专利名称：棉花Na的制作方法
技术领域：
本发明涉及棉花中Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1的克隆、重组及耐盐性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
由于Na+/H+反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本发明人从棉花中分离编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na+/H+反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因。将该基因转入盐敏感酵母突变体，能在一定程度上恢复其抗盐能力。进一步构建正义表达载体，转化烟草，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mmolL-1。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
本发明首次从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的全长cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得的转基因植株耐盐性高达200mmolL-1。
从棉花叶片中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+/H+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物正向引物5′-CC(GATC)CC(GATC)AT(TAC)AT(TAC)TT(TC)AA(TC)GC-3′反向引物5′-GT(GATC)AC(GATC)TT(AG)TGCCA(GATC)GT(AG)TA-3′进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，转化DH5α感受态细胞，涂平板，筛选阳性克隆，挑白斑摇菌，提取质粒，并进行酶切鉴定，之后进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长cDNA。具体的PCR试剂与条件为10×反应缓冲液5μl25mM MgCl24μl10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)1μl正向引物(10μM) 2μl反向引物(10μM) 2μl模板cDNA 1μlTaq DNA聚合酶 0.5μl总体积50μlPCR反应条件为94℃ 5分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共30个循环，最后72(C延伸5分钟。
结果扩增到一个614bp的DNA片段。取2μl PCR产物连接到pGEM-T easy载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取白色菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。
经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为2485bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1629bp，由此推得具543个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的野滨藜、水稻和拟南芥的Na+/H+反向转运蛋白的氨基酸同源性分别为77.30％、72.74％和76.61％，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na+/H+反向转运蛋白的基因。该基因序列如下序列表(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度2485碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述SEQ IN N0.1ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT 60TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT 120CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT 180CAAGCTCTCTCTTCGAATTTACTCGTCTCTTTGAAACTGTCCGTTTTTTTTTGGTTCAAT 240AAAATCGCAAATTATTTGCTAATTTAGAGAAGAAAATTGAACGGAGCTGAAACAAGGATG 300ATTTGTTGCTGCATGATGTTGATTCTCCAAAACGATTCGAGTGCTTAAGGATTTTAAGAT 360TAGAAAGTTCTTGAAATGGACAGTTCAGAGGCATAAAAATTTTCGAAGATTTACATTGTT 420GAAGGAGAGCTTAAATCTGAAGCCTTGGACTACAACTGTTTCAGTTAGAAGGAATTGGTG 480TTTAATAAAATTTGATTTAAAAAGAGGTCAATATGGTGGCTCCGCAGTTAGCTGCTGTCT 540TTACTAAGTTGCAGACACTATCTACTTCAGACCATGCGTCTGTGGTCTCCATGAACATAT 600TTGTAGCGCTTCTTTGTGCTTGCATTGTGATTGGTCATCTTTTGGAGGAGAATAGATGGA 660TGAACGAATCAATTACTGCCCTTATCATTGGTGTTTTTACTGGGGTCATTATTTTGTTGA 720CAAGTGGGGGTAAAAGCTCTCATCTTTTAGTCTTCAGTGAAGATCTGTTCTTTATCTATC 780TTCTGCCCCCTATTATATTCAATGCTGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCAATTTTTCCGTA 840ACTTTATCACCATCATGCTGTTTGGGGCTGTTGGTACACTAATATCTTGTACAATTATCT 900CTTTAGGTGTAATTAACTTCTTCAAGGAAATGGACATTGGCTCCTTAGACATTGGAGATT 960TTCTAGCAATTGGTGCAATATTTGCTGCGACAGATTCTGTTTGCACACTGCAGGTGCTTA 1020ATCAGGATGAGACTCCATTACTCTACAGTTTGGTTTTCGGAGAGGGTGTTGTAAATGATG 1080CAACATCTGTGGTGCTTTTCAATGCAATCCAGAGTTTTGACCTCGTTAATACCAGTCCTA 1140GAATTCTTCTGGAGTTTATTGGCAGCTTTTTGTATTTATTTTTAGCAAGCACTATGCTGG 1200GAGTGATTGTTGGGTTGGTTAGTGCTTACATCATCAAAAAGTTGTACTTTGGAAGGCACT 1260CAACAGATCGTGAATTTGCTCTTATGATGCTTATGGCATACCTTTCGTATATCATGGCTG 1320AACTGTTCTATTTGAGTGGCATTCTTACAGTATTCTTTTGTGGGATTGTGATGTCACATT 1380ATACCTGGCACAATGTAACTGAGAGTTCAAGAGTAACTACAAAGCATGCCTTTGCTACCT 1440TGTCATTTGTTGCTGAGACTTTTCTCTTTCTTTATGTCGGGATGGATGCTTTGGACATGG 1500AGAAGTGGAGATTTGTCAGTGATAGCCCTGGAACGTCAGTTGCTGTTAGTGCTGTGCTGA 1560TGGGTCTTGTTATGGTTGGAAGAGCGGCTTTTGTGTTTCCCCTGTCATTTTTATCCAACT 1620TGGCAAAGAAATCAACTAGTGAGAAAATCAGCTTCAGGGAACAAATTATAATATGGTGGG 1680CTGGGCTCATGAGAGGCGCTGTATCTATGGCACTTGCATATAATCAGTTTACAAGGGGGG 1740GCCATACTCAGTTGCGAGGAAATGCAATTATGATTACAAGCACCATAACCATTGTTCTAT 1800
TCAGCACTGTGGTTTTTGGTTTAATGACTAAACCTCTAATAAGGTTCTTGCTGCCTCATC 1860CCAAACCAACAGCCAGCATGCTCTCAGACCAATCCACTCCAAAATCAATGGAGGCACCAT 1920TTCTCGGAAGCGGCCAGGACTCTTTTGATGATAGTTTAATTGGAGTTCATCGACCAAACA 1880GCATTCGTGCACTTCTTACAACTCCAGCACACACTGTTCATTACTATTGGCGAAAGTTTG 2040ATAATGCCTTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGCCGGGGTTTTGTGCCCTTCGTTCCTGGCT 2100CCCCAACAGAAAGGAGTGAACCTAATCTGCCTCAATGGCAATGAGGTGGTTGAACAAGAT 2160CTCTACAAAAATGTACATGTAATATAACAATGCAGTCGGTTGCAAAAAACATGCTTCTGG 2220CGAGAAGCCAGTGCGGTATGCTTTGTATGTTTCATGTATAGGCTATATTTTGTTGGTTTT 2280CAAGTTTCCTCAAGAGGTTCTTGTTTATTCTCCCCGAAACTACCTTCGCACCTGATGCTA 2340TCTTTCCATTTGACATTTACGAATATTTATGATCTGGGTGAAGCTTAGGGGTAGGTGTGC 2400CATTCTATTTTGTACGTATACGAGTATTTATTTTGTGTTTATATCAGTGTGTTTAGTTTT 2460TATTTTTATTAAAAAAAAAAAAAAA 2485(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*长度543氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIG 60VFTGVIILLTSGGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAV 120GTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSL 180VFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAYI 240IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSR 300VTTKHAFATLSFVAETFLFLYVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAF 360VFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMALAYNQFTRGGHTQLRGNAIM 420ITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKPTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD 480SLIGVHRPNSIRALLTTPAHTVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLP 540QWQ 543根据上述序列，设计构建表达载体的引物正向引物5′-ATGGTGGCTCCGCAGTTAGCT-3′反向引物5′-ACCTCATTGCCATTGAGGCAG-3′以叶的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连接到pMD18-T载体上，进行测序鉴定。然后用XbaI和SalI切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHAl05。
转化烟草，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在100mmolL-1、200mmolL-1和30mmolL-1氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能正常生长，具较高的耐盐能力。
转化酵母盐敏感突变株，在选择培养基上筛选转化子，将筛选出的阳性转化子在喊含1600mM氯化钠的选择培养基上培养。结果表明GhNHX1对酵母盐敏感突变株有补偿作用，转6hNHX1的酵母盐敏感突变株的耐盐能力大大增强。
根据上述技术，从棉花中分离出编码液泡型Na+/H+反向转运蛋白的基因GhNHX1，该基因过量表达能导致转基因烟草具较高的耐盐性。让该基因在棉花中表达，将会提高棉花的耐盐性；如果与特异启动子连接，对其表达进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益.
(五)具体发明实施方式实施例1棉花Na+/H+反向转运蛋白基因的克隆方法1.总RNA的提取采用RNAeasy mini kit(promoga公司产品)提取总RNA。
2.cDNA第一条链的合成取2微克总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mmolL-1脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μ1)0.5μl，引物T26(10pmol/μ1)1μl，反转录酶(10u/μ1)2μl，42℃反应60分钟，85℃ 10分钟终止反应。
3.PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起10×反应缓冲液 5μl10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μl
正向引物(10μmolL-1) 2μl反向引物(10μmolL-1) 2μl模板cDNA 1μlTaqDNA聚合酶 0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 5分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。
4.基因克隆取2μl PCR与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5.质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
6.序列测定本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
7.3′和5′序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。
8.同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。实施例2棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHXl，如下序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度2485碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.1ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT 60TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT 120CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT 180
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*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIG 60VFTGVIILLTSGGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAV 120GTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSL 180VFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAYI 240IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSR 300VTTKHAFATLSFVAETFLFLYVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAF 360VFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMALAYNQFTRGGHTQLRGNAIM 420ITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKPTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD 480SLIGVHRPNSIRALLTTPAHTVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLP 540QWQ 543实施例3表达载体的构建1.根据分离出的棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHXl的核苷酸序列，设计引物正向引物5′-ATGGTGGCTCCGCAGTTAGCT-3′反向引物5′-ACCTCATTGCCATTGAGGCAG-3’以叶的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
2.取2μl PCR与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pMD18-T Vectorsystem说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3.用XαbI和SαlI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
4.将构建好的表达载体转化农杆菌EHAl05。实施例4基因耐盐性分析1.种植烟草。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10X MS培养基悬浮。
4.将烟草叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。
5.侵染后的叶片切块置于分化培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，)上共培养2天，然后转入选择培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，卡那霉素100毫克/升，头孢青霉素250毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将抗性植株移入花盆，每两天浇含10mmolL-1，100mmolL-1，200mmolL-1和300mmolL-1氯化钠的1/2Hoagland营养液，20天后测定野生型和转基因植株的光合速率和叶绿素含量。实施例5棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1对酵母盐敏感突变株的补偿作用1.将克隆到的全长cDNA亚克隆到pMD18-T载体中，构建成pMD18-T-GhNHX1。
2.将pMD18-T-GhNHX1和酵母表达载体pYES2经BamHI和HindIII酶切，回收目的条带，在连接酶作用下，构建成pYES2-GhNHX1表达载体。
3.挑取YPD平板上的酵母菌株K601(野生型)和R100(盐敏感突变株)单菌落与5mlYPD培养液中，30℃振荡培养过夜，再稀释10倍，振荡培养6小时，3000rpm离心5分钟收集菌体，用1.5mlTE重悬菌体。
4.分别取0.1ml上述菌液、3μg pYES2-GhNHX1质粒和0.6mlTE-liOAC-PEG溶液于一1.5ml离心管中，30℃振荡培养30分钟，42℃热击15分钟，3000rpm离心20秒收集菌体，重悬于0.5ml重蒸水中，取200μl涂布于选择培养基上，30℃培养2-4天。
5.转化子接种到选择培养液中，30℃振荡培养48小时，测定600nm处的光吸收。
钠离子反向运转蛋白基因序列表-wordSEQUENCE LISTING<110>山东农业大学<120>棉花Na+/H+反向转运蛋白基因的克隆和应用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2485<212>DNA<213>Gossypium hirsutum<220>1<221>CDS<222>(513)..(2141)<223><220><221>5’UTR<222>(1)..(512)<223><220><221>3’UTR<222>(2142)..(2485)<223><400>1acgcggggca acacagtctt gattttgatc gtttttcgct cccatcgaaa gcgaagattt 60taagctgaaa aaagaagaga ggaaaattgt ggcaatttgt tggtgagaaa gtcgaagatt120cacgtgggta agctccataa acagtgaaac attggatttt cttttttgtt tttgttttct180caagctctct cttcgaattt actcgtctct ttgaaactgt ccgttttttt ttggttcaat240aaaatcgcaa attatttgct aatttagaga agaaaattga acggagctga aacaaggatg300atttgttgct gcatgatgtt gattctccaa aacgattcga gtgcttaagg attttaagat360tagaaagttc ttgaaatgga cagttcagag gcataaaaat tttcgaagat ttacattgtt420gaaggagagc ttaaatctga agccttggac tacaactgtt tcagttagaa ggaattggtg480tttaataaaa tttgatttaa aaagaggtca at atg gtg gct ccg cag tta gct 533Met Val Ala Pro Gln Leu Ala1 5gct gtc ttt act aag ttg cag aca cta tct act tca gac cat gcg tct 581Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser10 15 20gtg gtc tcc atg aac ata ttt gta gcg ctt ctt tgt gct tgc att gtg 629Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val25 30 35att ggt cat ctt ttg gag gag aat aga tgg atg aac gaa rca att act 677Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Ash Glu Ser Ile Thr40 45 50 55gcc ctt atc att ggt gtt ttt act ggg gtc att att ttg ttg aca agt 725Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser60 65 70ggg ggt aaa agc tct cat ctt tta gtc ttc agt gaa gat ctg ttc ttt 773Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val Phe Set Glu Asp Leu Phe Phe75 80 85atc tat ctt ctg ccc cct att ata ttc aat gct ggg ttt cag gtg aaa 821Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Ash Ala Gly Phe Gln Val Lys90 95 100aag aag caa ttt ttc cgt aac ttt atc acc atc atg ctg ttt ggg gct 869Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala105 110 115gtt ggt aca cta ata tct tgt aca att atc tct tta ggt gta att aac 917Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn120 125 130 135ttc ttc aag gaa atg gac att ggc tcc tta gac att gga gat ttt cta 965Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser Leu Asp lle Gly Asp Phe Leu140 145 150gca att ggt gca ata ttt gct gcg aca gat tct gtt tgc aca ctg cag 1013Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln155 160 165gtg ctt aat cag gat gag act cca tta ctc tac agt ttg gtt ttc gga 1061Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly170 175 180gag ggt gtt gta aat gat gca aca tct gtg gtg ctt ttc aat gca atc 1109Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe Asn Ala Ile185 190 195cag agt ttt gac ctc gtt aat acc agt cct aga att ctt ctg gag ttt 1157Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe200 205 210 215att ggc agc ttt ttg tat tta ttt tta gca agc act atg ctg gga gtg 1205Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Thr Met Leu Gly Val220 225 230att gtt ggg ttg gtt agt gct tac atc atc aaa aag ttg tac ttt gga 1253
钠离子反向运转蛋白基因序列表-wordIle Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly235 240 245agg cac tca aca gat cgt gaa ttt gct ctt atg atg ctt atg gca tac 1301Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr250 255 260ctt tcg tat atc atg gct gaa ctg ttc tat ttg agt ggc att ctt aca 1349Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr265 270 275gta ttc ttt tgt ggg att gtg atg tca cat tat acc tgg cac aat gta 1397Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Ash Val280 285 290 295act gag agt tca aga gta act aca aag cat gcc ttt gct acc ttg tca 1445Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser300 305 310ttt gtt gct gag act ttt ctc ttt ctt tat gtc ggg atg gat gct ttg 1493Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu315 320 325gac atg gag aag tgg aga ttt gtc agt gat agc cct gga acg tca gtt 1541Asp Met Glu gys Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val330 335 340gct gtt agt gct gtg ctg atg ggt ctt gtt atg gtt gga aga gcg gct 1589Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu Val Met Val Gly Arg Ala Ala345 350 355ttt gtg ttt ccc ctg tca ttt tta tcc aac ttg gca aag aaa tca act 1637Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr360 365 370 375agt gag aaa atc agc ttc agg gaa caa att ata ata tgg tgg gct ggg 1685Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly380 385 390ctc atg aga ggc gct gta tct atg gca ctt gca tat aat cag ttt aca 1733Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Ash Gln Phe Thr395 400 405agg ggg ggc cat act cag ttg cga gga aat gca att atg att aca agc 1781Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly Ash Ala Ile Met Ile Thr Ser410 415 420acc ata acc att gtt cta ttc agc act gtg gtt ttt ggt tta atg act 1829Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly Leu Met Thr425 430 435aaa cct cta ata agg ttc ttg ctg cct cat ccc aaa cca aca gcc agc 1877Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro His Pro Lys Pro Thr Ala Set440 445 450 455atg ctc tca gac caa tcc act cca aaa tca atg gag gca cca ttt ctc 1925Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu460 465 470gga agc ggc cag gac tct ttt gat gat agt tta att gga gtt cat cga 1973Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp Ser Leu Ile Gly Val His Arg475 480 485cca aac agc att cgt gca ctt ctt aca act cca gca cac act gtt cat 2021Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr Thr Pro Ala His Thr Val His490 495 500tac tat tgg cga aag ttt gat aat gcc ttc atg cgc cct atg ttt ggt 2069Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Ash Ala Phe Met Arg Pro Met Phe Gly505 510 515ggc cgg ggt ttt gtg ccc ttc gtt cct ggc tcc cca aca gaa agg agt 2117Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser520 525 530 535gaa cct aat ctg cct caa tgg caa tgaggtggtt gaacaagatc tctacaaaaa 2171Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln540tgtacatgta atataacaat gcagtcggtt gcaaaaaaca tgcttctggc gagaagccag2231tgcggtatgc tttgtatgtt tcatgtatag gctatatttt gttggttttc aagtttcctc2291aagaggttct tgtttattct ccccgaaact accttcgcac ctgatgctat ctttccattt2351gacatttacg aatatttatg atctgggtga agcttagggg taggtgtgcc attctatttt2411gtacgtatac gagtatttat tttgtgttta tatcagtgtg tttagttttt atttttatta2471aaaaaaaaaa aaaa 2485<210>2<211>543<212>PRT<213>Gossypium hirsutum<400>2Met Val Ala Pro Gln Leu Ala Ala Val Phe Thr Lys Leu Gln Thr Leu1 5 10 15Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Ile Phe Val Ala20 25 30
钠离子反向运转蛋白基因序列表-wordLeu Leu Cys Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg35 40 45Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly Val Phe Thr Gly50 55 60Val Ile Ile Leu Leu Thr Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Leu Leu Val65 70 75 80Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe85 90 95Asn Ala Gly Phe Gln ValLys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Ile100105 110Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala Val Gly Thr Leu Ile Ser Cys Thr Ile115 120 125Ile Ser Leu Gly Val Ile Asn Phe Phe Lys Glu Met Asp Ile Gly Ser130 135 140Leu Asp Ile Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr145 150 155 160Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu165 170 175Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser180 185 190Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Val Asn Thr Ser195 200 205Pro Arg Ile Leu Leu Glu Phe Ile Gly Ser Phe Leu Tyr Leu Phe Leu210 215 220Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Ile Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Ile225 230 235 240Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Phe Ala245 250 255Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Met Ala Glu Leu Phe260 265 270Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser275 280 285His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys290 295 300His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu305 310 315 320Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Met Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser325 330 335Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ala Val Leu Met Gly Leu340 345 350Val Met Val Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser355 360 365Asn Leu Ala Lys Lys Ser Thr Ser Glu Lys Ile Ser Phe Arg Glu Gln370 375 380Ile Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala385 390 395 400Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Gly Gly His Thr Gln Leu Arg Gly405 410 415Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr420 425 430Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro435 440 445His Pro Lys Pro Thr Ala Ser Met Leu Ser Asp Gln Ser Thr Pro Lys450 455 460Ser Met Glu Ala Pro Phe Leu Gly Ser Gly Gln Asp Ser Phe Asp Asp465 470 475 480Ser Leu Ile Gly Val His Arg Pro Asn Ser Ile Arg Ala Leu Leu Thr485 490 495Thr Pro Ala His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala500 505 510Phe Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro515 520 525Gly Ser Pro Thr Glu Arg Ser Glu Pro Asn Leu Pro Gln Trp Gln530 535 540
权利要求
1.一个棉花Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1，其特征在于具有SEQ IN NO 1所示的核甘酸序列，SEQ IN NO 2所示的氨基酸序列(1)SEQ IN NO 1的信息(a)序列特征*长度9.485碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.1ACGCGGGGCAACACAGTCTTGATTTTGATCGTTTTTCGCTCCCATCGAAAGCGAAGATTT 60TAAGCTGAAAAAAGAAGAGAGGAAAATTGTGGCAATTTGTTGGTGAGAAAGTCGAAGATT 120CACGTGGGTAAGCTCCATAAACAGTGAAACATTGGATTTTCTTTTTTGTTTTTGTTTTCT 180CAAGCTCTCTCTTCGAATTTACTCGTCTCTTTGAAACTGTCCGTTTTTTTTTGGTTCAAT 240AAAATCGCAAATTATTTGCTAATTTAGAGAAGAAAATTGAACGGAGCTGAAACAAGGATG 300ATTTGTTGCTGCATGATGTTGATTCTCCAAAACGATTCGAGTGCTTAAGGATTTTAAGAT 360TAGAAAGTTCTTGAAATGGACAGTTCAGAGGCATAAAAATTTTCGAAGATTTACATTGTT 420GAAGGAGAGCTTAAATCTGAAGCCTTGGACTACAACTGTTTCAGTTAGAAGGAATTGGTG 480TTTAATAAAATTTGATTTAAAAAGAGGTCAATATGGTGGCTCCGCAGTTAGCTGCTGTCT 540TTACTAAGTTGCAGACACTATCTACTTCAGACCATGCGTCTGTGGTCTCCATGAACATAT 600TTGTAGCGCTTCTTTGTGCTTGCATTGTGATTGGTCATCTTTTGGAGGAGAATAGATGGA 660TGAACGAATCAATTACTGCCCTTATCATTGGTGTTTTTACTGGGGTCATTATTTTGTTGA 720CAAGTGGGGGTAAAAGCTCTCATCTTTTAGTCTTCAGTGAAGATCTGTTCTTTATCTATC 780TTCTGCCCCCTATTATATTCAATGCTGGGTTTCAGGTGAAAAAGAAGCAATTTTTCCGTA 840ACTTTATCACCATCATGCTGTTTGGGGCTGTTGGTACACTAATATCTTGTACAATTATCT 900CTTTAGGTGTAATTAACTTCTTCAAGGAAATGGACATTGGCTCCTTAGACATTGGAGATT 960TTCTAGCAATTGGTGCAATATTTGCTGCGACAGATTCTGTTTGCACACTGCAGGTGCTTA 1020ATCAGGATGAGACTCCATTACTCTACAGTTTGGTTTTCGGAGAGGGTGTTGTAAATGATG 1080CAACATCTGTGGTGCTTTTCAATGCAATCCAGAGTTTTGACCTCGTTAATACCAGTCCTA 1140GAATTCTTCTGGAGTTTATTGGCAGCTTTTTGTATTTATTTTTAGCAAGCACTATGCTGG 1200GAGTGATTGTTGGGTTGGTTAGTGCTTACATCATCAAAAAGTTGTACTTTGGAAGGCACT 1260CAACAGATCGTGAATTTGCTCTTATGATGCTTATGGCATACCTTTCGTATATCATGGCTG 1320AACTGTTCTATTTGAGTGGCATTCTTACAGTATTCTTTTGTGGGATTGTGATGTCACATT 1380ATACCTGGCACAATGTAACTGAGAGTTCAAGAGTAACTACAAAGCATGCCTTTGCTACCT 1440TGTCATTTGTTGCTGAGACTTTTCTCTTTCTTTATGTCGGGATGGATGCTTTGGACATGG 1500AGAAGTGGAGATTTGTCAGTGATAGCCCTGGAACGTCAGTTGCTGTTAGTGCTGTGCTGA 1560TGGGTCTTGTTATGGTTGGAAGAGCGGCTTTTGTGTTTCCCCTGTCATTTTTATCCAACT 1620TGGCAAAGAAATCAACTAGTGAGAAAATCAGCTTCAGGGAACAAATTATAATATGGTGGG 1680CTGGGCTCATGAGAGGCGCTGTATCTATGGCACTTGCATATAATCAGTTTACAAGGGGGG 1740GCCATACTCAGTTGCGAGGAAATGCAATTATGATTACAAGCACCATAACCATTGTTCTAT 1800TCAGCACTGTGGTTTTTGGTTTAATGACTAAACCTCTAATAAGGTTCTTGCTGCCTCATC 1860CCAAACCAACAGCCAGCATGCTCTCAGACCAATCCACTCCAAAATCAATGGAGGCACCAT 1920TTCTCGGAAGCGGCCAGGACTCTTTTGATGATAGTTTAATTGGAGTTCATCGACCAAACA 1880GCATTCGTGCACTTCTTACAACTCCAGCACACACTGTTCATTACTATTGGCGAAAGTTTG 2040ATAATGCCTTCATGCGCCCTATGTTTGGTGGCCGGGGTTTTGTGCCCTTCGTTCCTGGCT 2100CCCCAACAGAAAGGAGTGAACCTAATCTGCCTCAATGGCAATGAGGTGGTTGAACAAGAT 2160CTCTACAAAAATGTACATGTAATATAACAATGCAGTCGGTTGCAAAAAACATGCTTCTGG 2220CGAGAAGCCAGTGCGGTATGCTTTGTATGTTTCATGTATAGGCTATATTTTGTTGGTTTT 2280CAAGTTTCCTCAAGAGGTTCTTGTTTATTCTCCCCGAAACTACCTTCGCACCTGATGCTA 2340TCTTTCCATTTGACATTTACGAATATTTATGATCTGGGTGAAGCTTAGGGGTAGGTGTGC 2400CATTCTATTTTGTACGTATACGAGTATTTATTTTGTGTTTATATCAGTGTGTTTAGTTTT 2460TATTTTTATTAAAAAAAAAAAAAAA 2485(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*长度543氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述SEQ IN NO.2MVAPQLAAVFTKLQTLSTSDHASVVSMNIFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALIIGVFTGVIILLTSGGKSSHLLV 81FSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIMLFGAVGTLISCTIISLGVINFFKEMDIGSLDIGDFLAIGAIFAAT 161DSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNAIQSFDLVNTSPRILLEFIGSFLYLFLASTMLGVIVGLVSAY 241IKKLYFGRHSTDREFALMMLMAYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHAFATLSFVAETFLFL 321YVGMDALDMEKWRFVSDSPGTSVAVSAVLMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKSTSEKISFREQIIIWWAGLMRGAVSMA 401LAYNQFTRGGHTQLRGNAIMITSTITIVLFSTVVFGLMTKPLIRFLLPHPKPTASMLSDQSTPKSMEAPFLGSGQDSFDD 461SLIGVHRPNSIRALLTTPAHTVHYYWRKFDNAFMRPMFGGRGFVPFVPGSPTERSEPNLPQWQ 543
2.根据权利要求1所述的Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX1的克隆方法，其特征在于从棉花叶片中提取总RNA，然后利用2微克总RNA反转录成cDNA，根据其它植物中的Na+/H+反向转运蛋白保守的氨基酸序列设计一对兼并引物正向引物5′-CC(GATC)CC(GATC)AT(TAC)AT(TAC)TT(TC)AA(TC)GC-3′反向引物5′-GT(GATC)AC(GATC)TT(AG)TGCCA(GATC)GT(AG)TA-3′进行常规聚合酶链式反应，将扩增出的DNA片段连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，用于序列测定，然后经过3’和5’末端快速扩增得到全长的cDNA为2485bp。
3.根据要求1所述GhNHX1耐盐基因的应用，其特征在于该基因在烟草中过量表达，能提高植物的耐盐性，该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，提高其耐盐性。
全文摘要
本发明涉及棉花中Na
文档编号C12P19/00GK1425675SQ02151530
公开日2003年6月25日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者郑成超, 吴长艾, 杨国栋 申请人:山东农业大学