞悬浮液时，在所述液体介质中含有的病毒颗粒固定在其膜处呈悬浮液状的细胞上。这第二种介质流能够得到在遗传上修饰的所期望的培养细胞，这是人们希望培养的细胞。这种介质事实上输送了基因转移媒介物，因此有可能使它们与这些细胞接触，以便确定靶细胞与基因转移媒介物之间的膜熔合。这些基因转移媒介物是任何种类的。作为说明，可以列举病毒，例如像腺病毒、反转录病毒、脂质体、质粒配合物。
在人体外进行的这样一种细胞标记(通过注射基因转移媒介物)能够精确地击中待遗传上修饰的组织。此外，例如可以使用合成病毒，这种病毒唯一用于击中在有治疗意义的细胞群上转移基因。这种病毒的特征在于分离外壳编码基因，确切地说载有遗传信息的基因，在所期望的遗传信息转移后，其病毒在细胞内不能够再复制。因此，由使用的合成病毒和由可能存在于病人中的野生病毒重组的病毒产生的危险性是有限的。
根据第三种功能，这第二种动态液体介质(F2)可以起到漂洗在细胞约束空间中存在的抑制大分子流的作用。事实上，这些进行培养的细胞在收获之前，或它们进行预接种处理时或在培养室中接种期间，可能受到应激反应。这种应激反应可能诱发产生(通过所述的细胞)蛋白质，这种蛋白质会抑制它们的繁殖能力，同时使它们通过休眠期，也称之静止期。在这种状态，所述细胞不再处于用生长因子进行刺激作出反应的生理期，同时繁殖。
在造血细胞的情况下，可以列举《放射-诱发》的应激反应，这种应激反应是通过受到离子辐射照射(目的是放射治疗应用或事故引起时)引起的，随后表现在应激反应。这类应激反应引起产生抑制物，例如像《β-转化生长因子》或《α-肿瘤坏疽因子》。与培养造血细胞所带来生长因子一样，这些抑制分子是细胞分裂素，因此它们被培养室具有不同断裂阈值的膜所约束。
为了进行适当培养这些细胞，应该除去培养介质，因此应该从该培养室除去这些抑制分子。在第三功能中的第二种动态液体介质自此用于漂洗细胞约束区，以便除去所述的抑制分子。
第三种动态液体介质(F3)通过生物相容管道加入和排出，这些管道与靠近具有对称轴外壳的第二个端壁(例如下端壁)的模块(C3)侧壁相连，提供含有基本营养介质的培养介质(还称之基本-再生营养介质)。这种基本营养介质是完全无生长因子的营养介质。这样一种基本介质因此由葡萄糖、水、痕量元素组成，例如像维生素和矿物质，用于评价介质pH的着色剂和白蛋白类的蛋白质。
根据本发明，用于通过具有三种不同动态液体介质(F1、F2、F3)(还称三液流)系统加料的这个培养室的特征是三对所述介质进口和出口。这些对中两对(F1、F3)在靠近往模块(C1)和(C3)加料的端壁处连接，有可能在与具有不同断裂阈值的平面过滤膜接触时使它们分布。第三对(F2)与处在两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜之间其外侧壁相连，即与模块(C2)相连。
限定培养室的在外壳上这些介质的进口和出口对交错排列能够达到所述液体介质在所述室中分布的均匀性(见图1)。
根据本发明的特征，三液流系统的进口和出口管道因此适当分配在培养室的具有对称轴的外壳上。
根据图1，记为EF1的第一种液流进口的生物相容性管道与接近培养室外壳上端壁的水平处相连，而记为SF1的第一种液流出口管道也在同样端壁相连，但与进口管道相反。
记为EF3的第三种液流进口的生物相容性管道与所述外壳下端壁的水平处相连，以便这种管道按照相对于富含生长因子的第一种有营养液流(EF1)进口管道的角度约120°相连，以便使在培养室中所述介质良好分配。另外，记为SF3的第三种液流出口生物相容管道也与同样端壁相连，但与所述液流(EF3)进口管道相反。
根据图1，记为EF2的第二种动态液体介质进口的生物相容管道，在两个记为(M1)和(M3)的平面过滤膜之间，按照相对于第一种液流(EF1)进口管道的角度约60°在外壳的外侧壁处相连，这两个膜的断裂阈值分别是0.22微米和10KDa。记为SF2的出口生物相容管道与在侧壁上所述液流进口管道相反相连。
结果，三对动态液体介质进口和出口置于三个外壳对称轴通过的垂直平面，这些平面以动态液体介质在第一个进口与第二个进口之间角度约60°，在第一个进口与第三个进口之间角度约120°交错排列，所述液体介质出口是以同样角度排列。
本发明还涉及生物反应器，该反应器包括前面描述的细胞培养室。这种培养室，借助这三对动态液体介质进口和出口，通过连接管道与所述室的加料容器和/或排出容器相连。本发明的生物反应器还包括培养条件的调节装置和所述动态液体介质质量转移的控制装置，这些装置与所述生物反应器的调节-指令模块相连。
因此，这种生物反应器除培养室外包括《还称之指令模块的调节模块》，这种块能够控制和调节pH，氧浓度和培养介质温度。《调节-指令模块》可以自动地控制整个生物反应器运行。这种调节是数值P.I.D.(比例积分微分数值调节)类的，可以记录采用不同探测器所收集的数据，并且通过数据处理进行分析。
自此，有前面描述的培养室的本发明生物反应器是，由按照一定质量或能量转移值规格加工的可互换的单元功能模块组成(例如像曝气器模块，换热器模块)，通过串联和/或并联的相同功能单元并列构成再定尺寸的模块组件，并由程序调节-指令模块提供给生物反应器。
调节-指令模块通过控制与调节装置接受与动态液体介质F1、F2、F3相关的信息，以及在培养室的区域-模块C1、C2、C3中发出的与各种容器、泵、阀和压力相关的信息，对它们管理并发出必需的运行命令。
因此，可能的是根据请求修改这些培养室的内部特征，并且为了适应于培养细胞类型而改变调节参数和程序，以达到介质的稳态。
整个调节作用还可以具有一个红外光谱测量的结晶池，这种池能够通过再发射光谱反褶积以测量在培养介质中某些溶质的浓度。这时可能的是《在线》和《实时》跟踪葡萄糖和乳酸盐的浓度。
因此，可以将培养介质的温度固定在30-38℃给定值。在细胞生长期间，培养介质的pH可以固定在6.5-7.7给定值。调节-指令模块还能够调节空气流量和CO2含量，其CO2溶解得到HCO3-气氛，它可缓冲介质，并且达到pH稳定。
根据本发明生物反应器其中一个特征，按照有可能循环在培养物中细胞发育所必需的生长因子的封闭回路中循环，第一种动态液体介质F1(室的)进口和出口管道通过连接管路与富含生长因子的有营养的介质容器R1相连。这种容器R1可以起到膨胀瓶的作用。
根据这种生物反应器其中一个特征，在该室第一种富营养介质F1进口管道与记为R1的这种介质容器之间的连接管路，配置了泵P1，该泵能够控制与调节在培养室的封闭回路中循环的介质F1体积与流量。
载有富营养液流F1的封闭回路在位于膨胀瓶R1处通入空气，其通入空气配置具有断裂阈值为0.22微米的过滤器，保证介质无菌。同样地，这个回路配置了由可程序调节-指令模块控制的电磁阀V1，这样有可能使压力与要求的气氛压力达到平衡。配置槽R1还配置了高含量和低含量液体介质传感器，用于启动流体循环反转。
根据本发明生物反应器其中一个特征，培养室的第三种基本有营养介质(EF3)进口管道通过连接管路与记为R3的这种介质容器相连，出口管道(SF3)通过排水管相连(废物回收室)。
根据本发明，与上面提到的第三种动态液体介质进口管道相连的连接管路，配置泵P3，而与所述液流出口管道相连的管路配置阀V3，它任选地用调节-指令模块控制，该组件能够调节与控制在培养室开放回路中循环的所述第三种介质F3的体积和流量。
根据本发明，富营养介质F1曝气设备和基本营养介质F3曝气设备在其一个或另一个上配备两种封闭和开放循环回路，而它们分别置于在细胞培养室中所述动态液体介质F1和F3进口与容器R1和R3之间。
根据本发明，在细胞培养室中，在所述动态液体介质F1和F3进口处两个循环回路中每个回路上配置了富营养介质F1的热交换器和基本营养介质F3的热交换器。
这些设备能够通过预调节进入其室的介质流，可保持培养室的稳态，以便不让培养介质容量中的元素进入培养室，其元素可能诱发其物理-化学参数严重扰动。
根据本发明生物反应器的其它特征，培养室的第二种动态液体介质EF2进口管道，其室位于外壳侧壁处，通过连接管路与记为R2的容器相连，该容器装有根据对它起作用所选择的第二种动态液体介质，即往用于培养的细胞培养室加料和在培养后从所述室卸料，或者进行基因转移，或者具有用于从培养室排出待培养细胞中抑制分子的漂洗液流的作用。
根据归因于培养室的第二种动态液体介质的功能，位于与所述壁上进口EF2管道相对的出口SF2管道通过下述方式相连-按照一种开放回路循环，通过连接管路，在培养后(即接近收获)与细胞回收容器相连，或与排出管相连(除去抑制分子的室)，或
-按照一种封闭回路循环，通过连接管路，与装有包含适当基因转移媒介物的介质的容器相连。
根据本发明生物反应器的其它特征，为了纯化从培养室出来的有营养介质F1，可以添加一种或多种介质交换功能模块，也称之渗析器或超滤器。这个或这些介质交换功能模块位于培养室外部，串联安装在富含生长因子的第一种营养介质F1封闭回路的循环出口连接管路上，并且开放回路的基本营养介质F3反向流过。
在封闭回路F1上使用以特别方式串联连接的两种功能模块的情况下，可以使用两种不同的断裂阈值，例如10KDa和30KDa。将来自10KDa模块的液流注入30KDa模块中，回收渗透液，即通过具有30KDa断裂阈值的膜的液体部分，以便再注入回路F1中，可以进行10KDa-30KDa介质蛋白质分选(fenêtrage)，其值相应于生长因子大小。
例如在第一个补充培养室中支持的细胞可产生生长因子时，并且希望调节这种介质(即回收产生的生长因子，不回收这些支持细胞产生的细胞废物)，以便能够在回路F1中再使用这种介质，刺激在基本培养室中存在的具有治疗意义的所述细胞，这样一些附加的功能模块是有效的。
应该指出培养造血细胞和/或血液细胞所使用的方法，可以使用基质(stromale)细胞的所述支持细胞。这些基质细胞一般可以被修饰，以便生产出具有表达水平的人的细胞分裂素，例如它们可以提供对培养细胞分裂素部分需求。
另外，应该强调指出，能够达到营养物分布均匀性，并最佳分散的具有对称轴的外壳，其优点是在与细胞和培养介质接触时与所有生物反应器的元件一样都是无菌的。事实上，将全部设备与容器瓶在121℃压力釜中进行生物反应器灭菌20分钟。连接管路、容器和其它密封元件都用生物相容材料制成，这些材料在实验室使用的情况下进行十个灭菌循环还可以支持，无任何损伤。相反地，整个培养室、连接管、介质容器等在人的临床使用的情况下构成单独使用的培养盒。
另外，在实验室类使用的情况下，用摩尔(Molaire)盐酸溶液消化蛋白质，接着超纯漂洗，再灭菌，如此进行细胞培养后的生物反应器再调节。
根据本发明生物反应器运行方式，和根据图2和7，富营养介质F1在外壳上端壁处加入培养室的区(C1)(C1模块或室)，它位于所述壁与具有约0.01-7微米断裂阈值的平面过滤膜之间，打开位于连接管路上的泵P1加入该富营养介质F1，该连接管路将培养室与装有所述介质F1的容器R1相连，而位于连接管路上的泵P3是停止的，该连接管路将培养室与装有基本营养介质F3的容器R3相连。另外，在位于外壳下端壁与具有至多15KDa断裂阈值的平面过滤膜之间培养室的区(C3)(C3模块或室)，其压力p3可用位于管路上的记为V3的反向压力阀调节，该管路将培养室与排出管(下水管)连接起来，以便在培养室区C1中压力p1高于压力p3，在区(C2)(C2模块或室)中压力p2按照压力梯度是在p1-p3之间。
因此，打开泵P1将第一种动态液体介质加入培养室中时，营养介质中生长因子通过记为C1的区，通过培养室具有约0.01-7微米断裂阈值的所述膜，但被具有至多15KDa断裂阈值的平面过滤膜保留，这种膜起到通过生长因子和大蛋白质阻挡层的作用。
因此，这些生长因子可能在具有约0.01-7微米断裂阈值的平面过滤膜两侧迁移，保证对两个培养室平面膜之间约束培养期细胞刺激生长和/或控制分化的作用，这两个膜确定了所述培养室的区C2(C2模块或室)。
根据图4，具有至多15KDa断裂阈值的平面过滤膜M3，规定了在培养室区C1和C2中新营养介质F1中的生长因子和大蛋白质。相反地，由所述室区C2中约束的细胞培养物产生的所述营养介质F1的痕量元素和小尺寸废物(如NO，NH4+，乳酸盐及其它物质)排到区3，从此处送到下水管。总横跨膜的液流因此从培养室的区C1朝向区C3(见图2和7)。
在这种本发明生物反应器运行方式中，该方式也称《下降段》，在封闭回路循环的新营养介质F1，由于这种水溶液排到区C3，具体地排到下水管而失去容量分析。因此，容器R1中营养介质F1的体积减少了。新营养介质F1中的生长因子和大蛋白质约束(限制)在区C1和C2中，这些废物从培养室的这些区排到区C3，并且借助打开的阀V3排到下水管。
一旦输送新营养介质F1的封闭回路的容器R1或膨胀瓶的体积达到一定的低水平，就按照特别顺序程序化的生物反应器调节-指令模块使液流循环反转。因此，运行的泵P1停止和处于停止的泵P3运行。这时关闭打开的阀V3。
因此，按照与前面运行方式相比反向压力梯度，在支配培养室区C1中的压力p1变得低于压力p3，而区C2中的压力p2是在p1-p3之间。这时总横跨膜的液流从区C3朝向培养室的区C2(见图3和8)。在这种生物反应器运行方式中，根据称之《向上段》的图3、8和5，在培养时中液流反转有可能使在培养室中循环的新营养介质F1再加入新营养元素，这些元素来自第三种动态液体介质F3，通过《下降段》补偿偶然的损失，其中包括水。事实上，这种基本介质(再生)F3向该室反馈葡萄糖、水、痕量元素细胞培养液。
一旦在输送新营养介质F1的封闭回路中循环的容器R1或膨胀瓶的体积达到一定的高水平，按照特别顺序程序化的生物反应器控制系统重新使液流循环反转。
因此，由于在富营养介质F1(即第一种动态液体介质)封闭回路中循环，它们构成该动态液体介质部分，生长因子限制在封闭回路和区C1和C2中，它们的浓度是在浓度C0至C0+/-ΔC之间摇摆。因此循环这种富培养介质，使用借助培养室和本发明的生物反应器优化的生长因子。
这个在培养室中液流反转系统能够产生横跨膜的液流，该液流具有与培养细胞脆性相容的低水力应力。因此得到一种缓慢的《层流》液流系统。这种液流反转还可以防止堵塞过滤膜，使用置于每个动态液体介质流上的电子压力计，可以实时控制所述过滤膜的横跨膜压力损失(测量膜的渗透性的指数)。
在本发明生物反应器运行方式中，在培养室二个平面过滤膜之间的外侧壁处进入或排出的第二种动态液体介质(F2)，在所述的培养室中，按照给予它的功能，根据在开放回路中或在封闭回路中的循环进行循环，泵P1和P3处于停止，通过希望给予它的功能，设定进口与出口布局(configuration)。
根据这种生物反应器运行方式，在第一种功能中第二种动态液体介质F2用于在培养室中接种待培养的细胞，用于培养后卸料，同它用在漂洗该室，除去抑制分子的第三种功能一样，它在开放回路中运行。相反地，动态液体介质F2具有转移基因的作用，在接种和培育时，它在封闭回路中运行。
在第一种功能中，根据图6的生物反应器运行方式，使用注射器，通过生物相容的隔膜，在培养室区C2中接种含有待培养细胞的第二种动态液体介质F2，该隔膜定位于进口管道EF2(外侧壁)的三个支管中的一个支管上，其电磁阀V2E1是开的，电磁阀V2E2和V2E3是关闭的。所述介质接种时，位于出口管道SF2的三个支管上的电磁阀V2S1、V2S2和V2S3是关闭的，出口管道SF2与进口管道EF2相反配置。
培养后回收细胞时，进口管道EF2的两个电磁阀V2E2和V2E3是关闭的，位于出口管道SF2的三个支管上的电磁阀V2S1是开的，该管道与回收培养细胞容器上的连接管路相连，而出口管道SF2的其它两个支管上的电磁阀V2S2和V2S3是关闭的。这时开启泵P2从容器R2泵送再生的基本介质，并且用来在细胞收集袋中净化室C2(在两个具有不同断裂阈值的膜之间)的内容物。能够采用胰蛋白和/或胶原酶和/或DNAse类酶处理，破坏在培养期间由细胞产生的细胞外基质，以利于它们连接。在由珊瑚构成类宏观支持物上培养造血细胞范围内，介质轻微酸化到pH＝6.0或pH＝6.5能够溶解该珊瑚，并且在漂洗后回收造血细胞。
在其第三种功能中，根据生物反应器运行方式，第二种动态液体介质F2，该介质含有在漂洗细胞限制空间时所必需的元素，按照与上述运行同样的电磁阀关闭与开启原则在开放回路中运行，只是进口管道没有安装生物相容的隔膜除外，但该管道通过连接管路与装有所述选择介质F2的容器R2相连。
漂洗介质F2加入培养室区C2时，该区在进口管道EF2的三个支管的一个支管处(外侧壁)，其电磁阀V2E3是打开的，电磁阀V2E1和V2E2是关闭的。加入和回收所述漂洗介质时，位于出口管道SF2的两个支管上的两个电磁阀V2S1、V2S2是关闭的，位于出口管道SF2的另一个支管上的电磁阀V2S3是开启的，漂洗液流连续地在开放回路中循环。电磁阀V2S3出口可以连接在通到下水管的管道上。该下水管由灭菌介质容器构成，与整个生物反应器管道，容器、功能模块和培养室一样，这样确保流出液无菌。特别在该下水管可以再添加两个0.22微米过滤器，以便增加安全性和保证无菌，特别当由于流出液太满而使下水管容器变“热”。
在第二种功能中与根据图6生物反应器的运行方式，含有基因转移媒介物的第二种动态液体介质F2，通过开启电磁阀V2E2加入培养室的区C2，该电磁阀位于进口管道EF2的三个支管的一个支管上，电磁阀V2E1和V2E3是关闭的。加入所述介质时，位于出口管道SF2的两个支管上的两个电磁阀V2S1和V2S3是关闭的。这种含有基因转移媒介物的介质F2在接种和培育时必不可少时在封闭回路中循环。结束基因转移步骤时，以如前面所述的漂洗方式再通过回路F2，以便漂洗任选的残留媒介物。然后，结束漂洗，按照液流F1和F3“向上”和“向下”段交替进行培养。
应该指出，向下段的液流反转向上升段时一种不希望的副现象，与介质F1被来自区C2和C3的废物轻微污染一样有可能性。然而，显然是稀释现象使这种可能的污染变得可忽略不计。此外，将基本介质F3的容器与培养室连接起来的连接管路最接近部分装有新介质F3，即来自所述容器的新介质F3，仅仅连接培养室与下水管的管路末端部分，即接近阀V3，装废物。
本发明的培养室和生物反应器可以用于人细胞体外培养，基于这一点，本发明涉及药学领域。作为说明，本发明的培养室和生物反应器可以应用于生产造血细胞或肝细胞。
因此，本发明涉及其应用于体外培养骨髓细胞。造血是生理学过程，它能通过多潜能原始细胞(称之原始细胞)繁殖和分化使血液中所有定形元素更新(成熟血液细胞具有有限的生命)，这种原始细胞能产生各类细胞，血液细胞也称之血液定形元素。这个过程是在造血生长因子，也称之细胞分裂素的控制下。
在抗肿瘤治疗中经受到偶然或连续发育不全的病人，移植未成熟造血细胞，称之造血先祖(progéniteur)，是一种能够推进损伤的骨髓活性，引发恢复血细胞生成的办法。
这个过程涉及采用细胞单采法或直接采用骨髓穿刺从病人抽取先祖细胞(发育早期细胞)，在发育的早熟期细胞，在培养后再注入，以便这些细胞能够再构建病人的血液和免疫系统(在完全发育不全的情况下)，或能够补偿短时间全血细胞减少症的病态期(中性白细胞减少、淋巴球减少和血小板减少期)，以便能够使发育不全受害者内生血液得以恢复(在偶然辐照的情况下)。
同样地，急性肝功能不全可导致出现非常短生命期的危险时，必需通过体外血液解毒处理克服病人的肝功能不足，这种处理因此需要大量的肝细胞，以便实现必要的代谢功能。前面说明的培养室和生物反应器能够产生肝细胞，其数量足以达到与血液动力学应激反应相容的有效治疗和解毒快速性，这样提出了病人血液体外循环。
作为说明，有效体积可以是50-100毫升的生物反应器能够进行动物细胞体外培养，在移植应用中产生细胞生物量的范围内和/或作为作为减轻肝功能不足的办法，其培养期可达十天。在构建有组织和分系统的组织模型的范围内，该生物反应器所允许的培养时间可以达到数月。
对于移植骨髓类细胞(造血细胞)，必需是106-107CFU(未成熟细胞类)/千克病人体重来自培养物。这个临床极值能够估算出移植所必需的来自造血培养物的细胞数为1010，该极值部分地决定了移植成功性。可以为这类应用规定如前面描述的一个或多个培养室以及生物反应器的尺寸。
上述细胞培养的pH、温度和氧分压条件是生长的pH时为约7.4，温度约37.5℃和氧分压(以％饱和)等于15％。有营养的介质是合成介质，该介质由超纯或合成的蛋白质和痕量元素(例如铁、锡、转铁蛋白、维生素等)以及所必需的着色剂组成。这种营养介质富含细胞分裂素生长因子，根据需要，其浓度可以是10-100纳克/毫升。此外，这些细胞分裂素可因类肝素存在而以生物学活性态被稳定。基本(再生)营养介质是以下述商品名销售的，α-MEM或RPMI1640或IMDM。
权利要求
1.动物细胞体外培养的培养室，该室用具有对称轴的外壳限定，该外壳由一个外侧壁，两个端壁和动态液体介质进口和出口构成，特征在于，该室包括a)至少两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜(M1和M3)，这些膜与该对称轴垂直；b)在这些膜(M1和M3)之间，构成支持生物相容培养物的装置，其能够粘附培养状态下的细胞；c)两个端壁构成分配动态液体介质的装置；d)三对动态液体介质(F1、F2、F3)的进口和出口，它们用于供给培养室细胞和用于选择性提取所培养的细胞，它们培养所得到的废物和过量营养物，在其中一个端壁与其中一个膜之间连接两对中的每一对，在两个平面过滤膜之间连接第三对。
2.根据权利要求1所述的培养室，其特征在于其中一个平面过滤膜具有断裂阈值0.01-7微米，另一个平面过滤膜具有断裂阈值至多15千道尔顿(KDa)。
3.根据权利要求1或2所述的培养室，其特征在于其中一个平面过滤膜优选具有断裂阈值0.2-4微米，另一个平面过滤膜优选具有断裂阈值10-12KDa。
4.根据权利要求1-3中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜彼此相距至多25毫米，优选地0.2-20毫米。
5.根据权利要求1-4中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于构成支持生物相容培养物的装置能够粘附培养状态下的细胞，该装置是生物相容宏观支持物床。
6.根据权利要求5所述的培养室，其特征在于宏观支持物床的厚度至多等于两个具有不同断裂阈值过滤膜之间的距离。
7.根据权利要求5和6中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于在膜之间的宏观支持物具有圆柱形状或多面体形状或球形。
8.根据权利要求5-7中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于宏观支持物构成材料选自无机材料、金属材料和生物相容聚合物材料。
9.根据权利要求8所述的培养室，其特征在于宏观支持物构成材料优选地选自珊瑚、钛及其合金、聚酰胺、氟化聚合物。
10.根据权利要求1-4中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于构成支持生物相容培养物的装置能够粘附培养条件下的细胞，该装置是置于两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜M1和M3之间的培养过滤膜M2。
11.根据权利要求10所述的培养室，其特征在于该培养过滤膜M2置于具有断裂阈值至多15KDa的膜上。
12.根据权利要求10-11中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于该培养过滤膜M2通过接枝或通过细胞共培养进行修饰。
13.根据权利要求12所述的培养室，其特征在于该培养过滤膜M2的修饰剂接枝涉及固定粘附糖蛋白质类分子、抗体分子，蛋白质分子的配位体。
14.根据权利要求12所述的培养室，其特征在于用第一类细胞生成基层，其基层构成了第一粘附细胞培养物，接着漂洗所述的基层，放入第二类细胞，优化共培养条件，这样采用细胞共培养进行修饰。
15.根据权利要求10-14中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于构成支持生物相容培养物的培养过滤膜M2具有断裂阈值0.01-7微米。
16.根据权利要求1-4和10-15中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于具有不同断裂阈值的过滤膜M1和M3和培养过滤膜M2用网眼支持物支持。
17.根据权利要求1-16中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于具有对称轴外壳的端壁内表面构成了动态液体介质分布的装置。
18.根据权利要求17所述的培养室，其特征在于端壁内表面是光滑的。
19.根据权利要求17所述的培养室，其特征在于两个端壁内表面配备了两种动态液体介质F1和F3的分布条纹。
20.根据权利要求19所述的培养室，其特征在于端壁的分布条纹构成主要网，这些条纹优选地沿动态液体介质传递方向扩散。
21.根据权利要求19-20中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于端壁分布条纹用副网补充，副网由副条纹构成，这种条纹与主要网条纹基本垂直。
22.根据权利要求19-21中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于主要网和副网构成了动态液体介质传递的“方格”网。
23.根据权利要求19-22中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于端壁的主要网和副网条纹是与具有不同断裂阈值的膜接触的。
24.根据权利要求19-22中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于主要网的条纹深度至多5毫米，宽度至多2毫米，两个相邻条纹之间的间距是至多2毫米。
25.根据权利要求19-23中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于副网条纹深度至多2毫米，宽度至多2毫米。
26.根据权利要求1-25中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于在端壁与具有断裂阈值0.01-7微米膜M1之间连接两对动态液体介质进口和出口F1中的一对，通过具有断裂阈值0.01-7微米的所述平面过滤膜，在含有生长因子的营养介质中加入细胞培养介质。
27.根据权利要求26所述的培养室，其特征在于这对动态液体介质进口和出口对F1按照回路封闭循环运行。
28.根据权利要求1-27中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于在两个过滤膜之间连接的这对动态液体介质F2进口和出口，可实现加入待培养细胞和回收所述培养细胞、转移基因和回收遗传修饰的细胞，以及加入漂洗液体和从培养物中除去细胞发育的抑制分子的功能。
29.根据权利要求1-28中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于在开放回路中在另一个端壁处连接两对动态液体介质F3进口和出口中的另一对，通过具有断裂阈值至多15KDa的平面过滤膜，在无生长因子的营养介质中加入细胞培养介质。
30.根据权利要求1-29中至少一个权利要求所述的培养室，其特征在于三对动态液体介质进口和出口置于三个外壳对称轴通过的垂直平面上，这些平面以动态液体介质在第一个进口与第二个进口之间角度约60°，在第一个进口与第三个进口之间角度约120°交错排列，所述液体介质出口是以同样角度排列的。
31.用于动物细胞体外培养的生物反应器，该反应器包括培养室，该室由具有对称轴的外壳限定，其外壳由一个外侧壁、两个端壁和动态液体进口和出口构成，还包括所述介质在所述室中循环的装置，其特征在于它包括a)一个所述细胞培养室，该室包括至少两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜M1和M3，在具有不同断裂阈值的所述膜之间，有一个构成支持生物相容培养物的装置，该装置能够粘附在培养条件下的细胞，所述的室是用具有对称轴的外壳限定，其外壳包括两个构成动态液体介质分配装置的端壁，和三对动态液体介质的进口和出口F1、F2、F3，它们用于供给培养室细胞和用于选择性提取培养的细胞，从它们培养所得到的废物和过量营养物，两对中每对都是在其中一个端壁与其中一个膜之间连接，第三对是在两个平面过滤膜之间连接；b)按照在封闭回路中循环和装有所述介质的膨胀瓶R1的第一种动态液体介质F1循环装置，这些装置与所述的培养室相连；c)根据在封闭回路中或开放回路中，按照归因于所述介质运行的第二动态液体介质F2循环装置，和含有所述介质的容器R2，这些装置与所述的培养室相连；d)按照在开放回路中循环的第三动态液体介质F3循环装置，和含有所述介质的容器R3，这些装置与所述的培养室相连；e)控制、调整和调节动态液体介质的与调节-指令模块相连的装置。
32.根据权利要求31所述的生物反应器，其特征在于所述液体介质F1、F2和F3循环装置分别配置与调节-指令模块连接的泵P1、P2和P3。
33.根据权利要求31和32中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于第三种液体介质F3循环装置配置与调节-指令模块连接的泵V3。
34.根据权利要求31所述的生物反应器，其特征在于装有富含生长因子的动态液体介质F1的膨胀瓶R1配置具有断裂阈值0.22微米的过滤器和由调节-指令模块控制的电磁阀V1。
35.根据权利要求31-34中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于膨胀瓶R1配置高水平和低水平液体介质传感器，用于启动在所述培养室中流体循环反转。
36.根据权利要求31所述的生物反应器，其特征在于动态液体介质的调节装置包括氧、温度和所述介质pH的调节装置。
37.根据权利要求36所述的生物反应器，其特征在于所述介质的调节装置是为一定质量传递或热量值所规定的功能性单元模块。
38.根据权利要求37所述的生物反应器，其特征在于功能性模块是曝气模块，换热器模块、pH调节器模块或渗析或超滤模块。
39.根据权利要求31-38中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于它包括根据权利要求1-30中至少一个权利要求所述的培养室。
40.根据权利要求31-39中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于压力p1控制该培养室的区C1，该区位于在所述室的上端壁与具有断裂阈值为0.01-7微米的平面过滤膜之间。
41.根据权利要求31-40中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于压力p2控制该培养室的区C2，该区在所述室中两个具有不同断裂阈值的平面过滤膜之间。
42.根据权利要求31-41中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于压力p3控制该培养室的区C3，该区位于具有断裂阈值至多15KDa的平面过滤膜与所述室外壳的下端壁之间。
43.根据权利要求31-42中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于在培养室中压力p1高于压力p3，压力p2在p1与p3之间时，富含生长因子的营养介质F1从培养室的区C1排到所述室的区C3。
44.根据权利要求31-42中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于在细胞培养室中压力p3高于压力p1，压力p2在p1与p3之间时，无生长因子的基本营养介质F3从培养室的区C3排到所述室的区C1。
45.根据权利要求31-43中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于打开泵P1能够从培养室加入富含生长因子的营养介质F1，泵P3是停止的，其特征还在于调节反压力阀V3，以便在培养室的区C1控制的压力p1高于在培养室的区C3控制的压力p3，已知在区C2控制的压力p2是在p1与p3之间。
46.根据权利要求45所述的生物反应器，其特征在于一旦在膨胀瓶R1中的体积达到低水平，就按照特别顺序程序化的调节-指令模块使液流循环方向反转，同时停止泵P1和使泵P3运行。
47.根据权利要求45所述的生物反应器，其特征在于关闭阀V3。
48.根据权利要求46-47中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于无生长因子的基本营养介质F3有可能使培养室反馈，这时在所述室的区C3中的压力p3高于在区C1控制的压力p1，已知在区C2控制的压力p2是在p1至p3之间。
49.根据权利要求31-48中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于根据提供给它的功能，在封闭或开放回路中设定第二种动态液体介质F2的循环进口和出口布局时，泵P1和P3处于停止状态。
50.根据权利要求49所述的生物反应器，其特征在于动态液体介质F2用于往培养室中加入待培养的细胞，并用于回收培养后的细胞。
51.根据权利要求49所述的生物反应器，其特征在于动态液体介质F2用于往装有培养细胞的培养室中加入基因转移媒介物，并用于回收基因修饰的培养细胞。
52.根据权利要求49所述的生物反应器，其特征在于动态液体介质F2用于在培养物中加入细胞发育的抑制分子漂洗液，还用于除去所述分子。
53.根据权利要求50所述的生物反应器，其特征在于使用注射器，通过生物相容的隔膜，在培养室的区C2中接种所述介质F2，其电磁阀V2E1是开启的，电磁阀V2E2、V2E3、V2S1、V2S2和V2S3是关闭的。
54.根据权利要求50所述的生物反应器，其特征在于在该培养室中培养后回收细胞，电磁阀V2S1是开启的，电磁阀V2E2、V2E3、V2S2和V2S3是关闭的，泵P2运转以纯化在细胞收集袋中的区C2的内容物。
55.根据权利要求52所述的生物反应器，其特征在于当第二种介质F2含有漂洗细胞限制空间所必需的元素时为了除去抑制分子，加入所述介质时，电磁阀V2E3是开启的，电磁阀V2E1、V2E2是关闭的。
56.根据权利要求52所述的生物反应器，其特征在于漂洗的第二种介质F2在开放回路中连续循环，其特征还在于加入和回收所述漂洗介质时，电磁阀V2E1、V2E2、V2S1和V2S2是关闭的，电磁阀V2E3、V2S3是开启的。
57.根据权利要求51所述的生物反应器，其特征在于在细胞培养室的区C2中，为了接种在封闭回路循环的所述介质F2中含有的基因转移媒介物，电磁阀V2E2是开启的，而电磁阀V2E1、V2E3、V2S1和V2S3是关闭的。
58.根据权利要求31-57中至少一个权利要求所述的生物反应器，其特征在于调节-指令模块通过控制和调节装置来接受与动态液体介质F1、F2、F3相关的全部信息，与各种容器/罐、泵、阀和在培养室的区C1、C2、C3中控制压力相关的信息，处理所述信息并发出必需运行的命令。
全文摘要
本发明涉及抑制具有至少两个有不同断裂阈值的平面过滤膜的细胞培养室，该室用具有对称轴的外壳限定，该外壳由一个外侧壁，两个端壁和动态液体进口和出口构成，还涉及一种用于动物细胞体外培养的有所述培养室的生物反应器。
文档编号C12M3/00GK1460122SQ0181590
公开日2003年12月3日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月19日
发明者J·维特拉尔, F·赫罗丁, R·卡特里尼 申请人:格米赛尔有限公司