专利名称：中国人胸腺素α原及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及中国人胸腺素α原编码基因。
在T淋巴细胞分化成熟的过程中，胸腺上皮细胞分泌的多种肽类激素起着重要作用。Goldstein最先从胸腺素组分中分离到胸腺素α1(thymosinα)，它是一个含有28个氨基酸残基的多肽，胸腺素α1具有调节免疫功能的作用，目前临床上用于治疗病毒性肝炎，疗效较好。人工合成及大肠杆菌表达的胸腺素α1具有相同的生物学活性。
Haritos等在液氮中直接匀浆新鲜大鼠胸腺，分离蛋白时，未分离得到胸腺素α1，而得到了分子量约为12Kda的新组分。序列分析表明，它含有111个氨基酸残基，其N-末端的前28个氨基酸残基为胸腺素α1序列，故称该组分为胸腺素α原(prothymosin，缩写为Pro Tα)。
人的Pro Tα基因位于第2号染色体上，由5个外显子和4个内含子组成。人胸腺素α原与大鼠胸腺素α原不同，为109个氨基酸残基的多肽；其cDNA的起始密码子ATG后面紧接着的是胸腺素α原的成熟肽，即胸腺素α 1的序列，胸腺素α原cDNA上游和下游均无疏水氨基酸密集区域，显示其无信号肽。同时，胸腺素α原也无N-糖基化位点。在胸腺素α原氨基酸残基中，酸性的谷氨酸聚集成簇，约占整个氨基酸残基的32％；而胸腺素α原的C-末端有很多核蛋白共有Lys-Lys-Gln-Lys片段，所述片段可能为核定位信号；提示胸腺素α原可能作为核蛋白，在核内发挥生理作用。Manrow等的工作为此提供了依据，他们将人胸腺素α原基因与β一半乳糖苷酶基因融合，不论β一半乳糖在N端还是C末端，转染真核细胞后，该融合蛋白皆出现于细胞核内，而单独的β一半乳糖苷酶则仅分布于胞浆内，与胸腺素α原融合后方显示该特性。
因此，本发明的目的是提供一种中国人的胸腺素α原及其制备方法；即通过用植物血球凝聚素(PHA)和重组人白细胞介素1(IL-1)联合刺激胎儿胸腺细胞，从中提取总RNA，经反转录PCR获得了人胸腺素α原cDNA；将其克隆到pUC19中，经序列分析表明，与已报道的序列相比较，在N-端第38位的碱基C变为T。然后将所得的cDNA克隆到原核表达载体pBV220，转化大肠杆菌，从而得到大肠杆菌中以可溶形式表达的胸腺素α原，这个胸腺素α原与文献报道的肽链相比，在第13位的氨基酸残基不同，由苏氨酸变为异亮氨酸。经活性测定表明，它可明显刺激人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结的形成率。动物实验显示，本发明人制备的胸腺素α原可提高老年小鼠血浆IgG水平，明显增加老年小鼠已萎缩的胸腺和脾脏的重量，提高胸腺细胞CD8和脾脏细胞CD4的比例，显著提高特异性抗体溶血素的产生；并且胸腺素α原还可刺激甲状腺激素产生的作用。这些结果表明，胸腺素α原可以进一步开发成为免疫功能调节的药物。
本发明涉及的中国人胸腺素α原cDNA序列如下5’cggaattc atg tct gat gca gct gta gat acc agc tcc gaa atc accacc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat ggaaga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gag cag gaggct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gaggag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaagct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gatgtc gat acc aag aag cag aag gcc gac gag gat gac taa ggatcccg3’本发明涉及制备人胸腺素α原的方法，包括(a)合成富含A，T的引物；引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’(b)用(a)中合成的引物为模板合成胸腺素α原cDNA.；(c)将(b)得到的cDNA.克隆到表达载体中；(d)用所述的表达载体转化原核细胞；(e)培养所述的转化原核细胞，将所述细胞破碎后，从上清液中回收所表达的胸腺素α原。
其中所述的表达载体选自pBV220，pET32a。
其中所述的原核细胞为大肠杆菌。
其中所述的大肠杆菌选自大肠杆菌DH5a，JM101。
中国人胸腺素α原有调节免疫功能的作用。
图1表示检测胸腺总RNA的RT-PCR产物。APGEM7ZF(+)-Hae IIIMark，BRT-PCR产物。
图2表示重组质粒pUC19的限制酶裂解分析。A胸腺素α原cDNA对照B、C、D阳性克隆菌株。
图3表示中国人的胸腺素α原的cDNA序列。
图4表示胸腺素α原表达的结果A对照菌，B、C、D不同培养基中胸腺α原的表达结果。
1.2培养基LB培养基和高浓度培养基配方见参考文献8。玉米浆培养基为10.4％玉米浆和0.5％的水解酪蛋白，调PH至7.0。
1.3酶制剂及其他试剂限制性内切酶EcorI，BamhI及T4DNA连接酶均购自Promega公司，总RNA提取及反转录等试剂也购自Promega公司，ITPG为中科院生态环境研究中心产品，植物血球凝集素IL-2等皆为标准试剂。
1.4引物合成本发明人设计出胸腺素α原的适合引物，从而使以所述引物合成的cDNA在原核生物细菌，特别是大肠杆菌中表达，能够使胸腺素α原的表达产率大大提高。本发明人发现，增加上游引物中的A，T含量，就可以明显地提高胸腺素α原的表达。
引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’其中引物I为上游引物，引物II为下游引物，所述引物用美国ABI公司的391EPDNA合成仪合成。
1.5人胎儿胸腺细胞的培养取四月龄胎儿胸腺，制备成单个细胞，悬浮于RPMI1640培养液中，细胞密度为1×107/ml，在20ug/ml的PHA和500U/ml的IL-2联合刺激下，于37℃，5％CO2下培养24小时。
1.6胸腺细胞总RNA的提取和反转录PCR取刺激培养的胸腺细胞，按Promega公司的总RNA试剂盒方法提取细胞的总RNA，最后，溶于灭菌的去离子水中，取一定量的RNA，加下游引物和dNTP，在42℃下，反转录酶作用30分钟，将胸腺素α原mRNA反转录成单链cDNA，进一步加入上游引物及TaqDNA聚合酶后，进行如下步骤先在94℃变性2分钟，50℃退火1分钟，71℃延伸1分钟，再在94℃1分钟，50℃1分钟，和72℃1分钟进行30个循环，最后于72℃延伸7分钟。
1.7按Sambrook等人(分子克隆实验室指南，第二版，1992，科学出版社，金冬雁等)的方法进行DNA重组及其鉴定。按Sanger双脱氧末端终止法进行序列分析。
1.8玫瑰花结实验用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单核细胞，用Hanks液配成2×106/ml，实验管加一定量的胸腺素α原表达上清液，对照则加相同对照菌上清液于30℃水浴90分钟，加0.5％的绵羊红细胞后，涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合4个及以上绵羊红细胞)，计算玫瑰花形成细胞的百分数，可用公式求得表达上清液的激活率。 1.9重组人胸腺素α原对老龄小鼠免疫功能的影响选用15月龄的25只雌性昆明种小鼠作为衰老模型。小鼠群养，自由摄食、摄水。随机分为对照组和实验组，实验组每日腹腔注射腺素α原300ng/只，对照组每日腹腔注射生理盐水，实验期为三周。处死前四天，腹腔注射绵羊红细胞0.4ml/只(约含红细胞20亿)，观察特异性抗体溶血素产生情况；处死后取血、胸腺和脾脏。
血浆IgG水平的测定用免疫单扩散定量法。
溶血素测定采用微量法。血浆稀释500倍，加0.2％的羊红细胞和10％的豚鼠血清，高铁血红素法测定上清中血红素含量，以反映机体产生特异性抗体的能力。按下列公式计算每只小鼠样品半数溶血值HC50. 血浆甲状腺激素水平测定采用放免法。
胸腺和脾脏指数是指小鼠每10g体重所具有的胸腺和脾脏mg数。
2.结果与讨论2.1胸腺素α原cDNA的筛选体外培养人胚胎胸腺细胞，经PHA和IL-2联合刺激，提取的总RNA经反转录后进行30个循环的PCR，琼脂糖凝胶电泳可观察到有一条明显的DNA带，其分子量与胸腺素α原cDNA的大小相符，结果示于图1。
2.2胸腺素α原cDNA的克隆，筛选及序列测定常规低熔点琼脂糖回收法，经RT-PCR得到的特异带，用EcoRI和BamH I双酶切处理，在T4DNA连接酶的作用下，克隆入经相同消化的Puc19中，转化常规CaC12处理的JM101感受态细胞。经IPTG诱导，在含X-gal的琼脂平板上挑选白色菌落，用EcoR I和BamH I双酶切鉴定，可见一特异带被所述酶切出来，其分子量与胸腺素α原RT-PCR产物一致，结果见于图2。
挑出阳性转化子，用Promega公司的质粒纯化系统提取质粒，用GibcoBLRL公司的双链测序系统测序，测得的胸腺素α原cDNA序列与文献报道的一致。
2.3胸腺素α原cDNA在大肠杆菌中的表达将获得的胸腺素α原cDNA克隆入表达载体pBV220，然后转化DH5a。于30℃培养4小时后，42℃热诱导4小时，胸腺素α原的表达量约占细菌总蛋白的15～20％左右(图4)。
2.4表达产物初步活性的测定将克隆有胸腺素α原的cDHA菌大量培养，超声破碎，将上清液和沉淀物分别进行SDS-PAGE电泳，结果胸腺素α原蛋白带出现于上清液中，即它以可溶形式表达，不形成包涵体。将表达上清液加入外周血单个核细胞悬液中，与绵羊红细胞一起温育，结果示于表1。由表1可见，胸腺素α原可明显提高淋巴细胞玫瑰花结形成率，说明大肠杆菌表达的胸腺素α原具有生物活性。由于它以可溶形式表达，因而不需要复性，只需从细菌蛋白中进一步纯化出胸腺素α原，即可用于免疫学活性的测定及临床应用。
表1. 胸腺素α原对T细胞E-致瑰花结形成率的影响组别 E-致瑰花结形成率活化率对照 45 0pBV220DH5a55.1 22.4ProTα-EXPrestione70.3 56.2
2.5胸腺素α原调节免疫功能的实验结果2.5.1胸腺素α原对衰老小鼠胸腺、脾脏重量和指数的影响胸腺素α原对衰老小鼠胸腺和脾脏重量和指数的影响结果见表2。
表2.胸腺素α原对衰老小鼠胸腺脾脏重量和指数的影响组别n 胸腺(mg)胸腺指数 脾脏(mg)脾脏指数对照组 10 26.6±3.7 6.7±0.9 185.7±21.5 44.8±3.9ProTα 15 48.6±3.5*11.2±0.7*218.9±15.5*49.3±2.8**与对照结果相比较p＜005从表2可知，胸腺素α原可明显提高已萎缩的胸腺和脾脏的重量，并且胸腺和脾脏指数的变化趋势与重量是一致的。
2.5.2胸腺素α原对衰老小鼠血浆IgG的影响胸腺素α原可提高衰老小鼠血浆IgG的水平，但这种影响无统计学的显著性，见表3。
2.5.3胸腺素α原对衰老鼠血浆溶血水平的影响溶血素为B淋巴细胞接受抗原刺激而产生的特异性抗体。衰老过程中特异性抗体的产生减少，实验结果显示重组胸腺素α原可明显提高血浆溶血素水平，说明胸腺素α原还也可调节老龄机体T细胞依赖的体液免疫功能。见表4。
表3.胸腺素α原对衰老小鼠血浆IgG的影响组别n IgG(g/L)对照105.93±3.29ProTα 106.47±2.51
表4.胸腺素α原对衰老鼠血浆溶血素水平的影响组别n溶血素(DC50)对照10142.5±6.0ProTα 15 204.0±17.6**与对照组结果相比较p＜0012.5.4胸腺素α原对衰老鼠血浆甲状腺素水平的影响机体的内分泌功能影响免疫功能，同时免疫功能也可能影响内分泌功能。机体存在神经内分泌免疫网络，它在维持机体内环境的稳定，调节机体的功能状态方面起重要作用。胸腺组织上存在甲状腺激素和生长激素的受体，表明它们可能具有调节胸腺细胞的作用。胸腺素α原对甲状腺素和促甲状腺激素TSH等的影响尚未见报道，本发明人测定了衰老小鼠甲状腺激素的水平，以了解胸腺素α原对它们的影响，同时也测定了血清中腺垂体分泌的促甲状腺激素TSH的变化，结果见表5。
表5.胸腺素α原对衰老鼠血浆甲状腺素和促甲状腺激素TSH水平的影响组别n T4(ng/ml) T3(ng/ml) TSH(UIU/ml)对照1020.89±3.98 0.74±0.08 0.64±0.04ProTα 1036.90±2.85*0.90±0.07*0.47±0.05**与对照组结果相比较p＜0.01从表5可知，胸腺素α原可明显提高血浆甲状腺素T4和T3的水平。补充胸腺素α原可使血清中TSH的水平明显降低，这可能与较高水平的T3、T4反馈性抑制腺垂体分泌TSH有关。
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9.Goodall GJ，Dominguez F.Horecker BL. Proc Natl Acad Sci USA.1986，838926～8928.
权利要求
1.一种中国人的胸腺素α原编码基因，其特征是cDNA序列如下5’cggaattc atg tct gat gca gct gta gat acc agc tcc gaa atc accacc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat ggaaga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gag cag gaggct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gaggag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaagct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gatgtc gat acc aag aag cag aag gcc gac gag gat gac taa ggatcccg3’
2.一种制备胸腺素α原的方法，其特征包括(a)合成富含A，T的引物；引物I 5’CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG CTG TAG ATA CCA G 3’引物II5’CGG GAT CCT TAG GTC ATC CTC GTC GGT C 3’(b)用(a)中合成的引物为模板合成胸腺素α原cDNA；(c)将(b)得到的cDNA.克隆到表达载体中；(d)用所述的表达载体转化原核细胞；(e)培养所述的转化原核细胞，将所述细胞破碎后，从上清液中回收所表达的胸腺素α原。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是其中所述的表达载体选自pBV200，pET32a。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是其中所述的原核细胞为大肠杆菌。
5.根据权利要求2所述方法，其特征是其中所述的大肠杆菌选自大肠杆菌DH5a，JM101。
6.按照权利要求1～5制备的中国人胸腺素α原的方法，其特征是有调节免疫功能的作用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，中国人胸腺素α原通过用植物血球凝集素和重组人白细胞介素1联合刺激胎几胸腺细胞，从中提取总RNA，经反转录PCR获得人胸腺素α原cDNA。它可明显刺激人外周血淋巴细胞E－玫瑰花结的形成率，亦可显著提高老年小鼠血浆IgG水平，特异性抗体溶血素的产生，可进一步开发成为免疫功能调节的药物。
文档编号C12N15/16GK1436847SQ02100578
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者刘佃辛, 马清钧, 金宏, 王先远 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所