由真菌制备异源蛋白的方法

专利名称：由真菌制备异源蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及由真菌制备异源蛋白或肽的方法。
背景技术：
在宿主如真菌中制备异源蛋白是公知的。EP-A-481,008公开了在葡萄糖中生长的酵母中制备异源蛋白。
由宿主生物体以补料分批发酵法工业大规模制备异源蛋白通常显示三个期。
第一期是分批期，定义是其中细胞生长到所需浓度的期。在这个期，细胞以指数生长。描述分批期的模型假定细胞不死亡，氧气过量存在，以及所有其它条件使得可无限生长。这意味着在分批期，以充足的量提供所有营养需要。总之，分批期是(异源)蛋白产量仍低的同时，细胞扩增的期。
第二期是补料期，定义是碳源和其它需要以相对浓缩的液体流以预先计算的速度“补料速度”补充到发酵罐。在这个期重点是由生长细胞制备蛋白和导致生物量增加的细胞生长。补充到发酵罐的底物在这个期通常用于细胞生长和产物合成。细胞生长由补料速度控制，以获得最佳的细胞生长和异源蛋白制备。
最后到达第三期，定义是衰亡期，其中出现限制条件。在这个期，例如发酵罐中的氧气浓度降低到零，有些情况下导致乙醇形成。在这个期，多数细胞将集中于维持且通常产物合成减少。尽管在这个期仍可以观察到细胞生长，但是生长通常有限至零。在这个期细胞可能逐渐失去活力。
在包含普通碳源如基于葡萄糖或其它糖基的碳源的培养基上制备异源蛋白是令人满意的，直到补料期末开始存在限制条件。限制条件的实例包括生长培养基中氧气浓度降低，营养物如维生素、碳、氮减少，和有毒化合物的蓄积。
如果真菌，特别是酵母，在包含葡萄糖作为碳源的培养基中生长，限制条件一出现，异源蛋白产量就大大降低。
对于在包括糖作为碳源的普通培养基上生长的酵母，补料分批发酵中存在上述期。因此一旦衰亡期开始，比产量(其定义是每克生物量所产生的异源蛋白或肽量)维持或降低。尽管细胞密度很高，在衰亡期产物合成因此降低。通常含葡萄糖作为碳源的普通培养基的另一个缺点是转变为生物量而不是转变为产物的底物量高，该产物通常是本发明上下文中的异源蛋白。因此在这个系统中，生物量相对高不可避免地伴随高水平异源蛋白的产生。这个高生物量导致粘性发酵培养基，例如容易产生氧气限制。
因此，期望在宿主如真菌中制备异源蛋白的方法，如甚至在限制条件下可得到高异源的蛋白产量，其中会存在正常衰亡和比产量降低，然而同时生长系统的比产量维持或与已知生长系统相比增加。
本发明的方法克服了至少一个指出的问题。
发明概述已经惊奇地发现在含乙醇作为主要碳源和诱导剂如半乳糖控制异源蛋白产生的培养基上生长的真菌显示出异源蛋白比产量高，甚至在限制条件下异源蛋白的比产量也惊人地高。
令人惊奇地，根据这个方法生长的真菌不显示传统葡萄糖基培养基上生长的真菌所遭遇的熟知衰减特性。连续补充含这个特殊碳源的培养基下，真菌维持或甚至增加异源蛋白的绝对和比产量水平。
因此，本发明涉及由真菌制备异源蛋白的方法，该所述真菌在包含在含碳源的培养基上生长，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，其中培养基另外包含诱导剂。
发明详述在本发明上下文中，术语真菌包括酵母和霉菌。
为了本发明的目的，术语异源蛋白是指包括蛋白和肽。
异源蛋白是不是真菌天然产生，但是仅在真菌修饰到这个程度而产生的蛋白。
除非另有说明，指出的重量百分比是基于总产物或总培养基重量的重量百分比。
使用术语氧气浓度的地方，实施例中阐明的方法测定的溶解氧气浓度作为参照。
分批期末定义是提供给细胞的所有碳底物已经耗尽的时刻。
诱导期定义是在分批期后开始的期，从异源蛋白诱导开始的时刻，直到所用特定诱导剂浓度获得最大诱导的时刻。
碳源定义是给细胞提供碳和能量供应的底物。真菌主要从有机化合物得到它们的细胞碳源。这些通常用作碳源和能源它们部分被同化为细胞材料，部分被氧化提供能量。在本文中，H.Schlegel在General microbiology，剑桥大学出版社，1992，第7版，194页作为参考。
本发明涉及由真菌制备异源蛋白的方法。为了制备蛋白，真菌被遗传学修饰，使得可能进行这种异源蛋白或肽的控制生产。
任何合适的构建体或转化方法可用于这个遗传修饰。EP-A-481,008给出了合适的构建体和转化方法实例，该专利引入作为参考。
通常，被修饰的真菌将在修饰后含有启动子控制下的包括编码异源蛋白的基因的(整合)载体。启动子的活性由所谓的诱导剂调节。启动子的实例包括半乳糖启动子，如半乳糖诱导的GAL4，GAL7；甲醇诱导启动子，由甲醇诱导；乙醇启动子，由乙醇诱导；温度调节启动子，由温度改变诱导；磷酸盐调节启动子，由磷酸盐的存在诱导；和葡萄糖可抑制启动子，由葡萄糖的存在诱导。
真菌在含碳源(50至100wt％是乙醇)的培养基中生长，同时培养基中存在诱导剂。
在本领域中，乙醇用作碳源通常认为是不好的，下面引用的公开物可以例证。总之，据报道乙醇代替葡萄糖用作碳源可降低生物量产量，需要更高氧气消耗并因此在氧气有限条件下不提供或提供有限生长。而且，菌株的乙醇毒性可导致活力受损和细胞死亡。这在如Theyeasts，第3卷，第2版，第6章的表1中公开。这个公开物的附录1作为具体的参考，它公开了乙醇和葡萄糖上酵母的生长速度是0.1h-1∶0.35h-1。这个附录还公开了在乙醇作为碳底物的培养基上，酵母显示出比在含葡萄糖作为碳底物的培养基上更高的氧气消耗。
Shiba等(J.of bioscience and bioengineering，89卷，426-430页，2000)进一步描述了乙醇作为碳源的细胞的生长。Shiba公开了用GAL10启动子在啤酒糖酵母ga180突变体中进行羧肽酶Y(CPY)的表达。生长培养基包含乙醇作为唯一碳源。在乙醇补料开始时，报道生长速度和CPY产量都降低。这个系统不在诱导剂的控制下。
本发明提供了一种方法，其中在含50至100wt％是乙醇的碳源的培养基存在下，特别是当限制生长条件出现时，蛋白产量维持或甚至增加。此外，根据本发明的方法适用于任何类型的真菌，生长不需要特殊的ga180突变体。通过诱导可以很好控制本发明的方法。
Saliola，M等(applied and environmental microbiology，1999年1月，53-60页)公开了使用乙醇诱导型KIADH4启动子在Kluyveromyces lactis中表达异源基因。这个文件教导了在补料分批系统中，当乙醇用作启动子且同时作为唯一碳源时，表达最佳。这个生产系统不能够控制补料期的基因表达。
根据本发明的方法的另外益处是控制热产量，它对于热不稳定蛋白的制备很重要。
优选含碳源的50至100wt％是乙醇的培养基，培养基中同时存在诱导剂，贯穿所有相中，但是发现在分批期使用不满足这些需要的培养基是可能的，只要补料期培养基满足需要。
在优选的实施方案中，本发明涉及由真菌制备异源蛋白的方法，该方法包括分批期和补料期，且其中补料期培养基包含50至100wt％是乙醇的碳源，和其中补料期培养基另外含有诱导剂。
与通常含有葡萄糖或其它糖作为主要碳源的已知生长系统相比，根据本发明的培养基能够得到高水平比产量，甚至在限制条件下；即，优选没有衰亡期。
甚至发现限制氧气条件下，比产量在补料期最高，而对于基于葡萄糖的生长系统来说，发现最高的比产量通常在补料期，生物量的量仍相对较低。
不期望受任何理论的限制，申请人相信在本发明的方法中，由于使用含50至100wt％是乙醇的碳源的培养基，衰亡期延迟或甚至不存在。
在制备异源蛋白的方法中，优选优化补料条件，使得细胞生长速度和异源蛋白产量最佳。如上指出，如果真菌以工业规模生长，非常优选使用发酵罐的补料分批系统。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及由真菌制备异源蛋白的方法，该方法包括分批期、诱导期和补料期，其中在所述补料期a)真菌细胞在含任何碳源的培养基上生长到至少5g/l的细胞密度，没有特殊优选，随后真菌细胞生长到5g/l以上的细胞密度，优选10至90g/l，更优选40至60g/l，使用含诱导剂和碳源的培养基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已经达到步骤a)的细胞密度后，产生限制生长条件，c)这些限制条件到来后，细胞进一步在含碳源的培养基上生长，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
在这个优选方法的第一步中，细胞在分批期生长直到碳底物已耗尽，在第二步中，细胞生长到足够的细胞密度使得能够高量制备异源蛋白。在这个第二期的第一个阶段，向补料培养基中添加诱导剂诱导异源蛋白的产生。从零诱导，和由此很低水平异源蛋白产生，直到最佳诱导所花费的时间称作诱导期。这个诱导期组成补料期的第一个阶段。
发酵罐中的限制条件可以用几种方法获得。限制条件定义是不再可能进行指数细胞生长和细胞生长降低的那些条件。
本发明的方法中，优选培养基中的限制条件是由选自下组的方法产生的，包括a)发酵罐培养基中氧气浓度降低，优选低于30％，更优选低于15％，b)给含乙醇的培养基过量补料，直到培养基中乙醇水平达到或超过培养基中生长的菌株细胞的生长限制浓度c)降低细胞生长的其它必要成分的水平，所述成分优选选自氮、磷、硫和维生素优选在分批期后，补料方案随生物量产量呈指数增长。当出现氧气限制和进入衰亡期，优选补料速度设置为维持发酵罐培养基中乙醇浓度低于10vol％的速度。这可例如通过线性补料速度或脉冲补料速度或分步补料速度来达到。
在甚至更优选的实施方案中，以重复补料分批方法来实施本发明的方法。
优选诱导剂适合启动与用于转化宿主真菌的基因构建体中的异源基因可操作连接的启动子。优选诱导剂是半乳糖、甲醇、温度和磷酸盐。
最优选的诱导剂是半乳糖。
本发明不涉及乙醇用作诱导剂和(部分)碳源的表达方法。
当半乳糖是诱导剂时，优选培养基中半乳糖的量应该使得在其量很低的时候，启动子启动到期望水平，和半乳糖不分解代谢。为了防止这点，可能使用不能分解代谢诱导剂的菌株。
优选补料培养基的组合是使得发酵罐的培养基包含0.1-10wt％半乳糖，更优选0.05-1wt％，甚至更优选0.05-0.2wt％半乳糖。
根据本发明培养基中的碳源包含至少50wt％和至高100wt％乙醇。优选碳源包含80至100wt％乙醇。剩余碳源可以是例如糖如葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、果糖或其它化合物如甘油、醋酸盐，或复合碳底物如乳清和糖蜜。
真菌可以是酵母或霉菌。合适的酵母属实例包括糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属。合适的霉菌实例包括曲霉属、根霉属、木霉属。
特别优选的生物体是啤酒糖酵母。
异源蛋白可以是期望制备的任何蛋白或肽。发现根据本发明的方法特别适合抗冻肽、抗体或其片段，或酶如角质酶(cutinase)和半乳糖苷酶的制备。抗冻肽是具有改善冰雪下生长能力的蛋白，例如biotechnology advances，13卷，3期，375-402页，1995年，Griffith等所述，其引入本专利作为参考。
真菌生长的各个期的培养基通常包含碳源，含有或不含有诱导剂，分批期后需要其存在，和含有或不含有另外成分如维生素、酵母提取物、微量金属离子、酸化剂使pH保持在期望水平、磷酸盐、硫酸盐水和止泡剂。
根据另一个优选实施方案，本发明涉及制备异源蛋白或肽的方法，其中分批培养基含有1-40wt％葡萄糖、水、微量金属、根据需要存在的止泡剂、酵母提取物、维生素、磷酸盐和硫酸盐和其中培养基中含有5-35体积％乙醇、0.1-10wt％半乳糖、水、微量金属、和根据需要存在的止泡剂、酵母提取物、维生素、磷酸盐和硫酸盐和其中10升规模中，“补料速度”“”是0.25-4g/分，或较大规模发酵的相应值。
本发明进一步涉及根据本发明方法获得的异源蛋白分离物，特别是抗冻肽分离物。
现在将以下列非限制性实施例阐明本发明。实施例培养基和培养所有培养基和培养数据基于10升规模乙醇发酵。
对于10m3规模，根据比例因子1000粗略相同调整。培养基预先培养培养基
分批和补料培养基在表1中列出，对于10升规模表1
*乙醇纯度，96.2％v/v含量，不饱和所有培养基在121℃/1.2巴(Linden高压锅)灭菌25分钟，糖单独灭菌。自来水量在下面描述，总量是使得总重量如表1底行指出。Egli维生素和微量金属组成表2
维生素用0.22μm滤器灭菌菌株使用的菌株是啤酒糖酵母CEN.PK102-3A。基础CRN.PK2啤酒糖酵母菌株是从EUROSCARF，Institute for Microbiology，JohannWolfgang Goethe-University Frankfurt，Marie-Curie-Strasse 9；Building N250，D-60439 Frankfurt，德国商购得到的。
这个啤酒糖酵母菌株不能分解代谢半乳糖，因为来自啤酒糖酵母URA3基因的序列的插入已经打断GAL1基因。用含下列元件的表达载体转化宿主菌株启动子GAL7启动子，引导GAPDH。GAL7启动子总是存在两个上游活化序列。它们是作为连接的序列的一部分的2个天然元件。
选择性标记Leu2d信号序列转化酶(SUC2)整合靶具有为酵母染色体XII特定区域靶向整合的独特的限制性酶切位点的rDNA重复片段。
异源基因实施例1编码海洋鳕(ocean pout)HPLC12抗冻蛋白的抗冻蛋白基因(WO-A-9702343)实施例2K 609B，小猪中抗毒力因子的抗体。
实施例3蛋白VHH G，它是HGL11，是重链免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公开的抗人胃脂肪酶的脂肪酶抑制剂。
实施例4蛋白VHHP，它是HPL18，是重链免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公开的抗人胰腺脂肪酶的脂肪酶抑制剂。
实施例2-4的蛋白是根据EP-A-1,134,231公开的美洲驼免疫步骤得到的抗体。培养菌株保存菌株保存在-80℃，用脱脂牛奶和20％甘油的混合物1∶1稀释的YNB生长培养物的单批中。接种50ml YNB接种1ml保存的菌株，在30℃，以150rpm培养48小时+2小时。
随后接种物转移到500ml 2％YPD，随后在30℃，以150rpm培养24小时+2小时。发酵罐在标准发酵罐中进行发酵，所述发酵罐具有十升的工作体积。对于温度控制，发酵罐装配冷却线圈和加热指针。挡板是标准尺寸。带有六个叶片的Rushton型叶轮用于搅拌。用Inglod DO2-电极(Mettler-Toledo)测定溶解的氧气(DO2)，Inglod Impro 3000凝胶电极(Mettler-Toledo)测定pH。质谱分光光度计Prima 600(VG气体分析系统)用于测定废气。整个发酵过程是自动的和软件控制的，但是也可以在下面提供的指导基础上手工操作。
利用补料分布控制发酵。用3M磷酸(Baker)和12.5％v/v氨(Merck)控制pH。用叶轮速度的自动调节将DO2控制在30％，直到产生最大搅拌速度(1000rpm)。
发酵过程中，用自动取样器取出5ml样品并冷却在4℃，进行干重测定和产物浓度分析。分批期为启动分批期，500ml YPD接种物加入到5.5L分批培养基中。发酵参数根据表3.1，当废气中乙醇含量降低到300ppm时，开始指数补料。补料期补料培养基分装到同一泵连接的两个补料瓶中。
一个补料瓶含乙醇和自来水至2升，通过底板补料到发酵罐中。第二个补料瓶含所有其它补料成分和水至2升，通过顶板补料。根据等式1给与一个泵连接的两个瓶施加相同指数补料速度。对于两个瓶，所得补料速度是泵速度的两倍。Φv,t=μ*X0*eμ*tρfeed*Yx,s*60]]>[g/分](等式1)Φv，t＝补料速度g/分μ＝生长速度 h-1X0＝补料开始时的生物量g(Mw＝24.6g/mol)t＝从补料开始起的时间 分ρfeed＝补料密度 g乙醇/g补料Yx，s＝生物量的估计产量 g×/g底物60＝时间因子 分/小时补料参数根据表3。
表310升乙醇发酵的发酵补料参数
当氧气浓度是0％时，限制条件到来，泵速度设置到线性补料速度。这个补料连续直到所有补料耗尽。结果
基于这些结果，结论是补料期限制条件出现后AFP的产量，继续用含100wt％是乙醇的碳源的培养基进行补料，导致AFP的比产量惊人地高。
观察到生物量产量是恒定的，没有绝对AFP生产率的损失。对比实施例补料期的生长培养基不含有乙醇而是100wt％葡萄糖作为碳源。这个实验的培养基在上面描述。发酵罐补料条件也在上面说明，除了下列例外补料培养基从一个补料瓶应用于发酵罐，该补料瓶含有所有成分并通过底板补料到发酵罐。根据等式1实施指数补料速度。
补料参数根据表3，除了X0值设置为2.11mol，使得一个补料瓶的补料速度与一个泵上两个补料瓶的乙醇发酵相同。结果如下
结论是当生长培养基仅含葡萄糖作为碳底物时，AFP产量从限制条件到来的时刻降低。AFP产量不再增加且产量下降。结果-实施例2
*比产量mg异源蛋白/g干燥物质结论是使用乙醇作为碳源的异源蛋白的比产量大大高于葡萄糖作为碳源的产量。结果-实施例3
*比产量mg异源蛋白/g干燥物质结论是使用乙醇作为碳源的异源蛋白比产量大大高于葡萄糖作为碳源的产量。
结果-实施例4
*比产量mg异源蛋白/g干燥物质结论是使用乙醇作为碳源的异源蛋白比产量大大高于葡萄糖作为碳源的产量。
权利要求
1.由真菌制备异源蛋白的方法，包括所述真菌在含碳源的培养基上生长，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，和其中培养基另外含有诱导剂。
2.权利要求1的方法，它包括分批期和补料期，其中补料期培养基包含50-100wt％是乙醇的碳源和其中补料期培养基另外含有诱导剂。
3.权利要求2的方法，其中补料期培养基包含50-100wt％是乙醇的碳源和另外含半乳糖作为诱导剂。
4.权利要求2或3的方法，其中该方法在发酵罐中实施，培养基以使得发酵罐中乙醇浓度维持在低于10vol％的补料速度进行补料。
5.权利要求1-4任一项的方法，该方法包括分批期，诱导期和补料期，其中在所述补料期a)真菌细胞在含任何碳源的培养基上生长到至少5g/l的细胞密度，没有特殊优选，随后真菌细胞生长到5g/l以上的细胞密度，优选10至90g/l，更优选40至60g/l，使用含诱导剂和碳源的培养基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已经达到步骤a)的细胞密度后，产生限制生长条件，c)这些限制条件到来后，细胞进一步在含碳源的培养基上生长，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
6.前面任何一项权利要求的方法，其中该方法以重复补料分批方法实施。
7.前面任何一项权利要求的方法，其中诱导剂选自包括半乳糖、甲醇、温度和磷酸盐的组。
8.权利要求2-7任一项的方法，其中补料培养基包含0.1-10wt％的半乳糖。
9.前面任何一项权利要求的方法，其中碳源含80-100wt％的乙醇。
10.前面任何一项权利要求的方法，其中真菌是酵母，优选啤酒糖酵母。
11.前面任何一项权利要求的方法，其中异源蛋白或肽选自抗冻肽、抗体或其片段，和酶。
12.权利要求5的方法，其中分批培养基含1-40wt％葡萄糖、水、微量金属、止泡剂存在或不存在下、酵母提取物、维生素、磷酸盐和硫酸盐，和其中补料培养基含5-35vol％乙醇、0.1-10wt％葡萄糖、水、微量金属、和止泡剂存在或不存在下、酵母提取物、维生素、磷酸盐和硫酸盐和其中10升规模中的“补料速度”“”是0.25-4g/分。
13.异源蛋白，可根据权利要求1-12任一项的方法获得。
全文摘要
当补料培养基含50－100wt％乙醇碳源和诱导剂时，由真菌细胞制备异源蛋白是好的。
文档编号C12N9/00GK1481439SQ01820537
公开日2004年3月10日 申请日期2001年11月16日 优先权日2000年12月13日
发明者A·M·J·范德拉尔, N·M·林德纳, P·纽夫波尔特, A M J 范德拉尔, 林德纳, 虿ǘ 申请人:荷兰联合利华有限公司