专利名称：增强固氮能力的根瘤菌的制作方法
技术领域：
本申请的发明涉及到通过导入的过氧化氢酶基因表达，固氮能力增强的根瘤菌，以及以该根瘤菌为活性成分的豆科作物用制剂。
背景技术：
大豆、小豆、云豆等豆科作物因根瘤菌感染形成共生的根瘤，由于在该根瘤中形成的根瘤菌可对空气中氮气进行固定，所以即使在氮含量低的土壤中也能很好地生长。
因此，在对豆科作物进行栽培时，除了供给通常的肥料外，可以将预先培养的根瘤菌涂布到作物的种子上。
将促进各种豆科作物的生长和产量的增加作为目的，对适合于各豆科作物的根瘤菌株进行了不懈的探索。另外也尝试通过基因导入的转化根瘤菌的开发，例如在特表2000-514663号公报中公布了被改变的根瘤菌，其中导入了トリフオキトキシン基因，使进行竞争的根瘤菌的生长受到抑制。
根瘤菌由于其固氮能力对豆科作物的生长和产量起着重要的作用。例如，豆科作物吸收氮时对根瘤菌的依赖度高达30～65％。因此，人们期待着固氮能力增强的根瘤菌能够极大地扩大在各种各样土壤中的豆科作物栽培和其产量增加。而由于这样的根瘤菌的作用，豆科作物对氮吸收的效率高必然要减少对硫铵等无机氮肥的依赖性，在削减农药开支的同时对缓和环境污染也有很大贡献。
然而，通过从自然界探索新的根瘤菌，或通过基因操作制作改变的根瘤菌，没有获得固氮能力增强到可实用化程度的根瘤菌。
而过氧化氢酶具有将对动植物个体有害的过氧化氢分解为水和氧的作用。本申请发明人等分离了具有极强的过氧化氢酶活性的新菌株Vibrio rumoiensis S-1株(J.Ferment.Bioeng.85113-116，1998)，还对该菌株的过氧化氢酶基因进行了鉴定(特开2000-316584号公报；Appl.Environ.Microbiol.6567-72，1999；J.Biosci.Bioeng.90530-534，2000)。然而，以往并不知道过氧化氢酶活性会增强根瘤菌的固氮能力，另外，通过导入过氧化氢酶基因固氮能力增强了的根瘤菌也全然不知。
本申请的发明就是鉴于上述那样的事实而形成的发明，将提供通过基因导入固氮能力增强的新根瘤菌作为课题。
发明内容
豆科植物由于在根瘤菌感染初期，产生过氧化氢，过氧化氢成为细胞毒，所以含有分解过氧化氢的酶(过氧化氢酶)。因此如果根瘤菌本身具有高的过氧化氢酶活性，就可以进一步抑制过氧化氢的细胞毒性，预期可以促进豆科作物的生长和豆产量。事实上，本申请发明人等发现导入自己先前发明的来自Vibrio rumoiensis S-1株的过氧化氢酶基因(vktA)的转化根瘤菌具有很强的根瘤附着生存能力和固氮能力，使得本发明完成。
即，本申请的发明为导入过氧化氢酶基因的转化菌，提供通过该基因产生的过氧化氢酶固氮能力增强的根瘤菌。
在本发明的根瘤菌中，导入的过氧化氢酶基因最好是含有具有序列1碱基序列的来自Vibrio rumoiensis S-1株的过氧化氢酶基因的DNA片段。
另外本申请的发明提供以上述根瘤菌作为有效成分的豆科作物用制剂。
另外本申请的发明提供豆科作物的栽培方法，其特征是对与上述的根瘤菌或制剂接触的豆科作物种子进行栽培。
具体实施例方式
本发明的根瘤菌是导入了过氧化氢酶基因的转化菌。过氧化氢酶基因可以利用编码各种生物产生的过氧化氢酶的聚核苷酸(基因组DNA或mRNA、cDNA等)。已知的过氧化氢酶基因有很多，例如来自嗜肺军团菌(Legionella pneumophilla)的过氧化氢酶基因(J.Bacteriol.1826679-6686，2000；GenBank AF276752，FEMSMicrobiol.Lett.176339-344，1999；GenBank AB017595)、来自Aspergillus nidulans的过氧化氢酶基因(J.Bacteriol.1831434-1440，2001；GenBank AF316033)，来自Pseudomonas fluorescence的过氧化氢酶基因(FEMSMicrobiol.Lett.200235-240，2001；GenBank U72068)、来自Nicotiana tabacum的过氧化氢酶基因(Plant J.11993-1005，1997；GenBank U93244)、来自Straphyrococcus aureus的过氧化氢酶基因(Microbiology 146465-475，2000；GenBank AJ000471、AJ000472)、来自Xanthomonas campestris pv.phaseoli的过氧化氢酶基因(Gene241259-265，2000；GenBank AF170449)、来自Synechoccus Sp.的过氧化氢酶基因(Biochimie 82211-219，2000；GenBank AF197161)等。因此，本发明的根瘤菌范围包括文献和数据库等中已知的过氧化氢酶基因，或用今后可鉴定的未知的过氧化氢酶基因做成的。
导入的过氧化氢酶基因可以备有其本来的表达调控区(启动子/增强子)，或也可以是与在根瘤菌中高频率表达的基因的表达调控区连接的融合序列。
另外，本发明的转化根瘤菌的一个模式是导入了含有具有序列1的碱基序列的vktA基因的DNA片段的转化菌。具体来说，就象实施例所给出的那样，该根瘤菌是导入了含有由序列1碱基序列构成的vktA基因的编码区和其启动子序列的DNA片段(4.9kb)的根瘤菌。vktA基因可以使用根据特开2000-315684号记载的方法从Vibriorumoiensis S-1株分离的基因。或通过将对应于序列1的DNA序列的两端一部分区域的合成寡核苷酸作为引物，以S-1株基因组作为模板的PCR法也可得到。另外通过使用根据序列1的一部分序列合成的探针，对从Vibrio rumoiensis S-1株制备的基因组文库进行筛选也可以获得。克隆的vktA基因可以亚克隆到适当的载体，在根瘤菌的转化中使用。
根瘤菌是感染豆科作物的根、形成根瘤的革兰氏阴性菌，可以使用对豆科作物具有促进生长发育作用的众所周知的根瘤菌株。具体来说，如属于Rhizobium属、Bradyrhizobium属、Azorhizorium属等的微生物，再具体来说，如Rhizobium meliloti、Rhizobium trifolii、Rhizobium lupini、Rhizobium fredii、Rhizobium loti、Rhizobiumleguminosarum、Bradyrhizobium japonicum、Azorhizoriumcaulinodans等。这些根瘤菌适量地接种到适于其增殖的培养基(TY培养基等)，于25～30℃下振荡培养12～36小时左右，使其增殖，经离心分离收集菌，可供转化用。
vktA基因向根瘤菌的导入可以利用电穿孔法、磷酸钙法、脂转染法、DEAE葡聚糖法等众所周知的方法将拥有导入基因的重组载体导入根瘤菌来进行。或象实施例给出的那样，利用通过根瘤菌、拥有重组载体的细菌宿主(大肠杆菌等)和含有辅助质粒的细菌宿主的共培养的接合转移法也可以做成转化根瘤菌。
象上述那样做成的转化根瘤菌就象实施例所表示的那样，具有高的固氮能力，通过与豆科作物种子共存，可以很好地形成根瘤。
本发明的豆科作物用制剂是将上述的转化根瘤菌作为有效成分。具体来说，该制剂可以做成将本发明的根瘤菌按照105～108个/ml左右与根瘤菌可生长发育的液体培养基(例如TY培养基等)混合的混合制剂。也可以与有机质或无机质的载体混合。具体来说，如红土、焙烧红土、鹿沼土、黑ボク土、蛭石、珍珠岩、沸石等无机质载体，泥炭沼、木炭、糖渣、藁、甘蔗渣、油渣、鱼渣、骨粉、血粉、贝化石、蟹壳等有机质载体。为了将本发明的根瘤菌负载到载体上，可以通过将根瘤菌的混浊液和载体混合来进行。此时的根瘤菌含量相对于1g载体可以混合105～108个左右根瘤菌。另外对于根瘤菌和载体的混合物，通过使其含有40％以上的水，也可以提高根瘤菌的稳定性。另外还可以通过将煤灰等作为载体的一部分配合使用，将制剂的pH调整到5.5～8.0左右，也可以进一步提高根瘤菌的保存稳定性。
象上述那样制备的制剂例如可以与种植前的种子适量混合，或在向农地播种时与肥料一起撒布。
实施例以下给出实施例，进一步对本申请的发明进行详细、而具体地说明，但本申请的发明并不限定于以下例子。
1.重组载体的构建将由序列1碱基序列构成的vktA基因(含有启动子序列和过氧化氢酶编码区)插入到宿主域宽的载体(pBBR1MCS-2Gene 166175-176，1995)，构建拥有vktA基因的重组载体pBBR1MCS-2vktA。
2.转化菌的构建2.1使用的菌株作为进行转化的根瘤菌(受主菌)使用Rhizobium leguminosarumbv.phaseoli 2676(云豆菌)和Rhizobium fredii USDA 191(大豆菌)。作为供给菌使用通过重组载体pBBR1MCS-2vktA转化的大肠杆菌E.coli JM109。作为辅助质粒拥有菌使用拥有pRK2013的大肠杆菌E.coli MM294。
2.2通过接合转移导入基因将受主菌、供给菌以及辅助质粒拥有菌分别在5ml的TY培养基中于30℃下进行振荡培养(100stroke/分)，使菌增殖至对数增殖后期。在无菌条件下，将2种大肠杆菌培养物各40μl和根瘤菌培养物100μl于1.5ml的微量管中混合，于10,000rpm下离心1分钟，收集菌。除去上清后，将菌体悬浮于100μl的灭菌水中，于10,000rpm下离心1分钟，对菌体进行清洗。将菌悬浮于100μl的灭菌蒸馏水中，将50μl的混合菌液加到置于TY琼脂培养基上的Millipor膜上，于30℃下使其交配过夜。然后，将附着菌体的膜部分切下，加到1.5ml容量的微量管中，加入灭菌蒸馏水1ml，充分悬浮。除去膜后，于10,000rpm下离心1分钟，收集菌，再将菌悬浊于1ml灭菌蒸馏水中。然后将用灭菌蒸馏水稀释到105倍的稀释菌液100μl涂布到选择琼脂培养基(琥珀酸钠1.35g、谷氨酸钠1.1g、K2HPO4220mg、MgSO4100mg、FeCl2440mg、CaCl2440mg、生物素0.2mg/L蒸馏水(pH7.0))上，于30℃下培养4～5日，筛选vktA转化的根瘤菌转化体。
3.过氧化氢酶活性的测定3.1培养条件将在TY培养基(5ml)中于30℃下进行反复振荡培养(100stroke/分)的对数增殖后期的菌液(前培养基)移到本培养TY培养基(200ml)，于30℃下从对数增殖后期培养至恒定期初期。
3.2无细胞提取液的制备将培养菌液于9,000rpm、4℃下离心10分钟，收集菌。然后用50mM磷酸钾缓冲液(KPB50mM KH2PO48.5ml、50mM K2HPO491.5ml，pH7.8)洗2次。洗后，悬浊于1ml的KPB，通过超声处理(200W、2分×8)粉碎菌体，将该样品于19,000rpm、4℃下离心10分钟。将得到的上清作为无细胞提取液在测定中使用。
3.3过氧化氢酶活性的测定以H2O2作为底物在石英杯中对H2O2.645ml、0.5M KPB(pH6.9)0.3ml、30％H2O25μl进行混合，于25℃下温育3分钟使温度平衡后，混合50μl的无细胞提取液，通过240nm的吸光值的变化测定酶活性。H2O2的摩尔吸光系数为0.0436M-1cm-1。
3.4蛋白质量的测定根据使用Bradfoard的考马斯亮篮(CBB)的方法，将无细胞提取液100μl与5ml CBB溶液混合，由595nm吸光值测定蛋白质量，作为标准蛋白使用牛血清清蛋白。
3.5结果用vktA基因转化的Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli 2676和Rhizobium fredii USDA 191的过氧化氢酶活性分别为7,500U/mg蛋白质和6,100U/mg蛋白质，与他们的亲本株的过氧化氢酶活性(3.4和2.9U/mg蛋白质)相比，表现出有意义的高酶活性。
4.转化根瘤菌向豆科作物的接种4.1宿主作物使用大豆(品种名キタムスメ)和云豆(品种名エキテボウ)。将各个种子分别在70％乙醇中浸2分钟后，用灭菌蒸馏水洗3次，再用10％次亚氯酸钠进行表面杀菌，用灭菌蒸馏水洗6次。另外，在进行各个作物的栽培时，使用种子盒(ジ-ドバツク)(15×16cm)。注入无氮栽培液(Norris-Date氏液)30ml，用铝铂膜将整体包起来，进行高压灭菌。
4.2接种菌使用vktA基因转化的Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli2676(云豆菌)和Rhizobium fredii USDA 191(大豆菌)以及各自的亲本菌株。各个菌株在5ml TY培养基(细菌培养用胰化蛋白胨5g、酵母提取物3g、氯化钙(6水)1.3g/L)中，于30℃下、反复振荡(100stroke/分)条件下使其增殖至对数增殖后期(OD660nm的吸光值为1.0以上，109cells/ml)。用灭菌的磷酸缓冲生理盐水(phosphatebuffered sal inePBS)
将增殖的菌液稀释1,000倍，将菌浓度调整到106cells/ml，作为接种菌液。
4.3根瘤菌向宿主作物接种每个种子盒(シ-バツク)放2粒种子，按照每粒种子1ml标准向种子中加接种用菌液。整体用铝铂膜盖好，将他们于明期静置14小时(22℃)，暗期静置10小时(18℃)。6天后，除去铝铂膜。栽培过程中加灭菌蒸馏水直至第20天，20天以后适当地补充Norris-Date氏液。
4.4固氮活性的测定接种根瘤菌后40天(云豆)或50天(大豆)进行测定。将植物体移到1,000ml容量的玻璃瓶中，用橡胶栓密封。使用注射器由橡胶栓插入从各个瓶内抽出100ml(瓶内空气量的10％)的空气后，充填同样量的乙炔。于30℃下温育1小时后，用注射器从瓶内抽出1ml，用气相色谱(日立K53、检测器FID、柱子PORAPAK N50～80mesh、柱温50℃、注射温度150℃，流速30ml/分)测定生成的乙烯量。
4.5根瘤重的测定测定固氮活性后，将植物体从瓶内取出，将根瘤分离，用干燥器干燥过夜，测定重量(干重)。
4.6结果表1比较了接种了用vktA基因转化的根瘤菌Rhizobium frediiUSDA 191(Tf株n＝6)或其亲本株(n＝6)的大豆中相当于各个栽培日的植物体的根瘤数、根瘤重量以及固氮酶活性(ARA)。而表2对接种了用vktA基因转化的Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli2676(Tf株n＝26)或其亲本株(n＝29)的云豆进行同样的比较。
就象表1所表示的那样，接种转化菌的大豆每个植物体的根瘤数与接种亲本株相比表现出有意义增加，另外也可观察到固氮酶活性的增加。另外就象表2所表示的那样，接种转化菌的云豆根瘤数虽然没有增加，但可确认固氮酶活性的有意义增加。
表1
表2
就象以上详细说明的那样，本申请的发明可以提供通过过氧化氢酶基因的导入被转化的固氮能力优秀的根瘤菌。由此，可以促进豆科作物的生长和豆科产量的增加。另外，预计通过氮肥肥料的削减也可以使得农药费用降低和用量减少以及缓和环境污染。
序列表<110>科学技术振兴事业团<120>增强固氮能力的根瘤菌<130>02-F-038PCT<140>
<141>
<150>JP2001-209214<151>2001-07-10<160>1<170>Pa ten t ln V er.2.1<210>1<211>2354<212>DNA<213>V ib r io sp.
<220>
<221>基因<222>(703)..(2232)<220>
<221>CDS<222>(703)..(2232)<300>
<308>基因库/AB030821<309>2000-09-02<300>
<310>JP2000-316584A<311>1999-05-14<312>2000-11-21<400>1gtcgacgatg caatgaacgt ccaattcagc cggcacggcc ttgtcgatct cgcgcaggaa 60
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1.一种根瘤菌，是导入过氧化氢酶基因的转化菌，由于该基因产生的过氧化氢酶固氮能力被增强的根瘤菌。
2.权利要求1所述的根瘤菌，其中导入的过氧化氢酶基因是含有来自拥有基因序列1碱基序列的Vibriorumoiensis S-1株的过氧化氢酶基因的DNA片段。
3.以权利要求1或2的根瘤菌作为活性成分的豆科作物用制剂。
4.一种豆科作物的栽培方法，其特征是对与权利要求1或2的根瘤菌、或权利要求3的制剂接触的豆科作物种子进行栽培。
全文摘要
本申请发明提供作为用含有序列1碱基序列的过氧化氢酶基因转化的转化菌，通过该基因产生的过氧化氢酶固氮能力被增强的根瘤菌、以该根瘤菌为有效成分的豆科作物用制剂、以及特征为对与它们接触的豆科作物种子进行栽培的豆科作物栽培方法。利用这些发明，可以促进豆科作物生长和豆科产量的增加。另外，预计由于氮肥肥料的削减可以使农药费用降低和用量减少，以及缓和环境污染。
文档编号C12N5/02GK1537160SQ0281381
公开日2004年10月13日 申请日期2002年7月9日 优先权日2001年7月10日
发明者奥山英登志, 大和田琢二, 一濑信敏, 敏, 琢二 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构