专利名称：一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法
技术领域：
本发明是一种准确、快速筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，它主要应用于抗菌蛋白、抗菌肽类物质的初期筛选。
d.双向电泳结束后，将PAGE所得的两块胶分别处理；一块胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，脱色后用做备份，另一块胶置于10mMTris-Tricine(pH8.9)缓冲液中平衡30分钟，随即在同样缓冲液中电印迹到NC膜上，使用Pharmacia公司的微量电印迹装置(50V×1.5h)。第二块胶经电印迹，得到吸附有蛋白斑点的NC膜；e.将NC膜置于平衡缓冲液中(含10mM Tris-cl，pH7.5)浸泡10分钟并更换2次平衡液以除去残余的SDS，随即将NC膜真空干燥；f.原位测活，在NC膜上均匀地分布金黄色葡萄球菌(1×103CFU/mm2)后，将膜置于1mm厚的牛肉膏固体培养基(含0.0025％溴百里酚兰和0.0025％酚红，1％甘露醇)上37℃培养20小时，在NC膜上正常生长的细菌由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色，而有抗菌肽斑点的地方细菌生长受抑制，故而呈现出暗色的斑点。以上操作均应在无菌条件下进行；根据斑点的提示可以在第一块凝胶中找到相应的斑点，对其进行微量鉴定(N末端序列标签或质谱指纹图)结果表明，我们得到的是一个新的抗菌肽，而且它可以在体外表现出对多种细菌的抑制作用。
权利要求
1.一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，该方法的步骤为A将蛋白质组样品经过丙酮预处理以降低杂质含量；B将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF，IEF之后从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条，在缓冲液A中平衡后进行第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备非变性凝胶，上槽缓冲液的组分为Tris-base，Tricine和SDS，恒压电泳至溴酚蓝前缘到达底部；C将PAGE所得的两块胶分别处理，一块胶用考马斯亮蓝CBB染色，脱色后用做备份，另一块胶则经电印迹，将蛋白质斑点转移到NC膜上，使用不含SDS的缓冲液A；D经过0.01～0.2M Tris-Cl，pH＝7.5的缓冲液漂洗除去SDS，将NC膜真空干燥；E在NC膜上均匀地分布细菌，使其密度达到1×103～1×105CFU/mm2后，将膜置于牛肉膏固体培养基上培养，该培养基含显色剂；同时含有细菌生长所需的底物，该底物经细菌代谢能产生酸性或碱性产物；在NC膜上正常生长的细菌由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色，而有抗菌肽斑点的地方细菌生长受抑制，故而和周围呈现出色差，为暗色的斑点；F将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照，将凝胶上对应于NC膜上抗菌肽色斑的斑点切下，然后对这些斑点用质谱指纹图，N端序列分析，氨基酸组成分析进行微量鉴定。
2.按权利要求1所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤B的所指的缓冲液A的组分为0.05～0.2M Tris-base，0.05～0.2M Tricine，3～5mM SDS，pH＝9.0；在缓冲液A中平衡时间为20～30分钟，非变性凝胶是使用8～16％的丙烯酰胺及3.3％的甲叉双丙烯酰胺制备，pH＝9.0；上槽缓冲液为0.01～0.2M Tris-base，0.05～0.2M Tricine，1～2mM SDS，所指的恒压电泳的电压为150V。
3.按权利要求1或2所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤C的所指的电印迹的使用电压为50V，电印迹的时间为1～2小时，缓冲液A的pH＝9.0；
4.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025％～0.025％溴百里酚兰，0.00025％～0.025％酚红，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
5.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤E所指的在牛肉膏固体培养基上培养，其培养温度为37℃，培养时间为18～48小时；所指的显色剂为0.00025～0.025％中性红和0.00025～0.025％结晶紫，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
6.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025～0.025％5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
7.按权利要求1或2或3所述的筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，其特征是步骤E所指的显色剂为0.00025～0.025％四氯化三苯四氮唑，所指的底物为0.5～3％甘露醇。
全文摘要
本发明提供了一种准确、快速从天然产物中筛选具有抑菌生物活性的蛋白质多肽类物质的方法。克服了现有技术不能有效解决筛选速度、通量、准确率三者统一的弱点。该方法包括了等电聚焦,恒压电泳,电印迹,细菌培养及微量鉴定,将高通量的分离方法和高精度的活性锁定方法结合起来,能够在细胞水平上直接筛选出具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽,运用该方法每循环的操作时间约为一周。
文档编号C12Q1/18GK1364912SQ0211545
公开日2002年8月21日 申请日期2002年1月22日 优先权日2002年1月22日
发明者董先智, 徐辉碧, 黄开勋, 刘琼 申请人:华中科技大学