专利名称：发酵生产门冬酰胺酶的方法
技术领域：
本发明属于生物发酵领域，更具体地说是关于一种发酵生产门冬酰胺酶的方法。
背景技术：
门冬酰胺酶是治疗急性淋巴白血病的重要药物，在治疗小儿急性淋巴细胞白血病中有着不可替代的作用。国内现有的生产门冬酰胺酶技术存在很多不足，主要是①发酵效价低(10单位/毫升)，生产成本过高而不适合市场的要求，②发酵效价高的只局限于基因工程菌，且分离提纯技术达不到要求。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高效表达生产门冬酰胺酶的方法。
本发明的方法包括平板培养、种子罐培养、发酵罐培养，具体工艺过程如下(1)平板培养将冻干的大肠杆菌菌种用水溶解后，涂布至凝固有培养基的平皿上于36-40℃培养10-36小时；(2)种子罐培养将(1)中已长好的平皿菌种接入种子罐中，在36-40℃，转速250-500转/分，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分的条件下，培养10-16小时；(3)发酵罐培养将(2)中已培养好的种子罐菌种接入发酵罐中，接种量为10-30％，在36-40℃，转速180-350转/分，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分，pH 6.5-7.5的条件下，培养10-16小时；其中平板培养所用培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏2-6％、无机盐0.1-2％、琼脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中种子罐和发酵罐培养所用的液体培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏2-6％、玉米浆0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
本发明的方法中，平板培养所用培养基的组分及重量百分含量的优选方案为牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、琼脂1-2％、pH6.5-7.5；种子罐和发酵罐培养所用的液体培养基的组分及重量百分含量的优选方案为牛肉膏3-5％、玉米浆1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
本发明中对所使用的大肠杆菌菌种可以是野生的大肠杆菌菌种，也可以是经过化学或物理诱变的大肠杆菌菌种，诱变因子为常规的处理因子，如紫外线(UV)，氯化锂(LiCl)等。
利用本发明的方法，门冬酰胺酶的产酶单位达到50-80单位/毫升，生产门冬酰胺酶针剂原材料成本大大降低。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明的方法作进一步的说明。
实施例1(1)平板培养准备10个平皿，牛皮纸包好，灭菌备用。按牛肉膏3.5％，NaCl 1％，琼脂1.2％，pH 6.8的配方，配300毫升培养基，装在500毫升三角瓶中，灭菌，冷却至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。将冻干的大肠杆菌野生菌种用200微升无菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培养14小时。
(2)种子罐培养发酵培养配方牛肉膏3.5％，玉米浆2％，酵母粉1％，味精1.5％，pH 6.8。
种子罐采用100升罐，以装量为60升计，则应按上述配方配60升培养基(实际只加水至55升，预算灭菌后的蒸汽冷凝水为5升)，配好培养基后加入100升罐中，灭菌，待温度下降至40℃时，接入已长好的3个平皿菌种(用无菌水稍冲洗)，控制温度39℃，转速300转/分，风量1∶1体积/体积/分，培养时间14小时。
(3)发酵罐培养发酵采用500升发酵罐，实际装量为300升，减去种子罐菌种60升，实际配培养基量为300-60＝240升，按步骤(2)中所述配方，配240升培养基装于500升罐中，灭菌，冷却至40℃时，把已培养好的种子罐菌种接入500升罐内，控制温度39℃，转速250转/分，风量1∶1体积/体积/分，pH 7.0，13小时后离心，收集菌体，即得门冬酰胺酶粗品。发酵效价为60单位/毫升。
实施例2(1)平板培养准备10个平皿，牛皮纸包好，灭菌备用。按牛肉膏4％，NaCl 1％，琼脂1.5％，pH 7.0的配方，配300毫升培养基，装在500毫升三角瓶中，灭菌，冷却至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。将冻干的经紫外线(UV)诱变的大肠杆菌菌种用200微升无菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培养14小时。
(2)种子罐培养发酵培养配方牛肉膏4％，玉米浆2％，酵母粉1.5％，味精1.8％，pH 7.0。
种子罐采用100升罐，以装量为60升计，则应按上述配方配60升培养基(实际只加水至55升，预算灭菌后的蒸汽冷凝水为5升)，配好培养基后加入100升罐中，灭菌，待温度下降至40℃时，接入已长好的3个平皿菌种(用无菌水稍冲洗)，控制温度39℃，转速300转/分，风量1∶1体积/体积/分，培养时间14小时。
(3)发酵罐培养发酵采用500升发酵罐，实际装量为300升，减去种子罐菌种60升，实际配培养基量为300-60＝240升，按本实施例步骤(2)中所述配方，配240升培养基装于500升罐中，灭菌，冷却至40℃时，把已培养好的种子罐菌种接入500升罐内，控制温度39℃，转速250转/分，风量1∶1体积/体积/分，pH 7.0，13小时后离心，收集菌体，即得门冬酰胺酶粗品。发酵效价为78单位/毫升。
权利要求
1.一种发酵生产门冬酰胺酶的方法，包括平板培养、种子罐培养、发酵罐培养，其特征在于(1)平板培养将冻干的大肠杆菌菌种用水溶解后，涂布至凝固有培养基的平皿上于36-40℃培养10-36小时；(2)种子罐培养将(1)中已长好的平皿菌种接入种子罐中，在36-40℃，转速250-500转/分，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分的条件下，培养10-16小时；(3)发酵罐培养将(2)中已培养好的种子罐菌种接入发酵罐中，接种量为10-30％，在36-40℃，转速180-350转/分，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分，pH6.5-7.5的条件下，培养10-16小时；其中平板培养所用培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏2-6％、无机盐0.1-2％、琼脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中种子罐和发酵罐培养所用的液体培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏2-6％、玉米浆0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的发酵生产门冬酰胺酶的方法，其特征在于平板培养所用培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、琼脂1-2％、pH 6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的发酵生产门冬酰胺酶的方法，其特征在于种子罐和发酵罐培养所用的液体培养基的组分及重量百分含量为牛肉膏3-5％、玉米浆1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的发酵生产门冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的大肠杆菌菌种可以是野生型的，也可以是经过化学或物理诱变的大肠杆菌菌种。
全文摘要
本发明属于生物发酵领域，提供了一种发酵生产门冬酰胺酶的方法。以大肠杆菌为出发菌进行发酵生产，在适合的培养基和培养条件下，能使门冬酰胺酶获得高效表达，产酶单位为50－80单位/毫升。使用本发明的方法生产门冬酰胺酶针剂，原材料成本大大降低。
文档编号C12N9/78GK1397645SQ0213457
公开日2003年2月19日 申请日期2002年8月19日 优先权日2002年8月19日
发明者梁淑娃, 彭中健, 杜少平, 杨冠东 申请人:广州市微生物研究所