专利名称：四环素诱导的gus基因植物花药特异性表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，即将GUS基因置于经过改造的植物花药特异性表达的嵌合启动子TA29-Tx的控制之下，使其在受到四环素诱导后，在植物花药绒毡层中特异表达。利用该嵌合启动子可使目的基因在特定的时间及空间内表达，从而有利于我们研究其基因产物的作用。
TA29是来自烟草samsum-TA29基因的启动子1。该基因的表达是花药特异性的，其产物集中在花药绒毡层中，一般是在减数分裂后不久就出现，在小孢子有丝分裂之前含量达到最高，在开花期迅速下降。根据Koltunow等2的研究，TA29启动子的转录控制序列位于其转录起始位点上游的-279～-150bp之间。该段序列是保证TA29基因在花药绒毡层中高效表达所必需的。而-207～-191之间的序列和-165～-158之间的序列是决定TA29特异表达的两个关键序列。试验表明TA29启动子可以控制外源基因在植物花药中特异性的表达3.4。
Tx是由三个重复序列插入CaMV的35S启动子TATA框两侧形成，具体序列如下 其中 序列来源于大肠杆菌(E.coli)四环素抗性操纵子的启动子区。转座子Tn10编码的TetR(tet repressor)蛋白可以与上述操纵序列紧密结合，阻止转录起始复合物的形成，从而达到从转录水平抑制下游基因的表达。
该发明的意图是将TA29启动子和Tx/TetR系统的特性结合起来，从而创造一个新的系统，可以使目的基因既能够被四环素诱导表达，又仅仅局限在植物花药绒毡层表达。本发明的最终目的是通过构建可被四环素诱导的Barnase基因植物花药特异性表达载体，即TA29-Tx-Barnase，利用基因枪或农杆茵侵染的办法，使此载体整合到能组成型高水平表达TetR蛋白的植物基因组中，当用人为施加四环素诱导后，Barnase基因在植物花药中高效而特异性的表达，破坏花药绒毡层，导致花粉败育，获得植物雄性不育系，从而创造一种利用化学诱导获得植物雄性不育方法，为两系法育种中雄性不育系的获得提供了一条崭新的途径。
本发明主要包括以下几方面技术一.烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法，植物遗传转化技术手册，傅荣昭等1994)51.取0.5g新鲜烟草幼叶，加液氮研磨至干粉状，转入事先已放入500μl尿素缓冲液的离心管中(8M尿素，500mM Tris.Cl pH8.0，350mM NaCl，20mMEDTA，抽滤灭菌)。
2.摇动离心管，使植物材料于缓冲液充分混合，加入500μl的酚∶氯仿(1∶1)。充分混匀。
3.10000rpm离心5分钟，收集上清液，转移到一干净的离心管中，加入500μl的氯仿，重新抽提一遍。
4.转移上清到一干净的离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，静置沉淀10分钟。
5.15000rpm离心5分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤一遍，室温干燥10分钟。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测、定量。二·花药特异性基因TA29启动子的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)根据已发表的TA29启动子的全序列，我们选取了该基因5′区-826～-69之间的一段作为目标序列，该序列包含TA29花药特异性表达所必需的-279～-150bp序列。设计P1，P2序列为PCR引物，5’端引物P15’---AGGAATTCAGTAATACACTTTTTGGT---3’；3’端引物P25’---TACCCGGGCTTTTGTTGGAGCATTTC---3’。反应体系为50μl，其中包括模板DNA 2μl(0.1μg/μl)，P1 1μl(25pM)，P2 1μl(25pM)，10xBuffer 5μl，dNTPs 2μl(2.5mM)，ddH2O 38μl，Taq酶1μl。反应程序为94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分钟，30个循环；然后72℃延伸10分钟，终止反应。三.嵌合启动子的构建嵌合启动子由两部分组成TA29启动子，它能使其控制基因在花药绒毡层特异表达；Tx，可以与TetR蛋白紧密结合。当将Tx插入到TA29启动子TATA框适当位置，使得嵌合启动子既具有四环素诱导特性，又保持花药绒毡层特异表达特性。四.四环素诱导的GUS基因花药特异性表达裁体的构建我们以BinHygTx为载体，将TA29启动子和Tx序列串接到该载体的多克隆位点之间，然后在其后加上GUS基因，在GUS基因的下游连上Nos终止子。这样便完成了四环素诱导的GUS基因花药特异性表达裁体的构建。GUS基因的瞬间表达检测表明，此载体不仅受四环素诱导，而且是花药绒毡层特异表达的。该载体是一个双元载体，含有农杆菌T-DNA的左右边界，可以用农杆菌侵染方法导入植物。
图例说明在图例(1)中，TA29是以pGT89BN质粒为模板，根据陈潜等6的文章上的序列设计了引物P1，P2，通过PCR方法扩增得到，在其两端分别加上EcoRI和SmaI酶切位点。pGEM-T为一种大肠杆菌质粒载体，Amp为氨苄青霉素抗性，其上的酶切位点标明如图。
图例(2)中，载体pGEM-TA29由pGEM-T构建而来，其多克隆位点中插入了TA29启动子。质粒pUCA7-TX是德国Gottingen大学教授C.Gatz惠赠。
图例(3)中，载体pUCA7-TA29-TX由pUCA7-TX构建而来，TX序列恰好位于TA29启动子TATA box框处。
图例(4)中，载体pBI221和pGEM7Zf均为本实验室保存载体。
图例(5)中，载体pGEM-GUS是将pBI221上GUS基因切下，插入pGEM7Zf载体多克隆位点构建而成，目的是使GUS基因两端获得新的酶切位点。
图例(6)中，载体pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS分别为上述图例(3)和(5)，Bin-Hyg-TX是德国Gottingen大学教授C.Gatz惠赠。将TA29-TX片断和GUS基因分别从pUCA7-TA29-TX和pGEM-GUS上切下，置换掉Bin-Hyg-TX上35S-Tx片断，构建成载体Bin-Hyg-TA29-TX-GUS，即四环素诱导的GUS基因植物花药特异性表达载体。该载体既适合于农杆菌侵染转化，也适合于基因枪转化。
2.摇动离心管，使植物材料于缓冲液充分混合，加入500μl的酚∶氯仿(1∶1)。充分混匀。
3.10000rpm离心5分钟，收集上清液，转移到一干净的离心管中，加入500μl的氯仿，重新抽提一遍。
4.转移上清波到一干净的离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，静置沉淀10分钟。
5.15000rpm离心5分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤一遍，室温干燥10分钟。加入200μl ddH2O溶解。
6.取5μl，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测、定量。
取40ulPCR扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，将合适大小的条带切下，用DNA片段快速纯化/回收试剂盒(由北京鼎国生物技术发展中心生产)回收PCR扩增产物。将回收的PCR产物与载体pGEM-7Z按摩尔比1∶1的比例混合，加入Gibico公司生产的T4 Ligase于4℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
1.用EcoRI/SmaI双酶从质粒pGEMT-TA29上切下TA29片段，琼脂糖凝胶电泳、回收。
2.用EcoRI/EcoRV双酶处理质粒pUCA7-Tx，琼脂糖凝胶电泳并回收pUCA7-Tx载体。
3.将上述回收的TA29片断和pUCA7-Tx载体以3∶1的摩尔比混匀，加入T4 DNA连接酶，4℃连接过夜。
4.将连接产物转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，在含有70μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜。
5.挑取阳性克隆，提取质粒，通过限制性内切酶图谱分析，确认各个元件都处于正确连接，将该质粒命名为pUCA7-TA29-Tx。
6.将GUS片段(质粒pBI221经SacI酶切，T4 DNA聚合酶补平，再用BamHI酶切获得)插入经过BamHI/SmaI双酶处理的pGEM-7Z载体，获得重组质粒pGEM-7ZGUS。
7.将TA29-Tx片段(pUCA7-TA29-Tx质粒经过EcoRI/BamHI双酶处理后获得)和GUS片段(pGEM-7ZGUS质粒经过BamHI/XbaI双酶处理后获得)插入经过EcoRI/XbaI双酶切处理的BinHygTx载体中，这样就使得TA29-Tx-GUS片断处于T-DNA的LB和RB之间，可以用根癌农杆菌侵染的方法将此载体转入植物。将该质粒命名BinHyg-TA29-Tx-GUS。略图如下
微粒子弹的准备称60mg金粉于1ml 70％酒精中，充分涡旋，静置15min，1500rpm离心5min。去上清液，加1ml蒸馏水，充分涡旋，1500rpm离心5min，去上清液，重复三次。将金粉转入1ml50％甘油中，制成60mg/ml的金粉悬浮液。取50μl悬浮液，按顾序加入1μg/μl质粒DNA 5μl、2.5mol/L CaCl250μl和0.1mol/L亚精胺20μl，涡旋10min，1500rpm离心5sec，去上清液。250μl 100％乙醇洗一次，涡旋，1500rpm离心5min，去上清液，重复一次。最后，金粉悬浮于60μl 100％乙醇中。
取6μl包被DNA的金粉悬浮液，装备基因枪(PDS-1000型，美国BioRod公司制造)，每个培养皿轰击一次，子弹与烟草细胞之间的距离为6cm。轰击后，将培养皿于适宜条件下培养。整个轰击过程在无菌状态下进行。
与本发明相关的参考文献1.Seurinck，J.et al.，1990，Trends Biochem.Sci.14，450-4542.A.M.Koltunow，J.Truettner，R.B.Goldberg et al.(1990)Different Temporaland Spatial Gene Expression Patterns Occur During Anther Development.ThePlant Cell 2.1201-12243.Mariani，C.et al.，1990，Nature 347，737-7414.mariani，C.et al.，1992，Nature 357，384-3875.傅荣昭等，1994，植物遗传转化技术手册，中国科学技术出版社，北京6.陈潜，汪迎春，张利明等花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得农业生物技术学报，2001，9(1)62-6权利要求
1.一种质粒载体，含有受四环素诱导、花药特异性表达的嵌合启动子，β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因，终止子和筛选标记基因。其特征在于处于该嵌合启动子控制下的GUS基因，仅在受四环素诱导后才在植物花药绒毡层特异表达。
2.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于GUS基因的5’端组装了受四环素诱导、花药绒毡层特异性表达的嵌合启动子TA29-Tx，该嵌合启动子可以调节GUS基因在受到四环素诱导后在植物花药绒毡层中特异表达。
3.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于在GUS基因的3’端串联组装了增强表达能力的NOS终止子.
4.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于在该载体上组装了HPT-II基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用潮霉素筛选；作为转基因微生物的筛选标记，可以用卡那霉素筛选。
5.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征是在该载体上用核糖核酸酶基因(Barnase)置换GUS基因。受到四环素诱导后，Barnase基因在上述嵌合启动子控制下在花药绒毡层高效表达而获得植物雄性不育系。
全文摘要
将烟草花药特异性启动子T29与四环素诱导系统结合，构建成既受四环素诱导又是花药绒毡层特异表达的TA29－Tx/TetR系统。将barnase基因置于该系统控制下，施加四环素后，barnase基因在花药绒毡层特异表达，其产物是一种核糖核酸酶，能够是细胞致死，从而破坏了花药绒毡层，导致植物雄性不育，为农业上作物杂交育种雄性不育系的获得开辟了一条崭新的途径。
文档编号C12N15/56GK1446917SQ02103788
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者李文彬, 唐孙勇, 孙勇如, 张利明, 王义琴 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所