专利名称：氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸/纤维素亲和力功能区细胞贴附因子及其制造方法
技术领域：
本发明是有关一种增进细胞贴附效率的方法，尤其是有关一种重组CBD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)/RGD(纤维素亲和力功能区)细胞贴附因子及其制造方法。
贴附依赖性细胞在无血清培养液中的培养，通常需要另加入一些贴附因子(请参文献Clement，B.，Segui-Real，B.，Savagner，P.，Kleinnam，H.K.，Vamada，Y.1990.J.Cell Biol.110185-192)，这对于在微载体上大量的细胞培养特别重要，因为细胞一开始的贴附条件较为严苛(请参文献Steele，J.G.，Johnson，G.，Norris，W.D.，Underwood，P.A.1991 Biomaterials 12531-539)。1967年，Wezel首先发表了微载体(microcarrier)(请参文献Wezel，A.L.V.1967.Nature.21664-65)，利用带电荷的圆珠〔beads〕状物质，提供较大的单位生长表面积，可以令贴壁性细胞吸附于圆珠上，作大量的培养，并且方便配合各种生物反应器(bioreactor)设计，进行大规模的细胞或细胞产物的生产(请参文献Chen，Z.，Y.Chen and Y.Shi.1992.Can.J.Microbiol.38222-225.Pierre，J.，J.Lapierre，C.Daniel，R.Dugreand P.Trepanier.1989.J.Virol.Methods.2563-70.Hu，W.S.1985.Biotech.Bioeng.27585-595)。自此，固定化细胞培养技术(immobilized cellculture technology)开始迅速的被研究发展。固定化细胞培养技术研发的重点之一，便是固定化细胞材质的开发。目前广泛被应用的固定化细胞材质包括了用来制作微载体的带正电葡聚糖(dextran)(DEAE，diethylaminoethyl)、胶原蛋白(Collagen)等。其他还有空心纤维(hollow fier)、陶材(ceramicmatrices)等等。这个固定化细胞的材质大多已经商品化，虽然有效，但价格昂贵，过去曾有研究者利用天然纤维素来作为培养固定化细胞的材质；天然纤维素的好处是能够提供很大的生长表面积、价格低廉、容易取得、且合乎环保原则，但是动物细胞在纤维素材质上的贴附生长效率并不理想(请参文献Wierzba，A.，U.Reichl，R.F.B.Turnner，R.A.J.Warren andD.G.Kilburn.1995.Biotech.Bioeng.47147-154；Wierzba，A.，U.Reichl，R.F.B.Turnner，R，A.J.Warren and D.G.Kilburn.1995.Biotech.Bioeng.46185-193)。另外，生长培养液可添加一些各别的细胞外间质糖蛋白，但同样的，其纯化的花费高昂，并且，同样会导致污染，因此相当值得开发重组贴附因子。
下面再对先前技术作详细描述细胞在活体(In vivo)状况下的吸附(attachment)、伸展(spreading)、分化〔differention〕及移动(migration)是近年肿瘤学研究的重点之一；活体状况下，大多数的正常细胞都是固定于细胞外间质(extracellular matrix)上(请参文献Freshney，R.I.1986.Animal Cell Culture 2nd ed.OxfordUniversity Press，New York.)。细胞外间质是由细胞的生理合成产物运输到细胞膜外堆积而成，营养物质与病源体进入细胞或代谢物排出细胞，都必须经过细胞外间质。细胞外间质包含一些典型非胶原蛋白的贴附因子，都具有多重功能区(domain)，每一个功能区都具有结合至间质大分子和细胞表面接受器的特殊结合序列，这些蛋白具有重组间质并帮助细胞贴附至间质的功能，其中最为熟知的，为发现存在所有脊髓动物细胞纤维网蛋白(fibronectin)的糖蛋白大分子，纤维网蛋白的糖蛋白大分子被认为具有发动细胞贴附、分化及移动的功能(请参文献Hynes，R.O.1986.Fibronectins，Sci.Am.25442-51；Freshney，R.I.1994.Cultrueof Animal Cell.3th ed.Wiley Liss，New York)。纤维网蛋白的糖蛋白大分子是由二个次单位所组成，并且在二个次单位的C端以双硫键相连结，每一次单位会被折叠成一连串的功能区并由可弯曲的多胜肽链分离，这些功能区包括胶原蛋白结合(collagen-binding)、纤维结合(fibri-binding)、肝素结合(haparin-binding)及细胞结合(cell-binding)等(请参文献Hynes，R.O.1990.Fibronectin.1sted.Springer-Verlag，New York.)。纤维网蛋白(fibronectin)经低浓度的蛋白水解酶处理后，其中一个功能区(domain)具有结合至胶原蛋白(collagen)的功能，其他功能区(domain)尚可结合至肝素(haparin)和其他位于不同种细胞表面的特殊接受器。科学家证实具促进细胞贴壁功能的功能区(domain)上有特别的三个氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸[arginine-glycine-aspartate(RGD)]，为纤维网蛋白(Fibronectin)促进细胞贴壁的最小功能单位(请参文献Ruoslahti，E.andM.D.Pierschbacher.1987.Science.238491-496)。如果这些氨基酸被螯合至细胞培养材质表面，氨基酸会帮助细胞结合至这些固态材质上，RGD序列并非只限于出现在纤维网蛋白(fibronectin)上，许多其他细胞外间质蛋白都含有此序列。RGD序列具功能与否，乃决定于RGD序列在整个蛋白质结构中是否处于一个容易受到外界影响的位置(请参文献Hautanen，A.，J.Gailit，D.M.Mann and E.Ruoslahti.1989.J.Biol.Chem.2641437-1442)，例如纤维网蛋白(Fibronectin)中有促进细胞贴壁功能的RGD序列便是位于贝他转折处(b-turn)，裸露在整个构形的最外面(请参文献D’Souza，S.E.，M.H.Ginsberg and E.F.Plow.1991.TIBS.16246-250)。另外，RGD序列活性的强弱，似乎也受到了邻近几个氨基酸甚至更远的一些氨基酸的影响，但确实机制仍不明了(请参文献Ruoslahti，E.andY.Yamaguchi.1991.Cell.64867-869；Tranqui，L.，A.Andrieux，G.Hudry，J.Clergeon，J.Ryckewaert，S.Soyze，A.Chapel，M.H.Ginsberg，E.F.Plow andG.Marguerie，1989.J.Cell Biol.1082519-2527)。细胞间质利用与细胞表面的接受器结合，引发细胞内一连串的生物化学反应，使细胞发生生理及形态的改变而影响整个细胞架构，如果细胞生长于由纤维网蛋白(fibronectin)所组成的间质中时，细胞会展开并调整其细胞内的张力纤维(stress fibers)使与细胞外的纤维网蛋白丝(fibronectin filaments)排列在一起，而这样的相互作用便由整合素族群(Integrin family)来调控。活体中，整合素(Integrin)可辨识胞外间质中，纤维网蛋白(fibronectin)上的RGD序列，发动细胞内架构的重组，使细胞能稳定的贴附于细胞外间质上，是非常重要的细胞表面接受器蛋白。整合素(Integrin)是由二个穿膜糖蛋白次单位a及b组成，二个次单位皆可与间质蛋白结合；RGD序列的辨识区就位于b次单位上，a次单位较大，具有重链(heavy chain)及轻链(light chain)，a次单位位于细胞膜外的重链，可以与二价阳离子结合(请参文献D’Souza，S.E.，M.H.Ginsberg andE.F.Plow.1991.TIBS.16246-250)。
如果将具有细胞贴附特质的RGD序列胜肽与具有纤维素亲合力的蛋白质结合，作为促进细胞贴附于纤维素上的细胞培养添加物，不仅能降低动物细胞培养及蛋白纯化的成本，又能避免蛋白制剂可能有的污染，是相当值得开发的纤维素固定化细胞材质。
近期公开的技术在过去，已有科学家进行类似的结合首先是怀兹巴，A(Wierzba，A.)于1995年将纤维素摩纳斯费米(Cellulomonas fimi)细菌的葡聚糖内切酶(endoglucanase A)(Cen A)中的CBD基因接合上一段合成的RGD序列基因，表现出一段17KDa大小具活性的蛋白质(请参文献Wierzba，A.，U.Reichl，R.F.B.Turnner，R.A.J.Warren andD.G.Kilburn.1995.Biotech.Bioeng.47147-154).来自于细菌Cen A也是一中纤维素消化酶，具有一个催化功能区(catalytic domain)与一个纤维素亲和力蛋白质(cellulose binding domain)，两个功能区(domain)之间是以一段富含脯氨酸(proline)及酥氨酸(theronine)的连接子(linker)相连，Cen A中催化功能区(catalyticdomain)是位于C端，CBD是位于N端(请参文献Din，N.，I.J.Forsythe，L.D.Burtunick，N.R.Gilkes，R.C.Miller，A.J.Warren andD.G.Kilburn.1994.Mol.Microbiol.11747-755)，所以怀兹巴·A(Wierzba，A.)等人的实验中，直接将RGD序列接在天然CBD与PT连接子〔linker〕的N端。
另外陈韵如(1997，中兴大学硕士论文)则是将RGD序列结合于结合于木腐酶克尼基(Trichoderma koningii)细菌的CBH I基因，基本架构组成与Cen A基因非常相似，所不同的是CBH I基因的催化功能区(catalyticdomain)在N端，CBD在C端，由36个氨基酸所组成(请参文献Wey，T.T.，T.H.Hseu and L.Huang.1994.Cur.Microbiol.2831-39)，作者陈韵如发展出一段与原来不同的PT连接子(linker)，其接在CBD的C端后，才接上RGD序列。本发明乃再加改良，多加一段RGD序列并使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构中，且结合于具有纤维素亲和力蛋白质[cellulose bindingdomain(CBD)]的N端。曾有研究者推出，环状的RGD结构环状促进细胞贴附效率较线状RGD结构促进细胞贴附效率的功能要佳，例如蛇毒蛋白中的RGD序列(请参文献D’Souza，S.E.，M.H.Ginsberg andE.F.Plow.1991.TIBS.16246-250)。许多种蛇毒蛋白，例如罗多托敏[rhodotomin(Rho)]、三格拉敏(trigramin)中都被发现含有RGD序列，可与血小板上的结合素(integrin)辨识结合，抑制血小板凝集(请参文献Huang，T.F.，J.H.Holt，H.Lukasiewiez andS.Niewiarowaki.1987.J.Biol.Chem.26216157-16163)，这些蛋白质中通常具有8-14个胱氨酸(cysteine)残基，形成很多双硫键，而RGD序列就存在于双硫键架起来的稳定环状结构中(请参文献Knudsen，K.A.，G.P.Tuszynski，T.F.Huang andS.Niewiarowski.1988.Exp.Cell.Research.17942-49)。经测试证实本发明确实大大提升了促进细胞贴附的能力。
本
发明内容
有鉴于先前已知技术中CBD/RGD贴附因子对促进细胞贴附能力未达预期，本发明即旨在提供一种细胞贴附效率改良的CBD/RGD重组贴附因子，其是于将调控细胞贴附作用的RGD氨基酸序列(Arg-Gly-Asp)结合于一段具有纤维素亲合力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的C端，藉此CBD-RGD胜肽以促进细胞贴附于纤维素培养盘中，多加一段RGD序列，并使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构内，并结合于所述具有纤维素亲和力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的N端，构成可提升促进细胞贴附能力的CBD/RGD重组贴附因子，以大大提升其促进细胞贴附能力。
一种制造上述细胞贴附效率改良的CBD/RGD重组贴附因子的方法，其特征是包括下列步骤首先构筑一大肠杆菌株；
将合成的连接引子；5′CATGCCATGG CATGCGGTCG TGGTGACAGC TGTCCAA 3′3′CCACTGTCGA CAGGTTGATG AGGTTGGTAC CGTAC 5′以聚合酶链锁反应器放大，经Nco I限制酶切割后，藉由于标准溶液中混和连接于如陈所构筑的RGD序列以PT连接子(linder)连接于CBD的C端；于pET32a表现质体的模型中，用标准氯化钙步骤直接以连接溶液转型至BL21(DE3)大肠杆菌中，繁殖，平碟培养；抽取单一菌落(single colony)质体DNA，利用限制酶配合聚合酶链锁反应，筛选带有重组质体的菌株；将构筑好的大肠杆菌株以含有安比西林(ampicillin)0.05mg/ml的TB培养基培养至O.D.600＝0.7-1之间；加入1mM IPTG诱导表现，以4℃，7000g离心十分钟，收取细菌；再将细菌悬浮于20mM三胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH7.4)缓冲液，含0.1mM苯基甲磺酰基氟(PMSF)与1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中，加入EDTA与PMSF以抑制可能于纯化前水解目标蛋白的蛋白酶活性；以一压力机打破细菌细胞壁，并于4℃，10000g离心十五分钟；以0.45mm膜过滤后直接通过镍金属螯和的亲和性管柱纯化，首先以5-10倍管柱的20mM咪唑(Imidazole)溶液清洗平衡管柱，使多余没有结合的蛋白质移出；以5-10倍管柱的50-100mM咪唑(Imidazole)溶液清洗管柱，使非特异性结合的蛋白及结合力较弱的蛋白冲刷出管柱；再以250mM咪唑(Imidazole)溶液将目标蛋白由亲和性管柱特异性的结合冲刷下来并收集。
本发明的有益效果开发贴附蛋白，除了可以降低蛋白纯化或制造疫苗的成本外，尚可避免动物血清中微生物和病毒污染的危险性，对生物科技产业的发展有正面的帮助，是相当值得开发的产品，鉴于原CBD/RGD重组蛋白贴附因子〔陈韵如，中兴大学硕士论文，1997〕促进细胞贴壁的效率并没有预期佳，本发明的改良设计是模拟自然生理状态中的现象，使RGD序列存在于双硫架起来的稳定环状结构中，经测试证实本发明的改良的促进细胞贴附因子的贴附效率提升，且达到最大贴附效率所需的浓度较低，相比之下对产业的助益更大。
至于本发明的详细技术，其他目的与功能，则参照下列依附图
所示的说明，即可得到完全的了解。
将构筑好的B3901大肠杆菌株以含有安比西林(ampicillin)0.05mg/ml的TB培养基培养至O.D.600＝0.7-1之间，加入1mM IPTG诱导表现，以4℃，7000g离心十分钟，收取细菌，再将细菌悬浮于20mM三胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH7.4)缓冲液，含0.1mM苯基甲磺酰基氟(PMSF)与1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中，加入EDTA与PMSF以抑制可能于纯化前水解目标蛋白的蛋白酶活性。经16Kpsi，French Press(商标名)压力机打破细菌细胞壁，并于4℃，10000g离心十五分钟，由于pET32a表现质体所表现的蛋白包含一段6个组氨酸(Histidine)的区域，因此上清液(经SDS胶体分析，发现分子量约26kDa处有一蛋白被大量表达。请参图2，Lane 1)以0.45mm膜过滤后直接通过镍金属螯和的亲和性管柱纯化，首先以5-10倍管柱的20mM咪唑(Imidazole)溶液清洗平衡管柱，使多余没有结合的蛋白质移出(请参图2，Lane 2)，其次以5-10倍管柱的50-100mm咪唑(Imidazole)溶液清洗管柱，使非特异性结合的蛋白质及结合力较弱的蛋白冲刷出管柱，最后再以250mM咪唑(Imidazole)溶液将目标蛋白由亲和性管柱特异性的结合中冲刷下来并收集。收集样品在加入含0.1％溴酚蓝溶液后加热五分钟，在SDS胶体上进行电泳分析，以产生融合蛋白质而言，将会分子量26仟道尔吞的蛋白质讯号出现〔请参图2，Lane 3〕，即得本发明的CBD/RGD重组贴附因子。<实例一>
原CBD/RGD与本发明的改良B3901二个不同贴附因子贴附效率比较将贴附蛋白皆稀释为不同浓度0.01mg/ml，0.1mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，100mg/ml(如图3所示)，分别加到经乙酸纤维素(cellulose acetate)处理的24孔培养盘中，室温反应二至四个小时后将未结合的蛋白移除，并在每个培养盘孔洞中加入含2mg/ml小牛血清白蛋白的DMEM细胞培养液，置于37℃。使用胰蛋白酶将牛肾细胞(Maden DarbyBovine Kidiney cell)由培养盘上拆下后，以含0.01％黄豆萃取胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsine inhibitor)的DMEM培养液清洗，终止胰蛋白酶的作用，接着以两次DMEM培养液〔不含小牛胚胎血清〕清洗后各取1.6×105个细胞到每一个含不同浓度贴附蛋白的孔洞中培养，经1.5个小时后计数贴附细胞数，结果贴附效率达最高的贴附蛋白浓度CBD/RGD约为2-5mg/ml、B3901约为0.1-1mg/ml(六个分开的实验的Mean±SEM)，相比之下，B3901于较低浓度即能达到良好的促进细胞贴附效果。<实例二>
根据上述实验结果，利用相似的方法，取4×105个细胞，固定蛋白浓度，CBD/RGD蛋白浓度以2-5mg/ml、B3901以0.1-1mg/ml做不同时间点细胞贴附效率动力学统计(如图4)，结果，B3901实验组在第1.5小时即有将近100％的细胞完全贴附于培养盘上，CBD/RGD蛋白在同一时间点则只有50％的细胞贴附于培养盘上(六个分开的实验的Mean±SEM)，显示本发明的改良蛋白的促进细胞贴附效率明显较旧的构筑CBD/RGD蛋白高。牛肾细胞(MDBK cell)无论是贴附至CBD/RGD贴附蛋白或本发明的改良B3901贴附蛋白上，其型态与大小皆相似，唯从图5所示可看出本发明的改良的细胞贴附效率明显较佳。
权利要求
1.一种细胞贴附效率改良的CBD/RGD重组贴附因子，其特征是其是于将调控细胞贴附作用的RGD氨基酸序列(Arg-Gly-Asp)结合于一段具有纤维素亲合力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的C端，利用此CBD-RGD胜肽以可促进细胞贴附于纤维素培养盘中，多加一段RGD序列，且使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构内，并结合于所述具有纤维素亲和力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的N端，构成可提升促进细胞贴附能力的CBD/RGD重组贴附因子。
2.根据权利要求1所述的CBD/RGD重组贴附因子，其特征是RGD序列是存在于胱氨酸(cysteine)的双硫键架起来的稳定环状结构中。
3.一种制造权利要求1的细胞贴附效率改良的CBD/RGD重组贴附因子的方法，其特征是包括下列步骤首先构筑一大肠杆菌株；将合成的连接引子；5′CATGCCATGG CATGCGGTCG TGGTGACAGC TGTCCAA 3′3′CCACTGTCGA CAGGTTGATG AGGTTGGTAC CGTAC 5′以聚合酶链锁反应器放大，经Nco I限制酶切割后，藉由于标准溶液中混和连接于如陈所构筑的RGD序列以PT连接子(linder)连接于CBD的C端；于pET32a表现质体的模型中，用标准氯化钙步骤直接以连接溶液转型至BL21(DE3)大肠杆菌中，繁殖，平碟培养；抽取单一菌落(single colony)质体DNA，利用限制酶配合聚合酶链锁反应，筛选带有重组质体的菌株；将构筑好的大肠杆菌株以含有安比西林(ampicillin)0.05mg/ml的TB培养基培养至O.D.600＝0.7-1之间；加入1mM IPTG诱导表现，以4℃，7000g离心十分钟，收取细菌；再将细菌悬浮于20mM三胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH7.4)缓冲液，含0.1mM苯基甲磺酰基氟(PMSF)与1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中，加入EDTA与PMSF以抑制可能于纯化前水解目标蛋白的蛋白酶活性；以一压力机打破细菌细胞壁，并于4℃，10000g离心十五分钟；以0.45mm膜过滤后直接通过镍金属螯和的亲和性管柱纯化，首先以5-10倍管柱的20mM咪唑(Imidazole)溶液清洗平衡管柱，使多余没有结合的蛋白质移出；以5-10倍管柱的50-100mM咪唑(Imidazole)溶液清洗管柱，使非特异性结合的蛋白及结合力较弱的蛋白冲刷出管柱；再以250mM咪唑(Imidazole)溶液将目标蛋白由亲和性管柱特异性的结合冲刷下来并收集。
全文摘要
一种细胞贴附效率改良的CBD/RGD重组贴附因子及其制造方法，其是于将调控细胞贴附作用的RGD氨基酸(amino acid)序列(Arg－Gly－Asp)结合于一段具有纤维素亲合力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的C端，借此CBD－RGD胜肽以可促进细胞贴附于纤维素培养盘中，多加一段RGD序列，且使之存在于双硫键架起来的稳定环状结构内，并结合于所述具有纤维素亲和力功能区[cellulose binding domain(CBD)]的N端，构成CBD/RGD重组贴附因子，而可大大提升其促进细胞贴附能力。
文档编号C12N15/09GK1465591SQ0212471
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月24日 优先权日2002年6月24日
发明者林佳慧 申请人:三九生物科技股份有限公司