专利名称：利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种运用化学诱导基因调控系统来控制外源基因在重组微生物中的基因表达，从而同步解决重组菌株高效表达与安全性的方法。
背景技术：
随着人口的增长和社会生活水平的提高，人们对生活的质量提出了更高的要求。转基因技术能打破物种界线，实现遗传信息在不同物种间的交流，从而创造出更加符合我们要求的食品、药物等产品。但是，另一方面，正是由于原有生殖隔离界线被打破，转基因技术在给人类带来巨大经济效益和福利的同时，也可能由于外源基因的引入，给人类健康和生存环境造成潜在的危害。与植物等相比，重组微生物的控制更加困难。特别是许多真菌(包括工业、农业、医药和环境用真菌)，这些真菌的遗传改良可以产生巨大的经济与社会效益。但是，由于其产生的孢子通过空气和其他媒介传播，重组菌株一旦释放到环境后就难以控制，其安全性更值得重视。对于杀虫真菌等需要释放到环境中去的微生物来说，一方面我们希望杀虫微生物对害虫有很高的毒力，能在使用后尽快击倒害虫。另一方面，从生物安全性角度上考虑，我们希望重组微生物在杀死害虫后，外源基因不再表达，恢复到野生型状态，以维护生物的多样性，同时达到提高杀虫微生物毒力与安全性之目的。但是，迄今为止，还未见提高重组真菌安全性技术的报道。
基因表达的化学诱导调控系统具有基因表达水平高、可以人为控制等优点。其基本原理是，把目的基因置于一套双重启动子的控制之下，控制目的基因转录的启动子需要另一转录因子的激活才能启动，而转录因子的启动则受非真菌源的化学物质的诱导。换言之，目的基因的转录，受某一化学因子的诱导，当施用这种化学物质时，基因就表达，不施用时，该基因就不表达。因此，化学诱导基因表达系统的最大优点是，通过化学诱导物质的施用，实现对基因定时、定位表达的精确控制。
目前，已获成功的化学诱导系统主要有TetR，tTA，GVG，XVE，TGV等，其中，GVG系统是以哺乳动物的糖皮质激素(Glucocorticoid)地塞米松(Dexamethasone)为诱导因子，报道较多。Chua Nam Hai等(1997)将GVG系统用于烟草，经地塞米松诱导后转基因烟草中，报告基因的表达水平提高了100倍。但它的主要缺点是地塞米松具有毒性，限制了其应用。近年来，不断有新的诱导系统推出。其中值得注意的是Martinez等的GVGEc系统，其特点是以来自烟芽夜蛾(Hliothis uirescens)的蜕皮激素受体构建激活子，用一种防治鳞翅目害虫的蜕皮激素类似物RH5992作诱导，转基因烟草的报告基因表达水平提高了400倍，是35S的1.5倍。该系统在植物中已有成功应用的报道。诱导效率令人满意。目前尚无基因表达的化学诱导调控系统在杀虫真菌中应用的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法。该方法提出利用化学诱导调控系统来控制真菌重组菌株的基因表达，把非真菌源的化学物质(如昆虫蜕皮激素、高等哺乳动物糖皮质激素)为诱导物的基因表达化学诱导系统引入丝状真菌，对其基因表达实现精确控制，以同步解决重组菌株的基因高效表达与安全性问题。
本发明的基本思路是将受非真菌源的化学物质，如昆虫蜕皮激素(Ecdysone)、地噻米松(Dexamethasone)等诱导的基因化学调控系统引入杀虫真菌中，使其下游基因的表达受诱导物的控制。这一系统的建立主要包括三个主要部分1.组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建。2.置于诱导型启动子下的目的基因引入上述真菌表达载体。3.诱导目的基因的表达。
本发明的内容为用真菌的组成型启动子PgpdA(gpd promoter from Aspergillusnidulans)组成性的表达GVGEc系统的调节蛋白，将目的基因置于受调控的启动子下游，这一人工合成的启动子由几个重复的能与调节蛋白特异结合的操纵子序列和PgpdA的Minimal启动子序列连接而成。完成后的表达载体如图所示 PgpdAgpdA promoter from Aspergillus nidulansGRActGlucocorticoid receptor activationVP16the transcription domain of Herpes simplex virus protein 16GRDBDGlucocorticoid receptor DNA binding domainHecR LBDHeliothis ecdysone receptor ligand binding domainTtrpCtrpC termitorGREGlucocorticoid receptor response elementMPMinimal promoter of Pgpd A本发明依次通过下列步骤实现(1)组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建①用BamHI从含有调控蛋白GVGEc的载体pMF6GRVP16HecR上，切下并回收2.2kb的、编码调控蛋白的基因片段GRAct-VP16-GRDBD-HecR；②BamHI酶切pBSPMTn载体，并去磷酸化，该载体含有构巢曲霉(Aspergilliusnidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，以及色氨酸基因的终止子TtrpC；③将上述步骤①中的GRAct-VP16-GRDBD-HecR片段连入步骤②中的去磷酸化pBSPMTn载体，选择正向插入的克隆，得到中间载体pBS-P-GVGEc-T；④用XbaI/HindIII从上述pBS-P-GVGEc-T载体上切下5.2kb的PgpdA-GVGEc-TtrpC片段，回收；⑤上述步骤④的片段连入用XbaI/HindIII处理的真菌表达载体pBANF-Bar中，得到组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，该表达载体以抗除草剂基因bar作为选择标记基因，转化真菌后用除草剂筛选转化子；(2)真菌中受蜕皮激素诱导的诱导型启动子的构建①通过对构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，进行启动子分析，确定其Minimal启动子(MP)的序列；Minimal启动子的全序列如下，全长85bpCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTA②设计酶切位点，合成MP5’端引入HindIII、BglII位点(AAGCTTAGATCT)，3’端引入SmaI位点(CCCGGG)，完成后的MP序列为AAGCTTAGATCTCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTACCCGGG③将上述MP寡聚核苷酸双链用HindIII/SmaI双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子TtrpC的载体Xa-TtrpC，该载体Xa-TtrpC同样也用HindIII/EcoRV处理，由此得到含MP和TtrpC的中间载体pXa-MP-TtrpC；④将目的基因插入pXa-MP-TtrpC，得到中间载体pXa-MP-GUS-TtrpC；⑤用HindIII/BamHI从p222.1GRE6载体上切下163bp的GRE序列，该序列含有6个重复拷贝的GRE，全序列如下AAGCTTCGACTGTACAGGATGTTCTAGCTACTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGACTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGGATCC⑥将上述GRE酶切片段连入HindIII/BglII酶切的pXa-MP-GUS-TtrpC载体，得到含目的基因的、真菌中特异启动的、受蜕皮激素诱导的启动子载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC；(3)最终表达载体的构建①将(2)-⑥中构建的载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC，用HindIII单酶切，回收3.0kb的GREMP-GUS-TtrpC片段；②用HindIII单酶切(1)-⑤中得到的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，去磷酸化处理；③将上述①、②中的片段连接，选择两个启动子顺向连接的克隆，就得到最终所需的、用于转化真菌的表达载体pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS；④将上述pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS载体转化农杆菌，再通过农杆菌介导的方法转化真菌，筛选获得重组的菌株；⑤重组真菌加入蜕皮激素(如RH5992，2mg/mL)诱导下游基因表达，未加诱导物的不表达。
图1为步骤(3)-③得到的表达载体pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS的图谱。
本发明以杀虫真菌等微生物为对象，构建了用于真菌的基因化学诱导表达系统。使用本发明提供的系统，通过遗传转化获得重组菌株，当菌剂中加入诱导物时，菌株的毒力提高。不加时，重组菌株恢复野生型表型，因此有助于提高重组菌株的安全性。对提高杀虫真菌重组菌株的安全性有重要意义。而且，化学诱导系统的表达水平往往比组成型启动子高，因此，该系统的应用将有助于重组菌株侵染力进一步提高。这样使重组菌株的基因表达水平和安全性均得到同步提高。
本发明的优点是(1)使外源基因在重组微生物中的表达受到化学诱导物的调控。加入诱导物，外源基因表达；不加诱导物，外源基因不表达，这样使外源基因处于人为控制之下。由于化学诱导系统的表达水平往往比组成型启动子高，因此，将该基因表达的化学诱导调控系统用于真菌侵染相关基因的表达调控，将有助于重组菌株侵染力的进一步提高。该系统应用于杀虫微生物，通过遗传转化获得的重组菌株，当菌剂中加入诱导物时，目的基因高水平表达，菌株的毒力提高。不加时，重组菌株恢复野生型表型，因此可以达到同步提高重组菌株的毒力和安全性的目的。
(2)本系统所用的化学诱导物之一为昆虫蜕皮激素安全性好，本身还具有干扰昆虫正常发育的功能等优点，是一种理想的化学诱导因子。
(3)通过基因表达的化学诱导调控系统，可以对待研究的基因进行灵活的定时、定点的表达控制，更方便对基因进行功能分析。特别是研究一些与发育相关的基因，和一些对微生物有害或有致死效应的基因。
(4)本系统可进一步与基因删除系统(如Cre-loxP，FRT-FLP等)相结合，可使目的基因在完成功能后被自动删除。这将使杀虫真菌重组菌株的安全性得到更严格的控制。
具体实施例方式用BamHI从含有调控蛋白GVGEc的载体pMF6GRVP16HecR上，切下并回收2.2kb的、编码调控蛋白的基因片段GRAct-VP16-GRDBD-HecR，连接到用BamHI酶切并经磷酸化处理的载体片段pBSPMTn，选择正向插入的克隆，得到中间载体pBS-P-GVGEc-T。然后用XbaI/HindIII从pBS-P-GVGEc-T载体上切下5.2kb的PgpdA-GVGEc-TtrpC片段，回收，并将回收的片段连入用XbaI/HindIII处理的真菌表达载体pBANF-Bar中，得到组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT。通过对构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA进行启动子分析，确定其Minimal启动子(MP)的序列；设计酶切位点，人工合成MP序列，并在其5’端引入HindIII和BglII酶切位点(AAGCTTAGATCT)，3’端引入SmaI位点(CCCGGG)。将上述MP寡聚核苷酸双链用HindIII/SmaI双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子TtrpC的载体Xa-TtrpC(该载体Xa-TtrpC用HindIII/EcoRV处理)，由此得到含MP和TtrpC的中间载体pXa-MP-TtrpC。进一步将目的基因如GUS基因插入pXa-MP-TtrpC，得到中间载体pXa-MP-GUS-TtrpC。用HindIII/BamHI从p222.1GRE6载体上切下163bp的GRE6拷贝序列，连接到经HindIII/BglII酶切的pXa-MP-GUS-TtrpC载体，得到含目的基因的、真菌中特异启动的、受蜕皮激素诱导的启动子载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC。用HindIII单酶切构建的载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC，回收3.0kb的GREMP-GUS-TtrpC片段；同时用HindIII单酶切真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，去磷酸化处理，然后将GREMP-GUS-TtrpC片段和pBANF-Bar-PGVGEcT连接，选择两个启动子顺向连接的克隆，即得到最终所需的、用于转化真菌的表达载体pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS。将pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS载体转化农杆菌，再通过农杆菌介导的方法转化真菌，筛选获得重组的菌株。重组真菌在加入蜕皮激素(如RH5992，2mg/mL)的条件下，诱导下游基因表达，未加诱导物则下游基因不表达。
权利要求
1.一种利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法，其特征在于，依次包括下列步骤(1)组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建①用BamHI从含有调控蛋白GVGEc的载体pMF6GRVP16HecR上，切下并回收2.2kb的、编码调控蛋白的基因片段GRAct-VP16-GRDBD-HecR；②BamHI酶切pBSPMTn载体，并去磷酸化，该载体含有构巢曲霉(Aspergilliusnidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，以及色氨酸基因的终止子TtrpC；③将上述步骤①中的GRAct-VP16-GRDBD-HecR片段连入步骤②中的去磷酸化pBSPMTn载体，选择正向插入的克隆，得到中间载体pBS-P-GVGEc-T；④用XbaI/HindIII从上述pBS-P-GVGEc-T载体上切下5.2kb的PgpdA-GVGEc-TtrpC片段，回收；⑤上述步骤④的片段连入用XbaI/HindIII处理的真菌表达载体pBANF-Bar中，得到组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，该表达载体以抗除草剂基因bar作为选择标记基因，转化真菌后用除草剂筛选转化子；(2)真菌中受蜕皮激素诱导的诱导型启动子的构建①通过对构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，进行启动子分析，确定其Minimal启动子(MP)的序列；Minimal启动子的全序列如下，全长85bpCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTA②设计酶切位点，合成MP5’端引入HindIII、BglII位点(AAGCTTAGATCT)，3’端引入SmaI位点(CCCGGG)，完成后的MP序列为AAGCTTAGATCTCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTACCCGGG③将上述MP寡聚核苷酸双链用HindIII/SmaI双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子TtrpC的载体Xa-TtrpC，该载体Xa-TtrpC同样也用HindIII/EcoRV处理，由此得到含MP和TtrpC的中间载体pXa-MP-TtrpC；④将目的基因插入pXa-MP-TtrpC，得到中间载体pXa-MP-GUS-TtrpC；⑤用HindIII/BamHI从p222.1GRE6载体上切下163bp的GRE序列，该序列含有6个重复拷贝的GRE，全序列如下AAGCTTCGACTGTACAGGATGTTCTAGCTACTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGACTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGTCGAGTAGCTAGAACATCCTGTACAGGATCC⑥将上述GRE酶切片段连入HindIII/BglII酶切的pXa-MP-GUS-TtrpC载体，得到含目的基因的、真菌中特异启动的、受蜕皮激素诱导的启动子载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC；(3)最终表达载体的构建①将(2)-⑥中构建的载体pXa-GREMP-GUS-TtrpC，用HindIII单酶切，回收3.Okb的GREMP-GUS-TtrpC片段；②用HindIII单酶切(1)-⑤中得到的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，去磷酸化处理；③将上述①、②中的片段连接，选择两个启动子顺向连接的克隆，就得到最终所需的、用于转化真菌的表达载体pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS；④将上述pBANF-bar-GVGEc-GERMP-GUS载体转化农杆菌，再通过农杆菌介导的方法转化真菌，筛选获得重组的菌株；⑤重组真菌加入蜕皮激素(如RH5992，2mg/mL)诱导下游基因表达，未加诱导物的不表达。
全文摘要
一种利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法，该方法提出利用化学诱导调控系统来控制真菌重组菌株的基因表达，把非真菌源的化学物质(如昆虫蜕皮激素、高等哺乳动物糖皮质激素)为诱导物的基因表达化学诱导系统引入真菌，加入诱导物，外源基因表达，不加诱导物，外源基因不表达，对其基因表达实现精确控制，以同步解决重组菌株的基因高效表达与安全性问题。
文档编号C12N15/79GK1410526SQ0215320
公开日2003年4月16日 申请日期2002年11月26日 优先权日2002年11月26日
发明者裴炎, 张永军, 郑雪莲, 方卫国 申请人:西南农业大学