专利名称：一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适于幼仓鼠肾细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基。
背景技术：
幼仓鼠肾(BHK)细胞是一种能无限传代的哺乳动物细胞系，已被广泛用于生产疫苗、诊断试剂以及医药等生物技术产品。
BHK细胞通常在有血清培养基中培养，但血清的添加存在诸多不利第一，血清非常昂贵，血清的费用占到培养基总费用的50％以上，致使生产成本大幅度提高；第二，批与批之间血清质量的差异，会影响细胞生长，最终影响产品质量；第三，血清易被支原体和外来试剂污染；第四，血清蛋白增加了下游培养产物分离、纯化的难度，这些缺点使得血清在细胞大规模培养中的使用受到限制，致使人们展开了无血清培养基的开发和应用研究。
近年来，无血清培养基的研究开发发展很快，已报道了多种能支持不同种类细胞生长的无血清培养，例如Casser et al.(In Vitro Cell.Devel.Biol.，88，21588 1985)开发了一种能支持CHO细胞生长的培养基。该培养基以DMEM/F12(1∶1)为基础，添加了转铁蛋白、胰岛素以及亚硒酸钠，这就是现被广泛采用的(基础培养基+ITS)无血清培养基基础配方。美国专利U.S.592107公开了一种无血清培养基，该培养基含有高水平氨基酸，且添加了不同生长因子和微量元素，能支持CHO细胞高密度悬浮培养。但这些培养基多限于杂交瘤细胞和CHO细胞培养，且一般蛋白含量仍较高，通常可达几十毫克至几克，致使下游产物分离纯化的难度和成本增加。而涉及适于幼仓鼠肾细胞长期培养的低蛋白无血清培养基未见报道。
发明内容
本发明公开一种适于幼仓鼠肾(BHK)细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基，该培养基具有蛋白含量低、易于分离纯化及适于工业化生产的特点。
本发明的构思替代血清的补充因子种类很多，通常包括一些人类所必需的生长因子、激素、脂质、结合蛋白和多种微量元素等。为了有效的替代血清，支持细胞的高密度生长，本发明在基础培养基DMEM的基础上，添加了以下成分(1)转铁蛋白一种结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子。
(2)胰岛素胰岛β细胞分泌的多肽激素，能促进细胞生长。
(3)维生素细胞的组成成分，是细胞生长所必需物质，细胞自身无法合成，须从外界摄取。
(4)微量元素如Cu，Fe，Zn，Se，Co，Mo，Sn，Si，V，Mn等，主要起细胞生理过程调节。
(5)β-巯基乙醇促进胱氨酸的吸收，可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的损害。
(6)脂质包括一些脂肪酸和类脂，能促进细胞生长。例如亚油酸、亚麻酸、油酸以及胆固醇等。
本发明的技术方案本发明所述的培养基为一种组合物，由基础培养基DMEM和以下添加物组成(添加剂量的单位如无特别说明均为mg/L)L-天冬氨酸 0-20L-谷氨酸 10-40L-天冬酰胺 20-50L-丝氨酸 0-10L-谷氨酰胺 0-200L-组氨酸 0-40L-丙氨酸 0-40L-精氨酸 50-150L-蛋氨酸 10-50L-色氨酸 0-50L-苯丙氨酸 10-60L-亮氨酸 20-60L-赖氨酸 40-100L-脯氨酸 10-30NH4VO30.02-0.1SnCl22H2O 1.00-2.00Ba(C2H3O2)20.01-0.05AgNO30.01-0.05AlCl36H2O 0.3-1.53CdSO48H2O 0.001-0.005CoCl26H2O 0.03-0.15(NH4)6MoO244H2O 0.01-0.05NiCl26H2O 0.1-0.5Na2SeO30.01-0.05KBr0-0.0002NaF0-0.005KI 0-0.0005Na2SiO30.01-0.05NaH2PO32H2O0-100FeSO47H2O 0.3-1.5CuSO45H2O 0.001-0.005ZnSO40.3-1.5HEPES 1000-2500胰岛素2-20转铁蛋白 2-20丙酮酸钠 0-150Primatone 1000-2500
类脂混合物* 0.1-0.5％(v/v)还原型谷胱甘肽0.3-1.5维生素C 3.5-13.5维生素B60-0.06维生素B120-0.68氯化胆碱 0-5肌醇 0-5生物素(Biotin)0-0.02烟酰胺0-2.02核黄素0-0.044硫胺素0-2.17次黄嘌呤 0-2硫辛酸0-0.1β-巯基乙醇 0-2.5*为GIBCO生产的化学成分确定脂质(附组成，mg/L)。
花生四稀酸2胆固醇220DL醋酸α-生育酚 70亚油酸10亚麻酸10豆蔻酸10油酸 10
棕榈稀酸 10棕榈酸 10Pluronic F-68 100000硬脂酸 10吐温80 2200以上所述所有物质均为市售商品。本发明所述的培养基采用常规的方法配制而成。本发明所述的培养基使用方法为常规方法。
图1为实施例1和对比例的试验结果图示。
其中●—采用无血清培养基的细胞密度1×105cells/mL▲—采用有血清培养基的细胞密度1×105cells/mL具体实施方法下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1按照下面的浓度配制无血清培养基(包括基础培养基DMEM成分，mg/L)然后在该培养基中接入BHK细胞(种子细胞为无血清培养细胞)，接种密度为1.4×105cells/mL，培养4天(96小时)后，细胞密度可达到1.4×106cells/mL。
第一部分氨基酸第一部分氨基酸L-胱氨酸二盐酸63L-天冬氨酸8L-谷氨酸 19L-天冬酰胺31甘氨酸30L-丝氨酸 44L-谷氨酰胺688L-组氨酸 63L-丙氨酸 12L-精氨酸 190L-蛋氨酸 48L-色氨酸 28L-苯丙氨酸86二水L-酪氨酸二钠 104L-亮氨酸 147L-异亮氨酸105L-赖氨酸 209L-脯氨酸 17L-苏氨酸 95L-缬氨酸 94第二部分微量元素CaCl2200Fe(NO3)3·9H2O 0.1KCl400NCl6400NaHCO33700NH4VO30.092SnCl22H2O 1.556Ba(C2H3O2)20.02AgNO30.02AlCl3·6H2O 0.993CdSO4·8H2O0.003CoCl2·6H2O 0.101MnSO4·H2O 97.67(NH4)6MoO24·4H2O 0.033NiCl2·6H2O 0.35Na2SeO30.01KBr0.0001NaF0.0042KI 0.0002Na2SiO30.01NaH2PO3·2H2O 193.00FeSO4·7H2O 0.834CuSO4·5H2O 0.0025ZnSO40.863第三部分维生素和其它成分HEPES 2000胰岛素 5转铁蛋白5酚红15D-葡萄糖4500丙酮酸钠193类脂混合物* 0.2％(v/v)Primatone 1250还原型谷胱甘肽 0.75β-巯基乙醇 2.5D-泛酸钙4维生素C 6.25维生素B64.06维生素B120.68氯化胆碱9肌醇12.2叶酸4.00
生物素(Biotin)0.02烟酰胺6.02核黄素0.44硫胺素6.17次黄嘌呤 2.00硫辛酸0.10对比例采用与实施例1相同的培养方法，所用的培养基为添加了5％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，细胞密度最大为1.2×106cells/mL。
由上述的实施例对比可发现，在本发明的无血清培养基中培养BHK细胞，细胞生长明显优于有血清的培养基，完全可替代血清用于BHK细胞培养。
权利要求
1.一种适于幼仓鼠肾细胞生长与维持的无血清培养基，其特征为所述的培养基为一种组合物，由基础培养基DMEM和以下添加物组成(添加剂量的单位如无特别说明均为mg/L)L-天冬氨酸 0-20L-谷氨酸10-40L-天冬酰胺 20-50L-丝氨酸0-10L-谷氨酰胺 0-200L-组氨酸0-40L-丙氨酸0-40L-精氨酸50-150L-蛋氨酸10-50L-色氨酸0-50L-苯丙氨酸 10-60L-亮氨酸20-60L-赖氨酸40-100L-脯氨酸10-30NH4VO30.02-0.1SnCl22H2O1.00-2.00Ba(C2H3O2)20.01-0.05AgNO30.01-0.05AlCl36H2O 0.3-1.53CdSO48H2O 0.001-0.005CoCl26H2O 0.03-0.15(NH4)6MoO244H2O 0.01-0.05NiCl26H2O 0.1-0.5Na2SeO30.01-0.05KBr 0-0.0002NaF 0-0.005KI0-0.0005Na2SiO30.01-0.05NaH2PO32H2O0-100FeSO47H2O 0.3-1.5CuSO45H2O 0.001-0.005ZnSO40.3-1.5HEPES 1000-2500胰岛素 2-20转铁蛋白 2-20丙酮酸钠 0-150Primatone 1000-2500类脂混合物*0.1-0.5％(v/v)还原型谷胱甘肽 0.3-1.5维生素C 3.5-13.5维生素B60-0.06维生素B120-0.68氯化胆碱 0-5肌醇 0-5生物素(Biotin)0-0.02烟酰胺0-2.02核黄素0-0.044硫胺素0-2.17次黄嘌呤 0-2硫辛酸0-0.1β-巯基乙醇 0-2.5*为GIBCO生产的化学成分确定脂质(附组成，mg/L)。花生四稀酸2胆固醇220DL-醋酸α-生育酚 70亚油酸10亚麻酸10豆蔻酸10油酸 10棕榈稀酸 10棕榈酸10Pluronic F-68100000硬脂酸 10吐温80 2200
全文摘要
本发明公开一种适于幼仓鼠肾(BHK)细胞高密度生长和维持的低蛋白无血清培养基,该培养基具有蛋白含量低、易于分离纯化及适于工业化生产的特点。
文档编号C12N5/06GK1362514SQ0211064
公开日2002年8月7日 申请日期2002年1月25日 优先权日2002年1月25日
发明者张元兴, 易小萍, 孔祥明 申请人:华东理工大学, 山东东阿阿胶股份有限公司