专利名称：一种活性茯苓多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵和分离纯化技术领域，尤其涉及一种活性茯苓多糖的制备方法。
背景技术：
茯苓多糖早在70年代即已被证实具有抗肿瘤的作用，同时它还被证实是一种很强的免疫增强物质。但是从天然茯苓中提取这种具有抗肿瘤作用的茯苓多糖却并非容易，因为天然茯苓中的茯苓多糖是由50个以β1→3键结合的葡聚糖伴有1～2个以β1→6键结合的葡聚糖基间隔而成。抗肿瘤实验表明，这种多糖无抗肿瘤活性，需要将以β1→6键结合的葡聚糖去除，才能得到具有抗肿瘤活性的茯苓多糖。目前，制备茯苓多糖一般是采用化学半合成法，该方法是以茯苓粉末为原料，通过碱性溶媒提取、沉淀粗多糖、精制工艺得到茯苓多糖精制品，再通过氧化、羧甲基化得到具有抗肿瘤作用的茯苓多糖。这种制备茯苓多糖的方法工艺比较复杂、加工成本比较高，因此，在一定程度上限制了茯苓多糖的生产。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺简单、加工成本较低的活性茯苓多糖的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，该方法采用生物发酵工艺，其工艺步骤如下a.菌种培养取用液氮保存的茯苓菌种，移植在PDA斜面培养基上，在28℃～32℃温度下培育10～15天，得到培养好的茯苓菌种；
b.菌丝体的发酵制备采用三级通气发酵法，生产周期60～72小时，具体工艺流程如下取步骤a中茯苓菌种的菌丝体，移入有液体培养基的三角烧瓶中，在20～30℃温度下往复振荡5～7天，往复振荡的冲程4～10cm，振荡频率100～120rpm，接种量5％(v/v)；将摇瓶培养物合并，移入种子罐中，罐内装料70％(v/v)，接种量10％(v/v)，搅拌速度200～250rpm，通气量1∶0.4v/vmin，罐压0.4×105Pa，28～30℃温度下通气培养36～60小时后移入繁殖罐；繁殖罐菌丝体长浓后，再以1∶10的体积比扩大繁殖到发酵罐；发酵罐罐温为28～32℃，通气量1∶1(v/v)，搅拌速度100～200rpm，发酵罐繁殖60～72小时后，酵液经板框压滤，得菌丝体滤饼；c.茯苓多糖的提取将步骤b制得的滤饼加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加沸水回流浸取3～5小时，得到浸取液；将浸取液再经真空薄膜浓缩，取1份浓缩液加3倍体积95％(重量％)乙醇，在0～4℃条件下醇析8小时，取醇析物喷雾干燥，即得褐色粉末状的活性茯苓多糖提取物；或者将浸取液过超滤膜，收集滤液，经喷雾干燥，即得褐色粉末状的活性茯苓多糖提取物。
所述的步骤a中，PDA斜面培养基的配方如下马铃薯汁960ml、葡萄糖20克、琼脂20克，PH5.5～6.5。
所述的马铃薯汁采用以下方法得到去皮马铃薯200克，加水煮沸5分钟，取汁，加水至1000ml，在1.2kg/cm2下灭菌30分钟。
所述的步骤b中，液体培养基的配方为黄豆芽煮汁1000ml、葡萄糖10克、磷酸氢二钾0.5克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁0.1克，PH5.5～6.5。
所述的黄豆芽煮汁采用以下方法得到用200克黄豆芽加水1000ml煮10分后取汁。
所述的步骤b中，发酵罐的发酵培养基配方(重量％)如下黄豆饼粉4％、蔗糖2％、蛋白胨0.2％、酵母粉0.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.06％、加水至100％，PH5.5～6.5。
按照上述方法生产的茯苓多糖提取物与现有工艺制备品的比较如下本发明 现有工艺有效成分 多糖多肽羧甲基多糖生产原料 深层培养菌丝体茯苓子实体重金属≤1mg/Kg ≤10mg/Kg适应症抗肿瘤、抗花粉过敏、改善肾功能抗肿瘤制备方法 深层发酵 化学半合成加工成本 为现有工艺加工成本的30％用生物发酵法提取制备活性茯苓多糖的生产工艺，可不经过现有工艺中的氧化及羧甲基化过程，制得品即为以β1→3键结合的葡聚糖组成的活性茯苓多糖提取物。
具体实施例方式
下面将结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1取用液氮保存的茯苓菌种(Poria cocos)，移植在PDA(马铃薯—葡萄糖—琼脂)斜面培养基上，在28～32℃温度下培育10天，PDA配方如下马铃薯汁*960ml、葡萄糖20克、琼脂20克、PH5.5～6.5*去皮马铃薯200克，加水煮沸5分钟，取汁，加水至1000ml，灭菌(1.2Kg/cm2)30分钟。
取斜面菌种的菌丝体，移入有100毫升液体培养基的500毫升三角烧瓶中，25℃往复振荡5天。冲程4cm，振荡频率100rpm，接种量5％。将摇瓶培养物合并，以压差法移入50～100毫升种子罐中，罐内装料70％(V/V)，接种量10％(V/V)，搅拌速度200rpm，通气量1∶0.4V/V·min，罐压0.4×105Pa。28℃通气培养48小时后移入500立升繁殖罐。繁殖罐菌丝体长浓后，再以1∶10的体积比扩大繁殖到发酵罐。罐温28～32℃，通气量1∶1(V/V)，搅拌速度100～200rpm。
发酵培养基配方黄豆饼粉4％，蔗糖2％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.06％，加水至100％，PH5.5～6.5。
发酵罐繁殖60～72小时后，酵液经板框压滤，得菌丝体滤饼。将滤饼加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加沸水回流浸取3～5小时，将浸取液再经真空薄膜浓缩，取1份浓缩液加3份95％乙醇，在0～4℃条件下醇析8小时，取醇析物喷雾干燥，即可获得褐色粉末状的茯苓多糖提取物。
实施例2取低温保藏的茯苓(Poria cocos)斜面菌种一支，移入装有50毫升黄豆芽汁培养基的1500毫升培养瓶中，通气培养5天，其培养基配方为黄豆芽煮汁*1000ml葡萄糖10g 磷酸氢二钾0.5g 磷酸二氢钾0.5g 硫酸镁0.1g PH5.5～6.5*用200克黄豆芽加水1000ml煮10分钟后取汁。
然后依次加入50毫升种子罐，500毫升繁殖罐，及5吨发酵罐中通气培养2～3天，将发酵罐经压滤后收得的湿菌丝体用沸水浸取3小时，将浸取液通过超滤膜(1万分子量)，在4KG/CM2氮气压力下滤除小于1万分子量的物质。然后用15万分子量的滤膜过滤，收集滤液，经喷雾干燥即得。
实施例3一种活性茯苓多糖的制备方法，其工艺步骤a.菌种培养、b.菌丝体的发酵制备与实施例1相同，所不同的是，工艺步骤c.茯苓多糖的提取中，滤饼加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加沸水回流浸取3～5小时，得到浸取液；将浸取液过超滤膜，收集滤液，经喷雾干燥，即得褐色粉末状的活性茯苓多糖提取物。
权利要求
1.一种活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，该方法采用生物发酵工艺，其工艺步骤如下a.菌种培养取用液氮保存的茯苓菌种，移植在PDA斜面培养基上，在28℃～32℃温度下培育10～15天，得到培养好的茯苓菌种；b.菌丝体的发酵制备采用三级通气发酵法，生产周期60～72小时，具体工艺流程如下取步骤a中茯苓菌种的菌丝体，移入有液体培养基的三角烧瓶中，在20～30℃温度下往复振荡5～7天，往复振荡的冲程4～10cm，振荡频率100～120rpm，接种量5％(v/v)；将摇瓶培养物合并，移入种子罐中，罐内装料70％(v/v)，接种量10％(v/v)，搅拌速度200～250rpm，通气量1∶0.4v/vmin，罐压0.4×105Pa，28～30℃温度下通气培养36～60小时后移入繁殖罐；繁殖罐菌丝体长浓后，再以1∶10的体积比扩大繁殖到发酵罐；发酵罐罐温为28～32℃，通气量1∶1(v/v)，搅拌速度100～200rpm，发酵罐繁殖60～72小时后，酵液经板框压滤，得菌丝体滤饼；c.茯苓多糖的提取将步骤b制得的滤饼加水10倍后，用细胞捣碎机打碎细胞，然后加沸水回流浸取3～5小时，得到浸取液；将浸取液再经真空薄膜浓缩，取1份浓缩液加3倍体积95％(重量％)乙醇，在0～4℃条件下醇析8小时，取醇析物喷雾干燥，即得褐色粉末状的活性茯苓多糖提取物；或者将浸取液过超滤膜，收集滤液，经喷雾干燥，即得褐色粉末状的活性茯苓多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中，PDA斜面培养基的配方如下马铃薯汁960ml、葡萄糖20克、琼脂20克，PH5.5～6.5。
3.根据权利要求2所述的的活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，所述的马铃薯汁采用以下方法得到去皮马铃薯200克，加水煮沸5分钟，取汁，加水至1000ml，在1.2kg/cm2下灭菌30分钟。
4.根据权利要求1所述的活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中，液体培养基的配方为黄豆芽煮汁1000ml、葡萄糖10克、磷酸氢二钾0.5克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁0.1克，PH5.5～6.5。
5.根据权利要求4所述的活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，所述的黄豆芽煮汁采用以下方法得到用200克黄豆芽加水1000ml煮10分后取汁。
6.根据权利要求1所述的活性茯苓多糖的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中，发酵罐的发酵培养基配方(重量％)如下黄豆饼粉4％、蔗糖2％、蛋白胨0.2％、酵母粉0.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.06％、加水至100％，PH5.5～6.5。
全文摘要
本发明涉及一种活性茯苓多糖的制备方法，用深层发酵法对茯苓菌种进行菌丝体培养，经繁殖、发酵、提取、精制等工艺步骤制得。与现有工艺相比，本发明工艺无需经过氧化及羧甲基化等化学处理，大大降低了加工成本。所得到的产品除具备现有工艺产品的抗肿瘤作用外，还适用于抗花粉过敏及改善肾功能。
文档编号C12P19/00GK1483827SQ0213700
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月16日 优先权日2002年9月16日
发明者杨庆隆 申请人:上海大杨保健品科技发展有限公司