专利名称：棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程技术领域中的克隆、表达技术，具体涉及棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及克隆、表达技术。
昆虫幼虫要经过多次蜕皮才能变为成虫，蜕皮过程是由体内的蜕皮激素引起的，在昆虫生长发育过程中，蜕皮激素(Ecdysteroid)的滴度呈现出周期性的变化，在蜕皮激素滴度升高时，昆虫停止取食，行动迟缓，最后蜕皮，在体内则引发一系列级联反应，蜕皮激素与蜕皮激素结合蛋白(Ecdysteroid receptor，EcR)及ultraspiracle(USP)结合成为三聚体，然后结合在DNA上，诱导产生蜕皮调节转录因子(molt regulatingtranscription factor，又称为激素结合子，Hormone Receptor，HR3)。蜕皮调节转录因子(HR3)有多种功能，它结合于DNA，启动蜕皮早期必需的蛋白酶和几丁质酶表达，使旧表皮中的蛋白质和几丁质被分解吸收，同时阻遏幼虫表皮蛋白表达，并结合蜕皮激素使蜕皮激素水平下降，随着蜕皮激素水平下降，不再产生蜕皮调节转录因子，表皮蛋白得以表达，形成新的表皮，同时，在蜕皮激素下降后，蜕壳激素(EclosionHormone)释放，使旧表皮脱落，多巴脱羧酶也在蜕皮激素下降后出现，合成表皮硬化必需的前体物一多巴胺，使表皮完成鞣化和硬化。如果人为使虫体内持续产生蜕皮调节转录因子，它可结合于DNA，启动蜕皮早期反应，同时它的持续存在又抑制表皮蛋白表达，使新表皮不能产生，蜕皮晚期基因不能表达，从而导致虫体死亡。
国外已对烟草天蛾、枞色卷蛾、蜡螟、果蝇的蜕皮调节转录因子进行了分子克隆和作用机理研究，基因库(GenBank)检索结果证明目前尚无棉铃虫蜕皮调节转录因子的研究报道。昆虫核多角体病毒具有种属特异性，不感染人及其它脊椎动物，国内外均已经用做生物杀虫剂并在大田应用，但野生型核型多角体病毒杀虫速度较慢，在自然界使用达不到理想的防虫效果。通过基因工程方法，将棉铃虫蜕皮调节转录因子基因转入核型多角体病毒，可以使害虫提前进入蜕皮，从而增加核型多角体病毒的杀虫速度。通过基因工程方法，将棉铃虫蜕皮调节转录因子基因转入作物体内，可以引起取食的害虫进入非正常的提前蜕皮导致死亡，达到控制害虫的目的。由于棉铃虫属于鳞翅目夜蛾科，因此该项发明对其它鳞翅目害虫、特别是夜蛾科害虫的防治具有参考意义。
本发明从棉铃虫中克隆到棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，它具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度1668碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b) 分子类型cDNA(c) 假设否(d) 反义否(e) 最初来源棉铃虫(Helicoverpa armigera)(f) 序列描述SEQ ID NO.1atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga60ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag120ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac180atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg240ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct300caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc360gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac420taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag480tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga540cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag600atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg660agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg720tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag780cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg840gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag900ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc960aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac1020tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg1080attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat1140gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga1200ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa1260tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca1320aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg1380ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac1440atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac1500gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg1560cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc1620tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度556氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述Met Asn Asn Asn Gln Phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro1 5 10 15Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His16 20 25 30Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro31 35 40 45His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp46 50 55 60Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly61 65 70 75Ser Ser Asp Gly Met Phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met76 80 85 90Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile91 95 100 105Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly106 110 115 120Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln121 125 130 135Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val136 140 145 150Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln151 155 160 165Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly166 170 175 180Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg181 185 190 195Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp196 200 205 210Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln211 215 220 225Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu226 230 235 240Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn241 245 250 255Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp256 260 265 270Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys271 275 280 285Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu286 290 295 300Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His301 305 310 315Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu Phe Ile His Glu Met Phe Arg316 320 325 330Lys Pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr331 335 340 345Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met346 350 355 360Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met361 365 370 375Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser376 380 385 390Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn391 395 400 405Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu406 410 415 420Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly421 425 430 435Ile Phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu436 440 445 450Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu451 455 460 465Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn466 470 475 480Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala481 485 490 495Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys496 500 505 510Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu511 515 520 525Cys Arg Phe Lys Ala Ala His Pro His His Val Phe Pro Ala Leu526 530 535 540Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His541 545 550 555Gly556本发明的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法如下(1)从棉铃虫提取总RNA或mRNA，然后反转录合成cDNA；(2)根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物正向引物5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’反向引物5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；(4)将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。
上述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法具体操作如下从田间采集或人工饲养的棉铃虫中，采用一步法或RNA kit提取总RNA，或者用mRNAkit分离提取mRNA。
然后利用5～10微克总RNA或mRNA反转录合成cDNA。cDNA第一链合成5～10微克总RNA或mRNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。
链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件如下首先将下列试剂混在一起10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl)1μl反向引物(1.25μg/μl)1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μlTaq DNA聚合酶0.25μl灭菌水 37.75μl总体积 50μl链式聚合酶(PCR)反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果扩增到一个DNA片段。将扩增产物纯化，取3μl纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取3个白斑，提取质粒，用于序列测定。
测序得到一个开放阅读框部分，1668bp，由此推得具556个氨基酸的一段序列，将此序列放入国际基因库中检索，与已发表的埃及伊蚊、家蚕、果蝇等动物的蜕皮调节转录因子的序列比较，结果显示一致性为70％左右，因此可以确定该基因为一种新的蜕皮调节转录因子。
上述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。
根据棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA序列，设计表达引物，通过基因重组技术将该蜕皮调节转录因子重组到昆虫核型多角体病毒，产生有杀虫活性的蜕皮调节转录因子基因重组核型多角体病毒，获得具有生产价值的基因重组病毒杀虫剂；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子重组到作物，增加作物抗虫性，获得具有抗虫能力的作物，利于害虫的防治。
本发明克隆到棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，通过在昆虫核型多角体病毒中进行表达，可获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子转入作物，可获得具有抗虫能力的作物。
具体实施方式
实施例1棉铃虫(Helicoverpa armigera)，田间采集。
1.总RNA的提取采用现有技术一步法提取总RNA。
2.cDNA第一链合成6微克总RNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。
3.PCR反应链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件首先将下列试剂混在一起·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)·模板 cDNA 1μl·正向引物(1.25μg/μl)1μl·反向引物(1.25μg/μl)1μl·脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶0.25μl·灭菌水 37.75μl·总体积 50μl正向引物5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’反向引物5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’PCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
4.反应产物纯化利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。
5.棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA克隆取纯化产物3微升，连接于pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。
6.质粒纯化收取过夜培养菌液2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
7.序列测定与同源检索取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。
所得基因具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列。
实施例2如实施例1所述，所不同的是棉铃虫是人工饲养的，采用RNA kit提取总RNA。然后用8微克总RNA进行cDNA第一链合成。
实施例3如实施例1所述，所不同的是用mRNA kit分离提取mRNA。然后用10微克mRNA进行cDNA第一链合成。质粒纯化中收取过夜培养菌液1毫升进行质粒纯化。
实施例4将实施例1获得的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA通过现有技术基因工程方法，转入昆虫核型多角体病毒中，在昆虫细胞或昆虫体内表达，生产具有杀虫功能的基因重组病毒实施例5
将实施例2获得的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA通过现有技术基因工程方法，转入植物体内，如棉花，增加其抗虫性，在大田中应用。
按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰棉铃虫蜕皮调节转录因子基因并用于所述研究和生产。
序列表<110>山东大学<120>棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用<140><141><160>2<170>Patent In3.1<210>1<211>1668<212>cDNA<213>棉铃虫(Helicoverpa armigera)<400>1atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga60ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag120ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac180atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg240ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct300caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc360gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac420taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag480tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga540cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag600atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg660agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg720tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag780cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg840gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag900ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc960aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac1020tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg1080attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat1140gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga1200ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa1260tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca1320aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg1380ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac1440atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac1500gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg1560cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc1620tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668<210>2<211>556<212>PRT<213>棉铃虫(Helicoverpa armigera)<400>2Met Asn Asn Asn Gln Phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro1 5 10 15Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His20 25 30Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro35 40 45His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp50 55 60Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly65 70 75Ser Ser Asp Gly Met Phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met80 85 90Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile95 100 105Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly110 115 120Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln125 130 135Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val140 145 110Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln155 160 165Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly170 175 180Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg185 190 195Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp200 205 210Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln215 220 225Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu230 235 240Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn245 250 255Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp260 265 270Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys275 280 285Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu290 295 300Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His305 310 315Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu Phe Ile His Glu Met Phe Arg320 325 330Lys Pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr335 340 345Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met350 355 360Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met365 370 375Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser380 385 390Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn395 400 405Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu410 415 420Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly425 430 435Ile Phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu440 445 450Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu455 460 465Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn470 475 480Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala485 490 495Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys500 505 510Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu515 520 525Cys Arg Phe Lys Ala Ala His Pro His His Val Phe Pro Ala Leu530 535 540Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His545 550 555Gly55权利要求
1.一种克隆的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，其特征在于，具有如下序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度1668碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉铃虫(Helicoverpa armigera)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga60ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag120ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac180atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg240ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct300caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc360gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac420taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag480tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga540cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag600atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg660agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg720tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag780cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg840gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag900ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc960aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac1020tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg1080attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat1140gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga1200ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa1260tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca1320aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg1380ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac1440atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac1500gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg1560cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc1620tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度556氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述Met Asn Asn Asn Gln Phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro1 5 10 15Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His16 20 25 30Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro31 35 40 45His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp46 50 55 60Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly61 65 70 75Ser Ser Asp Gly Met Phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met76 80 85 90Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile91 95 100 105Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly106 110 115 120Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln121 125 130 135Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val136 140 145 150Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln151 155 160 165Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly166 170 175 180Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg181 185 190 195Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp196 200 205 210Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln211 215 220 225Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu226 230 235 240Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn241 245 250 255Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp256 260 265 270Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys271 275 280 285Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu286 290 295 300Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His301 305 310 315Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu Phe Ile His Glu Met Phe Arg316 320 325 330Lys Pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr331 335 340 345Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met346 350 355 360Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met361 365 370 375Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser376 380 385 390Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn391 395 400 405Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu406 410 415 420Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly421 425 430 435Ile Phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu436 440 445 450Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu451 455 460 465Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn466 470 475 480Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala481 485 490 495Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys496 500 505 510Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu511 515 520 525Cys Arg Phe Lys Ala Ala His Pro His His Val Phe Pro Ala Leu526 530 535 540Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His541 545 550 555Gly556
2.一种权利要求1所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，包括如下步骤(1)从棉铃虫提取总RNA或mRNA，然后反转录合成cDNA；(2)根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物正向引物5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’反向引物5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；(4)将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。
3.如权利要求2所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，所述步骤(1)中反转录合成cDNA是第一链合成cDNA，取5～10微克总RNA或mRNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶，42℃反应90分钟，70℃反应10分钟终止反应。
4.如权利要求2所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，链式聚合酶反应试剂与条件如下首先将下列试剂混在一起10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板 cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μlTaq DNA聚合酶0.25μl灭菌水 37.75μl总体积 50μl链式聚合酶反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
5.一种权利要求1所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子专入作物，获得具有抗虫能力的作物按照本发明的方法通过现有基因工程方法，修饰棉铃虫蜕皮调节转录因子基因并用于所述研究和生产。
全文摘要
棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用，属于生物基因工程技术领域。棉铃虫蜕皮调节转录因子具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列。本发明的克隆方法是，从棉铃虫中提取总RNA或mRNA，反转录合成cDNA；根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物，通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pGEM－T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。本发明棉铃虫蜕皮调节转录因子，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子专入作物，获得具有抗虫能力的作物。
文档编号C12N15/12GK1448398SQ02135768
公开日2003年10月15日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者赵小凡, 王金星 申请人:山东大学