专利名称：分离的结合hla-c分子的肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于细胞免疫学领域的肽。本发明更具体涉及与细胞表面HLA分子结合的肽。这些肽中至少有一些当与HLA分子形成复合物时，可以诱导细胞裂解性T细胞的激活。本发明还涉及这些肽在例如识别HLA-Cw3和HLA-Cw6阳性细胞刺激T细胞，鉴定特殊T细胞的存在，以及鉴定细胞裂解性T细胞本身的存在等方面的用途。
背景技术：
宿主生物对癌细胞的识别或丧失识别，对这一问题的研究已经朝很多不同方向进行。对这一领域的了解需要基础免疫学和癌病学的相关知识。
对小鼠肿瘤进行的早期研究显示，这些展示在表面的分子导致了肿瘤细胞在被移植入同系动物体内后受到排斥。这些分子被受体动物的T细胞所识别，激发细胞裂解性T细胞应答，并伴有对移植细胞的裂解。这一证据最初是通过由化学致癌剂，如甲基胆蒽，体外诱导的肿瘤而获得的。由肿瘤表达的激发T细胞应答的抗原对每种肿瘤而言不同。见Prehn，et al.，J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross，Cancer Res.3326-333(1943)；Basombrio，Cancer Res.302458-2462(1970)，其中教导了用化学致癌剂诱发肿瘤，以及细胞表面抗原的差别。这类抗原被称作“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTA”。在观察到化学致癌剂刺激使这类抗原呈递之后，体外通过紫外线照射诱导的肿瘤也观察到类似的结果，见Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
虽然在上面描述的肿瘤类型中观察到T细胞介导的免疫应答，自发性肿瘤一般认为是非免疫原性的。这些肿瘤一般认为不呈递能在携带肿瘤的个体中激发针对该肿瘤的应答的抗原。见Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer33241-259(1976)。呈递tum抗原的细胞系是通过对小鼠肿瘤细胞或细胞系进行诱变而获得的免疫原性变体，见Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)，其引入本文作为参考。详细地说，tum抗原是通过对肿瘤细胞进行突变得到的，这些肿瘤细胞在同系小鼠中不产生免疫应答，会形成肿瘤(即tum+细胞)。这些tum+细胞被诱变后，会被同系小鼠排斥，无法形成肿瘤(因此成为tum-)。见Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74272(1977)，其全文引入作为参考。许多肿瘤类型都有此现象。见Frost et al.，Cancer Res.43125(1983)。似乎Tum-变体无法形成进行性肿瘤，因为它们启动免疫排斥应答。支持这一假说的证据包括肿瘤的tum-变体，即通常不形成肿瘤的那些，在用亚致死量放射线照射从而使免疫系统受到抑制的小鼠体内可以诱发肿瘤(Van Pel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 765282-5285(1979))；腹腔内注射的肥大细胞瘤p815的tum-细胞在12-15天内呈指数扩增，但在淋巴细胞和巨噬细胞中只需几天就被清除了(Uyttenhove，et al.，J.Exp.Med.1521175-1183(1980))。进一步的证据包括小鼠获得免疫记忆，使得它们能够抵抗同一变体的进一步攻击，即便当进一步攻击后给予免疫抑制量的辐射时也是如此(Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74272-275，1977；Van Pel et al.，同上；Uyttenhove，et al.同上)。进一步研究发现，当对自发肿瘤进行诱变时，可产生能够引发应答的免疫原性变体。的确，这些变体能够引发针对初始肿瘤的免疫保护性应答。见VanPel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001，1983。因此，在作为同系排斥应答的目标的肿瘤中诱发所谓“肿瘤排斥抗原”的呈递是可能的。用外源基因转染自发肿瘤也得到类似的结果。见Fearon et al.，Cancer Res.482975-1980(1988)。
目前已找到一类抗原，它们被呈递在肿瘤细胞表面，被细胞裂解性T细胞所识别，导致细胞裂解。这类抗原在后文中被称作“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。TRA可以诱发或不诱发抗体应答。对这些抗原的研究进展目前仅达到通过体外细胞裂解性T细胞进行特征性研究的水平，即利用细胞裂解性T细胞的具体亚类(CTL)来鉴定抗原的水平。这一亚类在对呈递的肿瘤排斥抗原进行识别后增殖，使呈递肿瘤排斥抗原的细胞裂解。特征性研究鉴定了能特异性裂解表达肿瘤排斥抗原的细胞的CTL克隆。这类工作见Levy et al.，Adv.Cancer Res.241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.，J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12406-412(1982)；Palladino et al.，Cancer.Res.475074-5079(1987)。其他类型的被CTL识别的抗原也需要此类分析，包括次要组织相容性抗原，男性特异性H-Y抗原，称为tum-的一类抗原，如本文所述。
上述主题的一个例子是肿瘤P815。见DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J.91041-1050(1990)；Sibille et al.，J.Exp.Med.17235-45(1990)，其引入本文作为参考。P185肿瘤是肥大细胞瘤，用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱导，既作为体外肿瘤也作为细胞系加以培养。P815系在诱变后产生许多tum变体，包括P91A(DePlaen，同上)、35B(Szikora，同上)，P198(Sibille，同上)等变体。与肿瘤排斥抗原相反(这是一个关键区别)，tum抗原仅在肿瘤细胞诱变后出现。肿瘤排斥抗原出现在未经诱变的肿瘤的细胞表面。因此，根据文献记载，一个细胞系可以是tum+，例如称为P1的细胞系，而且可被刺激产生tum-变体。由于tum-表型与亲本细胞系的不同，我们会看到tum细胞系的DNA与tum+亲本细胞系的DNA有所不同，我们可以利用这一差别以定位tum-细胞中的目的基因。结果发现，tum变体例如P91A，35B和P198的基因在其编码区域与正常等位基因相比具有点突变。见Szikora和Sibille，同上；以及Lurquin et al.，Cell 58293-303(1989)。本发明的TRA没有这种情况。这些文章还证实，来源于tum-抗原的肽由H-2dI类分子呈递，被CTL识别。P91A由Ld呈递，P35由DL呈递，P198由Kd呈递。
PCT申请PCT/US92/04354(1992年5月22日提交)已转让给本申请的同一受让人，其中教导了一类人肿瘤排斥抗原前体编码基因，称为MAGE家族。Van der Burggen et al.Science 2541643(1991)也探讨了这些基因中的某些基因。现在知道，MAGE家族中的各种基因都可在肿瘤细胞中表达，它们可以作为诊断此种肿瘤的标记物，以及用于本发明的其它用途。见Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992)；van der Bruggen et al.，Science2541643(1991)，以及De Plaen，et al.，Immunogenetics 40360(1994)。对蛋白的加工和呈递于细胞表面的机制现在已有相当多的文献记载。对这一领域的发展的粗略回顾请参见Barinaga，“Getting Some‘Backbone’How MHCBinds Peptides，”Science 257880(1992)；Fremont et al.，Science 257919(1992)；Matsumura et al.，Science 257927(1992)；Engelhard，Ann.Rev.Immunol.12181-207(1994)；Madden，et al.，Cell 75693-708(1993)；Ramensee，et al.，Ann.Rev.Immunol.11213-244(1993)；Germain，Cell 76287-299(1994)。这些文章都指出，与MHC/HLA分子结合的肽一般需9个氨基酸长(九肽)，同时也指出了第二和第九残基在九肽中的重要性。对H-2Kb来说，锚定残基为八聚体的第5位和第8位，对H-2Db来说，它们是九肽的位置5和9，而HLA-A1的锚定残基是九肽的位置3和9。一般而言，对HLA分子来说，位置2和9是锚定残基。
对MAGE家族的基因的研究显示，一种特殊的九肽确实呈现在某些肿瘤细胞的表面，而该九肽的呈递要求呈递分子是HLA-A1。MAGE-1肿瘤排斥抗原(TRA或九肽)复合物导致了由细胞裂解性T细胞(CTL)对呈递该抗源的细胞进行裂解。
美国专利5,405,940(1992年8月31日提交)和5,571,711中的研究发现，当将各种MAGE基因的同源区域与MAGE-1基因编码相关九肽的区域进行比较时，发现有很大的同源性。这导致了在本文公开并要求权利的本发明的一个方面，即一个九肽家庭，其中每种九肽都具有相同的N末端和C末端氨基酸。这些九肽可用于各种用途，包括单独或与载体肽联合用作免疫原。九肽的长度足以形成一个抗原性表位，由它激发出的抗体可用来鉴定此九肽，无论该九肽单独存在，还是作为一个长肽的一部分时均是如此。
此前对相关文献的调查显示，各种肽(通常为八、九或十个氨基酸长)与MHC分子形成复合物，并呈递由细胞裂解性T细胞识别的标靶。针对黑素瘤进行了很多研究，被细胞裂解性T细胞所识别的黑素瘤抗原现在被分成三大类。第一类包括前面所讨论的很多抗原(如MAGE)，它们在部分黑素瘤及其它肿瘤类型中表达，还在正常睾丸及胎盘中表达。这些抗原是通常在正常组织中呈静息状态的正常基因的表达产物。
第二类黑素瘤抗原包括源自正常蛋白质的突变形式的抗原。这一类的例子包括MUM-1(Coulier，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927976-7980(1955))，CDK4(Wolfel，et al.Science 2691281-1284(1955))，和HLA-A2(Brandel，et al.J.Exp.Med.1832501-2508(1996))。第三类也可见于上述文献，包括在黑素瘤和黑素细胞中都有表达的分化抗原。例如酪氨酸酶，gp100，gp75和MelanA/Mart-1。Melan-A参见美国专利5,620,886，其引入作参考。酪氨酸酶参见Wolfel，et al.，Eur.J.Immunol.24759(1994)和Richard，et al.，Eur.J.Immunol.26224(1996)。gp100参见Kang，et al.，J.Immunol.1551343(1995)；Cox，et al.，Science 264716(1994)；Kawakami，et al.，J.Immunol.1543961(1995)。gp75参见Wang，et al.，J.Exp.Med.1831131(1996)。
有几种方法可用来鉴定受HLA限制的肽。例如，Boon，et al.J.Exp.Med.183725-729(1996)描述了如何利用对自体黑素瘤细胞的应答性鉴定CD8+T细胞的靶肽。该方法需要通过粘粒或cDNA载体将抗原表达转移至非表达细胞。分别参见Van der Bruggen，et al.Science 2541643-1650(1991)，Kawakami，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916458-6492(1994)，它门都引入本文作参考。在每一种情况下，转染分子必须编码相关抗原。如需要，也可使用HLA-I类限制元件。见De Plaen，et al.，Methods，12125-142(1997)。
被T细胞所识别的肿瘤抗原的编码序列被鉴定以后，HLA结合基序分析(如Falk et al，Nature，357290-296(1991)所述)对于鉴定相关肽很有用。
Hunt et al，Science 2551261-1263(1992)描述了鉴定肽的方法将这些肽从HLA分子上洗脱下来，通过HPLC分级，然后再使用结构鉴定技术。应用这一方法的例子见Cox，et al，Science 264716-719(1994)，Skipper et al，J.Exp.Med.183527-534(1996)，Castelli et al，J.Exp.Med.181363-368(1995)。这一方法存在技术挑战，尚未广泛使用。
已知一种使用病毒载体来鉴定已知肿瘤抗原的靶肽的方法。这一技术包括诱导幼稚T细胞的从头(de vovo)特异性应答(Chaux et al，J.Immunol.1632928-2936(1999)，Butterfield，et al，J.Immunol.1615607-5613，1998))；以及刺激和扩增体内致敏的T细胞。参见Toso，et al，Canc.Res.5616-20(1996)，Yee，et al，J.Immunol.1574079-4086(1996)；Kim，et al，J.Immunoother.20276-286(1997)；Ferrari et al，Blood 902406-2416(1997)。然后用T细胞鉴定引发T细胞应答的经天然加工的肿瘤肽。
上述工作的缺陷之一在于对HLA-A等位基因、尤其是HLA-A2呈递的强调。关于其它MHC/HLA分子的MHC/HLA限制，目前所知甚少。在非HLA-A亚型的MHC/HLA分子中，对HLA-B27分子的研究最多。参见Parker，et al，J.Immunol.152163(1994)，其引入本文作为参考。这提示，在被加工为MHC/HLA配体和/或表位的给定分子中，应可预见到HLA-B27结合子(binder)。但本发明的情况却不是这样。
与HLA-A2和HLA-B27相反，对HLA-C分子和其结合肽的了解很少。其结合基序不很清楚，几乎没有几种肽接受了检测。HLA-C的出现率远低于HLA-A和B分子，在一个群体库中，HLA-C分子远非研究者的首选。本发明的一个意想不到的发现是鉴定了两种HLA-C表位，这在文献中鲜有提示，而在本发明的实验设计中将加以详细描述。
美国专利5,804,381(在此作为参考文献)中所述NY-ESO-1分子被认为是肿瘤抗原中免疫原性最强的分子之一。晚期癌症病人中有近一半表达该抗原(Stockert，et al，J.Exp.Med.1871349-1354(1998))，其表达伴有较强的CD4+和CD8+T细胞应答。参见Jger，et al，J.Exp.Med.191625-630(2000)；Jger et al.，J.Exp.Med.167265-270(1998)；Jger，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)；Chen，et al，J.Immunol.(赴印)。来源于作为HLA-A2表位的分子的肽是已知的(Jger et al.，J.Exp.Med.187265-270(1998))。Wang et al，J.Immunol.1613598-3600(1998)则描述了HLA-A31结合表位。
已经发现，NY-ESO-1也呈递与HLA-C分子，例如HLA-Cw3和HLA-Cw6结合的表位。见第7页第13行“…HLA-Cw3和HLA-Cw6”之后。NY-ESO-1与另一肿瘤排斥抗原LAGE-1(Lethe et al，美国专利5,811,519)有同源序列。在了解MAGE-A1/HLA-A1和MAGE-A3/HLA-A1肽之后，LAGE-1上编码相关九肽的等效区也呈递与HLA-C分子，例如HLA-Cw3和HLA-Cw6结合的表位。这样的肽，以及与其相关的发现，也是本发明的一部分。本发明的另一部分则是鉴定这些肽的方法。本发明的所有方面均在下文中加以详述。
优选实施方案的详述实施例1以下实验描述了如何制备细胞样品，以用于后面的实验。
使用标准方法，从癌症病人收集外周血淋巴细胞(下文中称作PBL)。使用包被有CD8特异性抗体的磁珠和本领域已知技术处理细胞，以除去CD8+T细胞。一旦分离，便将CD8+细胞接种在圆底的96孔板上，密度为5×105细胞/孔，加入RPMI培养基1640，培养基中含有10％人AB血清，L-谷氨酰胺(2mM)，青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)，和1％的非必需氨基酸。
去除了CD8+细胞的PBL被用作抗原呈递细胞(后文称为APC)。正如此后要详细描述的，这些细胞或者用10μM肽进行脉冲处理，或者用腺病毒构建体以1000IU/细胞、在37℃、300μl无血清培养基中转染过夜。
实施例2测定NY-ESO-1蛋白在无CD8的PBL中的表达。无CD8的PBL通过上述方法获得。这些细胞然后用含有编码NY-ESO-1蛋白的cDNA的腺病毒载体进行转染，或者用“空”腺病毒载体进行转染。PBL既有来自健康供体的，也有来自癌症病人的。
为了制备载体，我们使用了Chen，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941914-1918(1997)以及美国专利5,804,381中所描述的方法，这两篇文献在此均作为参考文献。简言之，用EcoRI和XbaI消化载体pBK-CMVNY-ESO-1(后者在这两篇文献中均有描述)，产生包含NY-ESO-1的cDNA的0.8kb片段。分离该片段，将其克隆入市售的穿梭载体pSV2-ICEU-1 pAd的EcoRI和XbaI位点。所得到的穿梭质粒pSV2-ICEU-1 NY-ESO-1随后用ICEU消化，产生一种表达盒，该盒包含CMV启动子/增强子，NY-ESO-1 cDNA，以及BGH polyA序列。分离该片段，并将其克隆入“pAd-Quick”质粒的单一ICEU-1位点。这一质粒随后用SmaBI消化，用消化产物转化293细胞，产生编码NY-ESO-1的重组腺病毒载体。
PBL用1000 IU/细胞的腺病毒构建物感染，37℃温育过夜。对细胞进行透化，用1μg/ml特异于NY-ESD-1的单克隆抗体染色，该抗体在Stockert，et al.，J.Exp.Med.1871340-1354(1998)和WO99/53938中有所描述，在此一并列为参考文献。
高达85％的被感染PBL可表达重组NY-ESO-1细胞，显示这一方法可用于其它的实验。
实施例3这些实验测定用NY-ESO-1重组腺病毒感染的APC进行的刺激与用肽脉冲处理所得APC进行的刺激，两者是否相当。这些实验还提供了分析NY-ESO-1应答性T细胞在癌症病人中的出现和频率的方法。更为重要的是，通过使用重组病毒载体转导APC中NY-ESO-1而非外源肽例如SEQ ID No.1的表达，这一分析方法可以用于天然加工和呈递的肽表位。
在这些实验中，细胞样品取自两个病人，这两个病人在此前被确诊为具有对HLA-A2限制性肽SLLMWITQC(SEQ ID No.1)的自发性T细胞应答，如Jger，et al.，J.Exp.Med.167265-270(1998)和Jger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)中所述，这两篇文献在此都作为参考文献。取自这两个病人的PBL如上述加以处理，以从中分离CD8+细胞。去除了CD8的PBL如上述用10μM SEQ IDNo.1样品进行脉冲处理，用编码NY-ESO-1的腺病毒进行转染，或用编码绿色荧光蛋白的腺病毒进行转染。随后将自体CD8+细胞用PBL刺激8天。如上所述，每孔CD8+细胞加1×106APC予以刺激(即，将PBL加入含5×105CD8+细胞/孔的孔中)。刺激8小时后，加入IL-2(10U/ml)，以及IL-7(20ng/ml)。该过程重复3天，直到收获细胞用于测试。
细胞用四聚体实验进行检测，即将CD8+T细胞在含1％FCS的50μlPBS中，用藻红素(PE)标记的四聚体进行染色。四聚体合成参见Altman，et al.，Science，27494-96(1996)，在此作为参考文献。使用SEQ ID.No.1作为肽来装配四聚体。细胞在37℃染色15分钟，然后加入特异于CD8的市售单克隆抗体，即“三色(Tricolor)-CD8 mAb”，在冰上放置15分钟。洗涤细胞，用流式细胞仪分析。
刺激8天后，四聚体阳性细胞率是相同的，即，使用肽和使用腺病毒转化细胞，其应答是相同的。这一应答特异于NY-ESO-1，因为当使用编码绿色荧光蛋白的腺病毒时，四聚体染色是阴性的。
实施例4以下实验被设计用来更充分地研究得自一个个体的CD8+T细胞。使用在此作为参考文献的Jung，et al.，J.Immunol.Meth.159197-207所述细胞点(Cytospoet)方法。CD8+细胞如上述进行呈递后，与自体EBV-B靶细胞在300μl无血清培养基中以1∶2混合30分钟。样品中加入10μg/ml布雷菲尔德菌素，再放置5小时。上述自体EBV-B细胞用SEQ ID No.1肽脉冲处理，或用痘苗载体构建物转染。所用痘苗病毒构建物包含全长NY-ESO-1cDNA，其在痘苗病毒40k启动子控制之下(Gritz，et al.，J.Virol.645948-5857(1990)，在此作为参考文献)，所述构建物还包含大肠杆菌lacZ基因，其在禽痘病毒C1启动子控制之下(Jenkins，et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruses 7991-998(1991)，在此作为参考文献)。将外源序列插入该构建体的胸苷激酶基因中，位于痘苗病毒Wyeth株基因组的Hind III区域(见Mazzara，et al.，Meth.Enzymol.217557-581(1993)，在此作为参考文献)。
将细胞固定，透化，用上述CD8特异性三色单克隆抗体、FITC标记的IFN-γ单抗，PE标记的TNF-α特异性单抗室温染色15分钟。结果通过在流式细胞仪中对CD8+淋巴细胞进行选通来分析。
结果显示，受腺病毒构建体刺激的效应细胞，应对用编码NY-ESO-1的痘苗病毒构建物转染的自体EBV-B细胞，而产生大量IFN-γ和TNF-α；但它们却不对野生型痘苗转染体产生应答。没有观察到用来致敏的腺病毒载体和用来读取结果的痘苗病毒之间的交叉反应。致敏效应细胞具有激活的记忆T细胞的典型特征，包括CD45RO的高表达，以及CD62L的低表达，而且它们在没有再次刺激的条件下可在培养中维持一个月以上。
用上述方法、经流式细胞述分拣出任何对上述四聚体产生阳性应答的CD8+T细胞。发现两类细胞群体，一类对四聚体呈阳性应答，另一类呈阴性应答。
实施例5这些实验进一步对上面描述的两个细胞亚群进行分析。分拣以后，细胞在0.1μg/ml PHA，10U/ml IL-2和20ng/ml IL-7存在下，用同种异体的饲养细胞PBL进行刺激。每一亚群随后进行ELISPOT分析，以决定其特异性。具体是，平底的、96孔硝酸纤维素板用2μg/ml IFN-γ进行包被，然后4℃孵育过夜。平板用PBS洗涤，然后用10％人AB血清37℃封闭1小时。加入上述已呈递的CD8+T细胞(1×103～5×104细胞/孔)，还加入5×104靶细胞。靶细胞为用SEQ ID No.1肽脉冲处理的PBL，或用表达NY-ESO-1的痘苗病毒转染的PBL或用EBV-B细胞转染的PBL，如上述。细胞在无IL-2和人血清的RPMI培养基1640中孵育20小时。平板用PBS粗略冲洗以除去细胞，然后每孔加入0.2μg/ml IFN-γ单抗。37℃孵育2小时后，洗板，用1μg/ml链亲和素碱性磷酸酶室温显色1小时。随后冲洗，加入底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑，孵育5分钟。最后一次冲洗之后，板面上呈现暗紫色斑点，在显微镜下记数。
上述使用四聚体阳性亚群所进行的其他实验显示，呈现有NY-ESO-1重组腺病毒的CD8+T细胞可以唤醒特异性识别表达NY-ESO-1的HLA-A2肿瘤细胞的效应细胞。用表达NY-ESO-1的不同黑素瘤细胞系如上述进行的ELISPOT实验证实了这一点。选出一个不表达NY-ESO-1的细胞系。所选的所有细胞系均表达HLA-A2，只有一个细胞系除外；但这个细胞系却表达NY-ESO-1。总之，在所测试的五个黑素瘤细胞系中，3个既表达NY-ESO-1又表达HLA-A2分子，1个表达HLA-A2但不表达NY-ESO-1，1个表达NY-ESO-1但不表达HLA-A2。
结果显示，对四聚体阳性CD8+T细胞来说，NY-ESO-1和HLA-A2表达对识别都是必需的。
实施例6如上文所述，分拣出四聚体阴性CD8+T细胞亚群；然而，令人惊讶的是，当进行检测时，这一亚群却可与用表达重组NY-ESO-1的痘苗病毒感染的自体EBV-B细胞进行反应。这表明，NY-ESO-1蛋白被加工成由MHC分子而非HLA-A2呈递的表位。如“背景技术”部分所言，HLA-B27分子以一定频率被表达，并已知一结合基序(Parker et al.，J.Immunol.152163(1994)，引入为参考)。这是一个九或十聚体，位置2为精氨酸，C末端有一疏水残基。由于提供T细胞的病人可表达HLA-B27，有理由相信肽分子可能是由这一HLA分子呈递的。
用Parker所述基序对NY-ESO-1氨基酸序列进行图像分解，得到11个预计可与HLA-B27分子结合并可作为T细胞表位的肽序列。合成每个肽序列，用上文描述的ELISPOT方法进行检测。没有一个呈阳性反应。我们沿整个NY-ESO-1序列发现了所有目标肽，即，氨基酸42-50，51-60，76-85，80-88，85-94，105-113，124-133，135-143，157-165，159-167和163-171。参见，例如，引入作参考的WO99/53938提供了上述氨基酸序列。如所述，没有一个呈阳性反应。
四聚体阴性亚群随后用来自健康供体的EBV-B细胞进行测试，所述EBV-B细胞用重组病毒转导以表达NY-ESO-1，但在HLA特异性上却有差别，即细胞系名称HLA类型9-EBV A*0101；A*0301；B*15；B*4406；Cw*0303；Cw*070410-EBVA*3001；A*3301；B*4501；B*5301；Cw*060219-EBVA*0201；A*2402；B*2705；B*37.01；Cw*0202；Cw*060220-EBVA*0301；A*2301；B*0702；B*4403；Cw*0401；Cw*070221-EBVA*2402；A*3101；B*15；B*2705；Cw*0202；Cw*030326-EBVA*0201；B*0801；B*5701；Cw*0602；Cw*070132-EBVA*0101；A*0201；B*0801；B*15；Cw*0303；Cw*0701对上述每一种EBV细胞取样，用编码NY-ESO-1的痘苗病毒或野生型痘苗病毒进行转染。样品如上述进行检测。HLA-Cw3阳性细胞系能向四聚体阴性细胞亚群呈递NY-ESO-1。随后鉴定其中所涉及的肽。为此，使用现有技术合成长的、重叠的肽，以跨越整个NY-ESO-1序列。用这些肽对自体EBV-B细胞进行脉冲处理，并使用ELISPOT进行检测，如上述。相应于氨基酸85-102和91-108的肽被CD8+T细胞识别。Falk et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9012005-12009(1993)描述了用于结合HLA-Cw3的一种基序。使用该基序合成由NY-ESO-1的氨基酸92-100组成的肽，并进行测试。为此，HLA-1类阴性细胞系721.221用编码HLA-Cw3的cDNA进行转染，然后用肽进行脉冲处理。在比较试验中，用HLA-Cw4转染后，结果为阴性。HLA-Cw*0303和HLA-Cw*0304亚型均可很好地呈递所述肽。事实上，在浓度低于1nM时即可识别。此肽序列为LAMPFATPM(SEQ ID No.2)实施例7经过上面的实验，设计了以下实验来研究并非HLA-A2阳性的个体体内对NY-ESO-1的自发性T细胞应答。
选择一名对NY-ESO-1呈血清阳性的病人。从病人身上取PBL，随后用上面描述的方法分离CD8+T细胞，效应细胞在体外用感染了编码NY-ESO-1的腺病毒构建物的CD8耗竭型PBL进行刺激。使用上文的方法培养9天后，接近40％的致敏CD8+T应对痘苗病毒感染的组织相容性EBV-B细胞所表达的NY-ESO-1而特异性产生IFN-γ。如上文所述，用跨NY-ESO-1的重叠肽进行测试，以确定由氨基酸73-90和79-96组成的肽被受试者的预致敏T效应细胞识别。使用上述EBV-B细胞将HLA-Cw6鉴定为这一应答中的限制性成分。HLA-Cw6的锚定基序在Falk，et al.文章中已描述。由氨基酸80-88(ARGPESRLL；SEQ ID No.3)组成的肽被推定为相关的九肽。合成该肽，如上述进行测试，证实其可被效应细胞以HLA-Cw*0602限制性方式识别。
实施例8此前，Jger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)证实，CD8+细胞对NY-ESO-1的应答性只存在于带有对该蛋白质的抗体的病人中。我们研究了当使用本文所述腺病毒/痘苗病毒交叉致敏方法时是否也是这样。为此，我们研究了三例NY-ESO-1阳性肿瘤病人。一例病人是血清阳性，其他两例是血清阴性。来自血清阳性病人的CD8+T细胞用去除了CD8的PBL进行刺激，该PBL已被上述编码NY-ESO-1的腺病毒载体感染。结果观察到，针对借由痘苗病毒载体来表达NY-ESO-1的组织相容性EBV-B细胞，产生NY-ESO-1特异性应答。HLA-A2限制性肽(SEQ ID No.1)和HLA-Cw3限制性肽(SEQ ID No.2)都是该应答的标靶。血清阴性个体中未见应答。
前述实施例描述了本发明的特征，包括鉴别T细胞，例如特异于肽/MHC复合体的CD8+T细胞的方法，其中的肽来源于目的蛋白。在该方法中，使1例被认为包含相关CD8+细胞的样品与已被第一种编码目的蛋白的病毒载体感染的抗原呈递细胞，例如树突细胞接触。之后，使CD8+细胞再与已被第二种编码目的蛋白的病毒载体感染的第二群抗原呈递细胞接触，其中所述第二种病毒载体与第一种病毒载体不同。该方法的好处在于，可以更精确确定免疫应答针对的是抗原而非针对病毒的任何方面。在一个优选实施方案中，第一种病毒载体是腺病毒载体，更优选它不能复制，而第二种载体是痘苗载体。这个顺序也可以颠倒过来，这两种选择只能择一使用，并使得第二种病毒与这两种选择中的一种不同。
如上所述，这一方法需要一种抗原呈递细胞，例如树突细胞，或能够在其表面呈递MHC或HLA分子和一种肽的复合体的其他类型的细胞。在实践中，优选该方法涉及使用自体细胞，即来自同一病人的抗原呈递细胞和CD8+T细胞，但这一方法也可用同种异体细胞进行。通过使用这一方法，如实施例所示，可使技术人员鉴定那些因呈递MHC/HLA分子而被限制的表位。如这里所描述的，这一方法允许鉴别与HLA分子，例如HLA-Cw3和HLACw6分子结合的肽，包括，但不限于，SEQ ID No.2和3所定义的肽。这些肽可用来，例如，刺激特异于HLA分子和肽的复合物的细胞裂解性T细胞的产生，以鉴定能呈递HLA分子的细胞，等等。所述肽也可以用于治疗，例如，作为在增强免疫应答的配制剂中的单一肽成分来用，或作为多种肽中的一种。这类组合物还可以包含其他成分，例如佐剂。这类佐剂的一个例子是GM-CSF，如Jger et al.在引入本文作参考的美国专利中所教导的。
NY-ESO-1基因和其编码的蛋白与称作“LAGE”或“LL-1”的分子具有同源性。参见，例如，Lethe et al.，美国专利5,811,519，在此全文引用。与SEQ ID No.2和3同源的LAGE肽，即ITMPFSSPM(SEQ ID NO.4)ARRPDSRLL(SEQ ID NO.5)也是本发明的一部分，可作为HLA-Cw3、亚型HLA-Cw*0303和HLA-Cw*0304、尤其HL-C26的表位。
必须记住，本领域普遍认为，MHC配体和MHC表位之间存在区别。对前者来说，它们只是与MHC分子结合的肽，但结合后并不引起T细胞应答。而对后者来说，MHC表位是与MHC分子结合的肽，当它与特异于肽/MHC复合物的T细胞接触时可刺激T细胞。Falk等人在上文引用的文献中推出针对HLA-Cw*3、HLA-Cw*0301、HLA-Cw*0304、HLA-Cw*0601、HLA-Cw*0602的结合基序。Falk等也在其文章中对配体和表位进行了区分。将会看到，没有找到针对这些等位基因中的任何一个的T细胞表位。
本发明的一部分是所谓“微型基因”，即由编码目的肽的核苷酸序列组成的核酸分子。肽的长度使得能简单构建编码目的表位的所有简并序列。使用本领域已知方法可将这些编码序列制备成一个扩展的“多表位(polytopic)”序列的一部分，并可将其掺入已将微型基因或目的基因与启动子可操作连接的编码载体中，以便在宿主细胞中表达。
微型基因也可以与编码目的MHC分子的基因，例如HLA-Cw3或HLA-Cw6编码序列协同使用。这两种序列可以组成单一载体的一部分，随后用于试剂盒中的一对载体，或允许技术人员用其刺激T细胞应答的其他组合，等等。
本发明的其他特征对本领域技术人员是清楚的，在此无需赘述。
虽然本发明用特定实施方案进行了描述，但应该明了，本领域技术人员可以在不偏离本发明精神的条件下对其进行多种修饰和改动。此类修饰、改动或等效体都包含在本发明权利要求的范围内。
序列表<110>萨夏.格恩杰蒂克(Gnjatic，Sacha)劳埃德.J.奥尔德(Old，Lloyd J.)<120>分离的结合HLA-C分子的肽及其用途<130>LUD 5668 PCT<140><141>2001-09-26<160>5<210>1<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>1Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys5<210>2<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>2Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met5<210>3<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>3Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu5<210>4<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>4Ile Thr Met Pro Phe Ser Ser Pro Met5<210>5<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>5Ala Arg Arg Pro Asp Ser Arg Leu Leu权利要求
1.一种分离的肽，该肽与HLA-Cw3分子结合，并可刺激特异于所述肽与HLA-Cw3分子的复合物的T细胞增殖，其氨基酸序列由SEQ ID NO.2组成。
2.一种分离的肽，该肽与HLA-Cw6分子结合，并可刺激特异于所述肽与HLA-Cw6分子的复合物的T细胞增殖，其氨基酸序列由SEQ ID NO.3组成。
3.分离的细胞裂解性T细胞，其特异于HLA-Cw3分子与权利要求1的肽的复合物。
4.分离的细胞裂解性T细胞，其特异于HLA-Cw6分子与权利要求2的肽的复合物。
5.一种刺激细胞裂解性T细胞增殖应答的方法，包括将含有T细胞的样品与在表面呈递HLA-Cw3与权利要求1所述肽的复合物的细胞接触，从而刺激特异于所述复合物的细胞裂解性T细胞的增殖。
6.一种刺激细胞裂解性T细胞增殖应答的方法，包括将含有T细胞的样品与在表面呈递有HLA-Cw6与权利要求2所述肽的复合物的细胞接触，从而刺激特异于所述复合物的T细胞的增殖。
全文摘要
本发明教导了与细胞表面的HLA－Cw3和HLA－Cw6分子结合的肽表位。这些肽可用于诊断和治疗，编码它们的DNA分子、特异于HLA/肽复合物的细胞裂解性T淋巴细胞也可用于诊断和治疗。本发明另一特征是，在用不同病毒载体进行刺激和再刺激的系统中，鉴定诸如本文所述的那些相关分子的方法。
文档编号C12N5/08GK1476480SQ01819481
公开日2004年2月18日 申请日期2001年9月24日 优先权日2000年9月26日
发明者萨夏·格恩杰蒂克, 劳埃德·J·奥尔德, 永田康浩, 埃尔克·贾格尔, 陈耀桢, 亚历山大·克努思, J 奥尔德, 贾格尔, 大 克努思, 浩, 萨夏 格恩杰蒂克 申请人:路德维格癌症研究院