专利名称：新的甲型肝炎病毒毒株,制备甲肝灭活疫苗的方法及所得疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的甲型肝炎病毒毒株，利用其制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，以及由此方法制得的疫苗。本发明尤其是涉及一种利用Vero细胞制备甲型肝炎灭活疫苗的方法及由此方法制得的疫苗。本发明还涉及甲型肝炎病毒毒株的选育方法。
从70年代末，国内外相继开展甲肝疫苗的研制，欧美发达国家采用研制安全性可靠的灭活疫苗技术路线，但制造成本高昂；我国于1985年将甲肝减毒活疫苗研制列入国家“七五”攻关课题，至1992年获试生产批文，并投放市场。甲肝减毒活疫苗的广泛使用，为降低我国甲肝的发病率，控制暴发流行，起到了极其重要的作用。
然而甲肝减毒活疫苗存在着明显的缺点，最为突出的是毒力返祖和次传播问题，对接种者及其密切接触者构成潜在的安全隐患；其次对免疫功能低下或缺陷者高度危险；减毒活疫苗还存在热稳定性差、运输贮存条件要求苛刻等缺点。上述缺点在灭活疫苗中不复存在，且因灭活疫苗病毒蛋白纯度高，故免疫效果好，安全性高，这也是发达国家和地区迄今只使用甲肝灭活疫苗的重要原因。此外灭活疫苗是公认制备多价疫苗、联合疫苗的重要环节，而联合疫苗是世界卫生组织(WHO)与各国卫生当局所倡导的疫苗发展方向和策略。
现有的甲肝灭活疫苗(包括减毒疫苗)的甲肝病毒株所适应的细胞基质均为人二倍体细胞或人成纤维细胞，繁殖效率不高是其共同特点，而制备灭活疫苗需要大量纯化的病毒抗原，这是甲肝灭活苗制造成本高昂的根本原因。因此仍有必要开发能大规模产业化生产、节省时间、节省人力且降低成本的制备甲型肝炎灭活疫苗的方法及疫苗。
本发明的另一方面涉及一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法包括如下步骤(a)在培养液中静止或立体吸附培养细胞基质Vero细胞，使细胞浓度达到105-107/ml；(b)以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2将本发明的甲型肝炎病毒毒株YN5接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养14-21
天；(c)用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液；(d)纯化病毒制备疫苗。
本发明的再一方面涉及一种选育甲型肝炎病毒毒种的方法，其特征是包括下述步骤(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性检查确认为甲型肝炎病毒；(b)经如下方法进行病毒的细胞培养适应(b1)先在二倍体细胞上盲传适应5-6代，然后在Vero上培养适应35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；(b2)直接在Vero细胞适应培养，起初培养时间为35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；(c)选择经步骤(b)细胞培养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的毒种。
相比于现有技术，本发明采用甲型肝炎病毒YN5株与YN5-Vero细胞培养系统，可进行新型高效精制甲肝灭活疫苗(Vero细胞)的生产，并且，病毒产率高，是现有二倍体细胞甲肝病毒株产率的10倍以上，为大幅度降低生产成本，制备有效、廉价的甲肝灭活疫苗提供了保障。另外，本发明的疫苗为高纯度灭活疫苗，使甲肝灭活疫苗的安全性、有效性得以保证。
在本发明的制备甲型肝炎灭活疫苗的方法中，步骤(a)所述的细胞基质为Vero细胞，该细胞例如可购自ATCC，培养液为有血清培养液例如含10％血清的MEM培养液，培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为36.5-37.5℃。
步骤(b)的培养液为有血清培养液例如含2％血清的MEM培养液，培养温度为本领域技术人员所熟知，通常为34.5-35.5℃，培养过程中不出现细胞病变(CPE)。
步骤(d)的纯化病毒制备疫苗可采用本领域常规的方法，例如可采用如下方法进行首先，病毒-细胞培养悬液用超声波粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。然后用氯仿抽提细胞3-5次，每次振荡20-40min，然后3000rpm离心20-40min提取上清液，去除杂蛋白。接着用10％PEG(分子量6000)和0.4M的NaCl溶液浓缩，10000rpm离心50-70min收集沉淀。将收集的沉淀用PBS悬浮，经甘油蔗糖梯度(浓度范围从底层开始0.5ml 80％甘油(100mM NaCl，100mM Tris pH7.4)；1.8ml30％蔗糖；1.8ml 20％蔗糖；1.8ml 10％蔗糖(含10％SDS))。37000rpm离心6hr。之后柱层析进一步去除残余DNA和杂蛋白。得到的病毒用甲醛灭活，测抗原滴度，稀释至每毫升终抗原滴度为1∶1600。每毫升加佐剂0.5-1.25mg氢氧化铝，由此制成甲型肝炎灭活疫苗。
以下以实施例更详细地描述本发明。实施例1甲型肝炎病毒毒株YN5的选育方法(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性检查确认为甲型肝炎病毒；(b)在二倍体细胞2BS(来源中国药品生物制品检定所)上盲传适应6代；(c)然后在Vero上培养适应40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14天。
其中，每次培养期满后，用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液，置-60℃至-80℃保存备用。接种前用超声波粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2进行接种。培养液为含有2％新生牛血清、0.20％水解乳蛋白的MEM营养液(用7％NaHCO3调pH至7.4)。
最终获得一株具有希望特性的所需甲型肝炎病毒毒株，命名为YN5，该毒株于2001年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOV200104。实施例2甲型肝炎灭活疫苗的制备自液氮容器内取出Vero细胞安瓿(来源中国药品生物制品检定所)，1000rpm离心10分钟，弃去原保存液，加入含有10％新生牛血清、0.20％水解乳蛋白的MEM营养液(用7％NaHCO3调pH至6.8)置37℃培养，待细胞长成单层后，用PBS洗涤，胰酶-EDTA消化，加入上述营养液，以1∶2分种率，每5天传代1次，直至获得批量生产需用的足够细胞。
将上述细胞培养于浓度达到106/ml时，在pH7.4的培养液中按0.05MOI的分种率加入实施例1获得的甲型肝炎病毒毒株YN5，静止吸附培养14天。其间换2次维持液。培养期满后，用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液。该病毒-细胞培养悬液经超声波处理而粉碎细胞，至细胞破碎率达95％以上。之后用氯仿抽提4次，每次振荡40min，然后3000rpm离心40min提取上清液，去除杂蛋白。所得上清10％PEG(分子量6000)和0.4M的NaCl溶液浓缩，10000rpm离心70min收集沉淀。将收集的沉淀用PBS悬浮，甘油蔗糖不同梯度离心(浓度范围从底层开始0.5ml 80％甘油(100mM NaCl，100mM Tris pH7.4)；1.8ml30％蔗糖；1.8ml 20％蔗糖；1.8ml 10％蔗糖(含10％SDS)。)37000rpm离心6hr。Sepharose-4FF凝胶过柱进一步去除残余DNA和杂蛋白。将纯化后的病毒用1∶4000甲醛灭活12天，分装成品为每毫升终抗原滴度为1∶1600。每毫升加佐剂1mg氢氧化铝，制成疫苗。
本发明的相关实验数据见以下列表。证明YN5毒株具有在Vero细胞上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝病毒毒株在人二倍体细胞增殖的10倍以上；动物试验已证明YN5株具有良好的免疫原性。
表1.YN5株不同代次增殖情况抗原滴度感染性滴度代次 (EIA)(1gCCID50/ml)4 1∶2 未做6 1∶8 4.23101∶128 6.5141∶640 7.33181∶2560 8.23201∶5120 8.50231∶5120 8.67表2.YN5株23代连续3次一步生长曲线 表3.YN5株23代连续3次增殖情况感染性滴度次数抗原滴度(1gCCID50/ml)11∶51208.3321∶5120≥8.531∶5120-10240 ≥8.5表4.YN5株甲肝毒株与其他已知毒株增殖效力比较毒株 YN5 TZ-84L8细胞基质Vero 2BSKMB17疫苗类型 灭活苗灭活苗 灭活苗增殖周期 14-21天28天 28天抗原滴度 ＞1∶50001∶256-512 1∶256-512
表5.YN5株甲肝灭活疫苗小白鼠效力试验结果剂量 阳转率 MIU试验组 阳转数(EU/ml) (％)1 320010/10 100％25002 160010/10 100％20003 800 8/1080％ 17504 400 3/1030％ 1250史克苗 144010/10 100％1750Al(OH)3对照 0 0/1000
权利要求
1.甲型肝炎病毒毒株，命名为YN5，该毒株保藏号为CCTCC NOV200104。
2.一种制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，该方法包括如下步骤(a)在培养液中静止或立体吸附培养细胞基质Vero细胞，使细胞浓度达到105-107/ml；(b)以感染剂量(M.O.I.)为0.01-0.2将权利要求1的甲型肝炎病毒毒株YN5接种到上述细胞浓度的细胞基质培养液中，培养14-21天；(c)用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液；(d)纯化病毒制备疫苗。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述的培养液为含有2-10％新生牛血清、0.20-0.30％水解乳蛋白的MEM营养液，该营养液pH为6.8-7.4。
4.根据权利要求2所述的方法制得的甲型肝炎灭活疫苗。
5.一种选育甲型肝炎病毒毒种的方法，其特征是包括下述步骤(a)从临床甲型肝炎病人粪便中分离得到病毒，经生物学特性检查确认为甲型肝炎病毒；(b)经如下方法进行病毒的细胞培养适应(b1)先在二倍体细胞上盲传适应5-6代，然后在Vero上培养适应35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；(b2)直接在Vero细胞适应培养，起初培养时间为35-40天，以后逐渐减少培养时间，直到增殖高峰在14-21天；(c)选择经步骤(b)细胞培养适应后的病毒测试后作为生产疫苗的毒种。
6.如权利要求5所述的方法，其中培养用培养基为含有2-10％新生牛血清、0.20-0.30％水解乳蛋白的MEM营养液，该培养液pH为6.8-7.4。
全文摘要
本发明涉及一种新的甲型肝炎病毒毒株YN5，利用其以Vero细胞制备甲型肝炎灭活疫苗的方法，以及由此方法制得的疫苗。本发明还涉及甲型肝炎病毒毒株的选育方法。
文档编号C12N7/04GK1443844SQ0210698
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月12日 优先权日2002年3月12日
发明者陈尔佳 申请人:云南沃森生物技术有限公司