荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒的制作方法

专利名称：荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒。
背景技术：
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。
对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。
虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。
在目前已商品化的多种转基因玉米中，有四种(Bt-176，Bt-11，MON810和MON80100)含有插入的来源于苏云金杆菌(Bt)且具有抗虫活性的Cry1Ab外源基因序列和玉米内源基因zein序列，可作为检测的靶序列。
Cry1Ab基因的其他写法如cryIA(b)等含义相同，它是一个人工合成的截短了的抗虫基因，来源于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki strain HD-1)。含有Cry1Ab基因的转基因作物具有抗虫特性。

发明内容
本发明的目的就是要提供一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的序列。
试剂盒组成核酸提取试剂核酸扩增试剂Cry PCR反应液(定量)Zein PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量标准品Cry-STND1(2.0％)Cry-STND2(0.5％)Cry-STND3(0.1％)Cry定量阴性对照全基因序列见附录一核酸提取试剂可使用传统的植物DNA提取方法的试剂，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(Cat FF3750，200 tests)。
本试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的扩增双检测技术，在同一试管中以Fam和Tet两种荧光通道信号分别追踪Cry1Ab基因序列和内源基因zein序列的扩增动力学变化，为消除DNA样品上样量的差异，以ΔCt值(Fam-Ct值与Tet-Ct值之差)对梯度GMO含量的标准品做标准曲线，由标准曲线获得待测玉米样本的GMO含量。


图1荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米的扩增图(目的基因Cry1Ab)图2荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米的扩增图(内标基因Zein)图1中，阳性样品为0.1％，0.5％，1.0％，2.0％，5.0％，Fluka玉米标准品，待测样品1，待测样品2，阴性样品为0％Fluka玉米标准品和阴性玉米。图1中，1为0.5％，2，3为0.1％，4为0％。图2中，5为0.5％，6为0.1％，7为0.1％，8为0％具体实施方式
靶区域的选择以及引物和探针的设计本试剂盒选择转基因玉米的转入基因片段作为外源检测的靶片段，以玉米内源基因zein作为检测监控的参照基因。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
Cry1A(b)的引物和探针名称(5′-3′方向)区域1探针165，176，266，282，366，422上游引物Cy-2F下游引物Cy-2R，410r，485r区域2探针633，647，703上游引物576，590，626，648，657，677下游引物689，734，741，752，807，829区域3探针851上游引物792下游引物1015，1078Zein片段的引物和探针名称(5′-3′方向)区域1探针183上游引物63，77，110，131，下游引物218，228，313，328，348区域2探针352上游引物197，206，215，220，252下游引物403，406，422，505单检反应体系的建立及优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域阳性模板以如下方法获得用含有靶序列的转基因玉米2％标准品100mg(粉末)按Promega Kit方法提取DNA，以最末端的两对引物扩增PCR产物(35cycles)稀释10000倍作为引物与探针初筛的模板，以2％标准品原液作为再次筛选的模板。
引物和探针的筛选引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物任意配对，在PE7700上进行实验。
扩增反应体系配置根据以往引物筛选经验，引物筛选所采用的PCR反应体系如下表所示。
PCR反应体系组分 终浓度10×PCR反应液 1×dNTP(含dUTP) 0.2mmol/LTaq酶 2UnitMg2+浓度 2.5mmol/L引物I 约0.2umol/L引物II约0.2umol/L探针 0.1umol/L模板DNA 2ul补DEPC水至40ul循环参数的设置根据引物筛选经验，筛选引物所采用的PCR循环条件如下
94℃4min95℃15sec，60℃1min，40个循环初筛结果Cry1Ab引物与探针的初筛表明探针165，266，282，366，422，633，647，703，851都工作，探针176不工作。工作的探针中，703最好，其余探针效果较差，主要表现在与703配对的引物对扩增的Ct普遍较小，荧光增值普遍较高，而与其余探针配对的引物对扩增Ct普遍较大，荧光增值普遍较低。
Zein片段引物与探针的初筛表明探针183，352都工作，且效果都不错。其中183比352略好。
次筛结果在初筛的基础上，我们以2％标准品作为模板，对Cry1Ab初次筛选效果不错的703的组合对进行了再次筛选，另外对初次筛选效果不错的其它引物探针组合也进行了再次筛选，结果表明非703探针检测荧光增值在40-100范围(阈值38，基线3-22)，而703配对的引物对检测结果仍然普遍较好(见下表)。
引物探针组合次筛结果

用2％标准品作为模板，对Zein初次筛选效果不错的183组合及352组合进行了再次筛选(第一次合成的引物探针)，结果表明183探针较352探针略好。352探针荧光值从20至210(阈值40，基线3-23)不等。183探针引物组合筛选结果如下表183探针引物组合筛选结果

三筛结果经过初次与再次筛选，我们选择703探针的5对引物组合作为Cry1Ab检测的候选引物探针组合，进行重复性与稳定性检。这5对引物对分别是657u-752r，677u-734r，657u-807r，677u-741r，677u-807r。
以0.6ul 2％标准品DNA为反应模板，5种组合(第一次合成)检测结果如下表(阈值28.3，极限3-25)。
703fb探针引物组合筛选结果

最终，我们把677u-734r，703fb作为首选，其余4种组合作为候选。
经过初次与再次筛选，我们选择183探针的3对引物组合作为参照检测的侯选引物探针组合，进行重复性与稳定性检测。这3对引物对分别是131u-313r，110u-313r，77u-348r。
以按标准方法提取的0％阴性样品DNA 2ul作为反应模板，3种组合(第一次合成)检测结果如下表(阈值29.3，基线3-22)。
183探针与3对引物组合筛选结果

最终，我们把131u-313r，183tb作为首选，其它两种作为候选。
最终筛选结果cry1Ab基因检测的首选引物探针组合是677u-734r，703fb。其余4组657u-752r，703fb；657u-807r，703fb；677u-741r，703fb；677u-807r，703fb为候选组合。
Zein基因检测的首选引物探针组合是131u-313r，183tb。110u-313r，183tb；77u-348r，183tb是候选。
cry1Ab基因最优引物/探针序列如下上游引物Cryab pen 677uCGCGACTGGATCAGGTACA下游引物Cryab pen 734rTGGGGAACAGGCTCACGAT探针Cryab pen703fbFam-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-tamraZein基因最佳引物/探针序列如下上游引物zea131utgaacccatgcatgcagt下游引物zea313rggcaagaccattggtga探针zea183tb-78Tet-tggcgtgtccgtccctgatgc-tamra用选出的最佳上下游引物及探针对进行PCR反应体系的优化。双检反应体系的建立及优化从多次重复实验中选定下述最佳引物/探针组合上游引物 下游引物探针外源基因cry1Ab 677 734703fb
内源基因zein 131 313 183tb-78引物和探针浓度的优化实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较。最佳引物和探针终浓度结果见下表最佳引物和探针终浓度

循环参数的设置根据既往引物筛选经验，筛选引物所采用的PCR循环条件如下95℃4min95℃15sec，60℃1min，40个循环镁离子浓度和的优化实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl2为试剂盒反应体系镁离子浓度。
Taq酶用量的优化Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。
dNTP浓度的优化dNTP浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTP的终浓度。
双检系统的合一方法先确立外源性cry1Ab扩增系统(见上述)，然后逐一加入zea系统的模板、引物和探针，结果发现，两系统合并之后，各自的Ct值大约后延一个单位，Rn值有所下降，见下表双检系统参数

为观察两系统合并后对实际定量的影响，用玉米标准品作下述测定双检合一系统Fam和Tet通道的Ct值

为减少上样的DNA模板量的差异，采用以ΔCt值(Fam-Ct值与Tet-Ct值之差)对梯度GMO含量的标准品做标准曲线，得到y＝-4.1581x-2.5356 R2＝0.9982提示该双检合一系统可以用于定量检测。
反应体系的建立及优化组合综上所述在反应体系的建立所进行的各环节的优化实验结果，本荧光检测试剂盒优化后的PCR反应体系见下表优化后的PCR反应体系

PCR反应循环参数为37℃ 5min；95℃ 4min；95℃ 15sec，60℃ 1min 40个循环试剂盒组成组成成份(48tests/盒) 体积


UNG为UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶，Uracil-N-glycosylase)核酸提取试剂依方法而定，可使用传统的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(CatFF3750，200 tests)。
CTAB法样本处理试剂配方

纯化水的制备用自来水一次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。
Cry1Ab定量PCR反应液配方

Zein PCR反应液配方


定量标准品和阴性对照品的制备定量标准品的制备购买欧盟的Fluka公司的0.1％，0.5％，，2.0％和5.0％转基因玉米粉，用Promega试剂盒(Wizard Magnetic DNA Purification System for Food，Promega Cat# A7710)提取DNA，-20℃保存备用。
阴性对照的制备购买市场上的非转基因玉米，洗净、烘干，磨成粉，用合格的《转基因玉米荧光PCR定量检测试剂盒》试剂盒提取基因组DNA，做PCR扩增，平行做3个复管，如果检测结果为Cry1Ab序列检测为阴性，GMO含量＜0.1％，视为合格非转基因玉米粉。用CTAB法大量提取基因组DNA，-20℃保存备用。
自备设备及试剂水浴锅，离心机；氯仿、异丙醇(-20℃预冷)、70％乙醇(-20℃预冷)适用仪器PE Gene Amp7700荧光PCR检测仪或其他合适的荧光PCR仪使用方法1.样本核酸提取1.1 CTAB法提取DNA1.1.1 称取100mg充分粉碎后的玉米样品放入2ml离心管中，加800ul CTAB缓冲液，混匀后于65℃温育30分钟；1.1.2 15500g离心10分钟，转移上层液至含400ul氯仿的管中，混匀30秒，再以15500g离心10分钟直至液相分层，吸取上层液至干净离心管中；1.1.3 加入2V CTAB沉淀缓冲液，室温下温育60分钟；1.1.4 混合液以15500g离心5分钟，弃上清；1.1.5 加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混匀30秒后以15500g离心10分钟；1.1.6 转移上清至另一新管中，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀后15500g离心10分钟，弃上清液；1.1.7 加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混匀洗涤管壁后离心10分钟(15500g)，弃上清；1.1.8 室温干燥，然后将DNA溶解在100ul无菌去离子水中(如果样本DNA当天不使用，请于-20℃保存)。
1.2 Promega法提取DNA的步骤(备选)原方法样本称取量为200mg。根据本公司的经验，此量极难混匀，故将样本称取量改为100mg，其后的试剂用量和操作则完全按原方法进行。
2. 核酸扩增2.1. 试剂配制(PCR前准备区)从试剂盒中取出各管试剂，室温融化，2000rpm离心5秒。设所需要的管数为n(n＝样本数×3+2管阴性对照+6管定量标准品)。这里每个样本要做3个平行管，每个定量标准品及1个阴性对照品则只做两个平行管。每个测试反应体系配制如下表

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入35ul，转移至样本处理区。
2.2. 加样(样本处理区)若样本DNA保存在-20℃，先置室温解冻。
在设定的n个PCR反应管中，分别加入样本DNA溶液各5ul；0.1％、0.5％、2.0％定量标准品以及阴性对照品各5ul；盖好PCR反应管盖，转移至检测区，置于定量PCR检测仪上并记录样本摆放顺序。
2.3. PCR扩增(检测区)2.3.1. 循环条件设置37℃5min；95℃3min；95℃15sec，60℃1min，40个循环。反应体系设为40ul。
(不同的荧光PCR仪循环条件可能略有调整)2.3.2.仪器检测通道选择所有PCR反应管荧光信号收集分别设为Fam和Tet荧光通道。
具体设置方法请参照仪器使用说明书。
3.质控标准3.1 定量标准品、阴性对照品的zein基因Tet荧光通道Ct值应在18至25之间，否则需重做PCR反应。
3.2 待测玉米DNA样品的zein基因Tet荧光通道Ct值应在18至25之间；否则，样本DNA提取过程有误，需从样本DNA提取开始重做。
3.3 阴性对照品Cry1Ab基因的检测结果应为阴性；否则需重做PCR反应。
3.4 标准曲线的拟和度(R平方值)应大于等于0.90，否则应重做PCR反应。
4. 结果分析4.1 无论Fam荧光通道或Tet荧光通道，基线都取3-15个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，使阴性对照品成阴性结果为准。
4.2 记录每个定量标准品以及每个待测样品的Fam荧光通道的Ct值和Tet荧光通道的Ct值，并分别计算出定量标准品在Fam和Tet荧光通道Ct值的平均值。将各标准品的平均Ct值和各待测样品的Ct值输入到所配软件的相应位置，软件会自动计算出标准品和待测样本的ΔCt值。根据标准品的已知GMO含量和所得的ΔCt值之间的对应关系，软件可计算出回归曲线方程。
4.3 根据此回归方程，软件可通过每个待测样品的ΔCt值自动计算其GMO的含量，并在表格的对应位置显示结果。
4.4 GMO含量的报告方式
如果某待测样品的GMO含量计算值在0.1～2.0％之间，按实际值报告；如果某待测样品的GMO含量计算值小于0.1％，报告GMO低于检测限；如果某待测样品的GMO含量计算值大于2.0％，报告GMO大于2.0％；储存条件及有效期本试剂盒中样本处理试剂在室温保存；核酸扩增试剂-20℃保存；避免反复冻融。有效期为一年，连续生产的三批试剂盒自检定合格之日起试剂盒要求的储存温度下保存，每个月按成品检定规程检测一次，一直到14个月时，各项指标均合格，因此确定试有效期为12个月(请于有效期内使用)。
实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。
实施例1定量检测选取待检样品，以Promega磁珠法提取基因组DNA，具体为称重100mg植物材料，置于2ml离心管中；加入500ul Lysis Buffer A和5ul RNase A，与材料混匀；加入250ul Lysis Buffer B，混匀，室温放置10分钟；加入750ul沉淀缓冲液，混匀后高速离心(13000×g)10分钟；吸取上清于干净的2ml离心管中，加入50ul磁粉液，混匀；混合液中加入0.8体积异丙醇，混匀，室温放置5分钟；将离心管置于磁架上1分钟，去澄清液；取出离心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混匀后置于磁架上1分钟，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分钟，去澄清液；步骤重复2次；取出离心管，于65℃干浴锅中干燥5分钟或室温下干燥15-30分钟；离心管中加入100ul去离子水，混匀后于65℃干浴锅中孵育5分钟，再移至磁架上1分钟，吸取澄清液于0.5ml干净离心管中，做为DNA模板备用。
用本试剂盒做荧光PCR定量检测，荧光PCR仪采用PE7700。其结果如下表用本试剂盒做荧光PCR定量检测，标准品及样品ct值

从上述数据得到的回归曲线是y＝-0.2622x+7.6419；相关性r2＝0.989；再用1.0％和2.0％的标准品当做被测样品，测得的GMO含量分别为0.94％和2.26％，定量偏差为5％-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示所用引物的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。具体试剂盒灵敏度为0.1％GMO玉米。
试剂盒标准曲线拟合度≥0.95。
试剂盒精密性公司中3位技术熟练的操作人员在3个不同时间，各做3次精密性检测实验(总计9次)，每次平行处理10份精密性参比品。对每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析软件进行统计学处理，得出平均值和10个Ct值的CV值，实验结果显示，Ct值的CV值在4.5％以下，表明该试剂盒有良好的精密性。结果如下表玉米定量测定结果表


试剂盒特异性发明的效果对经过反复筛选确立的试剂盒进行测试。
以符合国际标准的Fluka玉米标准品0.1％转基因玉米提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已达到了目前同类产品的检测标准。
用于作定量检测，定量偏差为5-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示本试剂盒的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。
该试剂盒对阴性大豆、玉米、油菜、马铃薯标本均无非特异性扩增，表明该试剂盒具有良好的特异性。
该试剂盒中的引物、探针可用作杂交探针检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米。
PCR-ELISA的方法原理简介该实验要设计一对PCR引物和一条探针，它们均与模板DNA链互补，且探针的结合部位在引物结合部位之间。将PCR的一条引物5’端标记上荧光素(Fluorescein)，进行PCR扩增，得到的扩增产物带有荧光素标记。同时将探针的5’端标记上生物素(Biotin)，酶联板上包被有亲和素(Avidin)，通过生物素与亲和素的亲和作用，将探针包被在酶联板上。检测时，将扩增产物变性成单链，在酶联板上与探针进行特异的结合，洗板，再加入辣根过氧化物酶偶联的荧光素抗体，通过显色剂显色，在酶标板上读取OD值，根据OD值判断样品的阴阳性。
实施内容将上述探针35s7270FAM的5’端标记生物素，3’端不做标记；将引物35s2r的5’端标记上荧光素。预先将探针包被在有亲和素的酶联板上。
按常规方法(CTAB法或磁珠法)提取样本中的DNA。由10×PCR缓冲液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板组成PCR反应体系，进行扩增。
扩增结束后，将扩增产物变性成单链，加到包被了探针的酶联板上，如果有特异性扩增，扩增产物中的一条链与探针杂交，洗板，加入酶联荧光素抗体，洗板，加入显色剂，显色10分钟，停止显色，在酶标仪上读取OD值，根据OD值判断样本的阴阳性。下表是一次的实验结果

实验结果表明只要含有Cry1Ab基因序列的转基因作物经该系统检测结果均为阳性，而不含有Cry1A(b)基因的作物经该系统检测均为阴性本发明的优点1.本试剂盒对于转入35s启动子的转基因作物检测灵敏度可达0.1％，说明本试剂盒具有良好的灵敏度。
2.本试剂盒对于非转基因的农产品如大豆、玉米等均无扩增信号，说明本试剂盒具有良好的特异性。
3.用本试剂盒做荧光PCR定量检测，定量偏差为5％-20％(欧盟的GENESCAN公司同类检测定量偏差为≤20％)，提示该试剂盒的检测效率已达到核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。
4.由于本试剂盒采用了荧光PCR作为检测方法，整个反应均闭管进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性。
5.由于本试剂盒采用了植物内源基因Zein作为内标，避免了核酸提取的对定量造成的误差及假阴性的产生。
6.由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
备注以英文字母表示的引物探针的名称、引物探针的序列/基因的名称等大小写通用；Ct值的英文全称“Threshold Cycles”，意指荧光值超过阈值时所处的循环数。在不同荧光PCR仪上有不同的名称，但含意是一样的。
附录一ATGGACAACA ACCCCAACAT CAACGAGTGC ATCCCCTACA ACTGCCTGAG CAACCCCGAG61 GTGGAGGTGC TGGGCGGCGA GCGCATCGAG ACCGGCTACA CCCCCATCGA CATCAGCCTG121AGCCTGACCC AGTTCCTGCT GAGCGAGTTC GTGCCCGGCG CCGGCTTCGT GCTGGGCCTG181GTGGACATCA TCTGGGGCAT CTTCGGCCCC AGCCAGTGGG ACGCCTTCCT GGTGCAGATC241GAGCAGCTGA TCAACCAGCG CATCGAGGAG TTCGCCCGCA ACCAGGCCAT CAGCCGCCTG301GAGGGCCTGA GCAACCTGTA CCAAATCTAC GCCGAGAGCT TCCGCGAGTG GGAGGCCGAC361CCCACCAACC CCGCCCTGCG CGAGGAGATG CGCATCCAGT TCAACGACAT GAACAGCGCC421CTGACCACCG CCATCCCCCT GTTCGCCGTG CAGAACTACC AGGTGCCCCT GCTGAGCGTG481TACGTGCAGG CCGCCAACCT GCACCTGAGC GTGCTGCGCG ACGTCAGCGT GTTCGGCCAG541CGCTGGGGCT TCGACGCCGC CACCATCAAC AGCCGCTACA ACGACCTGAC CCGCCTGATC601GGCAACTACA CCGACCACGC CGTGCGCTGG TACAACACCG GCCTGGAGCG CGTGTGGGGT661CCCGACAGCC GCGACTGGAT CAGGTACAAC CAGTT Cryab pen 677u Cryab pen703fb721CTGGACATCG TGAGCCTGTT CCCCAACTAC GACAGCCGCA CCTACCCCAT CCGCACCGTGCryab pen 734r781AGCCAGCTGA CCCGCGAGAT TTACACCAAC CCCGTGCTGG AGAACTTCGA CGGCAGCTTC841CGCGGCAGCG CCCAGGGCAT CGAGGGCAGC ATCCGCAGCC CCCACCTGAT GGACATCCTG901AACAGCATCA CCATCTACAC CGACGCCCAC CGCGGCGAGT ACTACTGGAG CGGCCACCAG961ATCATGGCCA GCCCCGTCGG CTTCAGCGGC CCCGAGTTCA CCTTCCCCCT GTACGGCACC1021 ATGGGCAACG CTGCACCTCA GCAGCGCATC GTGGCACAGC TGGGCCAGGG AGTGTACCGC1081 ACCCTGAGCA GCACCCTGTA CCGTCGACCT TTCAACATCG GCATCAACAA CCAGCAGCTG1141 AGCGTGCTGG ACGGCACCGA GTTCGCCTAC GGCACCAGCA GCAACCTGCC CAGCGCCGTG1201 TACCGCAAGA GCGGCACCGT GGACAGCCTG GACGAGATCC CCCCTCAGAA CAACAACGTG1261 CCACCTCGAC AGGGCTTCAG CCACCGTCTG AGCCACGTGA GCATGTTCCG CAGTGGCTTC1321 AGCAACAGCA GCGTGAGCAT CATCCGTGCA CCTATGTTCA GCTGGATTCA CCGCAGTGCC1381 GAGTTCAACA ACATCATCCC CAGCAGCCAG ATCACCCAGA TCCCCCTGAC CAAGAGCACC1441 AACCTGGGCA GCGGCACCAG CGTGGTGAAG GGCCCCGGCT TCACCGGCGG CGACATCCTG1501 CGCCGCACCA GCCCCGGCCA GATCAGCACC CTGCGCGTGA ACATCACCGC CCCCCTGAGC1561 CAGCGCTACC GCGTCCGCAT CCGCTACGCC AGCACCACCA ACCTGCAGTT CCACACCAGC1621 ATCGACGGCC GCCCCATCAA CCAGGGCAAC TTCAGCGCCA CCATGAGCAG CGGCAGCAAC1681 CTGCAGAGCG GCAGCTTCCG CACCGTGGGC TTCACCACCC CCTTCAACTT CAGCAACGGC1741 AGCAGCGTGT TCACCCTGAG CGCCCACGTG TTCAACAGCG GCAACGAGGT GTACATCGAC1801 CGCATCGAGT TCGTGCCCGC CGAGGTGACC TTCGAGGCCG AGTACGACCT GGAGAGGGCT1861 CAGAAGGCCG TGAACGAGCT GTTCACCAGC AGCAACCAGA TCGGCCTGAA GACCGACGTG1921 ACCGACTACC ACATCGATCA AGTATCCAAT TTAGTTGAGT GTTTATCTGA TGAATTTTGT1981 CTGGATGAAA AAAAAGAATT GTCCGAGAAA GTCAAACATG CGAAGCGACT TAGTGATGAG2041 CGGAATTTAC TTCAAGATCC AAACTTTAGA GGGATCAATA GACAACTAGA CCGTGGCTGG2101 AGAGGAAGTA CGGATATTAC CATCCAAGGA GGCGATGACG TATTCAAAGA GAATTACGTT2161 ACGCTATTGG GTACCTTTGA TGAGTGCTAT CCAACGTATT TATATCAAAA AATAGATGAG2221 TCGAAATTAA AAGCCTATAC CCGTTACCAA TTAAGAGGGT ATATCGAAGA TAGTCAAGAC2281 TTAGAAATCT ATTTAATTCG CTACAATGCC AAACACGAAA CAGTAAATGT GCCAGGTACG2341 GGTTCCTTAT GGCCGCTTTC AGCCCCAAGT CCAATCGGAA AATGTGGGGA GCCGAATCGA2401 TGCGCTCCGC ACCTGGAGTG GAACCCGGAC CTAGACTGCA GCTGCAGGGA CGGGGAGAAG2461 TGCGCCCATC ATTCCCATCA TTTCTCCTTG GACATTGATG TTGGATGTAC AGACTTAAAT2521 GAGGACTTAG GTGTATGGGT GATATTCAAG ATTAAGACGC AAGATGGCCA TGCAAGACTA2581 GGAAATCTAG AATTTCTCGA AGAGAAACCA TTAGTAGGAG AAGCACTAGC TCGTGTGAAA2641 AGAGCGGAGA AAAAATGGAG AGACAAACGT GAAAAATTGG AATGGGAAAC AAATATTGTT2701 TATAAAGAGG CAAAAGAATC TGTAGATGCT TTATTTGTAA ACTCTCAATA TGATAGATTA2761 CAAGCGGATA CCAACATCGC GATGATTCAT GCGGCAGATA AACGCGTTCA TAGCATTCGA2821 GAAGCTTATC TGCCTGAGCT GTCTGTGATT CCGGGTGTCA ATGCGGCTAT TTTTGAAGAA2881 TTAGAAGGGC GTATTTTCAC TGCATTCTCC CTATATGATG CGAGAAATGT CATTAAAAAT2941 GGTGATTTTA ATAATGGCTT ATCCTGCTGG AACGTGAAAG GGCATGTAGA TGTAGAAGAA3001 CAAAACAACC ACCGTTCGGT CCTTGTTGTT CCGGAATGGG AAGCAGAAGT GTCACAAGAA3061 GTTCGTGTCT GTCCGGGTCG TGGCTATATC CTTCGTGTCA CAGCGTACAA GGAGGGATAT3121 GGAGAAGGTT GCGTAACCAT TCATGAGATC GAGAACAATA CAGACGAACT GAAGTTTAGC3181 AACTGTGTAG AAGAGGAAGT ATATCCAAAC AACACGGTAA CGTGTAATGA TTATACTGCG3241 ACTCAAGAAG AATATGAGGG TACGTACACT TCTCGTAATC GAGGATATGA CGGAGCCTAT3301 GAAAGCAATT CTTCTGTACC AGCTGATTAT GCATCAGCCT ATGAAGAAAA AGCATATACA3361 GATGGACGAA GAGACAATCC TTGTGAATCT AACAGAGGAT ATGGGGATTA CACACCACTA3421 CCAGCTGGCT ATGTGACAAA AGAATTAGAG TACTTCCCAG AAACCGATAA GGTATGGATT3481 GAGATCGGAG AAACGGAAGG AACATTCATC GTGGACAGCG TGGAATTACT TCTTATGGAG3541 gaataa
序列表<110>国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所深圳市匹基生物工程股份有限公司<120>一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒<130><160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>1ccgccgcgag ctgaccctga ccgtg 25<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2cgcgactgga tcagtaca 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>3tggggaacag gctcacgat 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>4tggcgtgtcc gtccctgatg c 21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5tgaacccatg catgcagt 18<210>6<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>6ggcaagacca ttggtga1权利要求
1.一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列，其特征在于所述的探针序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的探针序列。
2.据权利要求1所述的一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列，其特征在于所述的探针序列为ccgccgcgagctgaccctgaccgtg。
3.一种根据权利要求2所述的一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为核酸提取试剂核酸扩增试剂Cry PCR反应液Zein PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量标准品Cry-STND1(2.0％)Cry-STND2(0.5％)Cry-STND3(0.1％)Cry-定量阴性对照其中PCR反应液的上游引物序列CGCGACTGGATCAGGTACA下游引物序列TGGGGAACAGGCTCACGAT所述的Zein基因最佳引物/探针序列如下上游引物序列tgaacccatgcatgcagt下游引物序列ggcaagaccattggtga探针tggcgtgtccgtccctgatgc
4.根据权利要求3所述的一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列做成的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒的组成为CTAB法核酸提取试剂CTAB缓冲液 40ml×1管CTAB沉淀缓冲液 40ml×1管沉淀溶解液 24ml×1管核酸扩增试剂Cry PCR反应液 1ml×1管Zein PCR反应液 1ml×1管Taq酶(5U/ul) 20ul×1管UNG(1U/ul) 5ul×1管定量标准品Cry-STND1(2.0％) 30ul×1管Cry-STND2(0.5％) 30ul×1管Cry-STND3(0.1％) 30ul×1管Cry-定量阴性对照 30ul×1管其中Cry定量PCR反应液配方试剂成份 终浓度或体积10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulCrylAb上游引物 0.46mMCrylAb下游引物 0.46uMCrylAb探针 0.23uM加水至 17.3ulZein-PCR反应液配方试剂成份 终浓度或体积10×buffer 2ul25mM MgCl22ul100mM dATP 0.04ul100mM dCTP 0.04ul100mM dGTP 0.04ul100mM dUTP 0.04ulZein上游引物 0.46mMZein下游引物 0.46uMZein探针 0.23uM加水至 17.3ul
5.权利要求2所述的一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针，其特征在于所述的探针用作杂交探针检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米。
全文摘要
一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒，所述的探针序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的探针序列。试剂盒包括核酸提取试剂，核酸扩增试剂，定量标准品，其中，核酸扩增试剂包括CryPCR反应液、ZeinPCR反应液、Taq酶、UNG等，标准品包括Cry1A(b)不同浓度的阳性品以及阴性对照品。本发明的优点是对转基因作物检测灵敏度可达0.1％，具有良好的灵敏度和特异性。定量偏差为5％－20％，检测效率已达核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。采用了植物内源基因Zein作为内标，避免核酸提取造成的误差及假阴性的产生。实行了实时监测，大大节省检测时间，节约人力物力。
文档编号C12Q1/68GK1485435SQ02131290
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月24日 优先权日2002年9月24日
发明者朱文斯, 朱水芳, 黄茜华 申请人:深圳市匹基生物工程股份有限公司, 国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所