耐热性核糖核酸酶h的制作方法

专利名称：耐热性核糖核酸酶h的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽，具体地说涉及对于基因工程非常有价值的具有核糖核酸酶H活性的多肽。本发明也涉及可用于通过基因工程生产所述多肽的基因。本发明还涉及通过基因工程生产所述多肽的方法。
核糖核酸酶H(在下文也称为RNA酶H)首先由W.H.Stein和P.Hausen在1969年从牛胸腺中分离出来。RNA酶H目前被分类为细胞RNA酶H和病毒RNA酶H。细胞RNA酶H广泛存在于真核细胞例如各种动物细胞和酵母以及原核细胞例如大肠杆菌中，而病毒RNA酶H存在于RNA肿瘤病毒中。在细胞中存在几种类型的RNA酶H活性。它们需要二价金属离子，例如M2+和Mn2+。
得自大肠杆菌的一种RNA酶H是一种水解酶，由155个氨基酸组成，分子量约为17kDa，具有以内切型方式仅特异性地切割DNA-RNA杂合体中的RNA链的底物专一性。所得寡聚体在5’端具有一个磷酸基团，在3’端具有一个羟基。
RNA酶HI和RNA酶HII已经鉴定为来自大肠杆菌的RNA酶H。已经表明，RNA酶HI在Col E1质粒复制中具有以下生理功能1)它降解与非正常复制起点的部分结合的RNA，以确保正常的复制起点；和2)它合成对正常复制起点特异性的RNA引物。RNA酶HII的功能仍不清楚。
人们认为，随着基因工程的发展，RNA酶H变得越来越重要。然而，这种酶在大肠杆菌中的表达水平相当低。于是，人们一直尝试使用重组DNA技术生产这种酶。使用重组DNA技术生产的RNA酶H现在由BRL、Amersham Pharmacia Biotech、Takara Shuzo等供应。
这些市售的重组RNA酶H使用大肠杆菌作为宿主来生产(Kanaya等，The Journal of Biological Chemistry，26411546-11549(1989))。已经报道了使用大肠杆菌生产一种来自嗜热菌的、比来自大肠杆菌的RNA酶H稳定地高得多的RNA酶H的方法(Kanaya等，Dai 2 Kai NipponTanpakikougakukai Nenkai Program/Abstract(1990)第69页；日本专利第2533671号)。然而，用大肠杆菌生产的来自嗜热菌的RNA酶H的酶活性比来自大肠杆菌的RNA酶H的酶活性低。
RNA酶H基于底物专一性具有以下例举的用途，并且注意到RNA酶H是非常有价值的酶1)在cDNA克隆时除去模板mRNA；2)除去mRNA中的poly(A)区；和3)RNA片段化。
然而，如上所述，仅可得到生产率和酶活性低于来自大肠杆菌的RNA酶H的热稳定RNA酶H。因此，一直需要生产率和酶活性与来自大肠杆菌的RNA酶H相当或高于来自大肠杆菌的RNA酶H的热稳定RNA酶H的开发，以扩展RNA酶H的应用。
发明目的本发明的主要目的是提供一种对于基因工程非常有价值的具有RNA酶H活性的多肽、编码所述多肽的基因以及通过基因工程生产所述多肽的方法。发明概述鉴于上述情况，本发明人进行了深入的研究并进行了筛选，以便获得热稳定RNA酶H。结果，本发明人发现了具有高RNA酶H活性的热稳定RNA酶H多肽。本发明人进而发现了如此获得的热稳定RNA酶H在用基因工程技术生产时的生产率高。因此，完成了本发明。
本发明概述如下。本发明的第一个方面涉及热稳定核糖核酸酶H多肽，即具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽，所述多肽选自(a)具有以下氨基酸序列或其部分的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59；(b)具有在以下氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59；和(c)具有与以下氨基酸序列享有至少71％同源性的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59。
本发明的第二个方面涉及编码热稳定核糖核酸酶H的核酸，即编码具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽、选自以下的核酸(a)一种核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列或其部分的的多肽；(b)一种核酸，所述核酸编码具有在SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列的多肽；(c)一种核酸，所述核酸具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列；(d)一种核酸，所述核酸在SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列中有至少一个核苷酸缺失、添加、插入或取代，使得所述核苷酸的缺失、添加、插入或取代导致翻译为一种氨基酸序列；(e)一种核酸，所述核酸在严格性条件下可与(a)-(d)的核酸中任一种或其互补链杂交；和(f)一种核酸，所述核酸的核苷酸序列与SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列享有至少69％的同源性。
本发明的第三个方面涉及包含第二方面的核酸的重组DNA。
本发明的第四个方面涉及用第三方面的重组DNA转化的转化体。
本发明的第五个方面涉及一种生产具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽的方法，所述方法包括培养第四方面的转化体；和从培养物中收集具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽。
本发明的第六个方面涉及具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽，所述多肽可通过培养其中转移有以下任一种质粒的转化体而获得pRHB11、pBCA3Nd2、pPFU220、pTM-RNH、pPHO238、pAFU204、pTLI204和pTCE207。带有这些质粒的大肠杆菌菌株按照布达佩斯条约保藏于国际专利生物材料保藏单位-独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，保藏号分别为FERM BP-7655、FERM BP-7653、FERM BP-7654、FERMBP-7652、FERM BP-7692、FERM BP-7691、FERM BP-7693和FERMBP-7694。发明详述在下文，将详细描述本发明。
当用于本文时，RNA酶H是指具有以内切型方式仅特异性地切割DNA-RNA杂合体中的RNA链的底物专一性的水解酶，其中所得的寡聚体在5’端具有一个磷酸基团，而在3’端具有一个羟基。
虽然不打算限制本发明，但本文所用的涉及多肽的具有热稳定RNA酶H活性是指所述多肽在于60℃或高于60℃的温度下保温15分钟后具有RNA酶H活性。
例如，热稳定RNA酶H可以如下测定。
将1mg poly(rA)或poly(dT)(都得自Amersham Pharmacia Biotech)溶于含有1mM EDTA的1ml 40mM tris-HCl(pH7.7)中，制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后加入poly(rA)溶液(至终浓度为20μg/ml)和poly(dT)溶液(至终浓度为30μg/ml)至含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。让混合物于37℃反应10分钟，然后冷却至4℃，制备poly(rA)-poly(dT)溶液。
加入1μl酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。让混合物于40℃反应10分钟。向其中加入10μl 0.5M EDTA，以终止反应。然后测量260nm的吸光度。作为对照，加入10μl 0.5M EDTA至反应混合物中，让所得混合物于40℃反应10分钟，然后测量吸光度。通过从无EDTA时反应物的吸光度中减去对照的吸光度，获得一个数值(吸光度之差)。因此，基于所述吸光度之差，测量由于所述酶促反应从poly(rA)-poly(dT)杂合体中释放的核苷酸的浓度。因而，可以测定按照本发明的热稳定RNA酶H的活性。
另一方面，可以如下测定按照本发明的热稳定RNA酶H的活性。将100μl反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH8.5)、0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1％二甲基亚砜、4mM乙酸钾、20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml poly(rA)(Amersham PharmaciaBiotech)]于40℃温育，然后将其加入至1μl待测活性的酶溶液中。让混合物于40℃反应10分钟。然后加入10μl 0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。然后测量260nm的吸光度。
一个单位的RNA酶H定义为按照以下公式计算、增加相当于在10分钟内释放1nmol核糖核苷酸的A260的酶量单位＝[吸光度之差×反应体积(ml)]/0.0152本发明的多肽包括具有在下述氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59，只要它表现出热稳定RNA酶H活性。
在天然存在的多肽中可以产生突变，例如氨基酸序列中一个氨基酸缺失、插入、添加或取代。这种突变可能由于多态性或编码所述多肽的DNA突变而产生，或者由于所述多肽在体内或者在合成后纯化期间被修饰而产生。然而，已知如果这样一种突变存在于对于保留所述多肽的所述活性或结构而言不重要的部分中，则这样一种突变多肽可以表现出与无突变的多肽基本上等同的生理活性或生物活性。
这适用于在多肽的氨基酸序列中人工导入了这样一种突变的多肽。在这种情况下，有可能产生更多的各种突变。例如，已知其中在人白介素-2(IL-2)的氨基酸序列中半胱氨酸残基被丝氨酸取代的多肽保留了白介素-2的活性(Science，2441431(1984))。
此外，已知某些多肽具有对于其活性不是必需的肽区。这样的肽区的例子为在分泌到胞外的多肽中的信号肽、或者在蛋白酶前体中发现的原序列或前原序列。这类区中的大多数在翻译后或在转化为活性多肽后被除去。这样的多肽具有与无待除去区的多肽的一级结构不同的一级结构，但最终表现出等同的功能。
按照本发明分离出的具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列的基因，分别编码具有SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列的多肽。这些多肽具有热稳定RNA酶H活性。本发明的多肽包括缺失了对于其活性不必需的肽区的多肽。
当通过基因工程生产多肽时，可以在目的多肽的氨基末端或羧基末端添加与所述多肽的活性无关的肽链。例如，可以制备在目的多肽的氨基末端添加了在待用宿主中以高水平表达的多肽的氨基末端区部分的融合多肽，以便提高所述目的多肽的表达水平。在其它情况下，可以在目的多肽的氨基末端或羧基末端添加对特定物质具有亲和性的肽，以便于纯化所表达的多肽。所加入的肽如果对目的多肽的活性没有有害影响，则可以保持所加入的肽。必要时，可以对其工程改造，使得可以通过适当的处理，例如通过用蛋白酶有限消化，将其从目的多肽中去除。
因此，本发明包括具有在本文公开的下述氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、插入、添加或取代的氨基酸序列的多肽SEQ IDNO9、17、23、32、37、47、57或59，只要它具有热稳定RNA酶H活性。
此外，本发明包括其氨基酸序列与在本文公开的下述氨基酸序列中享有至少71％、优选80％、更优选90％同源性的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59，只要它具有热稳定RNA酶H活性。
可以用例如计算机程序DNASIS-Mac(Takara Shuzo)、计算机算法FASTA(version 3.0；Pearson，W.R.等，Pro.Naal.Acad.Sci.，852444-2448，1998)或计算机算法BLAST(version 2.0，Altschul等，NucleicAcids Res.253389-3402，1997)，测定同源性。
例如，本发明包括与来自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的核糖核酸酶HII的氨基酸序列(SEQ ID NO9)享有至少44％同源性的多肽、与来自热坚芽孢杆菌的核糖核酸酶HIII的氨基酸序列(SEQ IDNO17)享有至少47％同源性的多肽、与来自激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO23)享有至少69％同源性的多肽、与来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO59)享有至少53％同源性的多肽、与来自闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO37)享有至少51％同源性的多肽、与来自Thermococcuslitoralis的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO47)享有至少65％同源性的多肽、与来自速生热球菌(Thermococcus celer)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO57)享有至少71％同源性的多肽或与来自Pyrococcus horikoshii的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ ID NO32)享有至少71％同源性的多肽，只要它具有热稳定RNA酶H活性。
本发明的多肽可以例如通过以下方法生产(1)从产生本发明多肽的微生物的培养物中纯化，或者(2)从含有编码本发明多肽的核酸的转化体的培养物中纯化。
(1)从产生本发明多肽的微生物的培养物中纯化产生本发明多肽的微生物的例子为可以从德意志微生物和细胞保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)购买的热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)(DSM406)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(DSM3638)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(DSM3109)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(DSM4139)、Thermococcus litoralis(DSM5473)或速生热球菌(Thermococcus celer)(DSM2476)、或者可以从the Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)购买的Pyrococcus horikoshii(JCM9974)。所述微生物在适合于所述微生物生长的条件下培养。优选使用提高目的多肽表达水平的培养条件。在细胞或培养基中生产的目的多肽可以按照常规用于纯化蛋白质的方法来纯化。
常规用于培养热稳定细菌的方法可以用来培养上述菌株。在培养基中添加可以被所述菌株利用的营养物。例如，淀粉可以用作碳源，胰蛋白胨、蛋白胨和酵母膏可以用作氮源。金属盐例如镁盐、钠盐或铁盐可以作为微量元素加入至培养基中。另外，例如在热稳定海洋细菌的情况下，可能最好使用人工海水制备培养基。
所述培养可以是静置培养(standing culture)，或者是旋动培养。例如，可以使用Applied and Environmental Microbiology，552086-2088(1992)中描述的透析培养法。最好根据待使用的菌株或培养基的组成来确定培养条件和培养时间，使得所述多肽的生产率最大。
首先制备无细胞提取物，以便获得多肽。可以例如通过离心从培养物中收集细胞、过滤等、然后破碎细胞，制备无细胞提取物。对于提取目的酶非常有效的细胞破碎法可以选自超声处理、用微珠破碎、用裂解酶处理等。如果所述多肽被分泌到培养上清液中，则通过硫酸铵沉淀、超滤等浓缩培养上清液中的所述多肽。经浓缩的多肽用作无细胞提取物。常规用于纯化蛋白质的方法可以用来从如此获得的无细胞提取物中分离所述多肽。例如，可以联合使用硫酸铵沉淀、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱等。
(2)从用含有编码本发明多肽的核酸的重组DNA转化的转化体培养物中纯化本发明的多肽可以从用重组DNA转化的转化体获得，所述重组DNA含有编码本发明多肽的核酸，例如具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列的核酸。用具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO16的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO17的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO22的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO23的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO31的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO32的氨基酸序列的多肽。用具有SEQID NO36的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO37的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO46的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ IDNO47的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO56的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO57的氨基酸序列的多肽。用具有SEQ ID NO58的核苷酸序列的核酸产生具有SEQ ID NO59的氨基酸序列的多肽。
本发明的多肽可以从通过培养转移有下述任一种本发明质粒的转化体获得的培养物中纯化pRHN11、pBCA3Nd2、pPFU220、pTM-RNH、pPHO238、pAFU204、pTLI204和pTCE207。
待转化的宿主不限于具体的宿主，例子为在重组DNA领域中常规使用的那些宿主，包括大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酵母、丝状真菌、植物、动物、培养的植物细胞和培养的动物细胞。
例如，可以如下获得本发明的多肽用带有一种其中本发明的核酸连接在lac启动子或T7噬菌体启动子下游的质粒的大肠杆菌，在常规培养条件下，例如在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白酶、5g/l酵母膏、5g/l NaCl，pH7.2)中于37℃直至对数生长期，以1mM的终浓度加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，再于37℃培养，以在培养细胞中表达所述多肽。
在培养后通过离心收集细胞，通过超声处理破碎细胞，并将通过离心收集的上清液用作无细胞提取物。这种无细胞提取物表现出热稳定RNA酶H活性。本发明的多肽可以从所述无细胞提取物中采用已知方法纯化，所述方法例如离子交换色谱、凝胶过滤、疏水色谱和硫酸铵沉淀。自然，在如上所述的纯化过程中获得的部分纯化的产物也表现出RNA酶H活性。由于在带有与本发明核酸连接的质粒的大肠杆菌中表达的本发明多肽是热稳定的，因此，所述培养细胞和/或无细胞提取物可以例如于40℃或高于40℃的温度下加热约10分钟，以除去来源于宿主的热变性不溶性蛋白质，以便纯化所述多肽。可以适当地选择用于所述热处理的最适温度或时间。
如上所述，当本发明多肽用带有编码所述多肽的核酸的转化体在正常温度(例如37℃)下表达时，所产生的表达产物保留所述活性、热稳定性等。也就是说，本发明的多肽即使在与原始生产细胞的生长温度相当不同的温度下表达时，也可以采取其固有的高级结构。
本发明的核酸是编码本发明多肽的核酸。具体地说，它是(1)编码具有SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列、或者具有在所述序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列并且具有热稳定RNA酶H活性的多肽的核酸；(2)具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列的核酸；(3)具有在严格性条件下可与以上(1)或(2)的核苷酸序列杂交或者与以上(1)或(2)的核苷酸序列享有至少69％同源性、优选80％同源性、更优选90％同源性、并且编码具有热稳定RNA酶H活性的多肽的核苷酸序列的核酸等。
核苷酸序列的同源性可以用计算机程序DNASIS-Mac或计算机算法FASTA(version 3.0)或BLAST(version 2.0)来测定。
当用于本文时，核酸是指单链或双链DNA或RNA。如果上述(2)的核酸是一种RNA，则它用例如在SEQ ID NO8的核苷酸序列中T被U取代的核苷酸序列来表示。
例如，本发明的核酸可以如下获得。
可以如下分离具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列的上述(2)的核酸。按照常规方法，从如上所述培养用于本发明多肽的热坚芽孢杆菌(DSM406)、激烈热球菌(DSM3638)、海栖热袍菌(DSM3109)、闪烁古生球菌(DSM4139)、Thermococcus litoralis(DSM5473)、速生热球菌(DSM2476)或Pyrococcus horikoshii(JCM9974)中，制备基因组DNA。用所述基因组DNA构建DNA文库。可以从DNA文库中分离所述核酸。此外，通过用基因组DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列的核酸，可以获得所述核酸。
此外，根据本发明提供的编码本发明多肽的核酸的核苷酸序列，可以获得编码其热稳定RNA酶H活性与本发明多肽的所述活性类似的多肽的核酸(例如SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列)。具体地说，用编码本发明多肽的核酸或所述核苷酸序列的部分作为探针，与用从细胞提取的DNA或者用所述DNA作为模板获得的PCR产物杂交，可以筛选编码具有热稳定RNA酶H活性的多肽的DNA。或者，用基于上述核苷酸序列设计的引物，用基因扩增法，例如PCR，可以扩增编码具有热稳定RNA酶H活性的多肽的DNA。另外，可以化学合成编码具有热稳定RNA酶H活性的多肽的DNA。可以按照这样一种方法，获得以上(1)或(3)的核酸。
可以按照上述方法，获得仅含有目的核酸的一部分的核酸片段。在这种情况下，完整的目的核酸可以如下获得。测定所获得的核酸片段的核苷酸序列，以证实所述片段是所述目的核酸的一部分。用所述核酸片段或其一部分作为探针，进行杂交。或者，用基于所述核酸片段的核苷酸序列合成的引物，进行PCR。
“在严格性条件下杂交”是指能够在如T.Maniatis等(编著)，Molecular CloningA Laboratory Manual第2版，Cold Spring HarborLaboratory(1989)中所述的条件下，例如在以下条件下杂交。将固定有核酸的膜与探针在含有0.5％SDS、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400和0.01％变性鲑精核酸的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中于50℃保温12-20小时。在保温后，膜用含有0.5％SDS的2×SSC于37℃洗涤，同时将SSD浓度降至0.1×，并且将温度升至50℃，直至来自固定化核酸的信号可以与背景区别，然后检测所述探针。如上所述测定由如此获得的新核酸编码的蛋白质的活性，从而证实所述核酸是否是目的核酸。
如果使用寡核苷酸探针，“严格性条件”是指例如在含有6×SSC、0.5％SDS、5×Denhart’s和0.01％变性鲑精核酸的溶液中，于[Tm-25℃]的温度下保温过夜，虽然这并不是打算限制本发明。
寡核苷酸探针或引物的Tm可以例如按照以下公式确定Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中N为所述寡核苷酸探针或引物的链长；％G+C是所述寡核苷酸探针或引物中鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量。
如果所述寡核苷酸探针或引物的链长短于18个碱基，则Tm可以估计例如为A+T(腺嘌呤和胸腺嘧啶)残基数乘以2之积(℃)与G+C残基数乘以4之积(℃)的和[(A+T)×2+(G+C)×4]。
如上所述，按照本发明，本发明包括在严格性条件下能够与编码本发明多肽的核酸杂交的核酸，只要它编码具有热稳定RNA酶H活性的多肽，即使其核苷酸序列与本文所公开的核苷酸序列不同。
已知对于每个氨基酸，确定了在基因中限定一个氨基酸的1-6个密码子(三个碱基的组合)。因此，许多核酸可以编码一种特定的氨基酸序列，虽然这要视所述氨基酸序列而定。在自然界中，核酸不一定是稳定的。核苷酸序列发生突变并不罕见。在核酸中产生的突变可能不改变所编码的氨基酸序列(称为沉默突变)。在这种情况下，可以说产生了编码同一种氨基酸序列的不同的核酸。因此，不能否认在含编码一种特定氨基酸序列的核酸的生物体的传代过程中可能产生编码同一种氨基酸序列的各种各样的核酸。此外，如果人们使用各种基因工程技术，则不难人工产生编码同一种氨基酸序列的各种核酸。
例如，如果在编码目的蛋白质的原始核酸中使用的密码子是待用来通过基因工程生产所述蛋白的宿主中密码子使用频率低的密码子，则所述蛋白质的表达水平可能也低。在这种情况下，将所述密码子人工转变为在所述宿主中常用的密码子，而不改变所编码的氨基酸序列，目的是提高所述目的蛋白质的表达水平(例如JP-B 7-102146)。如上所述，自然可以人工制备编码一种特定氨基酸序列的各种核酸。它们也可能在自然界中产生。
可以将编码本发明多肽的核酸(例如具有SEQ ID NO7的核苷酸序列的核酸)与合适的载体连接，以构建重组DNA。待用来构建所述重组DNA的载体没有具体的限制。例如，可以使用质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。选择用于所述重组DNA的合适载体。
此外，通过将所述重组DNA导入合适的宿主中，可以产生转化体。待用于生产转化体的宿主没有具体的限制。可以使用微生物例如细菌、酵母和丝状真菌以及来自动物、植物、昆虫等的培养细胞。通过培养所述转化体，在培养物中生产本发明的多肽，可以大量生产本发明的多肽。
实施例1从嗜热菌热坚芽孢杆菌中制各RNA酶H将热坚芽孢杆菌YT-G(从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen购买；DSM406)接种到含有0.2％胰蛋白胨(DifcoLaboratories)和1.5％酵母膏(Difco Laboratories)的100ml培养基(pH6.5)中，于60℃振荡培养140分钟，用作预培养物。将30ml预培养物接种到3L具有相同组成的培养基中，以2.5L/分钟通气并以250rpm搅拌下于60℃温度下培养5小时。
以5000×g将培养物离心15分钟，收集细胞。将402g(湿重)所述细胞悬浮于含有10mM巯基乙醇、0.5M NaCl、1mM EDTA和20μMPAPMSF的1000ml 50mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，用MINI-Lab(APV GAULIN/RANNIE)破碎。离心除去细胞碎片，以回收上清液。
加入聚乙烯亚胺溶液至所得的上清液中，终浓度为0.1％。搅拌后，让混合物静置1小时。然后离心回收上清液。加入硫酸铵至上清液中，至50％饱和度。将通过离心获得的沉淀溶于含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)中。将所述溶液在同一缓冲液中透析。将经透析的样品上样至用同一缓冲液平衡的280ml DE52柱(Whatman)上，收集非吸附流分。
柱子进一步用420ml平衡所用的缓冲液洗涤，收集洗涤液流分。将来自DE52柱色谱的非吸附流分和洗涤液流分混合在一起，上样至用含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的240ml P-11柱(Whatman)上。然后用含有0-0.5M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱。
将所得的活性流分置于透析管中。将管置于固态聚乙二醇20000上，于4℃脱水浓缩。然后将酶浓缩液上样至用含有5mM巯基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和10％甘油的25mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的300ml Superdex G-200柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。用平衡用缓冲液进行洗脱，获得活性流分。将所述活性流分上样至用含有10mM巯基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的15ml肝素-Sepharose柱(AmershamPharmacia Biotech)上。用含有0-0.5M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱。
将所得的活性流分上样至用含有10mM巯基乙醇、0.1mMEDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的5ml Hitrap-SP柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。用含有0-0.5MNaCl的平衡缓冲液进行洗脱。再次将所得的活性流分上样至用含有5mM巯基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和10％甘油的25mMtris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的300ml Superdex G-200柱(AmershamPharmacia Biotech)上。所得的活性流分用作RNA酶H制剂(酶溶液)。
如下测量热稳定RNA酶H活性。
将1mg poly(rA)或poly(dT)(都得自Amersham Pharmacia Biotech)溶于含有1mM EDTA的1ml 40mM tris-HCl(pH7.7)中，制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后加入poly(rA)溶液(至终浓度为20μg/ml)和poly(dT)溶液(至终浓度为30μg/ml)至含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。让混合物于37℃反应10分钟，然后冷却至4℃，制备poly(rA)-poly(dT)溶液。
加入1μl酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。让混合物于40℃反应10分钟。向其中加入10μl 0.5M EDTA，以终止反应。然后测量260nm的吸光度。作为对照，加入10μl 0.5M EDTA至反应混合物中，让所得混合物于40℃反应10分钟，然后测量吸光度。通过从无EDTA时反应物的吸光度中减去对照的吸光度，获得一个数值(吸光度之差)。因此，基于所述吸光度之差，测量由于所述酶促反应从poly(rA)-poly(dT)杂合体中释放的核苷酸的浓度。一个单位的RNA酶H定义为按照以下公式计算、增加相当于在10分钟内释放1nmol核糖核苷酸的A260的酶量。如果使用经稀释的酶溶液，则根据稀释率校正用以下公式获得的数值单位＝[吸光度之差×反应体积(ml)]/0.0152
实施例2热坚芽孢杆菌RNA HII基因的克隆(1)从热坚芽孢杆菌制备基因组DNA将热坚芽孢杆菌YT-G(DSM406)接种到60ml LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母膏和0.5％NaCl，pH7.2)中，于65℃培养20小时。培养后，将培养物离心，以收集细胞。将细胞悬浮于2ml 25％蔗糖和50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入0.2ml含10mg/ml氯化溶菌酶(lysozymechloride)(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mMtris-HCl(pH8.0)的12ml混合物、0.1ml 20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)和1ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃保温1小时。
然后，向混合物中加入2.1ml 5M NaCl和2ml CTAB-NaCl溶液[10％溴化鲸蜡基三甲基铵(Nacalai Tesque)和0.7M NaCl]，将所得的混合物充分混合，并于65℃保温10分钟。加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)混合物。将所得的混合物温和混合10分钟，然后以10,000×g离心10分钟。离心后，向所得的上清液中加入等体积的用100mMtris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/乙醇(25∶24∶1，v/v)混合物。将所得的混合物温和混合10分钟，然后以10,000×g离心10分钟。离心后，向所得的上清液中加入0.6体积的2-丙醇。用玻璃棒缠绕所得的纤维状沉淀，用70％乙醇水溶液洗涤，风干，然后溶于0.5ml TE缓冲液中，获得基因组DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因的中间部分的克隆根据得自各种生物体的RNA酶HII氨基酸序列中保守的部分-基序I和基序III(Biochemistry，38605-608(1999))，合成了由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2表示的寡核苷酸BsuII-3和BsuII-6。
用实施例2-(1)中制备的1μl热坚芽孢杆菌基因组DNA溶液作为模板，用BsuII-3和BsuII-6各100pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟，进行50个循环。反应后，反应混合物经过苯酚处理，然后进行乙醇沉淀，以纯化DNA。所得的DNA用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约0.4kb的扩增DNA片段。用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)，将所述约0.4kb DNA片段与用SmaI(Takara Shuzo)消化的pUC119(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，获得其中插入所述约0.4kb DNA片段的质粒21-12。
(3)RNA酶HII基因的上游部分的克隆测定在实施例2-(2)中获得的质粒21-12中的约0.4kb插入片段的核苷酸序列。根据所测定核苷酸序列，合成由SEQ ID NO3和SEQ IDNO4表示的寡核苷酸RNII-S1和RNII-S2。
用BamHI(Takara Shuzo)消化在实施例2-(1)中制备的热坚芽孢杆菌基因组DNA，用T4 DNA连接酶将其与Sau3AI盒(Takara Shuzo)连接。程序按照TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)所附的方案，用连接混合物作为模板，用RNII-S2作为第一轮PCR的引物，用RNII-S1作为第二轮PCR的引物进行。在第二轮PCR后，通过苯酚抽提，然后乙醇沉淀，从溶液中纯化DNA。所述DNA用T4 DNA聚合酶平端化，然后经过琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约1.5kb的扩增DNA片段。用T4 DNA连接酶，将所述约1.5kb DNA片段与用SmaI消化的pUC119连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，以获得其中插入所述约1.5kb DNA片段的质粒B25N16。
(4)完整的RNA酶HII基因的克隆根据在实施例2-(3)中测定的质粒21-12中约0.4kb插入片段的核苷酸序列，合成由SEQ ID NO5和SEQ ID NO6表示的寡核苷酸RNII-S5和SNII-6。
用实施例2-(2)中制备的质粒21-12作为模板，用RNII-S5和SNII-S6作为引物，进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。PCR如下进行94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒，进行25个循环。反应后，反应混合物经过琼脂糖凝胶电泳。从胶凝中回收约0.3kb的扩增DNA片段。用DIGHigh-prime(Roche Diagnostics)，用洋地黄毒苷标记所述约0.3kb DNA片段。
用洋地黄毒苷标记的DNA作为探针，对用HindIII(TakaraShuzo)、SacI(Takara Shuzo)或HindIII和SacI消化实施例2-(1)中制备的热坚芽孢杆菌基因组DNA的消化物进行DNA印迹杂交。
用DIG Luminescent Detection Kit(DIG发光检测试剂盒)(RocheDiagnostics)，按照所附的方案，进行杂交和检测。
结果，用所述探针，对于用HindIII、SacI以及HindIII和SacI消化的消化物，分别杂交了约4.5kb、约5.8kb和约1.3kb的DNA片段。
根据这些结果，用HindIII消化热坚芽孢杆菌基因组DNA，经过琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约4.5kb的DNA片段。所得的DNA片段用SacI消化，经过琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约1.3kb DNA片段。用T4 DNA连接酶，将所得的DNA片段与用HindIII和SacI消化的pUC119(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌HB101。
将所得的转化体影印铺板到Hybond-N(Amershan PharmaciaBiotech)上。然后用上述洋地黄毒苷标记的探针，按照常规方法进行菌落杂交。从如此获得的阳性克隆中制备质粒pRHB1。
然后测定插入到pRHN1中的所述DNA的核苷酸序列。将从所述核苷酸序列导出的氨基酸序列与得自枯草杆菌的RNA酶HII的氨基酸序列进行比较，提示在pRHB1中所述DNA中缺失距起始密码子约40bp的一个区。然后，如下构建全长RNA酶HII基因。
在实施例2-(3)中制备的B25N16用HindIII消化，经过琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约160bp的DNA片段。用T4 DNA连接酶，将所述约160bp的DNA片段与用HindIII消化的pRHB1连接。用连接混合物转化大肠杆菌HB101。从所得的转化体中制备质粒。
接着，根据起始密码子周围的推定的核苷酸序列，合成由SEQ IDNO7表示的寡核苷酸RNII-Nde。用从所述转化体制备的质粒作为模板，用RNII-Nde和RNII-S6作为引物，进行PCR。选择一个扩增出约0.7kb DNA片段的质粒，命名为pRHB11。
测定插入到如此获得的质粒pRHB11中的所述DNA片段的核苷酸序列。所述结果的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框(ORF)。该可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO8中。从所述核苷酸序列中导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO9中。
用质粒pRHB11转化的大肠杆菌HB101被命名和指定为大肠杆菌HB101/pRHB11，于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏号为FERM Bp-7655。
(5)热坚芽孢杆菌RNA酶HII基因的表达将用pRHB11或pRHB1转化的大肠杆菌HB101接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。培养后，将通过离心收集的细胞悬浮于0.5ml TE缓冲液中，进行超声处理。经离心获得的上清液用作粗制细胞提取物。
将10mM tris-HCl(pH8.0)、1mM DTT(Nacalai Tesque)、0.003％BSA(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml poly(dT)(AmershamPharmacia Biotech)和30μg/ml poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)混合在一起。让混合物于37℃保温10分钟，用作供测量RNA酶H活性用的底物溶液。
加入1μl 1M MnCl2至100μl底物溶液中。让混合物于40℃保温。加入10μl粗制细胞提取物的10倍稀释液至所述混合物中，以起始反应。于40℃反应30分钟后，加入10μl 0.5M EDTA以终止反应。然后测量260nm的吸光度。
结果，来自使用从带有pRHB11的大肠杆菌HB101制备的粗制细胞提取物的反应的260nm吸光度明显高于来自使用从带有pRHB1的大肠杆菌HB101制备的粗制细胞提取物的反应的吸光度。因此，表明pRHB11含有一个RNA酶HII基因，并且带有pRHB11的大肠杆菌表达RNA酶H活性。
(6)经纯化的RNA酶HII制剂的制备将用实施例2-(4)中获得的pRHB11转化的大肠杆菌HB101，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的1L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于52.3ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于60℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得50.0ml热处理上清液。
将所述溶液经过用缓冲液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油]平衡的RESOURSE Q柱(Amershanm PharmaciaBiotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
将51ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液C平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约240mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
将3.0ml所述RNA酶HII流分分2份经过用含50mM NaCl的缓冲液C平衡的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)。让7.0ml所得的流出液经过用含有50mM NaCl的缓冲液C平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，使用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约310mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Amicon)，通过超滤浓缩4.4ml所述RNA酶HII流分。将280μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(AmershamPharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于35千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。
将如此洗脱出的RNA酶HII用作Bca RNA酶HII制剂。
如下测定如此获得的Bca RNA酶HII制剂的酶活性。
将100μl反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.8)、0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1％二甲基亚砜、10mM氯化镁、20μg/mlpoly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)]于40℃温育，然后将其加入至1μl Bca RNA酶HII制剂中。让混合物于40℃反应10分钟。然后加入10μl 0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。然后测量260nm的吸光度。
结果，观察到Bca RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例3热坚芽孢杆菌RNA酶HIII基因的克隆(1)RNA酶HIII基因片段的克隆根据基于在得自枯草杆菌[Otani，N.等，Biochemistry，38605-608(1999)]和其它生物体的RNA酶HIII的氨基酸序列中的同源性测定的、在枯草杆菌和其它生物体中很好保守区的氨基酸序列，合成供筛选编码RNA酶HIII的基因用的、由SEQ ID NO10-13表示的引物BsuIII-1、BsuIII-3、BsuIII-6和BsuIII-8。
用实施例2-(1)中制备的200ng热坚芽孢杆菌基因组DNA作为模板，用BsuIII-1和BsuIII-8各100pmol作为引物，在50μl的体积中进行第一轮PCR。用1μl所述反应混合物作为模板，用BsuIII-3和BsuIII-6各100pmol作为引物，在100μl的体积中进行第二轮PCR。用TaKaRaTaq聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行所述两轮PCR。如下进行PCR94℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟，进行25个循环(第一轮PCR)或30个循环(第二轮PCR)。
约450bp的扩增DNA片段用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，然后经过琼脂糖凝胶电泳，以回收约450bp的所述扩增DNA片段。用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)，将所述约450bp DNA片段与用SmaI(Takara Shuzo)消化的pUC119(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，以获得其中插入了所述约450bp DNA片段的质粒pBCA3204。
(2)用DNA印迹杂交法克隆RNA酶HIII基因测定在实施例3-(1)中获得的pBCA3204中插入的所述DNA片段的核苷酸序列。根据所测定的核苷酸序列，合成由SEQ ID NO14和SEQ ID NO15表示的引物RNIII-S3和BcaRNIII-3。用RNIII-S3和BcaRNII-3作为引物，用pBCA3204作为模板，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR98℃0秒、55℃0秒和72℃20秒，进行30个循环。反应后，反应混合物经过苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀和琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约0.4kb DNA片段。用DIG DNALabeling kit(DIG DNA标记试剂盒)(Boehringer Mannheim)标记所述约0.4kb DNA片段，以制备探针。
20μg在实施例2-(1)中制备的热坚芽孢杆菌基因组DNA用BamHi、EcoRI、HindIII、PstI或XbaI(都得自Takara Shuzo)完全消化。然后一半的每种消化物经过琼脂糖凝胶电泳。用0.4N NaOH将DNA从琼脂糖凝胶转移至尼龙膜上，于120℃固定30分钟。将所述膜在含有30ml杂交缓冲液[43.4g/L氯化钠、17.6g/L柠檬酸钠、1％封闭剂(Boehringer Mannheim)、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％十二烷基硫酸钠(SDS)]的密封袋中于60℃预保温4小时，然后在含有5ml含所述探针的杂交缓冲液的密封袋中于60℃保温16小时。
所述膜在含有0.1％SDS的50ml 2×SSC(17.5g/L NaCl、7.7g/L柠檬酸钠)中于室温洗涤2次，在含有0.1％SDS的50ml 0.5×SSC(4.4g/L氯化钠、1.9g/L柠檬酸钠)中于45℃洗涤2次。然后用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)检测具有与所述探针互补的序列的约8kb的EcoRI片段、约4.5kb的PstI片段和约1kb的HindIII片段。
用PstI完全消化而剩下一半的热坚芽孢杆菌基因组DNA经过琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中回收约4.5kb PstI片段。然后将所述DNA片段与已经用PstI消化并且用碱性磷酸酶(Takara Shuzo)去磷酸化的质粒载体pTV119N连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
用RNIII-S3和BcRNIII-3作为引物，用其中一个菌落作为模板，在50μl体积中进行PCR，以选择推定带有RNA酶HIII基因的菌落。用TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR98℃0秒、55℃0秒和72℃20秒，进行30个循环。结果，发现目的基因包含在88号菌落中。
用从88号菌落制备的质粒作为模板，用引物对RN-N(TakaraShuzo)和BcaRNIII-3或者引物对M4(Takara Shuzo)和RNIII-S3进行PCR，以检查在该质粒中是否包含完整的RNA酶HIII基因。结果，根据扩增产物的长度，预期在该质粒中包含完整的RNA酶HIII基因，该质粒命名为pBCA3P88。
(3)含RNA酶HIII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例3-(2)中获得的插入到质粒pBCA3P88中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析揭示，存在一个编码包括RNA酶HIII的N末端氨基酸序列在内的氨基酸序列的可读框。所述可读框的核苷酸序列和从该核苷酸序列导出的RNA酶HIII的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO16和SEQ ID NO17中。
(4)用于表达RNA酶HIII的质粒的构建用实施例3-(2)中所述的质粒pBCA3P88作为模板，用参考上述RNA酶HIII可读框周围的序列设计的由SEQ ID NO18表示的BcaRNIIINde和M13引物M4(Takara Shuzo)，在100μl体积中进行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。PCR如下进行94℃30秒、55℃30秒和72℃3分钟，进行30个循环。约4kb的扩增DNA片段用NdeI(Takara Shuzo)消化，经过琼脂糖凝胶电泳，以从凝胶中回收约1.4kb NdeI片段。将所述约1.4kb DNA片段与用NdeI消化并且用碱性磷酸酶去磷酸化的pTV119Nd(一种在pTV119N中所述NcoI位点转变为NdeI位点的质粒)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
接着，用其中一个菌落作为模板，用RV-N(Takara Shuzo)和BcaRNIII-3(SEQ ID NO15)作为引物，在50μl体积中进行PCR，以便筛选其中所述NdeI片段中的RNA酶HIII基因连接在载体pTV119Nd中的lac启动子下游的质粒。然后选择推定带有所述RNA酶HIII基因的菌落。用TaKaRa-Z Taq(Takara shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。PCR如下进行98℃0秒、55℃0秒和72℃20秒，进行30个循环。结果，发现2号菌落含有其中所述NdeI片段中的RNA酶HIII基因连接在载体pTV119Nd中的lac启动子下游的质粒。该质粒命名为pBCA3Nd2。
通过双脱氧法测定插入到该质粒中的所述DNA片段的核苷酸序列表明，除起始密码子GTG变为ATG外，没有因PCR引起的突变。
用质粒pBCA3Nd2转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pBCA3Nd2，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7653。
(5)经纯化的RNA酶HIII制剂的制备将用实施例3-(4)中获得的pBCA3Nd2转化的大肠杆菌JM109，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于39.6ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于60℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得39.8ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HIII流过RESOURSE Q柱。
将45ml所述流通RNA酶HIII流分用2L缓冲液B[50mMtris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析2小时。在相同条件下再重复透析2次。将55.8ml透析过的酶溶液经过用缓冲液B平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约105mM NaCl洗脱出的含RNA酶HIII的流分。
将含1M NaCl的缓冲液B加入至7.0ml所述流分中，使NaCl浓度至150mM。将混合物经过用含150mM NaCl的缓冲液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)。结果，RNA酶HIII流过所述HiTrap-肝素柱。
用Centricon-10(Millipore)，通过超滤浓缩7.5ml所述流通RNA酶HIII流分。将190μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HIII在相当于33千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HIII的分子量。
将如此洗脱出的RNA酶HIII用作Bca RNA酶HIII制剂。
如下测定如此获得的Bca RNA酶HIII制剂的酶活性。
将100μl反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH 7.8)、0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1％二甲基亚砜、4mM乙酸镁、20μg/mlpoly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)]于40℃温育，然后将其加入至1μl Bca RNA酶HIII制剂中。让混合物于40℃反应10分钟。然后加入10μl 0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。然后测量260nm的吸光度。
结果，观察到Bca RNA酶HIII制剂的RNA酶H活性。
实施例4激烈热球菌RNA酶HII基因的克隆(1)从激烈热球菌制备基因组DNA将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种激烈热球菌(从德意志微生物保藏中心购买；DSM3638)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。
然后将所得细胞悬浮于4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mMNaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。
反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因组序列已经发表[Kawarabayashi，Y.等，DNA Research，555-76(1998)]。已知在基因组中存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO19，National Institute ofTechnology and Evaluationhttp//www.nite.gojp/的主页)。
搜索了PH1650基因(SEQ ID NO19)和激烈热球菌的部分发表的基因组序列(University of Utah，Utah Genome Centerhttp//www.genome.utah.edu/sequence.html的主页)之间的同源性。结果，发现一个高度同源的序列。
根据所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO20)和1650Bam(SEQ ID NO21)。
用实施例4-(1)中获得的200ng激烈热球菌DNA作为模板，用1650Nde和1650Bam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行30个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。将所得的DNA片段插入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，制备质粒pPFU220。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例4-(2)中获得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析表明，存在一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO22中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO23中。
用质粒pPFU220转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPFU220，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7654。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备用实施例4-(2)中获得的pPFU220转化大肠杆菌HMS174(DE3)。将所得的带有pPFU220的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于66.0ml超声处理缓冲液[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于80℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得61.5ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
将60.0ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约150mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Millipore)，通过超滤浓缩2.0ml所述RNA酶HII流分。将250μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mM EITA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(AmershamPharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于17千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。
将如此洗脱出的RNA酶HII用作Pfu RNA酶HII制剂。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定如此获得的Pfu RNA酶HIII制剂的酶活性。结果，观察到所述Pfu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例5海栖热袍菌RNA酶HII基因的克隆(1)从海栖热袍菌制备基因组DNA将含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母膏、1％可溶性淀粉、3.5％JamarineS Solid、0.5％Jamarine S Liquid、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2、0.1ppm H3BO3、0.1ppmNa2MoO4·2H2O和0.25ppm NiCl2·6H2O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种海栖热袍菌(从德意志微生物和细胞保藏中心购买；DSM3109)，于85℃不振荡培养16小时。
将通过离心从300ml培养物收集的细胞悬浮于3ml TE缓冲液[10mM tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA]中。加入150μl 10％十二烷基硫酸钠(Nacalai Tesque)的水溶液和15μl 20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)。将混合物于37℃温育1小时。
反应后，向混合物中加入0.5ml 5M NaCl。充分混合后，向混合物中加入0.4ml CTAB-NaCl溶液[10％溴化鲸蜡基四甲基铵(NacalaiTesque)、0.7M NaCl]。充分混合后，将混合物于65℃保温10分钟。加入1.5ml氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)的混合物。将混合物温和混合10分钟，以20,000×g离心5分钟。离心后，向所得的上清液中加入等体积的用100mM tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)的混合物。将混合物温和混合10分钟，然后以20,000×g离心5分钟。离心后，向上清液中加入0.6体积的2-丙醇。通过以10,000×g离心5分钟获得的沉淀，用70％乙醇水溶液洗涤、风干，然后溶于200μl TE中，获得基因组DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因的克隆根据在海栖热袍菌基因组DNA的核苷酸序列中已经被鉴定为RNA酶HII基因的部分的核苷酸序列(http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)，合成由SEQID NO24-27表示的寡核苷酸915-F1、915-F2、915-R1和915-R2，以便通过用海栖热袍菌基因组DNA作为模板进行PCR，获得含有RNA酶HII基因的扩增的DNA片段。
用实施例5-(1)中制备的海栖热袍菌基因组DNA作为模板，用915-F1和915-R1、915-F2和915-R2、915-F2和915-R1或者915-F2和915-R2作为引物对，进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR95℃0.5分钟、55℃0.5分钟和72℃1.5分钟，进行25个循环。在反应后，相应的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，以提取和纯化约0.7kb的扩增DNA片段。
用引物对915-F1和915-R1或者915-F1和915-R2扩增的DNA用HindIII和XbaI(都得自Takara Shuzo)消化，用T4 DNA连接酶(TakaraShuzo)将其与用HindIII和XbaI消化的pUC19(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，以制备其中插入了所述约0.7kb DNA片段的质粒DNA。结果，获得具有用915-F1和915-R1扩增的DNA片段的1号和2号质粒以及具有用915-F1和915-R2扩增的DNA的3号和4号质粒。
另外，用引物对915-F2和915-R1或者915-F2和915-R2扩增的DNA用NcoI(Takara Shuzo)和XbaI双重消化，用T4 DNA连接酶将其与用NcoI和XbaI双重消化的pTV119N(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，以制备其中插入了所述约0.7kb DNA片段的质粒DNA。结果，获得具有用915-F2和915-R1扩增的DNA片段的5号和6号质粒以及具有用915-F2和915-R2扩增的DNA的7号质粒。
用7号质粒转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pTM-RNH，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERMBP-7652。
(3)海栖热袍菌RNA酶HII基因的表达将用1-7号质粒之一或pUC19转化的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母膏、5g/L NaCl，pH7.2)中，于37℃振荡培养。当660nm的吸光度达到0.5时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，至终浓度为1mM，将细胞培养过夜。培养后，将通过离心收集的细胞悬浮于1ml TE缓冲液中，进行超声处理。将经超声处理的悬浮液于80℃加热10分钟。经离心获得的上清液用作粗制细胞提取物。
按照实施例2-(5)中所述的方法，用粗制细胞提取物测量吸光度。
结果，当在MnCl2存在下进行反应时，来自使用从带有3、5、6或7号质粒的大肠杆菌JM109制备的粗制细胞提取物的各个反应的260nm吸光度明显高于来自使用从带有pUC19的大肠杆菌JM109制备的粗制提取物的反应的吸光度。因此，表明3、5、6和7号质粒含有RNA酶HII基因，并且带有这些质粒之一的大肠杆菌表达RNA酶H活性。
测定已经证明在大肠杆菌中表达RNA酶H活性的质粒中所插入的所述DNA片段的核苷酸序列。所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQID NO58中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO59中。然后，发现在7号质粒中所插入的DNA片段的核苷酸序列中观察到一个推定在PCR时产生的碱基取代，导致所编码的氨基酸残基改变。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备将用实施例5-(2)中获得的7号质粒(pTM-RNH)转化大肠杆菌JM109。将所得的带有pTM-RNH的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的1L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于31.0ml超声处理缓冲液[50mMtris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得32.0ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巯基乙醇、10％甘油]平衡的RESOURSE Q柱(AmershamPharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
将32.5ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液C平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约240mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
将2.0ml所述RNA酶HII流分经过用含50mM NaCl的缓冲液C平衡的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)。让3.5ml所得的流出液经过用含有50mM NaCl的缓冲液C平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，使用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约295mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
将如此洗脱出的RNA酶HII用作Tma RNA酶HII制剂。
按照实施例2-(6)中所述方法，测定如此获得的Tma RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到Tma RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例6得自Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII基因的克隆(1)从Pyrococcus horikoshii制备基因组DNA将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种Pyrococcus horikoshiiOT3(从the Institute of Physical and Chemical Research(RIKEN)购买；JCM9974)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。
然后将所述细胞悬浮于4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mMNaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。
反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。
(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcus horikoshii的完整基因组序列已经发表[DNA Research，555-76(1998)]。已知存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO28，National Institute of Technology and Evaluationhttpwww.nite.go.jp/的主页)。
根据PH1650基因(SEQ ID NO28)的序列，合成引物PhoNde(SEQID NO29)和PhoBam(SEQ ID NO30)。
用实施例6-(1)中制备的100ng Pyrococcus horikoshii DNA作为模板，用PhoNde和PhoBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段加入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pPHO238。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例6-(2)中获得的插入到pPHO238中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO31中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO32中。
用质粒pPHO238转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPHO238，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7692。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备用实施例6-(2)中获得的pPHO238转化大肠杆菌HMS174(DE3)。将所得的带有pPHO238的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的1L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于34.3ml超声处理缓冲液[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于80℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得33.5ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pbarmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
将35.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L缓冲液B[50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析2小时。再重复透析2次。将34.5ml透析过的酶溶液经过用缓冲液B平衡的RES0URSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约155mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
加入缓冲液B至4.0ml所述流分中，使NaCl浓度至50mM。将混合物经过用含50mM NaCl的缓冲液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约160mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Millipore)，通过超滤浓缩6.9ml所述RNA酶HII流分。将从250μl所述浓缩液分离出的两个部分分别经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于24.5千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。
将如上所述洗脱出的RNA酶HII用作Pho RNA酶HII制剂。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定如此获得的Pho RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到所述Pho RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例7得自闪烁古生球菌的RNA酶HIT基因的克隆(1)从闪烁古生球菌制备基因组DNA将从8ml培养物收集的闪烁古生球菌(从德意志微生物和细胞保藏中心购买；DSM4139)细胞悬浮于100μl 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的800μl混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和50μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀并风干，然后溶于50μl TE中，获得基因组DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因的克隆闪烁古生球菌的完整基因组序列已经发表[Klenk，HP等，Nature，390364-370(1997)]。已知存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(AF0621)(SEQ ID NO33，http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
根据AF0621基因(SEQ ID NO33)的序列，合成引物AfuNde(SEQID NO34)和AfuBam(SEQ ID NO35)。
用实施例7-(1)中制备的30ng闪烁古生球菌基因组DNA作为模板，用AfuNde和AfuBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.6kb扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段加入到质粒载体pTV119Nd(一种其中pTV119N的NcoI位点被转变为NdeI位点的质粒)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pAFU204。
(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例7-(2)中获得的插入到pAFU204中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO36中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO37中。
用质粒pAFU204转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pAFU204，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7691。
(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备用实施例7-(2)中获得的pAFU204转化大肠杆菌JM109。将所得的带有pAFU204的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于37.1ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得40.3ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham PharmaciaBiotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过所述RESOURSE S柱。
将40.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L含有50mM NaCl的缓冲液B[50mM tris-HCl(pH7.0)、1mM EDTA]透析2小时。再重复透析2次。将40.2ml透析过的酶溶液经过用含有50mM NaCl的缓冲液B平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约240mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Millipore)，通过超滤浓缩7.8ml所述RNA酶HII流分。将从600μl所述浓缩液分离出的4个部分分别经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于30.0千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。
将如上所述洗脱出的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII制剂。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定如此获得的Afu RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到所述Afu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例8Thermococcus litoralis RNA酶HII基因的克隆(1)从Thermococcus litoralis制备基因组DNA从11ml培养物收集Thermococcus litoralis(从德意志微生物和细胞保藏中心购买；DSM5473)细胞。将所述细胞悬浮于500μl 25％蔗糖和50mM tris-HCl(pH8.0)中。加入100μl 0.5M EDTA和50μl 10mg/ml氯化溶菌酶(Nacalai Tesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的4ml混合物、50μl 20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)和250μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，风干，然后溶于100μl TE缓冲液中，获得基因组DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因中间部分的克隆基于各种热稳定RNA酶HII的氨基酸序列中保守的部分，合成由SEQ ID NO38和SEQ ID NO39表示的寡核苷酸RN-F1和RN-R0。
用实施例8-(1)中制备的5μl Thermococcus litoralis基因组DNA溶液作为模板，用RN-F1和RN-R0各100pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟，进行50个循环。反应后用Microcon-100(Takara Shuzo)从反应混合物中除去引物，并且浓缩反应混合物。
(3)RNA酶HII基因上游和下游部分的克隆测定在实施例8-(2)中获得的约0.5kb的所述插入片段TliF1R0的核苷酸序列。根据所测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸TliRN-1(SEQ ID NO40)和用于克隆下游部分的特异性寡核苷酸TliRN-2(SEQ ID NO41)。另外，合成了表1中所示的48种引物。表1中的标志序列示于SEQ ID NO60中。表15’-标志序列-NN-SSSSSSS-3’(NG、A、T和C的混合物；S代表以下核苷酸序列)No. 核苷酸序列 No. 核苷酸序列 No. 核苷酸序列1ggagcag19gtaacgg 37gcgcaag2ggcaaag20gtaagcg 38gcgcttg3ggcaacg21gtacacg 39gcggacg4ggcacag22gtagacg 40gcgtaag5ggcattg23gtagcgg 41gctacgg6ggccaag24gtcaacg 42gctcacg7ggccttg25gcaccag 43gctccag8ggctaag26gcagacg 44gcttgcg9ggctacg27gcagcag 45gcttggg10ggctcag28gcatggg 46ggacacg11ggctttg29gccaaag 47ggaccag12gggacag30gccacag 48ggagacg13gggcaag31gccattg14gggcttg32gcccaag15gggtacg33gcccttg16ggtaacg34gcctacg17ggtacgg35gcctcag18ggtagch36gcctttg在含有在实施例8-(1)中制备的作为模板的1μl Thermococcuslitoralis基因组DNA溶液、20pmol TliRN-1或者20pmol TliRN-2与20pmol表1中所列的48种引物之一的组合、20mM tris-乙酸盐(pH8.5)、50mM乙酸钾、3mM乙酸镁、0.01％BSA、dNTP各30μM和2.5单位TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的反应混合物中，进行PCR。如下进行PCR于94℃保温3分钟；然后98℃10秒、50℃10秒和72℃40秒，进行40个循环。用每种PCR产物各1份进行琼脂糖凝胶电泳。用Microcon-100(Takara Shuzo)从产生单个条带的反应混合物中除去引物，并且浓缩反应混合物。对浓缩物直接测序，以筛选含有所述RNA酶HII上游部分或下游部分的片段。结果，表明一个约450bp的PCR扩增片段TliN7含有RNA酶HII基因的上游部分，一个约600bp的PCR扩增片段TliC25和一个约400bp的PCR扩增片段TliC26含有RNA酶HII基因的下游部分。
(4)完整RNA酶HII基因的克隆含有Tli RNA酶HII的基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO42中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ IDNO43中。根据所述核苷酸序列，合成引物TliNde(SEQ ID NO44)和TliBam(SEQ ID NO45)。
用实施例8-(1)中制备的1μl Thermococcus litoralis基因组DNA溶液作为模板，用TliNde和TliBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段分别加入到质粒载体pTV119Nd(一种其中pTV119N的NcoI位点被转变为NdeI位点的质粒)或pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pTLI223Nd和pTLI204。
(5)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例8-(4)中获得的插入到pTLI223Nd和pTLI204中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析表明，存在分别推定编码RNA酶HII的可读框。pTLI204中所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO46中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ IDNO47中。在pTLI204中所述可读框的核苷酸序列中位置484的“T”在pTLI223Nd中所述可读框的核苷酸序列中被“C”所取代。在所述氨基酸序列中，位置162的苯丙氨酸被亮氨酸所取代。
用质粒pTLI204转化的大肠杆菌HMS174(DE3)被命名和指定为大肠杆菌HMS174(DE3)/pTLI204，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7693。
(6)Thermococcus litoralis RNA酶HII基因的表达将用pTLI223Nd转化的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的10ml LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于196μl缓冲液A中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热10分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液，作为热处理上清液。同样，将用pTLI204转化的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。培养后，按照上述方法加工经离心收集的细胞，获得热处理上清液。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定热处理上清液的酶活性。结果，观察到这两种转化体的RNA酶H活性。因此，证实了本发明所述多肽的所述活性，尽管在核苷酸序列或氨基酸序列中有取代。
(7)纯化RNA酶HII制剂的制备将用在实施例8-(4)中获得的pTLI223Nd转化的大肠杆菌JM109，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于38.7ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心20分钟，以收集上清液。从而获得37.2ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
所述样品经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)，采用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)，以0-500mM NaCl的线性梯度洗脱。获得用约220mM NaCl洗脱的含RNA酶HII的流分。
含有3ml所述RNA酶HII流分和加入的缓冲液A(使NaCl浓度至50mM)的混合物，经过用含有50mM NaCl的缓冲液A平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约320mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10(Millipore)，通过超滤浓缩6ml所述RNA酶HII流分。将约198μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于26.5千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。将如此洗脱出的RNA酶HII用作Tli RNA酶HII制剂。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定如此获得的Tli RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到所述Tli RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例9速生热球菌RNA酶HII基因的克隆(1)从速生热球菌制备基因组DNA从11ml培养物收集速生热球菌(从德意志微生物和细胞保藏中心购买；DSM2476)细胞。按照实施例8-(1)中所述的方法，获得基因组DNA溶液。
(2)RNA酶HII基因中间部分的克隆基于各种热稳定RNA酶HII的氨基酸序列中保守的部分，合成由SEQ ID NO48和SEQ ID NO49表示的寡核苷酸RN-F1和RN-R0。
用实施例9-(1)中制备的5μl速生热球菌基因组DNA溶液作为模板，用RN-F1和RN-R0各100pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟，进行50个循环。反应后，用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)将通过扩增获得的约500bp DNA片段平端化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，以回收约500bp的扩增DNA片段。用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)，将所述约500bp DNA片段与用SmaI(Takara Shuzo)消化的pUC119(Takara Shuzo)连接。用连接混合物转化大肠杆菌JM109。
培养所得的转化体，以获得其中插入有所述约500bp DNA片段的质粒pTceF1R0。
(3)RNA酶HII基因上游和下游部分的克隆测定在实施例9-(2)中获得的质粒pTceF1R0的核苷酸序列。根据所测定的核苷酸序列，合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸TceRN-1(SEQ ID NO50)和用于克隆下游部分的特异性寡核苷酸TceRN-2(SEQ ID NO51)。
在含有在实施例9-(1)中制备的作为模板的1μl速生热球菌基因组DNA溶液、20pmol TliRN-1或者20pmol TliRN-2与20pmol所述48种引物(在实施例8表1中所列的)之一的组合、20mM tris-乙酸盐(pH8.5)、50mM乙酸钾、3mM乙酸镁、0.01％BSA、dNTPs各30μM和2.5单位TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的反应混合物中，进行PCR。如下进行PCR于94℃保温3分钟；然后98℃10秒、50℃10秒和72℃40秒，进行40个循环。用Microcon-100(Takara Shuzo)从产生单个条带PCR产物的反应混合物中除去引物，并且浓缩反应混合物。对浓缩物直接测序，以筛选含有所述RNA酶HII上游部分或下游部分的片段。结果，表明一个约450bp的PCR扩增片段TceN24含有RNA酶HII基因的上游部分，一个约400bp的PCR扩增片段TceC29含有RNA酶HII基因的下游部分。
(4)完整RNA酶HII基因的克隆含有Tce RNA酶HII的基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO52中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ IDNO53中。根据所述核苷酸序列，合成引物TceNde(SEQ ID NO54)和TceBam(SEQ ID NO55)。
用实施例9-(1)中制备的1μl速生热球菌基因组DNA溶液作为模板，用TceNde和TceBam各20pmol作为引物，在100μl体积中进行PCR。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行40个循环。约0.7 kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。然后通过将所得的DNA片段分别加入到质粒载体pTV119Nd(一种其中pTV119N的NcoI位点被转变为NdeI位点的质粒)或pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，构建质粒pTCE265Nd和pTCE207。
(5)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定按照双脱氧法，测定在实施例9-(4)中获得的插入到pTCE265Nd和pTCE207中的所述DNA片段的核苷酸序列。
所测定的核苷酸序列的分析表明，存在分别推定编码RNA酶HII的可读框。pTCE207中所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO56中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ IDNO57中。在pTCE207中所述可读框的核苷酸序列中位置14的“A”在pTCE265Nd中所述可读框的核苷酸序列中被“G”所取代，并且位置693-696的核苷酸缺失。结果，位置5的谷氨酸被甘氨酸所取代，位置231的苯丙氨酸在氨基酸序列中缺失。
用质粒pTCE207转化的大肠杆菌HMS174(DE3)被命名和指定为大肠杆菌HMS174(DE3)/pTCE207，并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于国际专利生物材料保藏单位-National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7694。
(6)速生热球菌RNA酶HII基因的表达将用pTCE265Nd转化的大肠杆菌JM109接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的10ml LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于203μl缓冲液A中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热10分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液，作为热处理上清液。同样，将用pTCE207转化的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。培养后，按照上述方法加工经离心收集的细胞，获得热处理上清液。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定热处理上清液的酶活性。结果，观察到这两种转化体的RNA酶H活性。因此，证实了本发明所述多肽的所述活性，尽管在核苷酸序列或氨基酸序列中有取代和缺失。
(7)纯化RNA酶HII制剂的制备将用在实施例9-(4)中获得的pTCE265Nd转化的大肠杆菌JM109，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于39ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于70℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心20分钟，以收集上清液。从而获得37.5ml热处理上清液。
将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。
所述样品经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)，采用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)，以0-500mM NaCl的线性梯度洗脱。结果，获得用约220mM NaCl洗脱的含RNA酶HII的流分。
含有3ml所述RNA酶HII流分和加入的缓冲液A(使NaCl浓度至50mM)的混合物，经过用含有50mM NaCl的缓冲液A平衡的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以50-550mM NaCl线性梯度洗脱。结果，获得用约415mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。
用Centricon-10，通过超滤浓缩6ml所述RNA酶HII流分。将约178μl所述浓缩液经过用合有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mMtris-HCl(pH8.0)平衡的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham PharmaciaBiotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于29.5千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。将如此洗脱出的RNA酶HII用作Tce RNA酶HII制剂。
按照实施例3-(5)中所述的方法，测定如此获得的Tce RNA酶HII制剂的酶活性。结果，观察到所述Tce RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。
实施例10对在实施例2-9中获得的来自热坚芽孢杆菌(在下文称为BCA)、激烈热球菌(PFU)、海栖热袍菌(TMA)、闪烁古生球菌(AFU)、Thermococcus litoralis(TLI)、速生热球菌(TCE)和Pyrococcus horikoshii(PHO)的氨基酸序列和核苷酸序列进行同源性搜索。用DNASIS-Mac(Takara Shuzo)中的Maximum Matching或计算机算法FASTA(version3.0；Pearson，W.R.等，Pro.Natl.Acad.Sci.，852444-2448，1998)作为搜索程序进行计算。
用DNASIS测定的PFU氨基酸序列与PHO、AFU、TLI和TCE氨基酸序列的同源性分别为69％、45％、65％和58％。用DNASIS测定的PFU核苷酸序列与PHO、AFU、TLI和TCE核苷酸序列的同源性分别为68％、60％、65％和61％。
用计算机算法FASTA对PHO、AFU和TMA进行基因数据库搜索。对于PHO氨基酸序列，与推定为核糖核酸酶的氨基酸序列的最高同源性为70％，最低为20％。PHO与AFU的同源性为50％，而PHO与TMA的同源性为35％。对于AFU氨基酸序列，最高同源性为50％，而最低为25％。AFU与TMA的氨基酸序列同源性为32％。对于TMA氨基酸序列，最高同源性为52％，最低为22％。
用计算机算法BLAST对BCA、PFU、TCE和TLI进行基因数据库搜索。对于BCA核糖核酸酶HII、BCA核糖核酸酶HIII、PFU、TCE和TLI氨基酸序列，与推定为核糖核酸酶的氨基酸序列的最高同源性分别为43％、46％、68％、70％和64％。
另外，用DNASIS测定的PHO与AFU的氨基酸序列同源性也为50％。如上所述，用计算机算法FASTA测定的所述数值为50％。因此，表明在用DNASIS和计算机算法FASTA获得的同源性数值之间没有显著差异。
实施例11各种RNA酶H的作用方式和特性(1)Bca RNA酶HIII的作用方式如下所述制备底物，以便比较Bca RNA酶HIII和大肠杆菌RNA酶HI的切割方式。用大肠杆菌O157的热提取物作为模板，使用5’-FITC标记的嵌合引物VT2-R280N3-I7(SEQ ID NO61)(其中从3’端起的三个核苷酸为RNA)和DNA引物VT2-F110(SEQ ID NO62)进行PCR，以获得在两条链之一具有三个RNA的DNA片段。用Microcon-100(Millipore)从PCR产物中除去引物，获得可供用RNA酶H切割的底物。
制备含有0.3pmol所述底物的39.2μl反应缓冲液(20mM Hepes-KOH(pH7.8)、1％二甲基亚砜、0.01％牛血清白蛋白、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.002％propyrenediamine)。加入0.8μl大肠杆菌RNA酶HI30U/μl(Takara Shuzo)或者在实施例3-(5)中获得的纯化Bca RNA酶HIII制剂用缓冲液A稀释的10倍稀释液。让混合物于55℃反应5分钟或10分钟。反应后，将2μl每种反应混合物经过变性10％丙烯酰胺凝胶电泳，测定经切割的DNA片段的大小。
就大肠杆菌RNA酶HI而言，信号出现在18个碱基和19个碱基的位置上。所述19个碱基的位置上的信号随着时间的流逝而减少。由于未完全除去引物所引起的20个碱基位置上的背景信号也随着时间的流逝而减少。就Bca RNA酶HIII而言，信号出现在19个碱基的位置上。没有观察到引物背景的降低。
根据以上所述，大肠杆菌RNA酶HI在RNA之间的两个位点切割。另外，认为大肠杆菌RNA酶HI在3’RNA的5’一侧有切割活性，在与DNA不连接的3’RNA的5’一侧具有另外的切割活性。另一方面，认为Bca RNA酶HIII仅在3’RNA的5’一例切割，如果DNA没有连接在RNA的3’一侧，则不切割。因此，认为Bca RNA酶HIII的切割位点选择性高于大肠杆菌RNA酶HI的切割位点选择性。
(2)Pfu RNA酶HII、Pho RNA酶HII和Afu RNA酶HII的作用方式如下所述制备底物，以便分析Pfu(激烈热球菌)RNA酶HII、Pho(Pyrococcus horikoshii)RNA酶HII和Afu(闪烁古生球菌)RNA酶HII的切割方式。用大肠杆菌O157的热提取物作为模板，使用5’-FITC标记的嵌合引物VT2-IF20N3(SEQ ID NO63)(其中从3’端起的2个核苷酸为RNA)、5’-FITC标记的嵌合引物VT2-IF19N2(SEQ ID NO64)(其中从3’端起的2个核苷酸为RNA)或5’-FITC标记的嵌合引物VT2-IF18N1(SEQ ID NO65)(其中位于3’端的1个核苷酸为RNA)和DNA引物VT2IR20(SEQ ID NO66)进行PCR，获得在两条链之一分别具有3个、2个或1个RNA的DNA片段VFN3、VFN2和VFN1。用Microcon-100从PCR产物中除去引物，获得可供用RNA酶H切割的底物。
制备含有0.3pmol所述底物之一的39μl反应缓冲液(20mMHepes-KOH(pH7.8)、1％二甲基亚砜、0.01％牛血清白蛋白、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.002％propyrenediamine)。加入1μl浓度为37.2U/μl的相应的纯化RNA酶HII制剂之一。让混合物于55℃反应5分钟或10分钟。反应后，将2μl每种反应混合物经过变性10％丙烯酰胺凝胶电泳，测定经切割的DNA片段的大小。
对于Pfu RNA酶HII、Pho RNA酶HII和Afu RNA酶HII中的每种而言，用VFN3作为底物，在18个碱基的位置上观察到一个信号。对于Pfu RNA酶HII和Pho RNA酶HII中的每种而言，用VFN2作为底物，在19个碱基的位置上观察到一个信号。对于Pfu RNA酶HII、Pho RNA酶HII和Afu RNA酶HII中的每种而言，用VFN1作为底物，在17个碱基的位置上观察到一个信号。
根据以上所述，Pfu RNA酶HII、Pho RNA酶HII和Afu RNA酶HII在3’RNA的5’一侧切割。如果RNA的数目为1，则Pfu RNA酶HII和Pho RNA酶HII在RNA的5’一侧切割。关于即使RNA数目为1也切割的RNA酶H未曾有过报道。因为无论RNA的数目是多少，切割后的信号强度都是相似的，所以表明在随RNA数目而变的切割效率方面没有差异。另外，由于出现的信号随时间的流逝而减弱，或者没有观察到较短的信号出现，所以表明当DNA不连接在RNA的3’一侧时不发生切割。
(3)Bca RNA酶HII和Tma RNA酶HII的离子需求按照实施例1中所述的用于测定RNA酶H活性的方法，Bca RNA酶HII和Tma RNA酶HII需要Mn2+，在存在Mg2+时根本不表现出活性。用实施例11-(2)中所述的VFN3作为其底物，进行在存在Mg2+或Mn2+时切割的比较。
制备含有0.3pmol所述底物的39.2μl反应缓冲液(20mMHepes-KOH(pH7.8)、1％二甲基亚砜、0.01％牛血清白蛋白、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.002％propyrenediamine)和含有0.3pmol所述底物的39.2μl Mn2+反应缓冲液(20mM Hepes-KOH(pH7.8)、1％二甲基亚砜、0.01％牛血清白蛋白、100mM乙酸钾、10mM氯化锰、0.002％propyrenediamine)。加入0.8μl大肠杆菌RNA酶HI(30U/μl；TakaraShuzo)、纯化BcaRNA酶HIII制剂(在实施例2-(6)中获得的)用缓冲液A稀释的10倍稀释液或者Tma RNA酶HIII的粗制细胞提取物(在实施例5-(3)中获得的)用缓冲液A稀释的25倍稀释液。让混合物于55℃反应5分钟或10分钟。反应后，将2μl每种反应混合物经过变性10％丙烯酰胺凝胶电泳，测定经切割的DNA片段的大小。
当在存在Mg2+或Mn2+的情况下使用Bca RNA酶HII或Tma RNA酶HII时，在每种情况下信号都出现在19个碱基的位置上。信号的水平相互之间相同。
按照实施例1中所述的用于测量RNA酶H活性的方法，Bca RNA酶HII和Tma RNA酶HII在存在Mg2+的情况下根本不表现出活性。然而，它们在存在Mg2+的情况下表现出的切割活性与如上所述在Mn2+存在时观测到的活性相同。
根据以上所述，表明所述酶依赖于底物形式的切割可能不需要Mn2+，用Mg2+取代Mn2+是可能的，并且在供需要Mn2+或Mg2+的酶用的同样的反应混合物中反应是有可能的。
(4)RNA酶H热稳定性的检查使用用以下质粒转化的大肠杆菌来检查热稳定性在实施例2-(5)和3-(4)中获得的热坚芽孢杆菌RNA酶H的pRHB11和pBCA3Nd；在实施例4-(2)中获得的激烈热球菌RNA酶H的pPFU220；在实施例5-(2)中获得的海栖热袍菌RNA酶H的pTM-RNH；在实施例6-(2)中获得的Pyrococcus horikoshii RNA酶H的pPHO238；在实施例7-(2)中获得的闪烁古生球菌RNA酶H的的pAFU204；在实施例8-(4)中获得的Thermococcus litoralis RNA酶H的pTLI204和pTLI223Nd；在实施例9-(4)中获得的速生热球菌RNA酶H的pTCE207和pTCE265Nd。培养所述大肠杆菌菌株，将从培养物中制备的粗制酶提取物于60℃加热15分钟，按照实施例1中所述的方法测定RNA酶H活性。结果，观察到所有菌株RNA酶H的RNA酶H活性。
工业应用性本发明提供一种对于基因工程非常有价值的具有RNA酶H活性的多肽、编码所述多肽的基因和用于通过基因工程生产所述多肽的方法。由于本发明的RNA酶H是热稳定的，所出本发明提供了一种在工业上有优势的生产RNA酶H的方法。
现在有可能按照本发明将本发明的RNA酶H用于各种用途。
序列表的独立文本SEQ ID NO1PCR引物BsuII-3，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO2PCR引物BsuII-6，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO3PCR引物RNII-S1，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO4PCR引物RNII-S2，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO5PCR引物RNII-S5，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO6PCR引物RNII-S6，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO7PCR引物RNII-Nde，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO10PCR引物BsuIII-1，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO11PCR引物BsuIII-3，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO12PCR引物BsuIII-6，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO13PCR引物BsuIII-8，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO14PCR引物RNIII-S3，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO15PCR引物BcaRNIII-S3，用于从热坚芽孢杆菌克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO18PCR引物BcaRNIIINde，用于从热坚芽孢杆菌扩增编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO20PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO21PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO24PCR引物915-F1，用于从海栖热袍菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO25PCR引物915-F2，用于从海栖热袍菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO26PCR引物915-R1，用于从海栖热袍菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO27PCR引物915-R2，用于从海栖热袍菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO29PCR引物PhoNde，用于从Pyrococcus horikoshii克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO30PCR引物PhoBam，用于从Pyrococcus horikoshii克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO34PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO35PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO38PCR引物RN-F1，用于从Thermoococcus litoralis克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO39PCR引物RN-R0，用于从Thermococcus litoralis克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO40PCR引物TliRN-1，用于从Thermococcus litoralis克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO41PCR引物TliRN-2，用于从Thermococcus litoralis克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO44PCR引物TliNde，用于从Thermococcus litoralis扩增编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO45PCR引物TliBam，用于从Thermococcus litoralis扩增编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO48PCR引物RN-F1，用于从速生热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO49PCR引物RN-R0，用于从速生热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO50PCR引物TceRN-1，用于从速生热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO51PCR引物TceRN-2，用于从速生热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO54PCR引物TceNde，用于从速生热球菌扩增编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO55PCR引物TceBam，用于从速生热球菌扩增编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO61设计的嵌合寡核苷酸引物，为VT2-R280N3-I7，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO62设计的寡核苷酸引物，为VT2-F110，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。
SEQ ID NO63设计的嵌合寡核苷酸引物，为VT2-IF20N3，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增VFN3。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO64设计的嵌合寡核苷酸引物，为VT2-IF19N2，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增VFN2。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO65设计的嵌合寡核苷酸引物，为VT2-IF18N1，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增VFN1。“核苷酸15-17是核糖核苷酸，其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO66设计的寡核苷酸引物，为VT21R20，用于从出血性大肠杆菌O-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。
序列表<110>宝生物株式会社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>热稳定核糖核酸酶H<130>662774<150>JP 2000-280785<151>2000-09-14<150>JP 2001-64074<151>2001-03-07<160>66<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuII-3，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>1gtcgccagcg cagtnathyt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuII-6，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>2cggtccctcg tcacyttngc20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S1，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>3cgcgcttttc cggcgtcagc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S2，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>4acggcgcacg cttcaatttg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S5，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>5acgcctattt gccggggctt20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S6，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>6atgaccgacg cagcggcgat20<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-Nde，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>7tagaagaggg agaggcatat gaagcggtat acggtgaaa 39<210>8<211>780<212>DNA<213>热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)<400>8atgaagcggt atacggtgaa agacattgaa gcgctgcttc cgaagcttgg cgcggacgac 60ccgcgctggg agatgctgcg gcaggatgag cgaaaaagcg tgcaggcgct tcttgcccgt120tttgaaaggc agaaagcgcg ccggcacgcc atcgagcagc ggtgggaaga actaatgcgt180tatgagaggg aactatacgc cgctggcgtt agacggatcg ccggcattga tgaggccggg240cgcggcccgc tggccggccc ggtcgtcgcc gccgcggtca tcttgccgaa agacgcctat300ttgccggggc ttgacgactc gaagcggctg acgccggaaa agcgcgaggc attgtttgcg360caaattgaag cgtgcgccgt cgccatcggc atcggcatcg tcagcgcggc ggagatcgat420gaaaggaata tttacgaagc gacaaggcaa gcgatggcga aagcggtgaa cgccctttcc480ccgccgcctg aacatttgct tgttgatgcg atggcggtgc cgtgcccact gccgcaacag540cgcctcataa aaggagacgc caacagcgct tcaatcgccg ctgcgtcggt catcgccaaa600gtgacgcgcg accggtggat gaaagaactg gatcgccgct atccacaata cgggttcgcg660cgccatatgg gctacggaac gccggaacat ttcgaggcga tccgccgcta cggcgttacg720cctgagcacc gtcgttcgtt cgcaccggtg agggaggtgc tgaaggcgag cgagcagctc780<210>9<211>260<212>PRT<213>热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)<400>9Met Lys Arg Tyr Thr Val Lys Asp Ile Glu Ala Leu Leu Pro Lys1 5 10 15Leu Gly Ala Asp Asp Pro Arg Trp Glu Met Leu Arg Gln Asp Glu20 25 30Arg Lys Ser Val Gln Ala Leu Leu Ala Arg Phe Glu Arg Gln Lys35 40 45Ala Arg Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Trp Glu Glu Leu Met Arg50 55 60Tyr Glu Arg Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly65 70 75Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Leu Ala Gly Pro Val Val Ala80 85 90Ala Ala Val Ile Leu Pro Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Gly Leu Asp95 100 105Asp Ser Lys Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Glu Ala Leu Phe Ala110 115 120Gln Ile Glu Ala Cys Ala Val Ala Ile Gly Ile Gly Ile Val Ser
125 130 135Ala Ala Glu Ile Asp Glu Arg Asn Ile Tyr Glu Ala Thr Arg Gln140 145 150Ala Met Ala Lys Ala Val Asn Ala Leu Ser Pro Pro Pro Glu His155 160 165Leu Leu Val Asp Ala Met Ala Val Pro Cys Pro Leu Pro Gln Gln170 175 180Arg Leu Ile Lys Gly Asp Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ala Ala Ala185 190 195Ser Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Trp Met Lys Glu Leu200 205 210Asp Arg Arg Tyr Pro Gln Tyr Gly Phe Ala Arg His Met Gly Tyr215 220 225Gly Thr Pro Glu His Phe Glu Ala Ile Arg Arg Tyr Gly Val Thr230 235 240Pro Glu His Arg Arg Ser Phe Ala Pro Val Arg Glu Val Leu Lys245 250 255Ala Ser Glu Gln Leu260<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-1，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>10ggtaaggtct tgttycargg 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-3，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>11ggaaccggag attayttygg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-6，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>12atgattgaag cagcngcnac 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-8，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>13gtattggcga aatgnarytt 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNIII-S3，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>14cccgatcgtc gtcgccgccg 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BcaRNIII-3，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)克隆编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>15gatacgtgga cactttccgc 20<210>16<211>915<212>DNA<213>热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)<400>16gtgattcaag ccgaccaaca gctgcttgac gccttgcgcg cccactacca agacgcctta 60tccgaccggc ttccggctgg agcgttgttt gccgtcaagc gcccggatgt cgtcatcacc120gcctaccgct caggcaaagt gctgtttcaa gggaaagcgg cggagcaaga agcagcgaaa180tggatatcag gggcgagcgc ctcaaacgaa acagctgacc accagccgtc cgctttggca240gctcatcaac tcgggtctct ttccgccatc ggttccgatg aagtcggcac cggcgattat300ttcggcccga tcgtcgtcgc cgccgcctac gtggatcggc cgcatatcgc caaaatcgcg360gcgcttggcg tgaaagattc gaaacaattg aacgatgagg caatcaaacg gatcgccccc420gccatcatgg aaaccgtgcc gcatgcggtc accgtgttgg acaatgccga atacaaccgc480tggcagcgaa gcggcatgcc gcagacgaaa atgaaagcgc tccttcacaa ccggacgctc540gtgaaactcg ttgacgccat cgcgcccgcc gaaccagaag caatcatcat cgacgaattt600ttaaaacggg attcgtattt ccgttacctt tccgatgaag atcgcattat ccgcgagcgg660gtgcactgcc ttcccaaggc ggaaagtgtc cacgtatcag tcgccgccgc ctcgatcatc720gcccgctatg tgtttttaga ggagatggag caattatccc gcgccgtcgg cctcctgctt780ccaaaaggcg ccggcgccat tgtcgatgaa gccgcggcca acatcatccg cgcgcggggg840gcggaagcgc ttgagacatg cgccaagctt catttcgcca atacaaaaaa ggcgctggac900atcgccaaac gccgg 915<210>17<211>305<212>PRT<213>热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)<400>17Met Ile Gln Ala Asp Gln Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala His1 5 10 15Tyr Gln Asp Ala Leu Ser Asp Arg Leu Pro Ala Gly Ala Leu Phe20 25 30Ala Val Lys Arg Pro Asp Val Val Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gly35 40 45Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys Ala Ala Glu Gln Glu Ala Ala Lys50 55 60Trp Ile Ser Gly Ala Ser Ala Ser Asn Glu Thr Ala Asp His Gln65 70 75Pro Ser Ala Leu Ala Ala His Gln Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ile80 85 90Gly Ser Asp Glu Val Gly Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Pro Ile Val95 100 105Val Ala Ala Ala Tyr Val Asp Arg Pro His Ile Ala Lys Ile Ala110 115 120Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ala Ile125 130 135Lys Arg Ile Ala Pro Ala Ile Met Glu Thr Val Pro His Ala Val140 145 150Thr Val Leu Asp Asn Ala Glu Tyr Asn Arg Trp Gln Arg Ser Gly155 160 165Met Pro Gln Thr Lys Met Lys Ala Leu Leu His Asn Arg Thr Leu
170 175 180Val Lys Leu Val Asp Ala Ile Ala Pro Ala Glu Pro Glu Ala Ile185 190 195Ile Ile Asp Glu Phe Leu Lys Arg Asp Ser Tyr Phe Arg Tyr Leu200 205 210Ser Asp Glu Asp Arg Ile Ile Arg Glu Arg Val His Cys Leu Pro215 220 225Lys Ala Glu Ser Val His Val Ser Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile230 235 240Ala Arg Tyr Val Phe Leu Glu Glu Met Glu Gln Leu Ser Arg Ala245 250 255Val Gly Leu Leu Leu Pro Lys Gly Ala Gly Ala Ile Val Asp Glu260 265 270Ala Ala Ala Asn Ile Ile Arg Ala Arg Gly Ala Glu Ala Leu Glu275 280 285Thr Cys Ala Lys Leu His Phe Ala Asn Thr Lys Lys Ala Leu Asp290 295 300Ile Ala Lys Arg Arg305<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BcaRNIIINde，用于从热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)扩增编码具有RNA酶HIII活性的多肽的基因<400>18cgaacgttgt caaaccatat gattcaagcc gaccaacag 39<210>19<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>19atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga 663<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>20caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>21gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta33<210>22<211>672<212>DNA<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)<400>22atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac120tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg180gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg240aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct300cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga360agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta420gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa480aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt540gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact600gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc660tttaagaaac ct 672<210>23<211>224<212>PRT<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)<400>23Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala50 55 60Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn65 70 75Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp95 100 105Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg110 115 120Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp125 130 135Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val140 145 150Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala200 205 210Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro215 220<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-F1，用于从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>24aaaaagcttg ggaatagatg agctttac28<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-F2，用于从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>25aaaccatggg aatagatgag ctttac26<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-R1，用于从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>26aaatctagat cctcaacttt gtcgatgtg29<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-R2，用于从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>27aatctagatt aaaaaagagg gagattatgg30<210>28<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>28atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga 663<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物PhoNde，用于从Pyrococcus horikoshii克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>29aggaggaaaa tcatatgaag gttgctggag 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物PhoBam，用于从Pyrococcus horikoshii克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>30ttacatgaag gatccaagat cacttaagga 30<210>31<211>673<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>31atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tgatcttgga tcc 673<210>32<211>220<212>PRT<213>Pyrococcus horikoshii<400>32Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Arg Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro Gly Gln Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu50 55 60Asp Asp Tyr Tyr Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu65 70 75Arg His His Ser Met Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Arg Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp95 100 105Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala110 115 120Gly Leu Lys Tyr Glu Ala 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gataacg17<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物VT2-R280N3-I7，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。“核苷酸18-20为核糖核苷酸，而其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>61tgctcaataa tcanacgaag 20<210>62<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物VI2-F110，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。<400>62tcgttaaata gtatacggga ag 22<210>63<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物VT2-IF20N3，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增VFN3。“核苷酸17-19为核糖核苷酸，而其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>63tactgggttt ttcttcgua 19<210>64<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物VT2-IF19N2，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增VFN2。“核苷酸16-18为核糖核苷酸，而其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>64tactgggttt ttcttcgu 18<210>65<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的嵌合寡核苷酸引物VT2-IF18N1，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增VFN1。“核苷酸15-17为核糖核苷酸，而其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>65tactgggttt ttcttcg 17<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>设计的寡核苷酸引物VT21R20，用于从出血性大肠杆菌0-157扩增vero细胞毒素2编码序列的一部分。<400>66gtcccctgag atatatgttc 20
权利要求
1.一种具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽，所述多肽选自(a)具有以下氨基酸序列或其部分的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59；(b)具有在以下氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59；和(c)具有与以下氨基酸序列享有至少71％同源性的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59。
2.一种编码具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽的核酸，所述核酸选自(a)一种核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列或其部分的多肽；(b)一种核酸，所述核酸编码具有在SEQ ID NO9、17、23、32、37、47、57或59的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的氨基酸序列的多肽；(c)一种核酸，所述核酸具有SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列；(d)一种核酸，所述核酸在SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列中有至少一个核苷酸缺失、添加、插入或取代，使得所述核苷酸的缺失、添加、插入或取代导致翻译为一种氨基酸序列；(e)一种核酸，所述核酸在严格性条件下可与(a)-(d)的核酸中任一种或其互补链杂交；和(f)一种核酸，所述核酸的核苷酸序列与SEQ ID NO8、16、22、31、36、46、56或58的核苷酸序列享有至少69％的同源性。
3.一种重组DNA，所述重组DNA包含权利要求2限定的核酸。
4.一种用权利要求3限定的重组DNA转化的转化体。
5.一种生产具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽的方法，所述方法包括培养权利要求4限定的转化体；和从所述培养物中收集具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽。
6.一种具有热稳定核糖核酸酶H活性的多肽，所述多肽可通过培养其中转移有以下任一种质粒的转化体而获得pRHB11(FERMBP-7655)、pBCA3Nd2(FERM BP-7653)、pPFU220(FERM BP-7654)、pTM-RNH(FERM BP-7652)、pPHO238(FERM BP-7692)、pAFU204(FERM BP-7691)、pTLI204(FERM BP-7693)和pTCE207(FERM BP-7694)。
全文摘要
对基因工程非常有用的具有RNA酶H活性的多肽、编码这些多肽的基因和用于基因工程生产这些多肽的方法。
文档编号C12N9/22GK1474873SQ01818690
公开日2004年2月11日 申请日期2001年9月13日 优先权日2000年9月14日
发明者上森隆司, 佐藤好美, 小山信人, 平野亮, 高蔵晃, 小堀博史, 桥元勇二, 浅田起代蔵, 加藤郁之进, 之进, 二, 人, 代, 史, 美 申请人:宝生物工程株式会社