专利名称：一种用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和甲壳素及用甲壳素制备壳聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种从蝇蛆中提取蛋白质和甲壳素的方法，特别是一种用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和甲壳素及用甲壳素制备壳聚糖的方法，属于生物技术酶解蝇蛆蛋白质技术领域。
背景技术：
蝇蛆是一种繁殖速度快、营养价值高的昆虫，含有优质的蛋白质和甲壳素资源。目前已能形成大规模养殖蝇蛆的水平。但目前蝇蛆主要作为替代型饲料，产品的技术含量低，经济效益差，严重阻碍了蝇蛆养殖业的发展。近年来，随着人们对蝇蛆营养价值和功能活性的深入认识，对蝇蛆的利用已由替代型饲料转向食品、保健品、医药、化妆品等高附加值用途的深层次开发。
目前蝇蛆蛋白粉的生产主要采用机械法或化学法，如将蝇蛆湿法粉碎，直接干燥；或将蝇蛆干燥后再粉碎。这种蝇蛆蛋白粉产品的水溶性差、色泽差，还具有较重的腥味，仅用于动物饲料配方或作为动物饲料添加剂，应用领域受到较大的限制。有关蝇蛆甲壳素的提取主要利用机械破碎，清洗，获得蝇蛆皮后，再用稀酸稀碱处理，脱除蛋白、脱色、脱钙等工艺流程。但由于机械法制得的蛆皮中蛋白质含量较高，后续加工复杂，加工时间长，蛋白质资源浪费较大，生产过程污染严重。更重要的是在加工过程中尚无有效地去除黑色口腔和黄色内脏的方法，这些都影响了甲壳素和壳聚糖产品的聚合度、色泽和杂质度，使产品质量下降。
从相关文献看出，虽已有将蝇蛆用于动物蛋白粉配方和作为动物蛋白饲料添加剂的公开文献报道，并已有从蝇蛆中用化学法提取蝇蛆甲壳素的公开文献报道，如中国专利971164908、981034462、991193911、001002651等，但国内外未见用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和回收甲壳素的报道。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明要解决的技术问题是利用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和回收甲壳素；将蝇蛆水解蛋白脱腥增香；利用酶法水解和结合物理法筛洗，将蝇蛆甲壳素中的黄色物和黑点(蝇蛆口腔)除去；从蝇蛆甲壳素制备壳聚糖，使壳聚糖脱乙酰度≥85％，达到食品卫生标准。
(2)技术方案一种从蝇蛆中提取蛋白质的方法。它是应用酶水解方法来提取蝇蛆蛋白质，再利用美拉德(Maillard)反应进行脱腥增香。其工艺流程框图如附图所示。本发明利用生物技术酶水解法从蝇蛆中提取水解蛋白，应用酶水解将大分子蛋白质变成水溶性多肽和氨基酸，同时通过选择特定的酶种和条件优化防止酶解产生的苦味。将经酶解得到的蝇蛆蛋白质利用美拉德反应进行风味修饰，消除腥味，这样可大大提高蛋白质的溶解性和风味。以新鲜蝇蛆为原料，加水进行胶磨破碎，加热保温预处理，加酶进行酶水解反应，灭酶，过滤，滤液进行美拉德反应脱腥增香，浓缩或不浓缩，喷雾干燥，制得产品蝇蛆水解蛋白粉。
酶水解法工艺胶磨破碎用1份蝇蛆加1～3份水(w/w，重量比，下同)进行胶磨破碎，得2～4份蝇蛆浆料，根据加工要求可加水调配蝇蛆浆料浓度。
加热保温预处理将蝇蛆浆料于60～90℃加热处理10～60分钟，冷却至60℃以下。
酶水解反应以蛋白质水解度的大小和苦味多少为指标，从多种蛋白酶中选择比较合适蝇蛆蛋白水解的酶种。酶种采用碱性蛋白酶、AS.1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味酶、中性蛋白酶的单种酶或两种酶的复合酶。工艺条件经正交试验分析，影响水解度的各因素主次关系为温度＞时间＞酶底比＞pH。酶解条件为温度30～55℃，时间1～4小时，酶底比(u/g)50～700，pH6.5～8.5。反应结束灭酶。
过滤滤液为蝇蛆蛋白液，滤渣为蝇蛆皮。滤液进行美拉德反应脱腥增香。
酶解蛋白液脱腥增香采用美拉德反应进行后修饰，达到增香和除腥的目的。反应利用酶水解产生的氨基酸和加入少量糖，根据下列配比进行。
原料及其配比
反应条件温度100～125℃，时间30～100分钟。
制备蛋白粉反应液浓缩，喷雾干燥，制得产品蝇蛆水解蛋白粉。产品中蛋白质含量≥60％。
也可以酶解液灭酶后不经过过滤，在相同工艺条件下直接将酶解液进行美拉德反应脱腥增香，浓缩或不浓缩，喷雾干燥，制得蝇蛆水解蛋白粉，蛋白质含量≥54％。
一种从蝇蛆中提取甲壳素(Chitin)的方法。它是如上所述，蝇蛆经酶水解后，以过滤分离蝇蛆蛋白液后的滤渣经酶水解的蝇蛆皮为原料，经脱蛋白和脱钙，制备蝇蛆甲壳素成品。其工艺流程框图如附图所示。通过酶水解提取蝇蛆蛋白质后，蝇蛆皮中主要成分为甲壳素，还有少量蛋白质、脂肪和灰分(碳酸钙盐)等，与虾蟹壳相比，蝇蛆皮中甲壳素含量高，蛋白质和钙盐的含量低，这就决定蝇蛆甲壳素提取工艺与虾蟹壳甲壳素提取工艺有较大的不同。因此，采用合理的脱蛋白和脱钙工艺条件对提高甲壳素的质量是极其重要的。应用生物技术酶水解法除水解去除蝇蛆皮中的蛋白质外，还可同时水解蝇蛆皮中黑色的口器和黄色的内脏，再经过物理法可有效去除产品甲壳素中的杂质。提取甲壳素的工艺为蝇蛆皮筛洗，碱煮脱蛋白，清洗至中性，酸浸脱钙，清洗至中性，干燥，制得蝇蛆甲壳素成品。
脱蛋白用NaOH溶液进行脱蛋白，碱液浓度2～6％(w/w)，温度60～100℃，液固比(ml/g)3～10，反应时间1～5小时。
脱钙蝇蛆皮经脱蛋白，筛洗去杂质后，留下的残渣清洗至中性，离心去水后，用稀盐酸溶液进行脱钙，盐酸浓度0.5～1.5mol/L，液固比2.0～9.0ml/g，反应时间20～60分钟，温度为室温，再用纯水清洗至中性，在低温下干燥得到蝇蛆甲壳素。
一种从蝇蛆甲壳素制备壳聚糖(Chitosan)的方法。它是以如上所述酶水解方法提取的蝇蛆甲壳素为原料，在浓碱液中进行脱乙酰反应而制备的壳聚糖产品。
壳聚糖是一种阳离子型直链氨基多糖，是甲壳素脱去分子中的乙酰基而形成的产物。壳聚糖的制备过程，实际也就是甲壳素这种酰胺类多糖的碱水解过程，即脱乙酰反应。脱乙酰反应的反应式如下R代表2-脱氧-D-葡萄糖基。
目前壳聚糖的制备原料主要为虾蟹甲壳素，通常是采用强碱在高温下处理甲壳素使其脱除大部分乙酰基而制得的。与虾蟹甲壳素相比，蝇蛆甲壳素灰分少，重金属含量低，品质稳定。脱乙酰度是壳聚糖的主要性能指标之一。食品级壳聚糖要求较高的脱乙酰度，即脱乙酰度≥85％。
本发明制备壳聚糖，是采用如上所述方法提取的蝇蛆甲壳素为原料，经碱水解，即脱乙酰反应而制备的壳聚糖产品。原料采用不粉碎的蝇蛆甲壳素，碱液采用NaOH溶液，碱浓度30～55％(w/w)，反应温度30～140℃，反应时间2～30小时，液固比为5～20ml/g。在优化工艺条件下，产品的脱乙酰度能达到88％以上。
(3)有益效果本发明通过详细研究蝇蛆蛋白质的酶水解工艺条件及甲壳素和壳聚糖的制备工艺条件，为蝇蛆资源的深度加工和综合利用提供了一条新途径。
通过蛋白质的提取率和溶出率的比较发现，酶法处理后蛋白质的提取率和溶出率达到92％和80％以上，而机械法分离仅为64％和24％。酶法显著改善了蛋白质的溶解性，提高了蛋白质的溶出率，增加了蛋白质的提取率。
采用美拉德反应，蛋白液达到增香和去腥的目的，在优化工艺条件下产品香味浓郁，腥味消失。
酶水解后的蝇蛆皮中蛋白质的含量低于机械破碎得到的蝇蛆皮。大大节约了脱蛋白工序中碱的用量和反应时间。酶水解后的蝇蛆皮中黑色口器和黄色内脏也被酶解，再经过筛洗，其中极大部分可容易被除去，少量残留在蝇蛆皮中的杂质经碱处理后加以筛洗也被进一步除去，镜检黑点除去率达98％以上。
蝇蛆壳聚糖由蝇蛆甲壳素制备。在优化工艺条件下，壳聚糖的脱乙酰度和得率均很高。经红外光谱和x-射线衍射分析，确证所得产品为壳聚糖。
蝇蛆蛋白质具有很高的营养价值。据国内外对蝇蛆营养成分的分析，蝇蛆(干基)含粗蛋白54～65％，脂肪10～14％，甲壳素8～10％和丰富的维生素、微量元素等，营养成分较全面。蝇蛆蛋白质中氨基酸比较齐全，所提供的氨基酸均能满足儿童和成人建议的氨基酸需要量。大量动物实验表明由蝇蛆制得的蝇蛆蛋白粉具有明显的免疫调节作用、抗疲劳作用、抗辐射作用、护肝作用及延缓衰老作用。应用酶水解制得的蝇蛆水解蛋白粉将大分子蛋白质变成水溶性多肽和氨基酸，食用后更易被人体所吸收。
酶水解法制备的蝇蛆蛋白质除具有很高营养价值外，还由于具有良好的溶解性、保水性、乳化性及抗氧化性等，可被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。
在食品工业中，水解蛋白是一种能很好地增强食品自然风味的调味基料，它可应用于各种风味型调味料和食品的营养强化剂，同时还可以提高食品的营养价值及贮藏安全性，作为一种天然的无限量食品添加剂可广泛用于各种食品之中，如肉制品加工、蛋白饮料、焙烤制品等。在化妆品工业中，水解蛋白具有良好的乳化性、润滑性和表面活性作用，是护肤品、护发品的优质基料之一。在医药工业中，口服水解蛋白可应用于需食用高蛋白的特殊人群，而对于缺乏蛋白质的病人，因肠胃功能衰退、严重烧伤、失血过多而不能口服者，注射水解蛋白是极为有效的方法。
壳聚糖是甲壳素最重要的衍生物之一，因其分子中含有游离的-NH2活性基团，当溶于酸性溶液时，可质子化而带上正电荷，是天然多糖中唯一碱性多糖，因而具有许多特殊的物理化学性质和生理、药理功能，已被许多学者誉为人体所必需的第六生命要素。
大量研究证实，甲壳素和壳聚糖具有多种功能，如降低胆固醇、保护肝脏、提高机体免疫力、降低体内尿酸、抑制胃酸分泌、调节平衡人体微量元素水平、降低食物的热量、抑菌防腐等。以甲壳素和壳聚糖为主要成分的保健食品正在被广泛开发，其保健功能有调节免疫、调节血脂、降低血糖等。
综上所述，本发明具有重要的经济效益和社会效益。
附图酶法提取蝇蛆蛋白质和甲壳素及用甲壳素制备壳聚糖的工艺流程示意图。
具体实施例方式实施例1
酶水解法从蝇蛆中提取水解蛋白和甲壳素。新鲜蝇蛆经胶磨破碎，浆料加热处理后，采用AS.1398蛋白酶，在酶底比500u/g、45℃和pH7.0下，水解3小时。此时水解度为18％，蛋白质溶出率为81％，水解液无苦味。
酶水解液灭酶，过滤，滤液经美拉德反应，120℃、反应60分钟时，产品的香味浓郁、腥味消失。喷雾干燥得到蝇蛆蛋白粉。
滤渣蝇蛆皮用于提取甲壳素，方法同下述实施例4。
实施例2酶水解法从蝇蛆中提取水解蛋白和甲壳素。采用AS.1398蛋白酶和风味酶，两者以1∶1(w/w)组成的复合酶进行酶解，其余条件同实施例1。水解后的水解度和蛋白质溶出率也能达到满意的结果。
实施例3酶水解法从蝇蛆中提取水解蛋白。在蝇蛆经过酶解后，酶解液直接经美拉德反应增香，喷雾干燥得到蝇蛆蛋白粉，蛋白质含量≥60％。
实施例4酶水解法从蝇蛆中提取甲壳素。将酶水解后得到的蛆皮筛洗去杂后，脱蛋白用5％NaOH溶液，100℃煮沸3小时，液固比9ml/g，清洗至中性；脱钙用1mol/L盐酸溶液，液固比6ml/g，反应50分钟，清洗至中性。
脱蛋白后的甲壳素经氨基酸分析证明，蛋白质去除率为97％(以氨基酸总量计)。脱钙后甲壳素的灰分含量为0.2％。
实施例5蝇蛆甲壳素脱乙酰化制备壳聚糖。将蝇蛆甲壳素在浓碱中进行脱乙酰化反应。采用温度120℃，时间3小时，碱浓度45％，液固比10ml/g。此时产品的脱乙酰度为88％，得率为75％。
权利要求
1.一种从蝇蛆中提取蛋白质的方法，其特征是应用酶水解方法来提取蝇蛆蛋白质，再利用美拉德反应进行脱腥增香，其工艺是以新鲜蝇蛆为原料，加水进行胶磨破碎，加热保温预处理，加酶进行酶水解反应，灭酶，过滤，滤液进行美拉德反应脱腥增香，喷雾干燥，制得产品蝇蛆水解蛋白粉；(1)酶水解法工艺胶磨破碎用1份蝇蛆加1～3份水(w/w，重量比，下同)进行胶磨破碎，得2～4份蝇蛆浆料，加水调配蝇蛆浆料浓度；加热保温预处理将蝇蛆浆料在60～90℃加热处理10～60分钟，冷却至60℃以下；酶水解反应酶种采用碱性蛋白酶、AS.1398蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味酶、中性蛋白酶的单种酶或两种酶的复合酶，酶解条件为温度30～55℃，时间1～4小时，酶底比50～700u/g，pH6.5～8.5，反应结束灭酶；过滤，滤液为蝇蛆蛋白液，滤渣为蝇蛆皮；(2)酶解蛋白液脱腥增香滤液进行美拉德反应脱腥增香，原料及其配比如下原料及其配比
反应条件温度100～125℃，时间30～100分钟；(3)制备蛋白粉反应液浓缩或不浓缩，喷雾干燥，制得产品蝇蛆水解蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的一种从蝇蛆中提取蛋白质的方法，其特征是加酶进行酶水解反应、灭酶后，将酶解液进行美拉德反应脱腥增香、喷雾干燥，制得蝇蛆水解蛋白粉。
3.一种从蝇蛆中提取甲壳素的方法，其特征是蝇蛆经酶水解后，以过滤分离蝇蛆蛋白液后的滤渣经酶水解的蝇蛆皮为原料，其工艺为蝇蛆皮筛洗，碱煮脱蛋白，清洗至中性，酸浸脱钙，清洗至中性，干燥，制得蝇蛆甲壳素成品；(1)脱蛋白用NaOH溶液进行脱蛋白，碱液浓度2～6％(w/w)，温度60～100℃，液固比3～10ml/g，反应时间1～5小时；(2)脱钙蝇蛆皮经脱蛋白，筛洗去杂质后，留下的残渣清洗至中性，离心去水后，用稀盐酸溶液进行脱钙，盐酸浓度0.5～1.5mol/L，液固比2.0～9.0ml/g，反应时间20～60分钟，温度为室温，再用纯水清洗至中性，干燥，得到蝇蛆甲壳素。
4.一种.从蝇蛆甲壳素制备壳聚糖的方法，其特征是以酶水解法提取的蝇蛆甲壳素为原料，在浓碱液中进行脱乙酰反应制得壳聚糖产品，原料为蝇蛆甲壳素，碱液采用NaOH溶液，碱浓度30～55％(w/w)，反应温度30～140℃，反应时间2～30小时，液固比为5～20ml/g。
全文摘要
一种用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和甲壳素及用甲壳素制备壳聚糖的方法，属于生物技术酶解蝇蛆蛋白质技术领域。解决了用酶水解法从蝇蛆中提取蛋白质和回收甲壳素，将蝇蛆水解蛋白脱腥增香，用甲壳素制备壳聚糖的工艺技术。主要技术特点是采用酶水解法来提取水解蛋白，用美拉德反应来去除腥味和后修饰增香，经酶解和筛选去除了蝇蛆皮中的黄色物和黑点，对酶解反应、美拉德反应、脱蛋白、脱钙、脱乙酰化均给出了优化的工艺条件。产品蛋白质和壳聚糖质量均达到食品级标准，可应用于食品、保健品、药品、化妆品等技术含量要求高的行业。
文档编号C12P19/00GK1415757SQ0213864
公开日2003年5月7日 申请日期2002年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者夏文水, 陈洁, 项建琳, 贺继东 申请人:江南大学