专利名称：薄层中组织培养用的生物反应器及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞和组织培养反应器，尤其通过细胞生长和/或细胞分化，可能在生物相容性基质和/或粘着支持物上任选制备植入物。
该生物反应器特别适合于在薄层中培养组织或者细胞，并且含有保证组织或者细胞的生理刺激并且向适用于在薄层中进行培养的培养基提供营养的装置。反应器还以有利的方式包括使得易于在培养室中引入或者取出组织或者植入物的固体部分的装置或者形式，以及包括例如壁或者可弹性变形的元件。另外，该反应器可以包括温度调节的装置。
该反应器可以用于培养不同类型的细胞和制备各种形式、组成和应用的植入物。
本发明还涉及在根据本发明的生物反应器的帮助下制备植入物的方法。因此本发明显然有用于制备牙、骨、软骨植入物等，包含组织或者细胞的制备，任选与生物相容性基质和/或细胞或组织或基质的固相支持物或者半固相粘着支持物相关联。
制造牙植入物的反应器特别公知于文献WO 00/21456。该反应器能够接受一种包括齿根部分和齿冠部分的植入物核心。所述的核心用惰性的生物相容性材料按照与拔出的牙齿相似的形状制造。所述植入物的根部浸入在培养基内的间叶细胞培养物中，所述的培养基的成分使细胞能够分化成成牙骨质细胞和成纤维细胞。把这种浸入保持足够长的时间，让成牙骨质细胞能够粘附在齿根部上，形成牙骨质的第一层和附着在此牙骨质上的牙槽齿韧带的轮廓。
反应器构思成能够机械激活在植入物周围进行成形的组织。这种激活再现牙齿正常受到的生理制约。的确需要生理刺激让成牙骨质细胞和成纤维细胞能够体内增生和分化。
在文献WO 00/21456所述的反应器中，植入物的核心位于由培养基经之扩散的刚性多孔壁所限定的泡室中。为了激活培养的组织，机械方法置于植入物核心与反应器容器之间。这些装置确保植入物核心相对于容器的前向和后向的位移。所述的位移显著地沿植入物的长度发生。激发装置包括例如电致动器。
这种反应器是精致的设备，因为它必须能够精确地控制相对于容器对植入物核心的引导。的确，在泡室的壁与核心之间的间隔应当保持在为成牙骨质细胞和成纤维细胞满意地生长所确定的值的范围内。另外，该反应器不允许更新或者监测其中浸入细胞的介质的成分。还有所提供的机械刺激有一定的局限性。另对该反应器加以说明专门用于制备牙植入物。
本发明的目的是提供反应器，所述的反应器容易制造并且让细胞，更特别是在薄层中培养的细胞或者组织，能够在反应器的腔内，优选地在基质内(例如培养的细胞或者组织产生的细胞外基质)和在支持物(用于粘着)表面上满意地生长和/或分化。
该反应器的规格尤其允许监测几个培养条件以促进细胞的增生和分化、细胞外基质产生及组织形成和成熟。该生物反应器更具体适用于在薄层中培养组织或者细胞，特别是存在许多制约和问题的结构组织。
第一个条件是表面效应，所述的表面效应让细胞粘着或者组织附着到反应器中的生物相容性壁上，或者两个相互面对的由培养区间分离开的壁上，所述的培养区间于是受到与表面或者附着有关的双重作用。
第二个条件是组织内产生的机械效应，以得到尽可能地接近自然的生理条件。约束条件可涉及压力、延展、剪切力、磨擦或者这些效应的组合。
另一个约束条件涉及培养基中的营养供应，使得组织能够在薄层中很均匀地生长，也就是在降低了的培养区间中均匀并且受控制地流加介质。
这些作用特别是对于结构组织，例如韧带、骨、软骨、牙周韧带、牙骨质、腱膜、韧带插入相关的骨等等的体内和体外的发育至关重要。这些组织对生理刺激非常敏感，从而使用这种激活的方法培养它们有较多的好处。
因此，本发明首次提供一种生物培养反应器，适用于在薄层中培养组织，确保对细胞的机械刺激并且确保营养供应和适用于营养介质的扩散。有利地，该反应器还装备有用于控制温度的装置和使之能够或者便于在培养区间引入或者取出植入物的固体部分(譬如粘着支持物)而不改变存在的细胞或组织的装置。
因此更准确地说，本发明的目的涉及一种在一层或多层薄层中培养细胞或者组织的反应器。所述反应器的一个特殊的特征是它包含(i)培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定1至1000微米之间、优选地10至1000微米之间，更优选地50至800微米之间的培养区间，(ii)在所述的区间中刺激细胞或者组织的机械装置和(iii)，优选地在该培养区间中灌注培养基的装置。
根据本发明的生物反应器可以为治疗或者科研或者工业用途而得到类似的生物组织。该生物反应器还使得能够在粘着支持物或者假体的表面上培养和发育组织，所述的粘着支持物或者假体将在其表面或者表面的一部分上保留所培养的组织，例如用于在手术插入如此制造的混合植入物或者所述假体后促进或者加速组织痛疤痕形成和器官修复。
本发明可以各种形式、结构和组成采用不同类型的植入物并且用于不同应用中。在本发明的精神内，术语植入物的确说明任何组成，包含可以与固相支持物相关联的细胞或者重构组织。优选地，它涉及包含固体核心(或者成分)和细胞或生物成分的植入物。该植入物的核心在本发明中用“粘着支持物”或者植入物的中心来称谓。植入物的核心可以用任何生物相容性材料制造，例如金属、塑料、聚合物、玻璃、生物材料、陶瓷、骨、珊瑚等等。通常，它由生物玻璃、陶瓷(例如锆石)、合金、钛或者骨组成。根据本发明的一个特定实施例的植入物是牙植入物，其含有部分由本发明反应器培养的细胞所覆盖的核心(齿根部分)。例如牙植入物可以用任何生物相容性的材料制备，例如金属(例如钛)、聚合物、生物玻璃、陶瓷等等。它还可以涉及其它类型的植入物，例如骨或者关节植入物。
如以上所指出，根据本发明的生物反应器有利地包括培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定适合于在一层或多层薄层中产生组织的培养区间。有利地，它对应于厚度≤约1000微米，一般在约10至约1000微米之间，更优选地50至800微米之间的培养区间。优选地，所述培养区间提供至少一个厚度≤约900微米，更优选地≤约800微米之间，优选地在50至800微米之间的区域。所述的反应器适用于成形厚度可控制并且薄的生物组织，例如结构组织，例如是层型的结构组织。
培养区间在所述培养腔的全部或者部分内有利地是均匀的，以确保产生基本上均匀的培养组织。从而培养区间的厚度在所述腔的关键区域内有利地是恒定的。
限定培养区间的壁可以包含或者含有可能是或者不是刚性的不同类型的材料。优选地，限定培养区间的壁是生物相容性材料制成的，例如聚合物、玻璃、塑料、金属等等。更优选地，至少一个壁是由促进细胞增生，或者细胞粘着，或者复制生理条件的材料制成的。在此方面，特别优选的材料是生物玻璃、骨、珊瑚、羟基磷灰石、二氧化钛等等(也可参阅实施例)。从而，在第一实施方法中，反应器含有由生物相容性材料制造的两个壁所限定的培养区间，两个壁的至少一个包含或者基于促进细胞培养的材料，优选地是用生物玻璃、骨、珊瑚。促进细胞培养的材料可以部分地或者完全地由其它生物相容性材料，譬如陶瓷、金属或者聚合物覆盖。
根据生物反应器的形状，所述的两个壁可以是固定或者可移动的，如后文所说明。优选地，两个壁至少一个是可移动的。另外所述壁之一可以由植入物的核心本身形成。在此情况下，反应器腔由与植入物核心的形状相适应的形状的壁限定，植入物核心引进所述的腔中会造成培养区间降低。在一个特定的实施方式中，反应器腔由圆锥形或者圆柱形的壁限定，并且植入物的核心也分别地是圆锥形或者圆柱形的。在此情况下，反应器还有支持植入物的核心的装置，将其安排或者控制以引入植入物的核心，与培养腔的壁一起，导致如上面所定义的培养区间降低。
根据实施方案的一个特定变例，反应器的培养腔被非刚性的、可弹性变形的壁限定，使得易于在腔内引入或者取出植入物的核心而不改变组织。因此，根据一个优选的实施形式，反应器还有在培养腔内引入或者取出植入物的核心的装置。本发明还因其目的在于提供一种反应器，其能够改进在腔内或者培养泡室内引入或者取出植入物的粘着支持物(或者核心)条件，特别是不会损伤粘着到核心表面上的组织。
根据一个特定的方法，反应器的明显特征是存在形成或者限定培养、分化和/或生长用的泡室(或者小腔)的膜，所述的膜可以弹性地变形以帮助向所述的腔内引入细胞或者粘着支持物。正如下文将说明，所述可变形的膜还使得能够在所述的腔内进行机械刺激细胞。
为此目的，本发明提出一种反应器，尤其通过细胞生长和/或分化，可选择地在生物相容性基质内，用于制备植入物，该反应器含有培养、细胞分化和/或生长用的泡室，其特征在于所述泡室由一种可弹性变形的膜限定。因此，本发明部分基于开发带有可变形的壁的腔，旨在容纳细胞，以及如果需要，植入物的粘着支持物(或者核心)。这种泡室的使用带来许多优点，而主要是能够在所述腔内易于引入细胞或者粘着支持物。
因此，例如为了制备含有与粘着支持物(固体部分，例如由骨、聚合物、生物相容性材料、生物玻璃、聚四氟乙烯、金属等等构成，也称为植入物的核心)相关的细胞并且可选择地含有细胞外基质的植入物，所述的反应器使得培养、分化和/或生长细胞能够在灭菌和可复制的条件下，在植入物的核心的表面上实施。的确，通过在泡室的壁中产生变形，有可能在其中引入植入物的核心而没有任何在核心和壁之间出现显著磨擦的风险，从而不会损伤位于所述核心表面上的细胞。在该制造方法中，还有可能把细胞置于凝胶中或者悬浮液中或者外源性的生物基质中或者自身分泌的基质中，不仅在容器中而且在植入物或者假体的核心上。在此情况下，在容器中或者在植入物或者假体的核心上，细胞可以是相同的或者是非常不同的。
另外，壁的变形特性，主要是其弹性特征，在培养的过程中，使得能够进行细胞的机械刺激，从而促进其增生和/或分化。
从而，本发明的目的是具有包含由可弹性变形的壁限定的培养腔的所有生物反应器。因此该生物反应器的容器在中间腔内含有可以通过压缩变形的弹性壁。在一个优选的实施形式中，根据本发明的反应器含有主要通过气动或者液压使壁机械变形的装置。
如上文指出，根据本发明的反应器有利地含有机械地刺激培养的细胞或者组织的装置。为此，培养区间可以受到两个壁的相对移动、生物组织或者微机械附着于一或两个产生机械刺激的对置壁的制约。
优选地机械作用通过压力、延展、剪切、磨擦或者通过这些作用的组合施加。一般获得机械作用的方法是移动腔的一或者双壁以基本上产生培养区间厚度的变化。有利地，所述厚度的变化通过两个壁之一的移动产生，并且受控使之不超过培养区间最初厚度的约±20％，优选地为±10％。
它可以通过使用可变形的壁、引入到培养腔的结构中或者培养腔与壁的支持物装置之间的挠性接头(主要是环面接头)、机械刺激(压力、旋转、碾压等)等得到，如下文在实施例中所说明。
在一个特别优选的实施形式中，反应器含有机械刺激细胞的装置，例如，借助于活塞，如果需要，通过植入物的核心的位移，或者通过培养腔或者培养腔的一部分(例如通过可变形的接头)的变形。在位移的情况下，例如，这可以通过前向及后向运动或者通过轻柔的局部旋转，随着植入物的轴线进行。以一种有利的方式，所述的刺激通过引入到反应器中(泡室膜、接头等)可变形的元件(例如易曲的)并且通过施加压力/压缩或者碾压力进行。
另外，为了在培养的组织中增加限制物的转递，有可能向培养区间中添加诸如可吸收或者不可吸收的海绵之类的元件，例如用胶原、壳聚糖或者胶原壳聚糖制成的海绵，或者甚至是壁之一的不规则的表面，例如沟槽，或者甚至例如是生物相容性聚合物的纤维，或者直径为50至1000微米，优选50至500微米的珠，稍小于培养区间的厚度，并且可以用聚合物、玻璃、陶瓷等等，或者这些材料的组合来制造。
本发明的一个优选实施形式涉及如前面定义的生物反应器，其含有(i)培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定厚度不到约1000微米的培养区间，(ii)在所述的区间中机械地刺激细胞或者组织的装置和(iii)，优选地在该培养区间中灌注培养基的装置，所述培养区间也包含能够让机械刺激增加的元件(海绵、纤维、珠、颗粒等等)或者具有至少一个不规则性的壁(沟槽、枝状物、纤维等等)。
本发明的另一个特定的实施形式涉及如前面定义的生物反应器，其含有(i)培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定厚度不到约1000微米的培养区间，(ii)在所述的区间中机械地刺激细胞或者组织的装置和(iii)，优选地在该培养区间中灌注培养基的装置，两个壁的至少一个用促进细胞培养的材料制造，优选地用生物玻璃或者骨制造。更一般地，本发明涉及一种含有培养腔的生物反应器，所述的腔由包含生物玻璃或者骨或者由生物玻璃或者骨制造的内壁所限定。
根据一个优选的实施形式，本发明的反应器还涉及在培养区间中灌注培养基的装置。本发明的生物反应器的另一个有益的特征是促进营养介质在减少了厚度的培养区间中扩散，这在培养的组织中得到表面作用和界面作用所需要的。介质的扩散通过灌注得到，但是其分布通过周期性地扩张-收缩该间隔和/或在所有的表面上尽可能有规律地幅度运动而得到。
从而，该作用类似于脉搏，并且可以控制幅度和频率以提供足够和适当的功能性营养和刺激而不危及到损坏组织。刺激的频率(主要为扩张-收缩的周期)有利地设定在每分钟1至80个周期之间。
构成培养界面和表面的刚性件的移动轴之间的夹角是得到良好调节的重要因素。对于弹性的泡室，施加的压力在中间腔中的变动使得能够向培养的组织传递扩张-收缩作用，然后该作用促进营养介质和功能性刺激，或者该刺激的部分的扩散。例如，依照培养的不同，培养区间可以在50至1000微米的平均值左右变化10％。
培养基的进出口数目可以因要培养的组织及泡室材料而异。对于弹性泡室，经过容器的底部进入以及在其上端退出是最简单的选择。例如，进入还可以从植入物核心进行。对于刚性泡室，除了或者取代前述的方案，可以用多个进口和出口以优化介质在培养区间中的分布(图5和图6)。有利地，进口和出口相互呈90°，出口和进口交错以得到优化的介质扩散。在泡室壁的表面上的槽路还可以帮助介质的扩散。
在一个优选的实施形式中，反应器还包括灌注系统，使得能够供应营养和/或更换存在于泡室中的培养基。灌注流速可以由本领域内普通技术人员根据细胞类型和培养类型、介质等等的作用加以控制。如所指出，介质在减少了的培养区间内的扩散有利地通过培养腔的一或双壁的移动促进(压力、弹性变形、前向和后向移动等)。
根据一个特定的实施形式，本发明的反应器还包括培养基温度控制的装置。所述的装置例如是受控温度下的循环水或者液体或者气体，电阻或者晶体管，例如珀尔贴效应晶体管的存在。
在这个方面，根据一个特定的实施形式，本发明还涉及任何细胞或者组织反应器，其特征在于它含有培养腔和控制培养腔温度的装置。有利地，它涉及如上定义的反应器，带有机械刺激细胞的装置，和/或灌注介质的装置。
根据本发明的反应器可以用于培养不同的细胞类型和制备各种形状、组成和应用的植入物。优选地，它用于制备含有其生长、培养、分化和/或粘着通过机械刺激而得到促进的细胞的细胞产物。特别可以例举成纤维细胞、成牙骨质细胞、软骨细胞等等。细胞的特定例子是皮肤、颊粘膜、牙龈、牙槽齿韧带(牙周韧带)的成纤维细胞、软骨细胞或者这些细胞的前体。另外，使用的细胞群体可以是含有不同细胞类型的混合群体。本发明使用的细胞可以是自体的、同种异体的或者异种的。它可以涉及原始培养物或者是已建立的细胞系。优选地，它涉及人体细胞或者人体起源的细胞。细胞可以悬浮液、聚集体、克隆、层的形式使用，可能在能够加强对植入物核心的粘着的天然或者合成的细胞外基质中。另外，细胞可以是基因修饰的细胞，即含有给予它们有利特性的重组核酸。
本发明还涉及把前文定义的生物反应器用于制备组织或者细胞培养物或者植入物。本发明还涉及使用以上定义的反应器制备植入物、培养的组织或者细胞培养物的方法。
细胞组织(可以含有若干细胞类型)的组合物可以在关闭生物反应器的容器以前置于该生物反应器的容器中。而且它可以放置在与植入物或者假体的粘着支持物表面接触之后再放进生物反应器的容器中。通过把细胞放进凝胶或者悬浮液中或者异体生物基质中或者自身分泌的基质中，这两种技术可以同时使用，既在容器中也在植入物或者假体的粘着支持物上。在此情况下，容器中或者植入物或者假体上的细胞可以是相同或者不同的。
该生物反应器适用于处理植入物周围相对低厚度的培养区间。依植入物或假体的形状可出现两种情况。
-由于相对插入和安装轴线的所谓“陷入”或者取出的形式，可以把这些小件放进或者取出生物反应器而不因磨擦而拔出或者刮伤粘着在其表面的组织。
-如果植入物或者假体的核心具有在安装生物反应器或者从生物反应器的小件上取下过程中易于导致培养的表面磨擦的形状，有利地采用前述的可变形的泡室，这种泡室在这样的埸合下与植入物隔开距离。
在一个特定的实施形式中，本发明的目的是具有以上定义的反应器，用于制备含有全部或者部分由细胞组成的基质覆盖的核心的植入物，所述的反应器包括-限定或者分界旨在接收全部或者部分植入物核心的泡室(或培养腔)的膜；-把所述的植入物核心支持在泡室中的装置；和-机械刺激植入物周围细胞的装置；其特征在于该膜是可弹性变形的并且在于机械刺激的装置包括重复使所述膜变形的装置。
本发明的运行的特定例子涉及通过在植入物的齿根部生长细胞用于制备牙植入物的反应器，其包含-限定用于接收植入物的齿根部的泡室的膜；-把所述的植入物用其齿根部支持在泡室中的装置；和-用于机械刺激植入物的齿根上的细胞的装置；其特征在于该膜是可弹性变形的并且机械刺激的装置包括使所述膜变形的装置。
在另一个特定的实施形式中，本发明的目的是具有以上定义的反应器，用于制备包含全部或者部分由细胞组成的基质所覆盖的核心的植入物，所述的反应器包括-限定或者分界旨在接收全部或者部分植入物核心的泡室(或培养腔)的挠性或者刚性壁；-把所述的植入物核心支持在泡室中的装置；-用于机械刺激植入物周围细胞的装置；和向泡室中灌注培养基的装置。
在一个特定的实施形式中，核心的支持装置还包括可弹性变形的元件(例如接头)，以确保植入物在泡室中的移动。
在另一个特定的实施形式中，泡室还由生物玻璃、骨或者其它生物相容性材料(聚合物、玻璃、塑料、金属或者珊瑚)构成或基于上述材料的刚性壁所限定。
在另一个实施形式中，生物反应器还具有温度控制的装置。
另外，本发明的目的是提供通过在固相粘着支持物(例如植入物核心)上于培养基内进行细胞生长和/或培养和/或分化来制造植入物的方法，所述方法包括-在让细胞粘着在所述的植入物核心或者其部分上的条件下，使植入物的核心与细胞接触；-把覆盖有如上得到的细胞的植入物核心的至少一部分浸入到事先或者同时充满培养基的如上定义的生物反应器的泡室或者培养区间中；以及-机械激活细胞。
根据一个特定的实施形式，所述方法包括-在让细胞粘着在所述的植入物核心或者其部分上的条件下，使植入物的核心与细胞接触；-把覆盖有如上得到的细胞的植入物核心的至少一部分浸入到充满培养基的泡室中，所述的泡室由一种可弹性变形的膜限定或者分界；以及-按时间机械致动所述膜使之变形。
本发明的另一个目的涉及通过在固相粘着支持物(例如，植入物的核心)上于培养基内进行细胞生长和/或培养和/或分化来制造植入物的方法，所述方法包括-在让细胞粘着在所述的植入物核心或者其部分上的条件下，使植入物的核心与细胞接触；-把覆盖有如上得到的细胞的植入物核心的至少一部分浸入到充满培养基的泡室中，所述的泡室由一种可弹性变形的膜限定并且该泡室事先由径向扩张而变形；-终止泡室的变形；以及-把植入物的核心保持在泡室中一个足以让细胞在所述植入物核心上生长和/或培养和/或分化的时期。
在本发明的意义上，术语“粘着”实际指的是将细胞(可能在基质中)与植入物的核心至少部分和暂时地保持接触一段时间以使核心引入到本发明的泡室或者反应器中。这种粘着可通过利用自然确保此粘着的表面而得到实施或用此目标预处理。还有可能把细胞加入到凝胶、膏糊、海绵、自身分泌的基质中，以促进这种粘着。还可能在把细胞沉积在植入物核心上以后用保证维持的薄膜，优选地是可生物降解的多孔膜，覆盖细胞。
如上文指出，本发明的一个特定的应用例子涉及通过在引入到根据本发明的可变形的泡室中的所述植入物的齿根部上培养细胞来制备牙植入物。
本发明的目的还涉及细胞的培养、分化和/或增殖的方法，所述的方法包括-把细胞组合物引入到充满培养基的泡室内，所述的泡室由可弹性变形的膜限定；以及-按时间机械致动所述膜使之变形。
如前文所指出，在本发明的方法中，优选地灌注组织，以更新培养基。优选地通过在泡室下部存在开口保证供应新鲜介质而确保所述的灌注。这种供应还可以通过槽路而实现，该槽路建立在植入物的核心(或者本体)中，或者在需要时用于机械刺激的活塞中。取走介质一般地是通过位于泡室上部的一个开口确保的。
用于细胞培养的介质可以是本领域普通技术人员公知的任何介质，尤其是任何适用于哺乳动物细胞的培养、生长或者分化的介质。具体而言，它可以是DMEM、RPMI、HAF介质等等，可补充以抗生素、氨基酸、血清等等。
本发明还涉及如上所述反应器或泡室的应用，以制备细胞组合物，特别是植入物，通常用于人类。
阅读以下实施例后将会清楚本发明的其它方面和优点，这些实施例应当看作是说明性的而不是限制性的，在附图中
图1是本发明的含有可变形壁的反应器的纵截面图；图2是本发明的反应器本体的顶视图；图3是本发明的反应器本体的纵截面图；图4是牙植入物的运输容器的纵截面图；图5是本发明的反应器的纵截面图，包括刚性壁，为培养成软骨细胞进行了灌注，具有功能性刺激；以及图6是根据本发明的反应器的纵截面图，为培养牙槽齿韧带的成纤维细胞进行了灌注，具有功能性刺激。
图1中所示的反应器2主要旨在通过在用生物相容性材料制造的植入物4的核心上生长细胞来制造牙植入物。该核心是例如用陶瓷、钛、生物玻璃或者这些材料的复合物形成的。
反应器2一般地绕x-x′轴旋转。它包括限定在封壳8上的容器6。容器6包括圆柱形本体10和融合在该本体上的罩盖12。本体和罩盖都有利地用PTFE制造。应当理解，其它的材料也可以用于制造反应器。
罩盖12用三个图中未示的螺栓固定在本体10上。螺栓接合在穿经罩盖12制造的通道14上。螺栓的拉制末端进入本体10内的锥形孔16中。另外，在罩盖和本体的对面中制造图2中可见的凹陷的孔18，用于容纳图中未示的中心件。
封壳8包括本体16中的轴向井筒22。此井筒在底的中心处露出，所述底一般为在本体10中挖空的同轴心小容器24的平板23。所述的小容器在圆柱形本体10的扁平末端10A的第一面上开口。
钟形的弹性膜26位于封壳8中。该膜限定植入物的一个一般为圆柱形的齿根部，在图中标示为30处的容纳泡室28。膜26具有由被槽路36轴向穿过的底34所密封的圆柱形段32。在该底的对端，所述的膜具有外环38用于把膜26锁定在本体10上。此环是用圆柱形段32的相同材料制造。它在其转向底34的面上具有一个外围凸缘40于所述小容器底23中制成的外围空腔中。
膜26是对液体和气体可通透的并且是可以变形的。它例如是用生物相容性硅酮制造。
圆柱形段32的内径，也就是泡室28的直径稍大于植入物的齿根部分30的直径。具体而言，直径的差别使得在膜26静止并且不变形时，泡室中的植入物4的核心与膜26之间的距离在0.1至5毫米之间。在该核心与膜之间形成的环形间隔与组织培养的区域对应。
另外，圆柱形段32和井筒22的相应的外径和内径是使得在本体10与膜26之间形成的环形腔42厚度不是零。该环形腔42的厚度至少为1毫米。例如它是3毫米。
轴向膛孔44伸过井筒22。该膛孔向本体的图中示为10B的末端第二平坦面开口。轴向膛孔44通常由卡进该膛孔内的件46密封为了以水密方式把它密封起来。
件46的一个末端突向井筒22内部。这个末端包括适用于与在膜底34的厚度中制成互补形状的空腔48的内部弹性接合的凸突47。另外，件46包括相对于膜底34中的通道36轴向地出于凸突47的顶部的内槽路49。槽路49在另一个末端通到位于反应器外部的件46。从而，槽路49借助于任何适用的装置(泵、注射器等等)向泡室提供培养基。槽路49还可以有弯曲，让它能够从反应器的侧壁出来。
连接到环形腔42的槽路50通过本体10形成。该槽路适用于把腔42连接到由52标示出的可变低压源。该可变低压源例如由真空泵代表。
槽路50径向地延伸并且向圆柱形本体10的侧壁开口，在此起连接到低压源52的作用。
另外，图2和图3中可见的抽空槽路54经本体10走行用于循环植入物的齿根部分30浸入于其中的培养基。该槽路在其第一末端开口进入小容器24，而在其另一个末端穿过本体10的圆柱形壁。把该槽路制得使它可以连接到培养基的收集器56上。
另外，反应器2包括装置58以支持植入物的核心4在相对于容器6和封壳8的固定位置上。
这种支持装置通过跨过罩盖12的中心小孔60形成。
支持装置58包括图3中独自所示的支持件62。该件62一般是能够旋转的。它包括一个轴向带肩的通道64，该通道64容纳一个用66标示的轴向延伸在植入物的核心4上的杆。
径向穿经件62的壁制做出一个从68分接的孔。该孔容纳一个无螺帽的螺丝70以相对于该件固定植入物。螺丝70的末端邻接杆66的扁平部分，从而保证它轴向固定和旋转。
轴66于植入物的核心4伸过件62直至其另一个末端。将该轴的这个末端连接到轴向的栓杆72上。该栓杆轴向地于其一个末端包括一个容纳轴66的末端的座。后者通过胶合固定在位。栓杆72在其另一个末端包括承接螺母78的外螺扣76。
件62通入到由圆柱形套圈82限定的腔80中。该套圈限定一个通到其两个末端的圆柱形通道并且其纵长形成腔80。
在一个末端上，该通道的直径因为一个形成隔膜的沉头的周缘84而变小了。该沉头的周缘限定一个用于支持件62的环形表面。
在通道的另一个末端，套圈82表现为一个分接，适用于容纳一个带螺纹的填充塞90以保持件62与边缘84接触。塞90由一个通过栓杆72的膛孔92轴向地交叉。它带有适合的外螺扣用于与所述的分接配合。在螺纹以外处，塞90具有带齿的冠顶94。
套圈82在其带边缘84的末端处具有外环96，它适配得可以插入在本体10和罩12之间。该环直径大于小容器24的直径。其外边缘部分地容纳到位于小容器24周围在本体的第一主面10A中制成的环形凹陷100中。该凹陷100具有一个扁平底，其中布置一个环形的槽102，所述的环形槽102采用水密的环面接头104。
凹陷100的深度小于环96的厚度以使得环96和套圈82保持紧密地固定在凹陷100底和罩盖12之间。
为了制造植入物，例如牙植入物，首先如图1所示安装反应器而在此时植入物的核心不在位。
具体地，把膜26插入进井筒22中，并且把套圈82接合在罩盖的小孔60中。该罩盖被固定在本体10上，由插入在本体和罩盖之间的环96把套圈82固定在位。
另外，植入物的核心4由保持杆66沿核心延伸的螺丝70固定在支持件62上。
在把核心固定到支持件上以后，在保证细胞粘着到所述的根部的条件下在细胞混合物中孵育核心的根部。为了制备牙植入物，细胞组合成通常包含牙槽齿韧带的成纤维细胞和/或这些成纤维细胞和成牙骨质细胞的前体。在一个特定的实施形式中，核心的根部用细胞组织覆盖。该细胞组织经过早期的平皿培养后，包绕在植入物的核心的根部。在另一个实施形式中，核心的根部用饱含细胞的基质，例如海绵型、凝胶型、膏糊型等的基质覆盖。
为了让以此方式覆盖的核心4能够插入进反应器中而没有损坏细胞组织的风险，在环形的腔42中进行了降压。这种降压通过泵52进行。在这种降压的作用下，膜26主要通过圆柱形段32的径向扩张而变形。
因此发现泡室28本身膨胀增加了其内部截面。然后经罩盖通道把植入物的核心引入到反应器2中。把核心的根部插入到泡室28中。为了使植入物的核心保持在位，把塞90接合在栓杆72的周围并且用螺纹旋进套筒82中。持续拧螺丝直到支持件62关闭并且轴向地固定于口缘84与塞90之间。
在初始插入植入物的核心后，通过停止产生在腔42中的降压使泡室28松驰。可以理解，本发明不限于该使用方式，并且有可能在反应器的泡室中使植入物与细胞材料直接进行接触。
为了培养细胞组织，用经膜底34通过槽路49引入的培养基恒定地灌注泡室28。从而培养基在泡室28中沿核心4循环并且经泡室的上部退出，排空进小容器24中。用排空槽路54把培养液从小容器24中移出。
在细胞培养或者生长的阶段，膜26受到反复的弹性变形周期。每个周期包括通过在水密腔42中建立低压加大泡室28的容积的第一阶段和对空气开放水密腔42以停止低压导致在通过弹性松驰膜的过程中降低其容积的第二阶段。
周期性的低压通过由槽路50连接到腔42的低压源52产生。
膜的变形在进行培养的细胞上产生机械作用。另外，由膜在培养基中产生的脉动促进培养基在泡室28中的扩散。
由源产生的低压是周期性的，并且其频率可以达到自然脉搏率，尽管并不认为这对于结果是必需的。对于人类，该频率是每分钟发生40至80次。在生物反应器中，每三至十秒一次脉动可能就足够了。有利地，在腔42中产生的周期性低压在整个细胞培养期间是反复的。它们对细胞产生促进细胞发育所必需的生理刺激。
作为一个变例并且为了进一步提高培养基在膜变形的作用下的扩散作用，把限定在膜26和本体10之间的腔42用分开的壁分成隔间。各个这样产生的封闭的隔间连接到其自己的低压源上。相继致动低压源以保证膜连续变形，从而产生沿膜26传播的波。该波在形成于膜与植入物的核心之间的培养区间中产生脉动现象。
在另一个变例中，沿容器的圆周水平分布的几个点上灌注培养基。培养基的进入和退出点分散地处于植入物核心，在竖直面上但在直径上相对于植入物的核心的多个点上。
入口和出口点有利地随着竖直线分布，但是在平面上相互呈90°并且交错开以得到优化的介质扩散。可以周期性地切换入口和出口点从而以相似的方式流注所有的细胞。
如前文已述，就良好控制而言，在形成培养界面和平面的刚性件的运动轴线之间的角度是重要项目。对于弹性泡室，施加压力在中间腔中的变动让扩张-收缩作用能够传递，所述的扩张-收缩作用促进营养介质的扩散以及对培养的组织的功能性刺激或者这种刺激的一部分。例如，培养区间可以视培养物而异在50至1000微米的平均值左右变化10％。
培养基的入口和出口数目还可以适应于要培养的组织及泡室材料。对于弹性泡室，经容器底的入口和经上部的出口是最简单的选择。对于刚性泡室，除了上述的方案以外，多个入口和出口有可能优化介质在培养区间中的分布。泡室壁中的中空表面槽路也可以帮助介质的扩散。
在细胞培养的出口处，用培养的细胞覆盖的核心4经罩盖12从反应器取出。在取出的过程中，由于在腔42中产生的低压使泡室28保持为扩张。
为了储存和运输到进行手术的地方，把植入物保持在图4所示的圆柱形容器130中。此容器具有适用于容纳覆盖有细胞的植入物的根部的圆柱形空腔132。
在其开放的末端，圆柱形空腔132具有一个使得能够用螺丝拧在拉制塞90上的分接134。
在空腔底和分接134之间，空腔具有一个肩台136形成支持件62的支持表面。
在用螺丝旋紧塞90后，由于被紧紧地固定在肩台136和塞90之间而使支持件轴向固定。
该空腔底和肩台136之间的距离是当支持件62接触肩台136时，植入物的根部在任何一点都不与该空腔的壁接触。
为了储存植入物，在空腔中充满保存液体，植入物的根部浸入其中。
图5所示的反应器含有优选地用生物玻璃制造的容器202，带有截锥形凹陷以保证与内圆锥203的界面，从而能够用近似于软骨受到的生理条件的压力作用和剪切磨擦对凝胶样培养物进行机械刺激。该装置的尺寸可以适配于所希望的培养表面(截锥)，从而也可以适配于细胞的数量。内圆锥203的柱身也可以优选地是生物玻璃或者尽可能模拟骨支持物的任何其他材料。圆锥越是扁平，压力变动和介质的扩散就越大，并且降低剪切作用的制约就越大，反之亦然。
容器202可以插入到装配有罩盖204并且具有扁平底的容器201中，以使得反应器可能用在加热台上，从而确保均匀的温度分布。还可以把温度控制系统直接装进生物反应器的容器201的壁中。例如，这可以包括水循环或者电阻或者帕尔帖效应晶体管等等。两个中心轴213插入在罩盖204和本体201中。
在罩盖204中，还有旨在让起移动作用的压缩空气通过的入口212，从而使得能够进行机械刺激。下环面接头210控制施加在介质上的竖直移动的幅度。还有可能给装置添加提高由压缩空气施加的竖直移动的幅度的上环面接头211。
装置还含有装配有下隔膜并且承载有内圆锥的可移动的圆柱形部分205。在此可移动的部分中。入口208使得能够灌注培养基，而出口209保证培养基的排出。与弹簧层片关联的垫片207或者复原硅酮垫片能够通过其厚度调节由可移动部分205传递的运动的高度。阻挡杆或者称加强杆206通过与垫片207进行接触限制竖直的运动。
图6所示的反应器含有优选地用生物玻璃制造的“泡化”的容器302，带有截锥泡室，它保证与内圆锥313(植入物的固体部分，例如韧带植入物)间面，从而得到用与牙周韧带受到的生理条件相接近的剪切作用，以及用让培养基在刚性壁之间均匀扩散的扩张-收缩作用机械刺激培养物。可以调配装置的尺寸以适合于所希望的培养物(截锥)，从而适合于细胞的数量。优选地，在内圆锥313与泡室之间的间隔是0.2±0.1毫米。
容器302可以插入进优选地由聚合物，例如PTFE，制造的容器301，所述的容器301具有也有利地用聚合物制造的罩盖303。容器301具有扁平底，构建这种扁平底是为了如果需要可以把反应器用在加热台上，从而保证均匀的温度分布。还可以把温度控制系统直接装进生物反应器的容器301的壁中。它也可以包括水循环甚至或者电阻或者帕尔帖效应晶体管等等。
两个中心的轴308插入罩盖303和本体301中。
在泡室302的体中，优选有入口-出口309旨在使得介质循环。这些入口出口，其数目取决于植入物313的固体部分(例如根部)的长度，分布在竖直线上，在一个平面上相互呈90°，并且交错开以得到优化的介质扩散。这些入口出口的数目最常见为二个或者三个。还可以把竖直槽进行排列以使泡室的竖直槽在四个象限中。也可在容器302中做出开口310以让连接管和尖端或者在需要时能够完成锁定机制的螺丝的尖端通过。挠性并且厚的下环面接头312控制施加在介质上的竖直运动的幅度。后者优选以0.1±0.05mm的幅度施加10秒钟。
装置在螺母307中还含有植入物载体304，其中可以插入内圆锥313和所述的圆锥的嵌入物提手305的轴。在嵌入物提手305的轴上设有安全键306，它能够阻止承载植入物并且含有件305、306、307、304和313的移动组件的旋转。与圆柱关联的隔膜311阻止移动组件的旋转。
由于设有多个入口-出口，这种装置能够优化和均衡营养介质的流动。
本发明可以用于运行各种形状、结构和组成以及不同用途的不同类型的植入物。有利地，本发明涉及一种牙植入物，其根部用根据本发明的反应器培养的细胞覆盖。
权利要求
1.一种培养细胞或者组织的反应器，其包含(i)培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定1至1000微米之间、优选10至1000微米之间，更优选50至800微米之间的培养区间，(ii)在所述区间中机械刺激细胞或者组织的装置和(iii)，优选在所述培养区间内灌注培养基的装置。
2.如权利要求1所述的反应器，其特征在于限定所述培养区间的壁是生物相容性材料的，例如基于聚合物、玻璃、塑料、金属、生物玻璃、骨或者珊瑚。
3.如权利要求1或者2所述的反应器，其特征在于它涉及由两个生物相容性材料的壁限定的培养区间，两个壁中至少有一个含有或者基于促进细胞培养的材料，优选是生物玻璃、骨或者珊瑚。
4.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其特征在于两个壁中至少有一个是可移动的。
5.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其用于制备含有全部或者部分由细胞覆盖的核心的植入物。
6.如权利要求5所述的反应器，其特征在于所述壁之一由植入物的核心本身形成。
7.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其用于制备植入物，其特征在于它包括由生物相容性材料的刚性壁限定的培养腔，所述的腔具有圆柱或者圆锥的形状，以及植入物核心的支持装置，所述的植入物具有适合于所述腔的形状，并且所述的支持装置被分布或者被控制，以使植入物核心的引入在腔的壁与核心的壁之间形成减少了的培养区间。
8.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其特征在于反应器的培养腔由非刚性、可弹性变形的壁限定。
9.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其特征在于机械刺激细胞或者组织的装置包括位移培养区间中至少一个壁的装置。
10.如权利要求9所述的反应器，其特征在于所述移位的装置在培养区间中产生压力、延展力、剪切力和/或磨擦力。
11.如权利要求9或10所述的反应器，其特征在于所述移位的装置产生培养区间的厚度变化，优选≤培养区间原始厚度的约20％，更优选约10％。
12.如权利要求11所述的反应器，其特征在于机械刺激借助于植入物核心的移位，通过前向和后向的移动和/或部分转动，优选通过植入物核心在轴向上的前向和后向的移动而获得。
13.如权利要求11所述的反应器，其特征在于机械刺激例如借助于可形变的接头或者弹性壁，由培养腔或者其部分的变形获得，并且在于所述反应器包括使所述腔变形的装置。
14.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其包含(i)培养腔，所述培养腔在两个壁之间限定厚度不到约1000微米的培养区间，(ii)在所述区间中机械刺激细胞或者组织的装置和(iii)，优选在该培养区间内灌注培养基的装置，培养区间另外含有能够增加机械刺激的元件(海绵、纤维、珠、颗粒等)或者具有至少一个展示不规则性的壁(沟槽、枝状物等等)。
15.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其特征在于它另外包括在培养区间内灌注和扩散培养基的装置。
16.如权利要求15所述的反应器，其特征在于所述介质的扩散通过周期性地扩张一收缩培养区间和/或在所有表面上尽可能地有规律移动而得到。
17.如权利要求16所述的反应器，其特征在于扩张一收缩和/或移动的频率在每分钟1至80个周期之间。
18.如权利要求15、16或17所述的反应器，其特征在于它包括一或者多个进口和出口，用于供应和移出介质，优选地分布在一个平面上，相互呈90°，出口和进口交错以便能够优化介质扩散。
19.如以上权利要求中任一项所述的反应器，其特征在于它另外包括控制培养基温度的装置，优选地是受控温度的循环水或者液体或者气体，电阻或者晶体管，例如珀尔贴效应晶体管。
20.如以上权利要求中任一项所述的反应器，用于生长、培养、分化和/或粘着成纤维细胞、成牙骨质细胞或者间叶细胞，或者这些细胞的前体。
21.反应器(2)，用于制备植入物，尤其是通过细胞生长和/或分化，可能在生物相容性基质内制备植入物，反应器(2)含有用于培养、分化和/或细胞生长的泡室(28)，其特征在于所述泡室(28)由弹性可形变的膜(26)限定以及在于反应器(2)含有使所述膜(26)变形的装置。
22.如权利要求21所述的反应器，其特征在于使所述膜(26)变形的装置包括在所述膜(26)的两面之间建立压力差的装置(52)。
23.如权利要求22所述的反应器，其特征在于它包括用膜(26)限定水密腔(42)的本体(10)，以及在于建立压力差的装置(52)包含连接到所述水密腔(42)的泵。
24.如权利要求21至23中任一项所述的反应器，其特征在于它包含一种灌注系统，使之能够供应和更新细胞浸入于其中的介质。
25.如权利要求24所述的反应器，其特征在于所述膜(26)是可通透的并且具有用于灌注培养基的通道(36)。
26.如权利要求21至25中任一项所述的反应器，其特征在于所述的膜(26)能够在植入物的核心(30)与膜(26)之间保持0.001至5mm之间的间隙。
27.如权利要求21至26中任一项所述的反应器，其特征在于它包括用于机械刺激细胞的装置，所述的刺激装置包含相对于所述泡室(28)移位植入物的核心的装置。
28.反应器(2)，用于制备覆盖在含有全部或者部分细胞的基质中的植入物，所述的反应器的组成如下-限定用于接收植入物核心(30)的全部或者部分的泡室(28)和细胞的膜(26)，所述膜(26)是可弹性变形的；-把所述的植入物用其基质(30)支持在泡室(28)中的装置(58)；-使所述膜(26)变形的装置；和-灌注系统，使之能够在所述泡室中供应或更新细胞浸入于其中的介质。
29.根据以上权利要求中任一项所述的反应器的应用，用于通过在植入物的根部上进行细胞培养和/或分化来制备牙植入物。
30.反应器(2)，用于通过在植入物的齿根部(30)上生长细胞来制备牙植入物，其包含-限定用于接收植入物的齿根部(30)的泡室(28)的膜(26)；-把所述植入物用其齿根部(30)支持在泡室(28)中的装置(58)；和-用于机械刺激在植入物的齿根部(30)上的细胞的装置；其特征在于该膜(26)是可弹性变形的并且机械刺激的装置包括使所述膜(26)变形的装置。
31.一种通过在固相粘着支持物(例如植入物核心)上于培养基内进行细胞生长和/或培养和/或分化来制造植入物的方法，所述方法包括-在让细胞粘着到所述植入物核心或者其部分上的条件下，使植入物的核心与细胞接触；-把覆盖有如上得到的细胞的植入物核心的至少一部分浸入到事先或者同时充满培养基的根据权利要求1至28中任一项所述的生物反应器的泡室或者培养区间中；以及-机械激活细胞。
32.一种通过在植入物的齿根部(30)上进行细胞生长来制备牙植入物的方法，所述方法包括-将细胞组织绕所述的植入物核心(4)的齿根部(30)放置；-把覆盖有细胞培养物的齿根部(30)浸入到充满培养基的泡室(28)中，所述泡室(28)由一种可弹性变形的膜(26)限定；以及-按时间机械致动所述膜(26)使之变形。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于膜(26)的机械致动通过建立膜(26)的两面之间的压力差而保证。
34.一种用于细胞或者组织培养的反应器，其特征在于它包含培养腔和控制培养腔温度的装置，例如受控温度的循环水或者液体或者气体，电阻，或者晶体管，例如珀尔贴效应晶体管的存在。
全文摘要
本发明涉及培养细胞或者组织的反应器，尤其适用于以薄膜的形式培养细胞或者组织，并且含有在适用于降低培养厚度的培养基中保证生物刺激和供应营养的装置。所述的反应器可以用于制备植入物并且还包含在适用于结构组织的培养基中保证生物刺激组织或细胞和供应营养的装置。所述的反应器还以有利的方式包含能够易于把组织或植入物的固体部分引入培养腔中的装置或者形状，以及例如壁或可弹性变形的元件。另外，所述反应器可以包括温度控制装置。该反应器可以用于培养不同类型的细胞和制备各种形状、组成和用途的植入物。
文档编号C12M3/04GK1507488SQ02804749
公开日2004年6月23日 申请日期2002年3月8日 优先权日2001年3月9日
发明者菲利普·高特, 菲利普 高特 申请人:天然植入物公司