专利名称：一种无血清培养基与浓缩液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学实验用品，尤其是涉及一种用于在体外培养人和动物的组织和细胞的无血清培养基与浓缩液及其制备方法。
国外早在1979年就开始进行了无血清培养法的研究。现国外生产的无血清培养基种类很多，分别适用于昆虫细胞、杂交瘤细胞、皮肤角朊细胞、造血细胞、肿瘤细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、胚胎干细胞的无血清培养基，它们共同存在下述缺点(1)仅适用于某一特殊组织类型的细胞，如神经细胞、肝细胞、角朊细胞、内皮细胞等；(2)均为1倍(1X)500-1000ml的工作液，少数也有粉末袋装。在用于造血、肿瘤细胞以及干细胞的无血清培养基中，尚未见5倍(5X)或10倍(10X)经过浓缩的无血清培养基浓缩液。
本发明的另一个目的在于提供一种无血清培养基的浓缩液，它更易于运输和贮存，并且使用方便，只需按比例稀释即可使用。
本发明的第三个目的在于提供戴氏无血清培养基与浓缩液的制备方法。
本发明的第一个目的是这样实现的本发明的戴氏无血清培养基的配方如下牛血清白蛋白溶液5--10mg/ml 胰岛素溶液 8--20μg/ml纯化人转铁蛋白溶液 1--30μg/ml胆固醇溶液 20--60μg/ml过氧化氢酶溶液 20--50μg/ml本发明的第二个目的是这样实现的本发明的戴氏无血清培养基的5-10倍浓缩液的配方如下牛血清白蛋白溶液25--100mg/ml胰岛素溶液 40--200μg/ml纯化人转铁蛋白溶液 5--300μg/ml胆固醇溶液 100--600μg/ml过氧化氢酶溶液 100--500μg/ml本发明的戴氏无血清培养基的制备方法为(1)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，缩写BSA)溶液的配制将市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒称取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去离子水)中，在4℃冰箱内静置24小时，然后将其与10g树脂珠混合，置4℃冰箱内2小时，每15分钟搅拌一次，去树脂珠，再与10g树脂珠混合，再将其在4℃冰箱内和室温下分别静置1小时，去树脂珠，测牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲盐水(--Mg2+、--Ca2+)10倍浓缩液，再用刀比科氏磷酸缓冲盐水工作液稀释为20％牛血清白蛋白溶液(重量/体积，即W/V)，过滤除菌，置-20℃冰箱内保存；(2)、胰岛素(Insulin，缩写Ins)溶液的配制将市售胰岛素粉末用少量磷酸缓冲液(PBS)溶解，滴加0.01M盐酸(HCL)，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s media，缩写IMDM)将其稀释至配方中浓度的10倍贮存液，置-20℃冰箱内保存；(3)、纯化人转铁蛋白(Human Transferrin，缩写HTf)溶液的配制将市售的纯化人转铁蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培养基中，每mg转铁蛋白加7.4×10-9M三价铁离子Fe3+(以溶于0.1mM盐酸中的FeCl3形式)，使1/3Fe2+饱和，稀释10倍，得到贮存液，再将贮存液过滤除菌后置-20℃冰箱内保存；(4)、胆固醇(Cholesterol，缩写Chol)溶液的配制将50mg市售的胆固醇粉末加在50ml酸性培养基中，用带2cm直径肽探头的超声波粉碎器粉碎，在0℃冰箱内以最大振幅振荡1小时，使之完全分散，然后将悬液先后通过1.2μm和0.45μm的滤膜过滤，置-20℃冰箱内保存；(此酸性培养基为刀比科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s media，缩写DMEM)溶液，不加碳酸氢钠，但加入抗菌素和1％去脂牛血清白蛋白)；(5)、过氧化氢酶(Catalase，缩写Cat)溶液的配制将市售的过氧化氢酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培养基直接溶解，配成1mg/ml贮存液，置-20℃冰箱内保存；(6)、将上述五种溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基稀释为500ml-1000ml/瓶，五种成份的终浓度为戴氏无血清培养基配方中的浓度，即得成品。
本发明的戴氏无血清培养基的浓缩液的制备方法为将上述五种溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基稀释成50-100ml/瓶，五种成份的终浓度为戴氏无血清培养基的浓缩液配方中的浓度，即得成品。
本发明是以牛血清白蛋白粉末、胰岛素粉末、纯化人转铁蛋白粉末、胆固醇粉末、过氧化氢酶粉末为原料，通过一定工艺制备而成。这些原料均为市售，且均呈粉末状，可以称量，不含多肽因子和激素物质，因而既可避免因血清批号不同所带来的不稳定性，又不至于影响实验结果。因此戴氏无血清培养基是在排除血清干扰的情况下使细胞维持正常生长，从而使实验结果更加科学和准确，并有较好的重复性。它还有如下特点(1)配方中加有过氧化氢酶溶液在戴氏无血清培养基中加入过氧化氢酶溶液可以促进细胞的长期生长和克隆，而且可以取代牛血清白蛋白和酪氨酸。研究证明，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质。培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等均能导致过氧化氢的形成，过氧化氢可由细胞膜上不饱和脂肪酸的氧化、细胞蛋白质的氧化和/或DNA的损伤而引起细胞的死亡，而过氧化氢酶则可以分解过氧化氢；(2)配方中各种成分的浓度和类似产品不同如牛血清白蛋白在1倍无血清培养基中为5--10mg/ml，而国外同类产品多数仅为0.4mg/ml。实验证实，5--10mg/ml的牛血清白蛋白在促进细胞生长方面远优于0.4mg/ml；。
(3)两种剂型和包装A、1倍无血清培养基为500--1000ml/瓶；B、5--10倍无血清培养基浓缩液为50--100ml/瓶，易于运输和贮存，且使用方便，使用时只需将此浓缩液按10％--20％比例加入任何一种基础培养基即可成为1倍戴氏无血清培养基；(4)本发明适用于多种类型的组织和细胞的生长本发明已应用于如造血细胞、淋巴细胞、皮肤角朊细胞、肿瘤细胞、干细胞、树突状细胞、猴肾细胞、免疫活性细胞(LAK细胞、TIL细胞、CD3AK细胞)的体外培养。申请人还用本发明研究了肿瘤细胞的凋亡，由于排除了血清本身存在的可诱导凋亡物质的干扰，可较真实地反映细胞凋亡情况。
权利要求
1.一种戴氏无血清培养基，其特征在于配方为牛血清白蛋白溶液5--10mg/ml 胰岛素溶液 8--20μg/ml纯化人转铁蛋白溶液 1--30μg/ml胆固醇溶液 20--60μg/ml过氧化氢酶溶液 20--50μg/ml
2.如权利要求1所述的戴氏无血清培养基的浓缩液，其特征在于5-10倍浓缩液的配方为牛血清白蛋白溶液25--100mg/ml胰岛素溶液 40--200μg/ml纯化人转铁蛋白溶液 5--300μg/ml胆固醇溶液 100--600μg/ml过氧化氢酶溶液 100--500μg/ml
3.制备如权利要求1所述的戴氏无血清培养基的方法，其特征在于(1)、牛血清白蛋白溶液的配制将市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒称取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去离子水)中，在4℃冰箱内静置24小时，然后将其与10g树脂珠混合，置4℃冰箱内2小时，每15分钟搅拌一次，去树脂珠，再与10g树脂珠混合，再将其在4℃冰箱内和室温下分别静置1小时，去树脂珠，测牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏磷酸缓冲盐水(--Mg2+、--Ca2+)10倍浓缩液，再用刀比科氏磷酸缓冲盐水工作液稀释为20％牛血清白蛋白溶液，过滤除菌，置-20℃冰箱内保存；(2)、胰岛素溶液的配制将市售胰岛素粉末用少量磷酸缓冲液溶解，滴加0.01M盐酸，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基将其稀释至配方中浓度的10倍贮存液，置-20℃冰箱内保存；(3)、纯化人转铁蛋白溶液的配制将市售的纯化人转铁蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培养基中，每mg转铁蛋白加7.4×10-9M三价铁离子Fe3+，使1/3Fe2+饱和，稀释10倍，得到贮存液，再将贮存液过滤除菌后置-20℃冰箱内保存；(4)、胆固醇溶液的配制将50mg市售的胆固醇粉末加在50ml酸性培养基中，用带2cm直径肽探头的超声波粉碎器粉碎，在0℃冰箱内以最大振幅振荡1小时，使之完全分散，然后将悬液先后通过1.2μm和0.45μm的滤膜过滤，置-20℃冰箱内保存；(5)、过氧化氢酶溶液的配制将市售的过氧化氢酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培养基直接溶解，配成lmg/ml贮存液，置-20℃冰箱内保存；(6)、将上述五种溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基稀释为500ml-1000ml/瓶，五种成份的终浓度为戴氏无血清培养基配方中的浓度，即得成品。
4.制备如权利要求2所述的戴氏无血清培养基的浓缩液的方法为(1)、牛血清白蛋白溶液的配制将市售牛血清白蛋白粉末按下法去毒称取市售的牛血清白蛋白粉末100g，使之溶于182ml三蒸水(或去离子水)中，在4℃冰箱内静置24小时，然后将其与10g树脂珠混合，置4℃冰箱内2小时，每15分钟搅拌一次，去树脂珠，再与10g树脂珠混合，再将其在4℃冰箱内和室温下分别静置1小时，去树脂珠，测牛血清白蛋白的容量，每15ml牛血清白蛋白加1.1ml刀比科氏磷酸缓冲盐水(--Mg2+、--Ca2+)10倍浓缩液，再用刀比科氏磷酸缓冲盐水工作液稀释为20％牛血清白蛋白溶液，过滤除菌，置-20℃冰箱内保存；(2)、胰岛素溶液的配制将市售胰岛素粉末用少量磷酸缓冲液溶解，滴加0.01M盐酸，使之完全溶解，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基将其稀释至配方中浓度的10倍贮存液，置-20℃冰箱内保存；(3)、纯化人转铁蛋白溶液的配制将市售的纯化人转铁蛋白粉末溶于90mg/ml的伊斯科夫改良刀比科氏培养基中，每mg转铁蛋白加7.4×10-9M三价铁离子Fe3+，使1/3Fe2+饱和，稀释10倍，得到贮存液，再将贮存液过滤除菌后置-20℃冰箱内保存；(4)、胆固醇溶液的配制将50mg市售的胆固醇粉末加在50ml酸性培养基中，用带2cm直径肽探头的超声波粉碎器粉碎，在0℃冰箱内以最大振幅振荡1小时，使之完全分散，然后将悬液先后通过1.2μm和0.45μm的滤膜过滤，置-20℃冰箱内保存；(5)、过氧化氢酶溶液的配制将市售的过氧化氢酶粉末用伊斯科夫改良刀比科氏培养基直接溶解，配成1mg/ml贮存液，置-20℃冰箱内保存；(6)、将上述五种溶液按配方比例混合，再用伊斯科夫改良刀比科氏培养基稀释为50ml-100ml/瓶，五种成份的终浓度为戴氏无血清培养基的浓缩液配方中的浓度，即得成品。
全文摘要
本发明公开了一种无血清培养基与浓缩液及其制备方法，它是以牛血清白蛋白溶液、胰岛素溶液、纯化人转铁蛋白溶液、胆固醇溶液、过氧化氢酶溶液为原料，通过一定工艺制备而成。本发明中的五种成份的主要原料均呈粉末状，可以称量，不含多肽因子和激素物质，因而既可避免因血清批号不同所带来的不稳定性，又不致于影响实验结果。因此无血清培养基是在排除血清干扰的情况下使细胞维持正常生长，从而使实验结果更加科学和准确，并有较好的重复性。它还有如下特点(1)配方中加有过氧化氢酶溶液；(2)配方中各种成分的浓度和类似产品不同；(3)两种剂型和包装500－1000ml/瓶或50－100ml/瓶；(4)本发明适用于多种类型的组织和细胞的生长。
文档编号C12N5/06GK1431297SQ02157709
公开日2003年7月23日 申请日期2002年12月17日 优先权日2002年12月17日
发明者戴育成 申请人:戴育成