拟南芥bud1基因及其应用的制作方法

专利名称：拟南芥bud1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种激活标签法克隆的BUD1(BUSHY AND DWARF 1)基因，以及利用转基因实验鉴定该基因；还涉及含有该基因和其具有类似功能的同源序列及其它物种的同源基因、相关载体以及利用该基因或其功能类似物调控植株的顶端优势、植株高度等株型性状。
背景技术：
植物的株型在很大程度上决定于茎的分枝系统。整个茎的结构由产生于胚胎期的主茎顶端分生组织和胚后期产生的其它分生组织共同决定。主茎的顶端分生组织决定了植株的主轴，来源于其他分生组织的侧枝又进一步修饰了植株的构型。茎的分枝过程一般包括两个发育阶段叶腋内腋生分生组织的形成和腋芽的生长。Shimizu-Sato S在2001年认为在许多物种中，腋芽的生长被主茎或主花序轴所抑制，即“顶端优势”。顶端优势是一个重要的农艺性状。在园艺上，花木常需要摘心，剪掉枝条的顶芽以去除顶端优势，促进腋芽生长，形成多分枝的丰满株丛，并把植株控制在理想的高度，提高观赏价值。
顶端优势是一个受到植物激素调控的过程。过去对顶端优势的研究主要是利用生理学的方法，通过外源施加植物激素及激素含量测定表明植物激素，如生长素和细胞分裂素，在对这个过程的控制中起着重要的作用。Klee H在1991年认为生长素对腋芽的生长有抑制的作用，而细胞分裂素则促进腋芽生长。腋芽生长与否决定于这两种激素的比例而不是任何一种的绝对含量。但是传统的生理学研究方法不能精确控制植株对外源激素的吸收量及部位。相比之下，分离分枝模式改变的突变体、鉴定突变基因功能就成为研究顶端优势机理更为有力的工具。目前已克隆的影响顶端优势的基因很少，包括Leyser H在1993年克隆的拟南芥生长素信号传导途径中的AXR1基因以及Tantikanjana T在2001年克隆的与细胞分裂素合成有关的SUPERSHOOT基因。本发明通过激活标签法得到控制拟南芥顶端优势及植株高度的基因BUD1，并通过转基因实验鉴定了该基因的功能。

发明内容
针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种从拟南芥突变体bud1中克隆的新基因，BUD1，如seq ID No1所示的DNA序列，也包括与seq IDNo.1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明中也提供一种如seq ID No2所示的蛋白质，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。本发明也包括与seq ID No2所示的氨基酸序列具有70％以上(包括70％)同源性的功能类似物。
本发明的另一个目的是提供一种用BUD1进行高效植物遗传转化的方法。任何可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物的载体。本发明还提供了一种含有以上表达载体的宿主细胞。宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。
本发明的另一个目的是提供一种利用激活标签法转化以改变植株形态的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一拟南芥株型改变突变体bud1的分离和遗传分析本发明所用的拟南芥株型改变突变体是利用正义/反义表达(SARE)系统[7]转化野生型拟南芥Co1-0生态型植株，再通过大量筛选得到的表型稳定的突变体bud1。通过对bud1与野生型拟南芥Co1-0杂交F1和F2代表型分离比的分析，我们确定bud1是一个符合单基因控制遗传规律的半显性突变体。该突变体顶端优势丧失、矮小、叶卷曲、杂合体半不育，但由于分枝多而使结实量增加、纯合体完全不育，如图1所示。
二控制植株形态的基因BUD1的分离bud1表型与T-DNA的共分离为了分离目标基因，本发明选取了bud1与野生型拟南芥Co1-0杂交后代F2代中10个野生型植株和70个突变体植株，用EcoR I完全酶切基因组，以T-DNA特异的2x35S增强子探针做Southern杂交检测突变表型与T-DNA的共分离。结果表明，转基因突变体中总共至少含有3个拷贝的T-DNA插入，其中7kb的条带与突变体共分离，如图2所示。T-DNA侧翼序列的分离回收经EcoR I完全酶切的bud1基因组6kb-8kb区段的DNA，构建成噬菌体亚基因组文库。将用T-DNA特异的2x35S增强子探针筛选得到的目的克隆转变成质粒，测序。根据测序结果搜索拟南芥数据库发现T-DNA插入拟南芥第一染色体BAC15H18的nt61451和nt61452间(图3)。插入导致T-DNA一侧一预测MAPKK-AtMKK7的过量表达(图4)。BUD1基因的鉴定与功能分析通过Bechtold 1993年建立的真空抽滤法进行转基因实验，结果表明本发明获得了能模拟bud1表型的转基因拟南芥，证明本发明正确克隆了BUD1基因，并证明BUD1基因的过量表达能够导致株型的改变。基因DNA序列及氨基酸序列见Seq ID No.1和No.2。
目前对植物株型的控制基本是依赖于人工修剪，如能通过生物技术实现对植株顶端优势的控制将更经济有效，特别是应用于观赏植物时，因为观赏植物仅供观赏而非食用，就其安全性而言，更易被批准投放市场而实现商业化。BUD1基因的发现与克隆使得应用基因工程技术调控植物的株型成为可能。


下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。
图1.拟南芥株型改变突变体bud1的表型.左野生型拟南芥；中bud1杂合体；右bud1纯合体图2.bud1表型与T-DNA的共分离。A野生型、bud1杂合体和纯合体基因组DNA经EcoR I酶切，2x35S探针杂交，显示bud1与一7kb条带共分离；B只含7kb条带的株系基因组DNA经多种酶切，2x35S探针杂交，显示2条杂交带。
图3.T-DNA插入位点示意4bud1中BUD1基因的过量表达。ANothern结果；BRT-PCR结果。
具体实施例方式
实施案例11.拟南芥突变体bushy and dwarf 1(bud1)，原始野生型材料为Co1-0生态型。
2.植物培养拟南芥培养采用蛭石浇以1/3 B5培养液，生长条件为23℃连续光照，强度为80-120μmol·m-2·sec-1。拟南芥无菌培养采用表面灭菌，70％酒精表面杀菌3-5分钟后，用10％Bleach浸泡灭菌10-15分钟，无菌水洗34次。4℃处理4天以促进发芽后点播在1/2 MS培养基上置于与蛭石培养相同的条件下生长。
3.bud1与T-DNA的共分离实验从bud1纯合体与野生型拟南芥杂交F2代群体中选取10个野生型植株和70个突变体植株，提取基因组总DNA。植物基因组DNA的提取采用Li j iayang 1995年创建的CTAB的方法。将基因组DNA用限制性内切酶EcoR I完全酶切后于1％琼脂糖凝胶中电泳，用真空转膜仪(Biorad)将其转至尼龙膜上，与T-DNA特异的2x35S增强子探针于65℃杂交16-20小时，经严谨性洗膜后用Phosphoimager进行扫描与分析。结果表明，转基因突变体中总共至少含有3个拷贝的T-DNA插入，其中7kb的条带与突变体共分离(图2)。只含有这7kb条带的突变体株系被保留，所有的研究工作都只利用这一个株系。该株系基因组DNA再用其他限制性内切酶BamH I、Xho I、Sac I完全酶切时，与2x35S探针能杂出两条带(图2)，这两条带在突变体中不分离，说明这是两个紧密连锁的T-DNA片段。bud1是利用SARE系统得到的突变体，SARE系统向转基因植株导入外源的cDNA片断[7]，但由于概率的原因，转化文库的载体上有时并未连接有这样的cDNA，转化造成的突变可能仅仅是插入突变，与外源cDNA干扰内源基因表达无关。PCR的方法被利用来鉴定bud1的突变原因。以转基因植物基因组为模板，5’-ACCACGTCTTCAAAGCAAGTG-3’(来自2x35S增强子)和5’-TATGATAATCATCGCAAGACCG-3’(来自NOS终止子)为引物将得到2条PCR产物条带，因为来自2x35S增强子的引物在2x35S增强子上有2个结合位点。若T-DNA片断不带外源cDNA，产物长度为0.2kb和0.5kb。从bud1中得到的产物为0.2kb和0.5kb，测序结果证明其中确实不含外源cDNA片断。因此bud1是一个插入突变体。该突变与EcoR I酶切的7kb条带共分离。
4.T-DNA侧翼序列的分离从琼脂糖凝胶上回收经EcoR I完全酶切的bud1基因组6kb-8kb区段的DNA，连入λZAP II载体(Stratagene产品)，构建成一个噬菌体亚基因组文库。用2x35S探针经三轮筛选得到20个单克隆。将每个单克隆转化成质粒，提质粒，酶切检测。结果表明20个单克隆显示出2种酶切指纹图谱，代表2种不同的质粒。这与前述Southern检测结果一致。取2种质粒13-2-5及5-1-3测序，搜索拟南芥数据库发现，13-2-5含T-DNA片段，插入拟南芥第一染色体BAC15H18，左边界紧邻nt61451，在一个预测的MAPKK(At1g18350，AtMKK7)开放阅读框(ORF)上游513bp；5-1-3也含T-DNA片段，插入拟南芥第一染色体BAC15H18，右边界紧邻nt61452，在一个预测的转录因子2.35kD亚基(At1g18340)开放阅读框上游1438bp。由此可见在拟南芥第一染色体BAC15H18 nt61451和nt61452间插入了两个T-DNA片段。并且测序结果表明这两个T-DNA片段序列相同，反向重复排列，5.BUD1表达量检测总RNA提取采用Wadsworth G在1998年创建的酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法。取1g植物材料于液氮中研碎，经硫氰酸胍、酸性苯酚和氯仿抽提，乙醇沉淀后，用LiCI洗涤一次，总RNA溶于无核酸酶的水中，测定O.D.值定容后于-20℃保存。利用RT-PCR的方法，设计基因特异性引物5’-GGATCCTCTCTCTTCTATTTCCATGGC-3’，5’-GAGCTCACAAGCAGTCGGATCTAAAG-3’和5’-AGGAGATGTCTTCCGCTGATG-3’，5’-AAGTCTTCATCGGATTCGTGTG-3’，以野生型总RNA反转录产物为模板分别扩增At1g18350和At1g18340 cDNA片段，扩增产物经测序证明为该基因本身。At1g18350 cDNA序列与拟南芥基因组数据库的预测一致。RT-PCR采用SUPERSCRIPT first Strand Synthesis System(Gibco BRL产品)，反应体系为20μl。其中2μg总RNA预先经DNaseI降解除去DNA杂质，2μl反转录产物用于随后的PCR扩增，扩增体系为50μl。PCR反应条件均为94℃ 3min.，35个循环(94℃ 1min.，58℃ 1min.，72℃ 1min.)，72℃ 10min。用上述RT-PCR产物做探针进行Northern杂交。将10-15μg总RNA在甲醛变性胶中电泳后，转移至尼龙膜上，在真空烤箱中于80℃烤2小时以固着，Northern杂交采用Church GM于1984年创建的Church buffer系统，并用Phosphoimager进行扫描与分析。Northern杂交结果显示，At1g18350在bud1中过量表达，在野生型中则不能检测出信号(图4)。而At1g18340不论在bud1或野生型中均无杂交信号。我们又通过RT-PCR方法进一步验证Northern结果(图4)，对照为ACTIN 7基因。扩增ACTIN7基因所用的引物为5’-TGGAATGGTGAAGGCTGGTTT-3’和5’-CTGTTGGAAGGTGCTGAGGGA-3’。At1g18350的表达模式同Northern结果一致。At1g18340的表达量在突变体和野生型中未见差异。以上数据可以支持这样一个结论bud1实际是激活标签法造成的突变体，插入位点附近一个预测的MAPKK(At1g18350，AtMKK7)被插入标签激活，表达量提高。我们把这个MAPKK命名为BUD1。6.BUD1 cDNA全序列的获得BUD1基因的5’及3’非翻译区的获得使用了5’/3’RACE kit(Roche产品)。所用特异性引物为SP1(5’-GAGCTCAAGTATCATCACTCCG-3’)SP2(5’-GCTAGTTGTTTCTCCGTAACGG-3’)
SP3(5’-CTGCTTCCTCTTCCGAGAAG-3’)SP5(5’-CCGTTACGGAGAAACAACTAGC-3’)。
实施案例2、根癌农杆菌介导转化拟南芥过量表达BUD1的转化质粒的构建是通过将BUD1的基因组PCR产物连接到pBI121的BamH I和Sac I位点之间获得，所用引物为5’-GGATCCTCTCTCTTCTATTTCCATGGC-3’和5’-GAGCTCACAAGCAGTCGGATCTAAAG-3’。将构建的转化质粒用电击法转入农杆菌GV3101(pMP90)菌株，菌落PCR鉴定后用Bechtold N1993年建立的抽真空法转化拟南芥Co1-0野生型，种子收获后播于含卡那霉素(50ng/l)的1/2 MS培养基上，待T1代植株长至4-6片莲座叶时移入土中，必要时取一个莲座叶提取基因组DNA检测。T1代单株收获后，部分种子用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，部分播于蛭石中以获得稳定的转基因株系。
bud1 patent.ST25SEQUENCE LISTING<110>中科院遗传与发育生物学研究所<120>拟南芥BUD1基因及其应用<130>patent<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1082<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>CDS<222>(36)..(959)<223><400>1accatcatca ctctctctct ctctcttcta tttcc atg gct ctt gtt cgt aaa53Met Ala Leu Val Arg Lys1 5cgc cgt caa atc aac ctc cgt ctc cct gtc cca ccg ctc tct gtt cac101Arg Arg Gln Ile Asn Leu Arg Leu Pro Val Pro Pro Leu Ser Val His1015 20ctc ccc tgg ttc tcc ttt gcc tca tcc acc gcc ccc gtc atc aac aac149Leu Pro Trp Phe Ser Phe Ala Ser Ser Thr Ala Pro Val Ile Asn Asn25 3035gga atc tca gct tcc gat gtc gag aaa ctc cac gtt ctc gga aga gga197Gly Ile Ser Ala Ser Asp Val Glu Lys Leu His Val Leu Gly Arg Gly40 45 50agc agc ggg atc gta tac aaa gtc cac cac aaa acc acg ggg gag ata245Ser Ser Gly Ile Val Tyr Lys Val His His Lys Thr Thr Gly Glu Ile55 60 6570tac gct ctg aaa tca gtc aac ggc gac atg agt cct gct ttc aca aga293Tyr Ala Leu Lys Ser Val Asn Gly Asp Met Ser Pro Ala Phe Thr Arg7580 85caa tta gcg cgc gag atg gag atc ctc cgt cgc acg gat tct cct tat341Gln Leu Ala Arg Glu Met Glu Ile Leu Arg Arg Thr Asp Ser Pro Tyr90 95 100
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1.一种拟南芥株型控制基因BUD1编码的蛋白质，或其的功能类似蛋白，其氨基酸序列与Seq ID No.2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性。
2.根据权利1所述的蛋白质或其功能类似物，具有Seq ID No.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利1所述的蛋白质，其中所说的氨基酸序列还包括在Seq IDNo.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成功能相似的衍生物。
4.一种编码权利要求1、2或3任意一项所述的蛋白质或其功能类似物的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，它具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的基因，其中所说的核苷酸序列还包括在SeqID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的功能相同的突变体、等位基因或衍生物。
7.一种含有权利要求4或5或6所述的基因或其功能类似物的质粒。
8.一种含有权利要求4或5或6所述的基因或其功能类似物的的部分序列的质粒。
9.一种含有权利要求7或8所述质粒的植物表达载体。
10.一种含有权利要求9所述的基因或其功能类似物的序列的转化子。
11.一种含有权利要求10所述的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌。
12.一种含有权利要求10所述的宿主细胞，该细胞为农杆菌。
13.一种含有权利要求10所述的宿主细胞，该细胞为植物。
14.一种培育植物株型的方法，包括用权利要求9、10、11、12所述的表达载体或宿主细胞转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
全文摘要
本发明从拟南芥株型改变的突变体bushy and dwarf 1(bud1)中克隆并鉴定了影响植株吲哚乙酸(IAA)代谢进而控制植株形态的基因，并将其命名为BUD1。转基因实验表明过量表达BUD1能控制植株的形态。氨基酸序列比较分析表明该基因是MAPK级联系统中未知的MAPKK－AtMKK7。BUD1在拟南芥中的高表达造成顶端优势丧失和矮小的表型，表明可以利用基因工程技术改变植物的株型。该基因在阐述BUD1调节生长激素代谢的机理方面；在利用生物工程技术有目的的调控植物株型性状方面具有非常重要的应用价值。
文档编号C12N15/29GK1488644SQ0214434
公开日2004年4月14日 申请日期2002年10月10日 优先权日2002年10月10日
发明者李家洋, 戴亚, 王晓群, 周亦华 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所