专利名称：一种d－氨基酸氧化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种半合成头孢菌素合成的关键中间体7-氨基头孢烷酸用的D-氨基酸氧化酶的发酵及提取生产方法。
背景技术：
头孢菌素是有着重要疗效的抗生素，而半合成头孢菌素则具有更强抗菌能力或可使药物动力学性质得到改善。而半合成头孢菌素的关键中间体为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，以往的传统生产的方法主要是通过化学方法，有四大步骤，过程复杂，所用试剂昂贵，污染严重，且收率较低，质量较差。而生物转化方法是一种较好的方法。研究表明，头孢菌素C可被D-氨基酸氧化酶氧化脱氨基，并进一步脱羧反应生成GL-7-ACA，到最后生成7-ACA，因而D-氨基酸氧化酶是生成7-ACA的关键酶。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，可使产物有较高收率的D-氨基酸氧化酶的制备方法。
将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤、超滤浓缩、纯化固定化后得产物；其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量胰蛋白胨1.0％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％发酵种子培养基的成分和含量
酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％发酵培养基的成分和含量氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 甘油0.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间为各为10-14小时。
发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V V M，培养时间为25-30小时。
本发明所使用的菌为大肠杆菌基因工程菌，D-氨基酸氧化酶产生菌(代号E.coli-DAAO2002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌均为RecombinantEscherichia coli BL21(DE3)，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsisvariabilis.其特征为1、细胞尺寸0.6um×(1-4)um，长度在不同生长期有较大变化，细胞呈典型的杆状；2、菌落表面光滑、湿润，有光泽；3、为革蓝氏阴性菌；4、不产生蛋白酶；D-氨基酸氧化酶的提取、纯化及固定化过程为首先用稀盐酸将发酵液PH调7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离得离心菌液，控制菌液活力8-10u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用D290树脂搅拌脱色20分钟，脱色酶液过滤后超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，洗水酶放置在2-4℃的冰箱20小时左右，然后用固定化用载体固定化。
本发明用1500u固定化D-氨基酸氧化酶在20℃下转化，可连续使用120批以上，可将2300克头孢菌素C钾盐转化得到1616克GL-7-ACA。本发明固定化酶不易被降解，且D-氨基酸氧化酶有极强的抗过氧化氢的能力。
所得产物固定化D-氨基酸氧化酶外观黄色或浅黄色球状颗粒粒径(100um) ≤1％含水量≤70％酶活力50-65(u/g)(25℃)
具体实施例方式实施例取D-氨基酸氧化酶产生菌大肠杆菌基因工程菌(代号E.coli-DAAO2002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌均为Recombinant Escherichiacoli BL21(DE3)，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsis variabilis.将該菌接种至装有100ml的摇瓶种子培养基的500ml三角瓶中，该培养基胰蛋白胨1.0克，酵母膏0.5克，氯化钠1.0克。培养温度控制在25℃，PH值为6.5，培养12小时。再将400ml摇瓶菌丝移入装有100升培养基的发酵罐中进行发酵种子培养，其中酵母膏1500克，，氯化铵240克，苹果酸220克，磷酸二氢钾680克。培养温度为25℃，PH值为6.5，空气流量为1∶1V/V/M，培养12小时。在发酵培养阶段，2500升培养基的发酵罐中，培养基为氯化铵15千克，酵母膏60千克，甘油10千克，乳糖12.5千克，泡敌1.25千克。先进行消毒后冷至60℃，加入无菌的KH2PO4-K2HPO4缓冲液(KH2PO423.1g/l，K2HPO4164.3g/l)控制消毒后PH值为6.8。将发酵种子液移至2500升发酵罐中，控制培养温度为25℃，空气流量为1∶1.5V/V/M，PH值为6.5-8.2，培养28小时。发酵结束酶活力可达3-5u/ml，2500升发酵液总活力为7.5-12.5百万单位(HPLC法，25℃)。接下来进行D-氨基氧化酶的提取、纯化及固定化，首先用稀盐酸将发酵液PH调7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离得离心菌液。控制菌液活力8-10u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用D290树脂搅拌脱色20分钟，脱色酶液过滤后超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，洗水酶放置在2-4℃的冰箱20小时左右，然后用固定化用载体固定化，固定化酶活力为50-65(u/g)，2500升发酵液可得固定化酶0.6-1.0百万，总收率8-9％(HPLC法，25℃)。
权利要求
1.一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心菌液，板框过滤、超滤浓缩、纯化固定化后得产物；所使用的菌为大肠杆菌基因工程菌，D-氨基酸氧化酶产生菌(代号E.coli-DAAO2002)，产生菌为Recombinant Escherichia coli BL21(DE3)，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsis variabilis；其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量为胰蛋白胨1.0％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％发酵种子培养基的成分和含量酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％发酵培养基的成分和含量氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 甘油0.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％
2.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间各为10-14小时。发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
3.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V V M，培养时间为25-30小时。
全文摘要
一种D－氨基酸氧化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，本发明是一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤，超滤浓缩、纯化固定化后得产物；可使产物有较高收率的D－氨基酸氧化酶的制备方法。
文档编号C12N9/02GK1428421SQ0213988
公开日2003年7月9日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者许岗, 朱敏 申请人:湖南福来格生物技术有限公司