专利名称：一种钠/质子反向转运器及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中的钠/质子反向转运器及其编码基因与应用。
背景技术：
盐渍对农业生产有极其严重的影响。盐胁迫是抑制植物生长，降低农作物产量的主要环境因素之一。中国15亿亩耕地中盐碱地大约有一亿亩，中低产田约10亿亩，大部分是由于干旱盐碱所致，另外还有3亿亩盐碱荒地。而且，在灌溉地区次生盐渍化田地还在继续增加。
Na+/H+反向转运器(Na+/H+antiporter)在细胞膜和液泡膜上都有分布。Na+/H+反向转运器与盐生植物的抗盐性有很大关系，它保证了Na+在液泡中的区域化，大大降低了液泡的渗透势，又减轻了Na+对细胞质的伤害。Na+/H+反向转运器还可以将进入根中的Na+泵出，维持体内低浓度的离子环境，这种机制在许多农作物中普遍存在。高等植物中Na+流出的主要机制是质膜上的H+/ATPase把H+泵出细胞，产生的电化学势可激活质膜上的Na+/H+反向转运器，H+进入细胞，Na+逆电化学势流出。从生理生化角度，在许多高等植物及藻类上都证明了Na+/H+反向转运器的活动。
许多植物的Na+/H+反向转运器载体的活性很低，因此他们在高盐环境中会失水最终死亡。在高盐环境中，Na+/H+反向转运器的合成及其活动都会受到抑制，但是通过提高细胞膜上不饱和脂肪酸的含量，可以消除这种阻碍因素的影响或通过转基因的方法增加Na+/H+反向转运器在植株中的含量来达到抗盐的目的。
1999年Apse用农杆菌介导的方法将AtNHX1转入拟南芥中，得到抗盐植株。这一结果给培育抗盐品种带来了美好的前景。
发明内容
本发明的目的是提供钠/质子反向转运器及其编码基因。
本发明所提供的钠/质子反向转运器来源于玉米，名称为zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由539个氨基酸残基组成的蛋白质。
以玉米EST设计引物，通过5’、3’RACE方法克隆到zmNHX1基因的全长cDNA。钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因，是下列核苷酸序列之一
1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2035个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第1617位碱基。
本发明所提供的钠/质子反向转运器及其编码基因，可以来自所有单子叶和双子叶植物，如烟草，拟南芥，草坪草，杨树，大豆，小麦，水稻，棉花和番茄等。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码钠/质子反向转运器zmNHX1的基因导入植物细胞，可获得对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，Ubiqutin启动子，增强子既可以是转录增强子，也可以是翻译增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明钠/质子反向转运器zmNHX1基因的表达载体可以是Ti(Tumor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体等，转化可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物技术方法实现，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻，小麦，玉米，大豆，棉花，蔬菜，树木和草坪草等。本发明的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
图1为Northern杂交分析结果。
具体实施例方式
实施例1、钠/质子反向转运器zmNHX1的克隆营养生长阶段的玉米(生长2周，4到5叶期)用150mmNaCl处理3小时。用TRIZLO(PROMAGA)提取根总RNA。根据玉米EST序列设计并合成基因特异引物GSP15’agcgtgcacacagaatccgttgcagGSP25’tgctgaatatcgctattgcgccgagGSP35’ctcggcgcaatagcgatattcagcaGSP45’ctgcaacggattctgtgtgcacgct具体操作按SMART RACE(CLONTECH)试剂盒进行。首先进行逆转录。反映体系为1ul盐处理玉米根总RNA，1ul 5’-CDS或3’-CDS，1ul SMATII OLIGO引物(10um/L)，2ul灭菌水。混匀后，于70℃加热2min。置冰上冷却2min，离心使液体沉底。加入2ul 5X第一链缓冲液，1ul DTT(20mm/L)，1ul dNTP(10mm/L)和1ul MMLV逆转录酶(20U/ul)，42℃逆转录1.5小时，加入100ul灭菌水，于72℃加热2min终止反应。
随后，以通用引物混合物(UPM)和GSP1，UPM和GSP3分别进行5’，3’“TOUCHDOWN”PCR扩增。在PERKIN-ELMOR(PE)DNA THERMAL CYCLER 9700启动PCR反应。条件为5X(94℃30 S，72℃ 3min)，5X(94℃30S，70℃10S，72℃2min)，20X(94℃30S，63℃30S，72℃30S)72℃min。以该次反应为模板，分别使用通用引物(NUP)和GSP2，GSP4进行巢式PCR。5’RACE获得400bp大小的条带，3’RACE获得1.6Kb大小的条带。分别回收纯化后，5’RACE片段连在PGEM-T EASY载体上，3’RACE直接测序。测序结果和已知EST序列进行拼接，并结合测序峰图进行校正。获得拼接好的序列zmNHX1基因，如序列表中的序列1所示，全长共2035bp，其中3’非编码区为418bp，编码区为1617bp。编码产物为539个氨基酸，如序列表中的序列2所示。
实施例2、zmNHX1基因在逆境胁迫条件下的表达特征玉米种于含蛭石的花盆中，待长到3叶一心时期进行不同浓度的盐胁迫处理50mM，150mM NaCl进行浇灌至土壤饱和。3小时后收取，提取根、叶总RNA，进行Northern blot分析。结果如图3所示，图中R对照根；L对照叶；50mmR50mMNaCl处理根；50mmL50mM NaCl处理叶；150 mmR150mM NaCl处理根；150mmL150mM NaCl处理叶。从图中可以看出，zmNHX1基因在根中表达，在叶中不表达。50mMNaCl处理后，zmNHX1表达量大幅度升高。在100mM NaCl处理时，zmNHX1转录水平高于50mM NaCl处理时的转录水平。表明zmNHX1在根中表达并受盐胁迫诱导。
序列表<160>2<210>1<211>2035<212>DNA<213>玉米属玉米(Zea mays.L)<400>1atggggctgg gtgcgggggc ggagctggtg cggctgggcg tgctgagctc gacctctgac60cacgcgtcgg tggtgtccat caacctgttc gtcgcgctgc tctgcgcctg catcgtcctg120ggccacctcc tggaggagaa ccgctgggtt aacgagtcca tcaccgcgct catcatcggg180ctgtgcaccg gcgtcgtgat cctgctgacc accaagggga agagctcgca catcctcgtc240ttcagcgagg acctcttctt catctacctc ctacctccca tcatcttcaa tgccgagttc300caggtgaaga agaaacggtt cttccggaat ttcatgacaa tcacactgtt gcagtgctgt360tggcacaatg atatccttct tcacatctct ctcggcgcaa tagcgatatt cagcagaatg420aacattggga cgctagatgt cggggatttt ctcgctattg gagctatctt ttctgcaacg480gattctgtgt gcacgctgca ggttctccat caggatgaga cgcccttttt gtacagtctc540gtgttcggtg agggagtcgt gaacgatgcc acgtctgttg tgctcttcaa cgcactccag600aacttcgatc ttaaccacat cgatgtagcc gttgtgctga atttcttggg aaacttctgt660tacttattcg tgtcaagcac cttacttgga gtgtttactg gattgctcag tgcctacata720attaagaagc tatatatagg aaggcattcc actgaccgtg aggttgcgct tatgatgctc780atggcttacc tctcctacat gctggccgag ctgctagatc tgagtggcat tcttaccgta840ttcttctgcg gcatcgtgat gtcgcattac acctggcaca atgtgacaga gagctcaaga900gtcacaacca agcatgcctt tgctactttg tccttcatcg ccgagacttt tctcttcctg960tatgttggga tggatgccct cgacatcgag aagtgggagt ttgccagtga cagcccgggc1020aaatccattg gcattagctc gattttgcta ggattggttc tgctggggag agctgcattt1080gttttcccat tgtcgttttt gtccaacctg acaaagaagt ctccattgga gaaaataaca1140tttagacagc aaattgtaat atggtgggcc ggactgatga gaggtgccgt gtccattgct1200ctcgcttaca acaagttcac gagatctgga cacactgagc tgcacggcaa cgcgataatg1260atcaccagca cgatcactgt ggtcctgttt agcactatgg tgtttgggat gatgacgaag1320ccattgatcc ggctgctgct ccctgcctgc agcaacacgg ccacctccga gccgtcctca1380cccaagtccc tgcactcgcc tctcctgacg agcatgcagg gctcggacat cgagacgggg1440tcggcacaga ttgtgaggcc gtccagcctc cggatgctcc taagcaagcc aacccacacg1500gtgcactact actggcgcaa gttcgacgac gcgctcatgc ggcccatgtt tggcggccgc1560gggttcgtgc ccttctcccc tggatcgccc actgagcaga gcgtccacga cggacggtga1620acaaagccgc gtctgacacc aagagacgag caggacatgc ttttggctgc taatggtcag1680atgatgatgt ttttgtttgt tgacagcttc tgatggtgcg ttagcaatgg caaggaggtg1740tcagtttgtt tggattagca ggatgaagaa gagcaaccct ggtaactggg gctgggggat1800tgagtttgtg catgacaagg ctgcaaactt ttgtatgtag ataaaaagaa cacccatttg1860gccatttgta ttgtatgtta ttgtatgtaa gctagcaggc ctgtacaact gcttttaggt1920cttcgtttgg atgggcgaaa ttctggcaaa cagcagcaca tccactctgt gttctgatct 1980aagcatcttg gtttgatttt tgaaatggac tcggtgtgta ggataagctt ttgga 2035<210>2<211>539<212>PRT<213>玉米属玉米(Zea mays.L)<400>2Met Gly Leu Gly Ala Gly Ala Glu Leu Val Arg Leu Gly Val Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe20 25 30Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu35 40 45Glu Asn Arg Trp Val Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly50 55 60Leu Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Thr Thr Lys Gly Lys Ser65 70 75Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu80 85 90Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Glu Phe Gln Val Lys Lys Lys95 100 105Arg Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr Ile Thr Leu Leu Gln Cys Cys110 115 120Trp His Asn Asp Ile Leu Leu His Ile Ser Leu Gly Ala Ile Ala125 130 135Ile Phe Ser Arg Met Asn Ile Gly Thr Leu Asp Val Gly Asp Phe140 145 150Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr155 160 165Leu Gln Val Leu His Gln Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr Ser Leu170 175 180Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu185 190 195Phe Asn Ala Leu Gln Asn Phe Asp Leu Asn His Ile Asp Val Ala200 205 210Val Val Leu Asn Phe Leu Gly Asn Phe Cys Tyr Leu Phe Val Ser215 220 225Ser Thr Leu Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile230 235 240Ile Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val
245 250 255Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu260 265 270Leu Leu Asp Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile275 280 285Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg290 295 300Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Ile Ala Glu305 310 315Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu320 325 330Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Ser Pro Gly Lys Ser Ile Gly Ile335 340 345Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Gly Arg Ala Ala Phe350 355 360Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys Lys Ser Pro365 370 375Leu Glu Lys Ile Thr Phe Arg Gln Gln Ile Val Ile Trp Trp Ala380 385 390Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Ile Ala Leu Ala Tyr Asn Lys395 400 405Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Glu Leu His Gly Asn Ala Ile Met410 415 420Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe425 430 435Gly Met Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro Ala Cys440 445 450Ser Asn Thr Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His455 460 465Ser Pro Leu Leu Thr Ser Met Gln Gly Ser Asp Ile Glu Thr Gly470 475 480Ser Ala Gln Ile Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Ser485 490 495Lys Pro Thr His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp500 505 510Ala Leu Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe515 520 525Ser Pro Gly Ser Pro Thr Glu Gln Ser Val His Asp Gly Arg530 535 539
权利要求
1.钠/质子反向转运器zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的钠/质子反向转运器，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自5’端第1到第1617位碱基。
6.含有权利要求4所述基因的表达载体。
7.含有权利要求4所述基因的细胞系。
8.权利要求4所述基因在培育抗盐植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种钠/质子反向转运器及其编码基因与应用。本发明所提供的钠/质子反向转运器来源于玉米，名称为zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK1490331SQ02146310
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月18日 优先权日2002年10月18日
发明者王学臣, 陈敏, 陈珈, 陈受宜 申请人:中国农业大学, 中国科学院遗传与发育生物学研究所