增强植物中胁迫耐受的组合物和方法

专利名称：增强植物中胁迫耐受的组合物和方法
技术领域：
本发明部分涉及新的植物法尼基转移酶α和β亚基聚核苷酸和多肽。同时包括在内的是表达新的聚核苷酸和多肽的转基因植物。本发明也包括具有从有意义或反义方向表达这些聚核苷酸得到的新的表现型的植物细胞，组织和植物。
背景技术：
大多数较高等的植物在它们的生命循环的一些时期会遇到相对水含量至少暂时的降低，结果是，现在已经发展了许多脱水保护机制。但是，如果水缺乏的变化延长，对植物生长和发育的影响可能是长远的。由于干燥，寒冷或盐胁迫水含量降低可能无可挽回地损坏植物细胞，依次限制农业上植物的生长和作物的生产率。
植物能应答干燥，盐度和寒冷的不利条件，带来各种形态和生理的变化。虽然我们对这些胁迫的植物耐受机制的理解是不完全的，植物激素抗坏血酸(ABA)是环境刺激和植物应答之间的基本介导物。ABA水平应答水缺陷而上升，外源应用ABA模拟了水胁迫诱导的许多应答。一旦ABA合成，就引起了叶子气孔的关闭，从而降低蒸腾作用导致的水损失。
将ABA转导进细胞应答的基因的鉴定打开开发这些调节物增强作物种类中的脱水耐受性的可能性。原则上，这些ABA发信号基因可以与适当的控制元素结合，允许最佳的植物生长发育和生产。所以，不仅这些基因允许作物的遗传剪切抵抗暂时的环境胁迫，而且它们也应该拓宽了传统作物可以生长的环境。
拟南芥突变体的最新的分离对ABA是超敏感的，已经显示也是对水饥渴条件可耐受的。ERA1已经鉴定为法尼基转移酶的β亚基。法尼基转移酶是杂二体酶，可以在底物靶序列上特异地添加法尼基磷酸成分。靶序列确定为存在于蛋白质的羧基末端的四个氨基酸序列，称为CaaX基序，其中“C”是半胱氨酸，“a”是任何脂肪族氨基酸，和“X”是任何氨基酸。α亚单位通常是两个异戊烯化酶，香叶基香叶基转移酶，具有不同的β亚基，在靶序列上加上了香叶基香叶基异戊烯基磷酸成分。
异戊烯化是多步骤途径，包括CaaX位点的半胱氨酸的异戊烯化，-aaX三肽的裂解和异戊烯基半胱氨酸残基的甲基化。这些步骤中的每一个都可以代表异戊烯化过程的遗传操作的靶，产生需要的表现型如胁迫耐受。
在植物中，异戊烯化已经与细胞循环控制，分生组织发育，和光激素信号转导连接，但是，异戊烯化，底物蛋白质或植物系统与哺乳动物和酵母系统类似的程度的细节只有少数是已知的。CaaX修饰的最大特征的底物是酵母的Ras和a因子蛋白质。虽然，虽然完成蛋白质的成熟有三步，但任何一步的去除或修改不一定导致靶生物活性的终止。如果-aaX三肽不裂解，但也不去除，一些蛋白质在法尼基化后保留了-aaX三肽那么Ras功能减弱了。这些观察可以是底物特异的，相反，有例子表明，一些蛋白质只有在适当异戊烯化后如调节过程，如哺乳动物中的分裂原应答，和酵母中的匹配信息素后才能完全发挥功能。
在拟南芥菜中，不只600个蛋白质含有CaaX基序，表明了在许多细胞过程中通过异戊烯化的翻译后的修饰的作用。在拟南芥菜中，已经证明，法尼基转移酶的β亚基将导致ABA超敏感表现型。虽然仍然不清楚为什么没有法尼基转移酶的功能性β亚基的植物变得对ABA更敏感，但很明显，蛋白质异戊烯化参与了ABA敏感性的稳态的调节。ABA细胞应答的平衡，是否对ABA更敏感或更不敏感可能是受异戊烯化蛋白质的相对活性的调节的。
本发明涉及法尼基转移酶(FT)亚基，α或β(FTA，FTB)改变法尼基转移酶表达和活性的操作。法尼基转移酶催化了法尼基化的第一步，其中在靶序列CaaX的半胱氨酸残基中加入15碳法尼基成分。包括在本发明中的是含有在适当调节序列的控制下的FTA或FTB序列的载体构建体，产生表现型如但不限于水胁迫耐受，增强的生物量积累，提高的产量或推迟的衰老。FTA亚基的操作也可以影响叶香基叶香基转移酶的活性并且，与这一操作相关的表现型是包括在本发明中的。
发明概述本发明部分基于来自拟南芥(Arabidospsis thaliana)，欧洲油菜(Brassica napus)，大豆(Glycine max)和玉米(Zea maize)的新法尼基转移酶核酸序列的发现。本文所述的核酸，聚核苷酸，蛋白质和多肽或其片段总称为FT核酸和多肽。
因此，在一个方面，本发明提供了包括SEQ ID NO1，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37或其片段，同源物，类似物或衍生物的序列的分离核酸。核酸可以包括例如，编码至少与包括氨基酸序列SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO37的多肽有99％的同一性的多肽的核酸序列，编码与包括氨基酸序列SEQ ID NO5，SEQID NO7或SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽有85％的同一性的多肽的核酸序列，或编码与包括氨基酸序列SEQ ID NO33，SEQ ID NO36，或SEQ ID NO39的氨基酸序列的多肽有至少99％的同一性的核酸序列，该核酸序列可以是例如基因组DNA片段，或cDNA分子。
本发明也包括SEQ ID NO2，3，4，29，30，32，35，38，40-57或58的核酸序列。同时包括在本发明中的是含有本文所述的一个或以上的核酸的载体，含有该载体的细胞或本文所述的核酸。在一些方面，FT核酸可操作地与启动子连接。启动子的例子包括构成性启动子(例如，35ScaMV，MuA)，ABA可诱导启动子(例如，RD29A)，组织特异启动子(例如，CUT1)，或保卫细胞特异启动子(例如，35S，MuA，和RD29A)。
本发明也涉及用含有本文所述的任意核酸分子的载体转化宿主细胞。
本发明也涉及用FT核酸或含有FT核酸的载体转化的植物和细胞。同时包括在本发明中的是种子，转化植物或细胞的子代。
本发明也进一步涉及在突变体文库和基因筛选方案的产生中用FT核酸或含有FT核酸的载体额植物和细胞的利用。
在其他方面，本发明包括基本纯化的FT多肽，例如，FT核酸和其片段，同源物，类似物和衍生物编码的任意FT多肽。
仍然在其他方面，本发明提供了特异地结合FT多肽的抗体。抗体可以例如是单克隆或多克隆抗体，和其片段，同源物，类似物和衍生物。本发明也涉及结合本文所述的任意核酸分子编码的多肽上的表位的分离的抗体。
本发明也包括生产转基因植物的方法，该转基因植物具有增强的胁迫抗性，如但不限于水缺乏，或生物量增大，产量增大；衰老推迟或在植物的一个或多个细胞中导入改变植物中的FT表达或活性的化合物。在一个方面，化合物是FT核酸。核酸可以例如是法尼基化或戊二烯化的抑制剂。或者，化合物是FT双链RNA抑制发夹核酸或FT反义核酸。
本发明进一步提供了通过提供含有FT核酸的细胞，例如，包括FT核酸的载体，并且在足以表达核酸编码的FT多肽的条件下培养细胞来生产FT多肽的方法。然后，从细胞中回收表达的FT多肽。优选地，细胞产生了小的或非内源的FT多肽。细胞可以是例如原核细胞或真核细胞。
本发明也涉及通过将样品与特异地结合多肽或核酸的化合物接触，和检测复合物的形成来鉴定样品中的FT多肽或核酸的方法。
本发明进一步提供了通过将FT多肽与化合物接触，测定是否FT多肽活性修饰了来调节FT多肽的活性的鉴定化合物的方法。
本发明也涉及调节通过将FT多肽与化合物接触和测定是否化合物修饰了FT多肽的活性，结合FT多肽，或结合编码FT多肽的核酸分子来鉴定额FT多肽活性的化合物。
除非特别定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明属于的领域的普通技术人员一般理解的相同意义虽然与本文所述相似或相当的物质和方法可以用于本发明的实践或实验中，适当的方法和物质如下所述。所有的公开物，专利申请，专利和其他本文提到的参考文献都通过在此引述而合并于本文。在有争议的情况下，本说明书，包括定义将为依据。另外，材料，方法和实施例只用于说明，不打算用于限制。
本发明的其他特征和优点将能从下面详细的叙述和权利要求中明了。
附图的简要说明

图1是描述pBI121反义FTA载体构建体的说明。
图2是抗FTA转基因拟南芥菜的基因组Southern杂交分析的说明。
图3是5个35S-抗-FTA拟南芥菜系(T3植物)的Northern分析的说明。
图4显示了利用抗FTA抗体检测FTA多肽的Western表达分析。
图5是显示了ABA对种子生长和发育的效果的图系列。FTA反义转基因秧苗展示了具有增强的ABA敏感性。
图6显示了ABA对秧苗生长和发育的影响。
图7显示了在不浇水8天后，拟南芥菜的野生型Columbia(A)和4个反义FTA转基因系(B，C，D，E)的图。
图8是根据Clustal W anaysis(给出了各物种的百分数)来自各种植物种类的FTA核酸(A)和氨基酸(B)序列的同源性的说明。
图9是根据Clustal W anaysis(给出了各物种的百分数)来自各种植物种类的FTB核酸和氨基酸序列之间的同源性的说明。
图10是水胁迫过程中转基因效率的说明。
图11是在水胁迫处理6天和6天恢复期后茎的新鲜重，或生物量积累的说明。
图12是在最佳条件下，或在6天水胁迫处理后得到的种子产量(g)的说明。
图13是最佳条件下的植物生长的说明，显示的是在第一次开花后6天的茎的新鲜重。
图14是生物胁迫与干旱胁迫处理对种子产量的效果的说明。
图15是在实验中的PCR凝胶电泳分析检测欧洲油菜的转基因系的代表性说明。
发明的详细说明本发明提供了从欧洲油菜(Bn)，拟南芥菜(At)，大豆(Gm)和玉米(Zm)分离的新的法尼基转移酶(FT)的核酸序列(SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ IDNO34，或SEQ ID NO37)和他们的编码多肽(SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39)。序列总称为“FT核酸”或FT聚核苷酸，对应的编码多肽称为“FT多肽”或“FT蛋白质”。法尼基转移酶亚基，Alpha(α)和Beta(β)称为FTA和FTB。大豆在整个说明书中也称为大豆。玉米也称为在整个说明书中也称为玉米。这些术语是可以交换使用的。除非特别说明，“FT”是指本文公开的任意新的序列。
表A提供了FT核酸和它们的编码多肽的概括。
同时包括在本发明中的是与公开的FT核酸序列互补的核酸。例如，SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38。另外本发明提供的是如SEQ ID NO4，40-58中公开的包括FT反义核酸的分子的构建体。
根据与已知的法尼基转移酶蛋白质的结构和功能关系，FT蛋白质是蛋白质的法尼基转移酶家族的新成员。(参见实施例3)本发明的FT核酸，和它们的编码多肽可用于各种申请书或文献中。例如，核酸可以用于生产对生物和非生物胁迫，例如寒冷胁迫，盐胁迫，热胁迫，水胁迫，伤口，致病原攻击或除草剂抗性增强的转基因植物。
本发明包括在转基因植物，细胞和组织培养物中利用过度表达的载体构建体上调FT酶活性的方法，和在转基因植物，细胞和组织培养物中利用双链RNA抑制，发夹载体构建体下调FT酶活性。这些方法是利用实施例生产上调或下调的效果，并不意味着局限于达到这一结果的方法。
另外，本发明的核酸和多肽可以用作调节或抑制FT活性的小分子的鉴定的靶。或者，FT核酸和多肽可以用于鉴定是相关蛋白质的法尼基转移酶家族的成员的蛋白质。
另外，通过化学诱变或辐射的作用来修饰FTA或FTB的核酸序列可以达到FT活性的调节或抑制。酶学编码非功能性FT多肽的FT核酸的表达可以用于引起FT活性的阴性优势的抑制效果。
本发明的FT核酸和多肽额其他用途也在本文中公开了。
FT核酸本发明的核酸包括编码FT多肽或蛋白质的那些。如本文所用术语多肽和蛋白质是可交换使用的。
在一些实施方案中，FT核酸编码了天然FT多肽。如本文所用，本文所述的多肽的“成熟”形式涉及天然存在额多肽或前体形式或前蛋白质的产物。天然存在的多肽，前体或前蛋白质包括非限制的例子对应基因编码的全长基因产物。或者，它可以确定为本文所述的开放读码框架编码的多肽，前体或前蛋白质。再次非限制地，产物“成熟”形式产生作为可以在产生基因产物的细胞内发生的一个或多个天然存在的加工步骤的结果。产生多肽或蛋白质的“成熟”形式的这样额加工步骤的例子包括开放读码框架的起始密码编码的N末端甲硫氨酸残基的裂解，或信号肽或前导序列的蛋白质水解的裂解。所以，从前体多肽或蛋白质产生的成熟形式具有1到N的残基，其中残基1是N末端甲硫氨酸，在N末端甲硫氨酸除去后将具有2到N的其余部分。或者，残基1到残基M的N末端信号序列裂解的从具有1到N的前体多肽或蛋白质产生的成熟形式具有残基M+1到残基N的其余部分的残基。另外，如本文所用，多肽或蛋白质的“成熟”形式可以从翻译后修饰而不是蛋白质水解事件中产生。这样的其他过程非限制地包括糖基化，豆蔻酰化或磷酸化。通常，成熟多肽或蛋白质可以从这些步骤中的一个或它们中的任意结合的操作步骤产生。
在FT核酸中的是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或它们的片段中提供序列的核酸。另外，本发明包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37或其片段的突变或变异核酸。其中的任意碱基可以从SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的对应碱基中改变，仍然编码至少维持它的FT类似活性和生理功能中的一个的蛋白质。本发明另外包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列的补体，包括其片段，衍生物，类似物和同源物。本发明另外包括其结构包括化学修饰的核酸，或核酸片段，或其补体。
本发明的一个方面涉及编码FT蛋白质或其生物活性部分的分离的核酸分子。同时包括足以用作鉴定FT编码核酸的核酸片段(例如，FTmRNA)和用作FT核酸分子的扩增或突变的聚合酶链式反应(PCR)因为的片段。如本文所用，术语“核酸分子”打算包括利用核苷酸类似物，和衍生物，片段和其同源物产生的DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，该DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选地是双链DNA。
根据用途，“探针”指可变长度的核酸序列，优选地在至少约10个核苷酸，100个核苷酸，或多至例如6,000个核苷酸。探针可用于检测相同，相似，或互补的核酸序列。更长长度的探针通常是从天然或重组来源得到的，是高度特异和比寡聚物更慢地杂交的。探针可以是单链或双链的，设计成在PCR，膜基础的杂交技术或ELISA类似技术中有特异性的。
“分离”的核酸分子是从存在于核酸的天然来源的其他核酸分子中分离的一个。分离的核酸分子的例子不限于载体中含有的重组DNA分子，在异源寄主细胞中维持的重组DNA分子，部分或基本纯化的核酸分子，和合成DNA或RNA分子。优选地，“分离”的核酸是没有核酸从中派生的有机体的基因组DNA中的核酸(即，定位于核酸的5’和3’末端的序列)天然侧接的序列。例如，在各种实施方案中，分离的FT核酸分子可以含有少于核酸派生的细胞的基因组DNA中的核酸分子天然侧接的核苷酸序列的约50kb，25kb，5kb，4kb，3kb，3kb，1kb，0.5kb或0.1kb。另外，当通过重组技术产生时，“分离”的核酸分子，如cDNA分子可以基本无其他细胞物质或培养基，当化学合成时可以基本无化学前体或其他化学物。
本发明的核酸分子例如，具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37的核苷酸序列的核酸分子或核苷酸序列的任意一个的补体可以利用标准分子生物学技术或本文提供的序列信息来分离。利用SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列的全部或一部分作为杂交探针，FT核酸序列可以利用标准杂交和克隆技术来分离(例如，如Sambrook等人，eds.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，NY，1989；和Ausubel，等人，eds.，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，NY，1993)。
根据标准的PCR扩增技术，利用cDNA，mRNA或者基因组DNA作为模板和适当的寡聚核苷酸引物可以扩增本发明的核酸。这样扩增的核酸可以克隆进适当的载体并且通过DNA序列分析来鉴定。另外，对应于FT核苷酸序列的寡聚核苷酸可以通过标准的合成技术，例如利用自动DNA合成仪来制备。
如本文所用，术语“寡聚核苷酸”指一系列连接的核苷酸残基，寡聚核苷酸具有足够数目的核苷酸碱基待用于PCR反应中。短的寡聚核苷酸序列可以根据或从基因组或cDNA序列中设计，并且用于扩增，证明或发现特定细胞或组织中的相同，相似或互补DNA或RNA的存在。寡聚核苷酸包括具有长度约10nt，50nt，或100nt，优选地15nt到30nt的核酸序列的部分。在一个实施方案中，寡聚核苷酸包括长度小于100nt的核酸分子，将另外包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或其补体的至少6个邻接的核苷酸。寡聚核苷酸可以化学地合成并且可以用作探针。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括是SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列的补体的核酸分子。例如，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO35或SEQID NO38的互补核酸序列。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或这一核苷酸序列部分所示的核苷酸序列的补体的核酸分子。与SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列互补的核酸分子是与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列足以互补的一个，它可以与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸小小地或没有错配而氢键合，从而形成稳定的双倍体。
如本文所用，术语“互补”指在核酸分子的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，术语“结合”指两个多肽或化合物或相关的多肽或其化合物或结合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子的，非离子的，Von der Waals，疏水相互作用等等。物理相互作用可以是直接的或间接的。间接的相互作用可以是完全的或由于另一个多肽或化合物的效果。直接的结合是指不通过或由于另一个多肽或化合物的效果发生的相互反应，而且是没有其他基本化学中间产物的。
另外，本发明的核酸分子可以仅仅包括SEQ ID NO1，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核酸序列，例如，可以用作探针或引物的片段，或编码FT生物活性部分的片段。本文提供的片段确定是作为至少6(邻接)核酸或至少4个(邻接)氨基酸，长度足以允许核酸情况中的特异杂交，或允许氨基酸情况中的表位的特异识别，大多数一些部分小于全长序列。片段可以从选择的核酸或氨基酸序列的任意的邻接部分派生。衍生物是直接从天然化合物或通过修改或部分取代形成的核酸序列或氨基酸序列。类似物是具有与天然化合物相似但不是相同，在一些成分或侧链上有结构的不同的核酸序列或氨基酸序列。类似物可以是合成的或来自不同的进化起源，可以具有与野生型比较，相似或相反的代谢活性。
如果衍生物或类似物含有修饰的核酸或氨基酸，衍生物和类似物可以是全长或不是全长。本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括，但不限于包括与本发明的核酸或蛋白质基本同源的区域的分子，在各种实施方案中，与相同大小的核酸或氨基酸序列或当与排列是通过本领域已知的计算机同源程序进行，或编码核酸能够在严格，中度严格或低严格条件下与编码前面提到的蛋白质的序列的补体杂交的排列序列比较时同源性至少约70％，80％，85％，90％，95％，98％或甚至99％的同一性(优选地同一性80-99％)。参见例如，Ausubel，等人，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993，和如下。程序的一个例子是Gap程序(Wisconsin程序分析包，第8版，UNIX，Genetics Computer Group，帕克研究大学，Madison，WI)，其中利用了出厂设定，利用了Smith and Waterman算式(Adv.Appl.Math，1981，2482-489，其通过在此引述而合并于本文)。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变异体指如上讨论的核苷酸水平或氨基酸水平的同源性鉴定的序列。同源核苷酸序列编码了编码FT多肽的同工型的那些序列。同工型可以在相同的有机体的不同组织中作为RNA的两可性拼接表达。或者，同工型可以由不同的基因编码。同源核苷酸序列也可以包括，但不限于天然存在的等位基因变体或本文所述的核苷酸序列的突变。同源核酸序列包括编码SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39中的保守氨基酸取代(参见如下)的那些核酸序列，以及具有FT活性的多肽，例如底物结合。
从克隆拟南芥菜FT基因的克隆确定的核苷酸序列允许产生设计用于在例如，来自其他组织的其他细胞类型中鉴定和/或克隆FT同源物，以及来自其他植物的FT同源物。探针/引物通常包括基本纯化的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸通常包括在严格条件下与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的至少约12，25，50，100，150，200，250，300，或400或更多的连续的有意义链核苷酸序列，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的反义链核苷酸序列，或SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的天然存在的突变体杂交的核苷酸序列的一个区域。
根据拟南芥菜FT核苷酸序列的探针可以用于检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。在各种实施方案中，探针进一步包括附着于它的标记基团，例如标记基团可以是放射性同位素，荧光化合物，酶，或酶协同因子。这样的探针可以用作鉴定mis表达FT的细胞或组织的诊断实验试剂盒的一部分，方法如通过测量来自受试者的细胞的样品中的FT编码核酸的水平，例如检测FT mRNA水平或确定是否基因组FT基因已经突变或缺失。
如在特定的生物实验中，有或没有剂量依赖时测定的，“具有FT生物活性部分额多肽”指具有与包括成熟形式的本发明的多肽的活性相似但不一定相同的活性的多肽。编码“FT的生物活性部分”的核酸片段可以通过分离编码具有FT生物活性(FT蛋白质的生物活性如下所述)，表达FT生物活性(例如通过体外重组表达)的多肽的SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO“31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37来制备，和评估FT的编码部分的活性。在另一个实施方案中，编码FT的生物活性部分的核酸片段包括一个或多个区域。
FT变异体本发明另外包括由于遗传密码的间并性而与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37不同的核酸分子。这样，这些核酸编码了相同的FT蛋白质，如SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ IDNO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的核苷酸序列编码的，例如SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的多肽。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸具有编码具有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的拟南芥菜FT核苷酸序列，本领域技术人员应该理解的是，导致FT的氨基酸序列中的变化的DNA序列多态性可能存在于群体中(例如，植物中)。在FT基因中的这样的遗传多态性可能存在于天然等位基因变化的群体内的个体。如本文所用，术语“基因”和“重组基因”指包括编码FT蛋白质优选地植物FT蛋白质的开放读码框架的核酸分子。这样的天然等位基因的变化通常可以导致FT基因的核苷酸序列的1-5％的变化。这样的天然等位基因的变化通常可以导致FT基因的核苷酸序列中1-5％的变化。天然等位基因的变化的结果和不改变FT的功能活性的任意的和所有的这样的核苷酸变化和得到的FT的氨基酸多态性是在本发明的范围内的。
另外，编码来自其他种类的FT蛋白质的核酸分子和所以具有与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列不同的核苷酸序列的核酸分子是在本发明的范围内的。根据严格杂交条件下的标准杂交技术，利用cDNA，或其一部分作为杂交探针可以根据它们与本文公开的拟南芥菜FT核酸的同源性来分离对应于本发明的FTcDNA的天然等位基因和同源物的核酸分子。
因此，在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子在长度上至少有6个核苷酸，并且在严格条件下与包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中，核酸至少有10，25，50，100，250，500或750个核苷酸长度。在另一个实施方案中，本发明的分离的核苷酸分子与编码区杂交。如本文所用，术语“在严格条件下杂交”打算用于叙述杂交的条件并且在核苷酸序列相互至少60％的同源性并且通常保留相互杂交下洗涤。
利用本领域已知的方法，利用特定的序列的全部或部分作为探针，在低，中度或高严格杂交下得到同源物(即，从不是拟南芥菜的种类派生的编码FT蛋白质的核酸)用于核酸杂交和克隆。
如本文所用，术语“严格杂交条件”指探针，引物或寡聚核苷酸将与它的靶序列但不是其他序列杂交的条件。严格条件是依赖序列的，将是在不同情况下不同的。较长的序列在比更短的序列更高的温度下杂交。通常，选择严格条件是在确定的离子强度和pH下特定的序列得到热熔化点(Tm)低约5℃。Tm是与靶序列互补的探针的50％与靶序列在平衡时杂交的温度(在确定的离子强度，pH和核酸浓度)。因为靶序列通常过量存在，在Tm时，平衡时占有50％的探针。通常，严格条件是这样的，其中盐浓度至少约1.0M钠离子，在pH7.0到8.3通常约0.01到1.0M钠离子(或其他盐)和对于短探针，引物或寡聚核苷酸(例如，10nt到50nt)时温度约30℃，和对于较长的探针，引物和寡聚核苷酸至少约60℃。在加入脱稳定剂如甲醛下可以得到严格条件。
严格条件是本领域已知的，并且可以在CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6找到。优选地，条件是使至少约65％，70％，75％，85％，90％，95％，98％或99％同源性的序列通常保持相互杂交。严格杂交条件的非限制例子是在高盐缓冲液中杂交，缓冲液中含6XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500mg/ml变性鲑精DNA，65℃。这一杂交是在0.2XSSC，0.01％BSA和50℃下一次或多次洗涤后的。在严格条件下与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列杂交的本发明的分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。如本文所用，“天然存在”的核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然的蛋白质)。
在第二个实施方案中，提供了在中度严格条件下，与包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37或其片段，类似物或衍生物的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸序列。中度严格杂交条件的非限制例子是在55℃下6XSSC，5Xdenhardt’溶液，0.5％SDS和100mg/ml变性鲑精DNA中杂交。可以利用的其他中度严格条件是本领域已知的。参见例如，Ausubel等人(eds)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，NY，and Kriegler，1990，GENE TRANSFER ANDEXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。
在第三个实施方案中，提供了在低严格条件下与包括SEQ IDNO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQID NO34或SEQ ID NO37或其片段，类似物或衍生物的核苷酸序列的核酸分子可杂交的核酸。低严格杂交条件的非限制例子是在35％的甲醛，5XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mMEDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100mg/ml变性鲑精DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，在40℃下杂交，接着在2XSSC，25mMTris-HCl(pH7.4)，5mMEDTA，和0.1％SDS中，在50℃下一次或多次洗涤。可以利用的低严格度的其他条件是本领域已知的(例如，交叉种类杂交中利用的)。参见例如，Ausubel等人(eds)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY，and Kriegler，1990，GENE TRANSFERAND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；Shilo and Weinberg，1981，Proc Natl Acad Sci USA786789-6792。
保守性突变除了可以在群体中存在的FT序列的天然存在的等位基因变异体，本领域技术人员将进一步理解的是，通过突变可以在SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的核苷酸序列中导入突变，从而导致编码的FT蛋白质的氨基酸序列中有变化，而且不改变FT蛋白质的功能。例如，导致“非基本”氨基酸残基中氨基酸取代的核苷酸取代可以在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的序列中进行。“非基本”氨基酸残基是可以从FT的野生型序列改变，但不改变生物活性的残基，而“基本”氨基酸残基是生物活性需要的。在本发明的FT蛋白质中保守的氨基酸残基被推测为对变化是特别不可修改的。
本发明的另一方面涉及编码含有对于活性非必须的氨基酸残基的变化的FT蛋白质的编码核酸分子。这样的FT蛋白质在来自SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列是不同的，但仍然保留了生物活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包括编码蛋白质的核苷酸序列，其中蛋白质包括与SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列至少约75％的同源的氨基酸序列。编码核酸的蛋白质与SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQID NO9，SEQ IDNO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39至少约80％同源，最优选地与SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39至少约99％同源。
通过在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQIDNO31，SEQ ID NO34或SEQ IDNO37的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸取代，添加或缺失可以产生编码与SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQID NO36或SEQ ID NO39的蛋白质同源的FT蛋白质的分离的核酸分子，使一个或多个氨基酸取代，添加或缺失导入到编码的蛋白质中。
通过标准技术如位点特异的诱变和PCR介导的诱变，可以在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，SEQ ID NO37的核苷酸序列中导入突变。优选地，在一个或多个推测的非必须氨基酸残基中进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是用具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸残基的一个。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中确定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，beta支链侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。所以，在FT中推测的非必须氨基酸残基是用来自相同的侧链家族的另一个氨基酸残基来取代的。或者，在另一个实施方案中，可以沿着FT编码序列的全部或部分，如通过饱和诱变任意导入突变，并且可以筛选其余的突变体的FT生物活性，鉴定保留活性的突变体。在SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的诱变后，通过本领域已知的任意重组技术可以表达编码的蛋白质，可以确定蛋白质的活性。
在一个实施方案中，可以测试突变的FT蛋白质的(1)形成与其他FT蛋白质，其他细胞表面蛋白质，或其生物活性部分的蛋白质蛋白质的相互作用的能力，(2)在突变的FT蛋白质和FT受体之间复合物的形成；(3)结合细胞内靶蛋白质或其生物活性部分(例如，抗生物素蛋白质)的突变的FT蛋白质的能力；(4)结合FT蛋白质额能力；或(5)特异地结合抗FT蛋白质抗体的能力。
反义FT核酸本发明的另一方面涉及与包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ IDNO37或其片段，类似物或衍生物的核苷酸序列的核苷酸分子杂交或互补的分离的反义核酸分子。“反义”核酸包括与编码蛋白质的“有意义”核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补的核苷酸序列。在特定的方面，提供了反义核酸分子，其中包括与至少约10，25，50，100，250，500个核苷酸，或整个FT编码链，或只是其中的一部分互补的序列。另外提供的是编码SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的FT蛋白质的片段，同源物，衍生物和类似物的核酸分子，或与SEQID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37的FT核酸序列互补的反义核酸。
在一个实施方案中，反义核酸分子是与编码FT的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指包括翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域(例如，对应于SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39)的拟南芥菜FT的蛋白质编码区)。在另一个实施方案中，反义核酸分子是与编码FT的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指与没有翻译成氨基酸的编码区侧接的5’和3’序列(即，也称为5’和3’未翻译区)。
在各个实施方案中，反义FT核酸分子包括SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38的序列。
给出编码本文公开的FT的编码链序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37)，本发明的反义核酸可以根据Watson和Crick或Hoogsteen碱基配对规则来设计。反义核酸分子可以是与FT mRNA的整个编码区互补的，但更优选地是与FTmRNA的编码或非编码区的一部分反义的寡聚核苷酸。例如，反义寡聚核苷酸可以是与围绕FTmRNA的翻译起始位点的区域互补的。翻译寡聚核苷酸可以是例如约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸长度的。本发明的一个反义核酸可以利用化学合成或利用本领域的已知方法通过酶连接反应来构建。例如，反义核酸(例如，反义寡聚核苷酸)可以利用设计成增强分子的生物稳定性或增强反义和有意义核酸，之间形成的双倍体的物理稳定性来化学合成，例如可以利用磷酸硫代衍生物和丫啶取代的核苷酸。
可以用于生产反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基2-硫尿苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖苷queosine，肌苷，N6-焦戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w；和2，6-二氨基嘌呤。或者，利用核酸已经在反义方向亚克隆的表达载体可以生物地生产反义核酸(即，从插入的核酸转录的RNA将是与下面的部分中进一步叙述的需要的靶核酸是反义方向的)。
原位产生本发明的反义核酸分子，使它们与编码FT蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译抑制蛋白质的表达。杂交可以是通过常规核苷酸互补性形成稳定的双倍体，或例如，在通过双螺旋的大沟中的特异相互作用结合DNA双倍体的反义核酸分子的情况中。
仍然在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基核酸分子。α-端基核酸分子与通常的β亚基相反，链相互平行的互补RNA的互补RNA形成特异的双链杂合体(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res 156625-6641)。反义核酸分子也可以包括2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res156131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBSLett215327-330)。
这样的修饰包括但不限于修饰的碱基，和修饰或派生糖磷酸骨架的核酸。这些修饰至少部分地进行了，用于增强修饰的核酸的化学稳定性，使它们可以用作申请中的反义结合核酸。
发夹核酸的双链RNA抑制(RNAi)本发明的另一方面涉及利用翻译后的基因沉默(PTGS)阻遏基因表达。双链RNA可以启动植物和动物中的基因表达的序列特异阻遏。将双链RNA加工成长度21-23个核苷酸的短的双倍体寡聚物。这些小的干扰RNA以序列特异的方式阻遏了内源和外源基因的表达(Fire等人Nature 391806-811，Carthew，Curr.Opin.In Cell Biol.，13244-248，Elbashir 等人，Nature411494-498)。RNAi阻遏构建体可以许多方法设计，例如可以形成长发夹分子的颠倒重复的转录，可以是不相关序列如GUS或内含子序列的间隔序列分开的颠倒重复。有意义和反义链的转录是通过相反启动子或有意义和反义基因的共转录。
FT核糖酶和PNA成分仍然在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酶活性的催化RNA分子，能够裂解单链核酸，如具有互补区的mRNA。所以，核酶(例如，锤头核酶(如Haselhoffand Gerlach(1988)Nature 334585-591中所述)可以用于催化裂解FTmRNA转录物，从而抑制FT mRNA的转录。具有FT编码核酸特异性的核酶可以根据本文公开的FT DNA的核苷酸序列设计(即，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37)。例如，可以构建Tetrahymena L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列是与FT编码mRNA中待裂解的核苷酸序列互补的，参见例如，Cech等人U.S.Pat.No.4,987,071；and Cech等人U.S.Pat.No.5,116,742。或者，FT mRNA可以用于从RNA分子的库中选择具有特异的核糖核酶活性的催化RNA。参见例如，Bartel等人，(1993)Science 2611411-1418。
通过靶击与FT的调节区互补的核苷酸序列可以抑制FT基因表达(例如，FT启动子和/或增强子)，形成防止靶细胞中的FT基因的转录的三倍体螺旋结构。参见通常，Helene.(1991)AnticancerDrug Des.6569-84；Helene.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；and Maher(1992)Bioassays 14807-15。
在各种实施方案中，可以在碱基成分，糖成分或磷酸骨架修饰FT的核酸，提高例如分子的稳定性，杂交或溶解性。例如，可以修饰核酸的脱氧核糖磷酸骨架产生肽核酸(参见Hyrup等人(1996)Bioorg Med Chem 45-23)。如本文所用，术语“肽核酸”或“PNAs”指核酸模拟物，例如，DNA模拟物，其中脱氧磷酸骨架是被假肽骨架取代，并且只保留了四个天然的核碱基。PNA的中性骨架已经显示允许在低离子强度条件下DNA和RNA杂交。PNA寡聚物的合成可以利用标准的固相肽合成方案来进行，如Hyrup等人(1996)；Perry-O’Keefe等人(1996)PNAS9314670-675所述。
FT的PNA可以用于治疗和诊断。例如，PNA可以用作基因表达的序列特异调节的反义或反基因试剂，例如通过诱导转录或翻译的遏止或抑制复制。FT的PNA也可以在基因中的单碱基对突变的分析中，例如涉及PNA的PCR钳中用作与其他酶例如S1核酶结合使用时的人工限制酶(Hyrup B.(1996))；或用作DNA序列和杂交的探针或引物；Perry-O’Keefe(1996)。
在另一个实施方案中，FT的PNA可以通过将亲脂或其他辅助基团附着于PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体，或利用本领域已知的脂质体或其他药物递送的技术来增强它们的稳定性或细胞吸收。例如，可以产生FT的PNA-DNA嵌合体，它可以结合PNA和DNA的有利特征。这样的嵌合体允许DNA识别酶例如Rnase H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，同时PNA部分将提供高的结合亲和力和特异性。利用根据碱基垛叠，核碱基之间的许多键选择的适当长度的接头可以连接PNA-DNA嵌合体，并且定向(Hyrup(1996))。PNA-DNA嵌合体的合成可以如Hyrup(1996)如上和Finn等人(1996)Nucl Acids Res243357-63所述来进行。例如，可以利用标准的磷酸酰胺偶联化学，在固相支持物上合成DNA链，可以在PNA和DNA的5’末端之间利用修饰的核苷酸类似物，例如，5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5‘-脱氧胸腺嘧啶磷酸酰胺(Mag等人(1989)Nucl Acid Res 175973-88)。然后，以逐步的方式结合PNA单体，生产具有5’PNA区段和3’DNA区段的嵌合分子(Finn等人(1996))。或者，嵌合分子可以用5’DNA区段和3’PNA区段来合成。参见例如Petersen等人(1975)Bioorg Med Chem Lett 51119-11124。
FT多肽本发明的FT多肽包括序列在SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9中提供的蛋白质。本发明也包括任意残基可以从SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39中所示的对应的残基改变的突变或变异蛋白质，这些序列仍然编码了维持FT类似活性和生理功能或其功能片段的蛋白质。在一些实施方案中，在突变或变异体蛋白质中可以如此改变达到20％或更多的残基。在一些实施方案中，本发明的FT多肽是成熟的多肽。
通常，保持FT类似功能的FT类似变异体包括在序列的特定位置的残基已经被其他氨基酸取代的任意变异体，另外包括了在亲本蛋白质的两个残基之间插入其他残基的可能性以及从亲本序列缺失一个或多个残基的可能性。任何氨基酸取代，插入或缺失包括在本发明中。在有利的情况中，取代是如上所述的保守取代。
本发明的一个方面涉及分离的蛋白质，和其生物活性部分，或其衍生物，片段，类似物或同源物。同时提供的是适于用作产生抗FT抗体额免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，天然FT蛋白质可以从细胞或组织来源通过适当的纯化方案来源标准的蛋白质纯化技术来分离。在另一个实施方案中，FT蛋白质是通过重组DNA技术产生的。取代重组表达，FT蛋白质或多肽可以利用标准肽合成技术化学地合成。
当化学合成时，“分离”或“纯化”蛋白质或其生物活性部分是基本无来自FT蛋白质派生的细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白质，或者基本无化学前体或其他化学物的。术语“基本无细胞物质”包括FT蛋白质的制备，其中蛋白质是从它分离或重组产生的细胞的细胞成分分离的。在一个实施方案中，术语“基本无细胞物质”包括具有少于约30％(干重)非FT蛋白质的FT蛋白质的制备(本文也称为“污染蛋白质”)，更优选地少于约20％的非FT蛋白质，更优选地小于约10％的非FT蛋白质，最优选地少于约5％的非FT蛋白质。当FT蛋白质或其生物活性部分重组生产时，它同样优选地是基本无培养基的，即培养基出现少于约20％，更优选地少于约10％，最优选地少于约5％的蛋白质制剂的体积。
术语“基本无化学前体或其他化学物”包括FT蛋白质的制剂，其中蛋白质是从参与蛋白质的合成的化学前体或其他化学物分离的。在一个实施方案中，术语“基本无化学前体或其他化学物”包括FT蛋白质的制剂具有少于约30％(干重)的化学前体或非FT化学物，更优选地少于约20％的化学前体或非FT化学物，更优选地少于约20％化学前体或非FT化学物，更优选地少于约10％化学前体或非FT化学物，最优选地少于约5％的化学前体或非FT化学物。
FT蛋白质的生物活性部分包括含有足以与FT蛋白质的氨基酸序列同源或从中派生的氨基酸序列，例如SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39所示的氨基酸序列的肽，其中包括了比全长FT蛋白质更少的氨基酸至少具有一个FT蛋白质活性，例如底物结合。通常，生物活性部分包括至少具有一个FT蛋白质活性的区域或基序。FT蛋白质的生物活性部分可以是例如10，25，50，100或更多长度的多肽。
本发明的FT蛋白质的生物活性部分可以至少含有一个上面鉴定的FT蛋白质之间的保守的区域。另外，蛋白质的其他区域缺失的其他生物活性部分可以通过重组技术制备，和评估天然FT蛋白质的一个或多个功能活性。
生物活性部分或FT蛋白质可以是FT多肽的N末端区。或者生物活性部分或FT蛋白质可以是FT多肽的C末端区。优选地，生物活性部分至少包括C末端区的75个氨基酸。更优选地，生物活性部分至少包括C末端区域的25个氨基酸。最优选地，生物活性部分至少包括C末端的10个氨基酸。
在一个实施方案中，FT蛋白质具有SEQ ID NO5，SEQ IDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的一个氨基酸序列。在其他实施方案中，FT蛋白质是与SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39基本同源的，并且保留了SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的蛋白质的功能活性，仍然由于天然等位基因变化或诱变氨基酸序列是不同的，如下文详细所述。因此，在另一个实施方案中，FT蛋白质是包括至少与SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO33，SEQ ID NO36或SEQ ID NO39的氨基酸序列45％同源的氨基酸序列，并且保留了SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO33，SEQ ID NO36或SEQ IDNO39的FT蛋白质的功能活性。
两个或更多个序列之间的同源性判断为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分数，将序列按照最佳目的进行序列排列(例如，在待比较序列之间的任一序列中导入缺口)。然后，比较对应于氨基酸位置或核苷酸位置中的氨基酸残基或核苷酸。当与第二个序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据了第一个序列中的一个位置时，那么分子在该位置是同源的(即，本文利用的氨基酸或核酸“同源性”是与氨基酸或核酸“同一性”相当的)。
如两个序列之间的同一性程度可以确定核酸序列的同源性。利用本领域已知的计算机程序可以确定同源性，如GCG程序包提供的GAP软件。参见例如，Needleman and Wunsch 1907 J MolBiol 48443-453。利用具有下面额核酸序列比较的设定值的GCGGAP软件GAP产生罚分5.0，GAP扩展罚分0.3，类似核酸序列的编码区指与SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34或SEQ ID NO37所示的DNA序列的CDS(编码)部分优选地至少具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％的同一性程度的上面的序列。
术语“序列同一性”指在比较的特定区域上根据残基对残基的原理两个聚核苷酸或多肽相同的程度。术语“序列同一性百分数”是通过在比较的区域比较两个最佳排列的序列，确定两个序列中存在的相同核苷酸碱基(例如，核酸情况中的A，T，C，G，U或I)的位置的数目得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除比较的区域(即窗的大小)中的位置的总数目，将结果乘100得到序列同一性的百分数来计算的。术语“基本同一性”如本文所用指聚核苷酸序列的特征，其中聚核苷酸包括与比较区域的参考序列比较具有至少80％序列同一性，优选地至少85％的同一性，经常是90到95％的序列同一性，更通常是至少99％的序列同一性的序列。术语“正残基的百分数”是通过比较在比较区域内的两个最佳排列的序列，确定在两个序列中如上所述的相同和保守的氨基酸取代的位置的数目得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除比较的区域中(即，窗的大小)位置的总数目，将结果乘100得到正残基的百分数来计算的。
嵌合和融合蛋白质本发明同时提供了FT嵌合或融合蛋白质。如本文所述，FT“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括与非FT多肽可操作地连接的FT多肽。“FT多肽”指具有对应于FT的氨基酸序列，而“非FT多肽”指具有对应于与FT蛋白质，例如与FT蛋白质不同和从相同或不同的有机体派生的蛋白质基本非同源的蛋白质的氨基酸的多肽。在FT融合蛋白质内，FT多肽可以对应于FT蛋白质的所有或部分。在一个实施方案中，FT融合蛋白质至少包括FT蛋白质的一个生物活性部分。在另一个实施方案中，FT融合蛋白质至少包括FT蛋白质的两个生物活性部分。在融合蛋白质内，术语“可操作地连接”打算指在框架内相互融合的FT多肽和非FT多肽。非FT多肽可以与FT多肽的N末端或C末端融合。
本发明的FT嵌合或融合蛋白质可以通过标准的重组DNA技术来生产。例如，根据常规技术，例如通过利用末端钝化或交错切口处理末端来连接，限制酶消化将编码不同的多肽序列的DNA片段在框架内连接，提供黏连末端的适当末端化和填充作为适当的，碱性磷酸处理，避免不需要的连接和酶连接。在另一个实施方案中，通过常规技术包括自动DNA合成仪可以合成融合基因。或者，利用锚引物可以进行基因片段的PCR扩增，产生可以随后退化和再扩增的两个连续的基因片段之间的互补突出，产生嵌合的基因序列(参见例如，Ausubel等人(eds)CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，1992)。另外，许多已经编码融合成分(例如，GST多肽，6Xhis-tag)的表达载体可以商业获得。FT编码核酸可以克隆进这样的表达载体使融合成分在框架内与FT蛋白质连接。
FT激动剂和拮抗剂本发明也涉及作为FT激动剂(模拟物)或作为FT拮抗剂起作用的FT蛋白质的变异体。激动剂可以例如是反义核酸分子。FT蛋白质的变异体可以通过诱变，例如FT蛋白质的不连续的点突变或截短来产生。FT蛋白质的激动剂可以基本保持FT蛋白质的天然存在形式的生物活性或其亚系。FT蛋白质的拮抗剂可以通过例如与包括FT蛋白质的细胞发信号级联的下游或上游成员竞争性结合，抑制FT蛋白质的天然存在形式的一个或多个活性。所以，特定的生物效果可以通过用限制性功能的变异体来处理而引发。
可以通过筛选突变体，例如FT.蛋白质的截短的突变体的结合文库的FT蛋白质激动剂或拮抗剂活性来鉴定作为FT激动剂(模拟物)或作为FT拮抗剂起作用的FT蛋白质的变异体。在一个实施方案中，FT变异体的杂色文库是通过在核酸水平的结合诱变来产生的，是通过杂色基因文库来编码的。FT变异体的杂色文库可以通过例如将合成的寡聚核苷酸的混合物酶学连接进基因序列使潜在的FT序列作为个别多肽，或者作为其中含有FT序列的系列的更大的融合蛋白质(例如，用于噬菌体展示)的一个系列来表达。存在可以用于从间并寡聚序列生产潜在的FT变异体的文库的各种方法。间并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后将合成的基因连接进适当的表达载体。基因的间并系列的利用允许在一个混合物中提供所有编码潜在的FT序列的需要系列的序列。合成间并寡聚核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如，Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu Rev Biochem 53323；Itakura等人(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucl Acid Res 11477。
多肽文库另外，FT蛋白质编码序列的片段的文库可以用于生产FT片段的杂色群体用于FT蛋白质的变异体的筛选和随后的选择。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可以通过在每个分子只发生一次缺口，变性双链DNA，再变性DNA的条件下用核酸酶处理FT编码序列的双链PCR片段可以生产编码序列片段的文库，形成可以包括来自不同缺口产物的有意义/反义对的双链DNA，通过S1核酶处理从再形成的双倍体除去单链部分，将得到的片段文库连接进表达载体。通过这一方法，可以派生编码FT蛋白质的各种大小的N末端和内部片段的表达文库。
几个技术是本领域已知的，可用于筛选点突变或截短制成的结合文库的基因产物，和用于筛选具有选择特性的基因产物的cDNA文库。这样的技术适用于快速筛选FT蛋白质的结合诱变产生的基因文库。筛选大基因文库额可修改成高通量分析的最广泛利用的技术通常包括将基因文库克隆进可复制的表达载体，用得到的文库转化适当的细胞，在需要的活性的检测简化编码产物得到检测的基因的载体的分离的条件下表达结合基因。反射系综诱变(REM)，增强文库中的功能突变的频率的新技术可以结合筛选实验来使用，鉴定FT变异体(Arkin and Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering6327-331)。
FT抗体FT多肽，包括嵌合多肽，或其衍生物，片段，类似物或同源物可以用作免疫原，产生免疫特异结合这些肽成分的抗体。这些抗体包括例如，多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段，和Fab表达文库。在特定的实施方案中，FT多肽的片段可以用作抗体生产的免疫原。本领域已知的各种方法可以用于生产FT多肽的多克隆或单克隆抗体，或其衍生物，片段，类似物或同源物的生产。
对于多克隆抗体的生产，可以用天然肽，或其合成变异体，或前面的衍生物注射来免疫各种寄主动物。各种佐剂可以用于增强免疫应答，并且包括但不限于弗氏(完全和不完全)，矿质凝胶(例如，氢氧化铝)，表面活性物质(例如，卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油乳液，二硝基酚等等)和人佐剂，如BacilleCalmette-Guerin and Corynebacterium parvum。
对于抗FT多肽的单克隆抗体，或其衍生物，片段，类似物，或同源物的制备，可以利用通过连续细胞系培养生产抗体分子的任何技术。这样的技术包括，但不限于杂交瘤技术(参见，Kohlerand Milstein，1975.Nature 256495-497)；三体技术；人B细胞杂交瘤技术(参见，Kozbor，等人，1983.Immunol Today472)和EBV杂交瘤技术生产人单克隆抗体(参见，Cole.，等人，1985.InMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人单克隆抗体可以用于本发明的实践中，并且可以利用人杂交瘤来生产(参见，Cote，等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA802026-2030)或通过用Epstein Barr病毒体外转化人B细胞(参见，Cole，等人，1985.InMonoclonal Antibodies and CancerTherapy(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)来生产。
根据本发明，可以采用一些技术来生产特异于FT多肽的单链抗体(参见例如，美国专利号，4,946,778)。另外，可以采用一些方法来构建Fab表达文库(参见例如，Huse，等人，1989.Science2461275-1281)允许快速而有效地鉴定具有FT多肽或其衍生物，片段，类似物或同源物的需要的特异性的Fab片段。含有FT多肽的独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术来生产，其中包括例如(i)抗体分子的胰蛋白酶消化产生的F(ab)2’片段；(ii)还原F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段；和(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生Fab片段，(iv)Fv片段。
在一个实施方案中，筛选具有需要特异性的抗体的方法包括，但不限于酶联免疫吸附实验(ELISA)和其他本领域已知的免疫介导的技术。在特定的实施方案中，特异于FT多肽的特定区域的抗体的选择是通过生产结合具有这样的区域的FT多肽的片段的杂交瘤的生产来简化的。特异于FT多肽，其衍生物，片段，类似物或同源物内的区域的抗体也提供在内。抗FT多肽抗体可以用于涉及FT多肽的定位和/或定量的本领域内的已知的方法中(例如，用于测量适当的生理样品内的肽的水平，用于诊断方法中，用于肽的成象中等等)。
FT重组表达载体和寄主细胞本发明的另一方面涉及含有编码FT蛋白质的核酸，其衍生物，片段，类似物或同源物的载体，优选地表达载体。如本文所用，术语“载体”指能够运输已经连接另一个核酸的核酸分子。载体的一个类型是“质粒”，指可以连接其他DNA区段的循环双链DNA环。载体的另一个类型是病毒载体，其中其他DNA区段可以连接进病毒基因组。一些载体能够在导入的寄主细胞中自动复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体)。将其他载体在导入寄主细胞中后整合进寄主细胞的基因组，从而沿着寄主基因组复制。另外，一些载体能够指导可操作地连接的基因的表达。这样的载体本文指“表达载体”。通常，在重组DNA技术中利用的表达载体经常是质粒形式的。在本申请书中，“质粒”和“载体”可以相互交换用作载体的最常用形式的质粒。但是，本发明打算包括如下其他表达载体的形式，如病毒载体或植物转化载体，双元或起同等功能的载体。
本发明的重组表达载体包括适于在寄主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，指包括在带用于表达的寄主细胞的基础上选择的一个或多个调节序列，是可操作地与待表达的核酸序列连接的。在重组表达载体内，“可操作地连接”指与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接的需要的核苷酸序列(例如，当在寄主细胞中导入载体时，在体外转录/翻译系统或寄主细胞中)。
术语“调节序列”打算包括启动子，增强子或其他表达控制元素(例如，聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列如Goeddel，GENEEXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中所述。调节序列包括在许多类型的寄主细胞中指导构成性表达核苷酸序列的那些和只在一些寄主细胞中指导核苷酸序列(例如，组织特异调节序列)的表达的那些。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的设计可以依据待转化的寄主细胞，需要的蛋白质的表达水平等选择这样的因子。本发明的表达载体可以导入寄主细胞中，从而产生包括如本文所述的核酸编码的融合蛋白质或肽的蛋白质或肽(例如，FT蛋白质，FT蛋白质的突变形式，融合蛋白质等等)。
本发明的重组表达载体可以设计成在原核或真核细胞中表达FT蛋白质的。例如，FT蛋白质可以在细菌细胞如大肠杆菌，昆虫细胞(利用，杆状病毒表达载体)，酵母细胞，植物细胞或哺乳动物细胞中表达。适当的寄主细胞进一步在Goeddel，GENEEXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY185，Academic Press，San Die go，Calf.(1990)中讨论。或者，重组表达载体可以例如利用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。
原核生物中蛋白质的表达最经常是利用含有指导融合或非融合蛋白质的构成性或可诱导启动子的载体，在大肠杆菌中进行的。融合载体在其编码的蛋白质中加了许多氨基酸，通常是在重组蛋白质的氨基末端，但羧基末端融合也是常见。这样的融合载体通常有三个目的(i)增强重组蛋白质的表达；(ii)增强重组蛋白质的溶解性；和(iii)通过作为亲和纯化的配体辅助重组蛋白质的纯化。经常，在融合表达载体中，在融合成分和重组蛋白质的结合处导入蛋白质裂解的位点，使重组蛋白质能够从融合成分中分离，随后纯化融合蛋白质。这样的酶，和它们的相关识别序列包括Xa因子，凝血酶和肠肽酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith and Johnson，1988，Gene6731-40)，pMAL(新英格兰生物实验室，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，这些表达载体可以将谷光甘肽-S-转移酶(GST)，甘露糖E结合蛋白质或蛋白质A分别与靶重组蛋白质融合。
适当的可诱导非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等人，(1988)Gene 69301-315)和Pet 11 d(Studier等人，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS INENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)60-89)。
在大肠杆菌中使重组蛋白质的表达最小化的一个方法是在蛋白质水解重组蛋白质的能力受损伤的寄主细菌中表达蛋白质。参见例如，Gottesman，GENE EXPRESSION TECHNOLOGYMETHODS IN ENZYMOLOGY 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)119-128。另一个方法是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，使各个氨基酸的个别密码子是那些优先用于大肠杆菌中的(参见例如，Wada，等人，1992.Nucl.Acids Res.202111-2118)。本发明的这样的核酸序列的改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，FT表达载体是酵母表达载体。在啤酒酵母中用于表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari，等人，1987.EMBO J.6229-234)，pMEa(Kurjan and Herskowitz，1982.Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等人，1987.Gene 54113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)，和picZ(InVitrogen Corp，San Diego.Calif.)。
或者，FT可以利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。在培养的昆虫细胞中(例如，SF9细胞)表达蛋白质可得的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith，等人，1983.Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers，1989.Virology17031-39)。
仍然在另一个实施方案中，本发明的核酸是利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达的。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987.Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman，等人，1987 EMBO J.6187-195)。当在哺乳动物细胞中利用时，表达载体控制功能经常是通过病毒调节元素提供的。例如，通常利用的启动子是从多形瘤，腺病毒2，巨细胞病毒，和猿猴病毒40中派生的。对于其他原核和真核细胞的适当的表达系统参见例如，Sambrook，等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL.第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.，1989，第16和17章。
仍然在另一个实施方案中，本发明的核酸是利用植物表达载体在植物细胞中表达的。植物表达载体系统的例子包括在农杆菌中发现的肿瘤诱导(Ti)质粒或其一部分，椰菜花叶病毒(CAMV)DNA和载体如pBI121。
对于植物中的表达，重组表达盒将包含FT核酸和植物启动子区，转录起始位点(如果待转录的编码序列中没有)，和转录终止/聚腺苷酸化序列。终止/聚腺苷酸化区可以从与启动子序列相同的基因中得到，或者可以从不同的基因中得到。通常包括在盒子的5’和3’末端的独特的限制酶位点允许容易地插入预存在的载体。
适当的启动子的例子包括来自植物病毒的启动子如来自椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV)。Odell，等人，Nature，313810-812(1985)。来自这些基因的启动子如水稻激动素(McElroy，等人，Plant Cell，163-171(1990))；泛素(Christensen，等人，Plant Mol.Biol.，12619-632(1992)；和Charistensen，等人，Plant Mol.Biol.，18675-689(1992))；pEMU(Last，等人，Theor.Appl.Genet.，81581-588(1991))；MAS(Velten，等人，EMBO J.，32723-2730(1984))；玉米H3组酮(Lepetit，等人，Mol.Gen.Genet.，231276-285(1992)；和Atanassvoa，等人Plant Journal，2(3)291-300(1992))，从根癌农杆菌的T-DNA派生的5’-或3’-启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(U.S.专利号，5,683,439)，Nos启动子，rubisco启动子，GRP1-8启动子，ALS启动子(WO 96/30530)，合成启动子，如Rsyn7，SCP和UCP启动子，核糖-1，3-二磷酸羧化酶，特异于果实的启动子，热休克启动子，特异于种子的启动子和其他来自各种植物基因的转录起始区，例如包括各种冠瘿碱起始区，如章鱼碱，甘露碱，和胭脂碱。
可以与FT编码核酸序列结合用于植物中表达的其他调节元素包括终止子，聚腺苷酸化序列，和编码允许植物细胞中定位从细胞分泌蛋白质的信号肽的核酸序列。用于添加或交换具有调节元素FT基因的这些元素的这样的调节元素和方法是已知的，并且包括，但不限于3’终止和/或聚腺苷酸化区域如根癌农杆菌合成酶9nos0基因(Bevan，等人，Nucl.Acids Res.，12369-385(1983))；土豆蛋白质酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，等人，Nucl.Acids Res.，145641-5650(1986)的那些，并且引入本文作为参考)；和An，等人，Plant Cell，1115-122(1989))；和CaMV 19S基因(Mogen，等人，Plant Cell，21261-1272(1990))。
本发明中利用了植物信号序列，包括但不限于编码将蛋白质靶击到植物细胞的细胞外基质的DNA/RNA序列的信号肽(Dratewka-Kos，等人，J.Biol.Chem.，2644896-4900(1989))和Nicotiana plumbaginifolia扩展基因(DeLoose，等人，Gene，9995-100(1991))，或将蛋白质靶击到液泡的信号肽，如甜土豆sporamin基因(Matsuka，等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)，88834(1991))和燕麦植物凝集素基因(Wilkins，等人，Plant Cell，2301-313(1990))，或导致蛋白质分泌的信号，如PRIb的(Lind，等人，Plant Mol.Biol.，1847-53(1992))，或将蛋白质靶击到质体的那些如葡萄种子烯酰-ACP还原酶的(Verwaert，等人，Plant Mol.Biol.，26189-202(1994))。
在另一个实施方案中，重组表达载体能够指导核酸优选地在特定的细胞类型中表达(例如，利用组织特异调节元素表达核酸)。组织特异调节元素是本领域已知的。特定地与本发明的核酸结合利用的是可在植物中操作的表达系统。这些包括在组织特异启动子的控制下的系统，以及包括在所有植物组织中可操作的启动子的那些。
器官特异启动子也是本领域已知的。例如，patatin类I启动子只在土豆块茎中转录激活，并且可用于靶击块茎中的基因表达(Bevan，M.，1986，Nucleic Acids Research 144625-4636)。另一个土豆特异启动子是颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)启动子(Visser，R.G.R.，等人，1991，Plant Molecular Biology 17691-699)。
利用已知的方法可以分离适用于需要的靶器官的其他器官特异启动子。这些控制序列通常是与在需要的器官中独特表达的基因结合的。在典型的高等植物中，每个器官具有其他器官系统中没有的几千个mRNA(参见Goldberg，P.，1986，Trans.R.Soc.London B3 14343)。
为了原位生产GST的反义mRNA，将包括未翻译区的转录成GST mRNA的GST基因的那些区域在反向的启动子系统的控制下插入表达载体。然后，得到的转录mRNA是与植物正常生产的互补的。
将得到的表达系统或盒子连接进或构建包括在适用于植物转化的重组载体。该载体也可以含有可选择的标记基因，该标记基因可用于在培养物中鉴定转化的植物细胞。通常，标记基因将编码抗生素抗性。这些标记包括对G418，潮霉素，博来霉素，卡那霉素，和庆大霉素的抗性。在转化植物细胞后，具有该载体的那些细胞可以由它们在含有特定的抗生素的培养基上的生长能力来鉴定。细菌或病毒起源的重复序列通常也包括在内，允许细菌或噬菌体寄主中克隆载体，优选地包括一个大的寄主范围的原核生物复制来源。细菌的可选择标记也应该包括在内，允许选择含有需要的构建体的细菌细胞。适当的原核生物可选择标记也包括对抗生素如卡那霉素或四环素的抗性。
编码其他功能的其他DNA序列也存在于本领域已知的载体中。例如，在农杆菌转化的情况中，T-DNA序列也将包括在内用于随后转化植物染色体。
本发明的另一方面涉及已经导入本发明的重组表达载体的寄主细胞。术语“寄主细胞”和“重组寄主细胞”在本文中是可以交换使用的。可以理解，这样的术语不仅指特定的主体细胞，而且是这样的一个细胞的子代或潜在的子代。因为在后续的子代中由于突变或环境影响可能存在一些改变，事实上，这样的子代可能与亲本细胞不相同，但仍然包括在本文所用的术语的范围中。可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核细胞或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”用于指在寄主细胞中导入外源核酸(例如，DNA)的许多领域内已认识的技术。
本发明的寄主细胞，培养物中的原核生物或真核生物寄主细胞可以用于生产(即表达)在本发明的聚核苷酸的开放读码框架中编码的本发明的多肽。因此，本发明另外提供了利用本发明的寄主细胞生产多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在能生产该多肽额适当培养基中培养本发明的寄主细胞(其中已经导入了编码本发明的多肽额重组表达载体)。在另一个实施方案中，该方法另外包括从培养基或寄主细胞分离多肽。
许多类型的细胞可以作为本发明的聚核苷酸的开放读码框架编码的多肽的表达所适用的寄主细胞。植物寄主细胞包括例如，可以作为本发明的聚核苷酸的表达的适当寄主起作用的植物细胞，包括来自各种植物种类如拟南芥，烟草，苜蓿，玉米，和大豆的表皮细胞，叶肉和其他地下组织，和叶子，茎，花器官和根中的微管束组织。
或者，也可以生产低等真核生物如酵母或原核生物如细菌中的多肽。潜在的适当的酵母菌株包括啤酒酵母，Schizosaccharomyces pombe，Kluyveromyces菌株，Candida，或能够表达异源蛋白质的任何酵母菌株。潜在的适当的细菌菌株包括大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，鼠伤寒沙门氏菌或能够表达异源多肽的任何细菌菌株。如果多肽是在酵母或细菌中制造的，可能需要修饰其中产生的多肽，例如通过适当位点的磷酸化或糖苷化，目的是得到足够长并且构型具有活性的功能多肽。这样的共价附着可以利用已知的化学或酶学方法来完成。
多肽可以通过在适于表达重组蛋白质的培养条件下培养转化的寄主细胞来制备。然后，可以从这样的培养物(例如，从培养基或细胞萃取物)中利用已知的纯化方法，如凝胶过滤和离子交换层析纯化得到的表达多肽或蛋白质。多肽或蛋白质的纯化也可以包括含有结合蛋白质的试剂的亲和柱；一个或多个柱步骤，这样的亲和树脂如伴刀豆球蛋白A琼脂糖，肝素富山珍珠或Cibacrom蓝3GA琼脂糖；包括利用这样的树脂，如苯乙醚，丁乙醚，或丙乙醚的疏水相互反应层析；或免疫亲和层析的一个或多个步骤。
或者，多肽或蛋白质也可以表达成能简化纯化过程的形式。例如，它可以表达成含有六残基组氨酸末尾的融合蛋白质。然后，组氨酸末尾的蛋白质结合Ni-亲和柱。在洗脱所有其他的蛋白质后，可以洗脱组氨酸末尾的蛋白质完成快速有效的纯化。可以利用疏水RP-HPLC介质，例如具有悬垂甲基或其他双亲性基团的硅胶的一个或多个逆相高效液体层析(RP-HPLC)步骤进一步纯化多肽。结合各不相同的一些或所有前面的纯化步骤也可以用于提供基本同源分离的重组多肽。这样纯化的蛋白质或多肽基本无其他植物蛋白质或多肽，根据本发明定义为“已分离”。
已转化植物细胞和转基因植物本发明包括原生质体，植物细胞，植物组织和植物(例如，用FT核酸，含有FT核酸的载体或含有FT核酸的表达载体转化的单子叶和双子叶植物，适于转化植物细胞和植物的核酸的例子包括SEQ ID NO4，40-57或58的那些核酸序列。如本文所用，“植物”指不仅包括整个植物，而且包括其一部分(即，细胞，和组织，包括例如，叶子，茎，苗，根，花，果实和种子)。
植物可以是任何植物类型，包括例如，来自下列属的种类Cucurbita，Rosa，Vitis，Juglans，Fragaria，Lotus，Medicago，Onobrychis，Thifolium，Trigonella，Vigna，Citrus，Linum，Geranium，Manihot，Daucus，Arabidopsis，Brassica，Raphanus，Sinapis，Atropa，Capsicum，Datura，Hyoscyamus，Lycopersicon，Nicotiana，Solanum，Petunia，Digitalis，Majorana，Ciahorium，Helianthus，Lactuca，Bromus，Asparagus，Antirrhinum，Heterocallis，Nemesis，Pelargonium，Panieum，Pennisetum，Ranunculus，Senecio，Salpiglossis，Cucumis，Browaalia，Glycine，Pisum，Phaseolus，Lolium，Oryza，Zea，Avena，Hordeum，Secale，Triticum，Sorghum，Picea，Caco，和Populus。
在本发明的一些方面，转化植物是抗抗生素和非生物胁迫的，例如，寒冷胁迫，盐胁迫，热胁迫，水胁迫，疾病，虫害，和伤口愈合。另外，本发明也包括抗致病原如真菌，细菌，线虫，病毒和寄生杂草有抗性的转基因植物。或者，转基因植物是抗除草剂的。抗性是指植物能在胁迫条件(例如，高盐，失水，低温)或在正常地抑制未转化的植物到一定程度的条件下生长。确定植物生长或对胁迫的应答的方法包括例如，高度的测量，重量的测量，叶子面积，开花，水利用，呼吸速度和生产的能力的测量。
本发明也包括细胞，组织，包括例如叶子，茎，苗，根，花，果实和种子和从转化植物派生的子代。
在植物中导入外源基因的许多方法是已知的，并且可以用于在植物寄主中插入基因，包括生物和物理的植物转化方案。参见例如，Miki等人，(1993)“在植物中导入外源DNA的方法”，植物分子生物学和生物技术方法，Glick and Thompson，eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，67-88页，和Andrew Bent，Clough SJ andBent AF，1998。花浸蘸选择的方法根据寄主植物改变，包括化学转染方法，如磷酸钙，聚乙二醇(PEG)转化，微生物介导的基因转移如农杆菌(Horsch，等人，Science，2271229-31(1985))，电穿孔，原生质转化，微注射，花蘸和颗粒或非颗粒生物炸弹。
农杆菌介导的转化在植物中导入表达载体的利用最广泛的方法是基于农杆菌(Agrobacterium)的天然转化系统的。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是在遗传上转化植物细胞的植物致病原土壤细菌。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带了负责植物的基因转化的基因。参见例如，Kado，Crit.Rev.Plant Sci.，101-32(1991)。Gruber等人，出处同上；和Moloney，等人，Plant Cell Reports，8238-242(1989)提供了用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统的描述。
转基因拟南芥属植物可以容易地通过将开花植物蘸入农杆菌培养物中的方法来生产，方法是根据Andrew Bent in，Clough SJand Bent AF，1998。蘸花拟南芥的农杆菌介导的转化的简化方法。野生型植物生长直到植物具有在开的花和已开的花。植物回到携带适当的基因构建体的农杆菌培养物的溶液中1分钟。然后，植物在一个浅盘中保持水平，保持覆盖2天保持潮湿，然后，扶正，打包，继续生长，发育种子。大量收获成熟的种子。
直接基因转移植物转化的一般可应用的方法是位粒介导的转化，其中在约1到4mu.m的微粒表面上携带了DNA。该表达载体是利用将微弹的速度加速到足以渗透到植物细胞壁和膜的300到600m/s的生物装置来导入植物组织(Sanford，等人，Part.Sci.Technol.，527-37(1987)；Sanford，Trend Biotech，6299-302(1988)；Sanford，Physiol.Plant，79206-209(1990)；Klein，等人，Biotchnology，10286-291(1992))。
将DNA物理递送到植物的另一个方法是将靶细胞超声波处理，如Zang，等人，BioTechnology，9996-996(1991)。或者，利用脂质体或原生质体融合在植物中导入表达载体。参见例如，Deshayes，等人，EMBO J.，42731-2737(1985)；and Christou，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，843962-3966(1987)。利用CaCl2沉淀，聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸也已经叙述过。参见例如，Hain，等人，Mol.Gen.Genet.，199161(1985)；和Draper，等人，PlantCell Physiol.，23451-158(1982)。
原生质体和整个细胞和组织的电穿孔也已经叙述过。参见例如，Donn，等人，(1990)Abstracts ofthe VIIth Int；1.Congress onPlant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，53页；D’Halluin等人，Plant Cell，41495-1505(1992)；and Spencer等人，Plant Mol.Biol.，2451-61(1994)。
植物也可以利用Held等人的方法来转化(美国申请20010026941)。该方法利用了携带需要的分子，DNA进入靶细胞的小滴的加速的气雾束。这一方法产生的小滴的大小据报道足以小到转化长度1到2微粒的细菌细胞。
颗粒创伤/农杆菌递送另一个有用的基本转化方法包括结合创伤和颗粒炸弹，接着利用农杆菌递送DNA，入Bidney，等人，Plant Mol.Biol.，18301-31(1992)所述。利用的植物转化质粒包括Bin 19。参见Bevan，Nucleic Acids Research，128711-8721(1984)，该文通过在此引述而合并于本文。
通常，完整的分生组织转化方法包括在暗中吸涨种子，除去子叶和根轴，接着培养分生组织外植体。24小时后，除去最初的叶子，暴露顶端的分生组织。将外植体圆顶立起来放置，例如用颗粒轰炸两次，接着与农杆菌共培养。为了与整个分生组织共培养，将农杆菌放置于分生组织上。在约共培养了3天后，将分生组织转移到培养基上，用头胞噻肟加卡那霉素进行NPTII选择。
劈开分生组织的方法包括，吸涨种子，断裂子叶在胚轴的平台上产生一个清洁的裂口，切掉根尖，然后在原始叶子之间纵向等分外植体。两个阀放置在培养基上的切开的表面，然后用颗粒轰炸两次，接着与农杆菌共培养。对于分开的分生组织，在轰炸后，将分生组织放置于农杆菌悬浮液中30分钟。然后，从悬浮液中移到固体培养基上共培养3天。在这一时期后，将分生组织转移到新鲜的培养基中，用头胞塞肟加卡那霉素选择。
通过植物育种转移或者，当通过前面的重组DNA方法得到一次转化的植物后，利用常规的植物育种方法通过杂交和回交转移基因和相关的调节序列。这样的中间性方法包括其他步骤(1)将抗病植物与来自疾病敏感的类群的植物有性杂交；(2)从杂交的子代回收可再生物质；和(3)从可再生物质生长疾病抗性植物。需要或必须时，可以将这一方法延伸包括其他重复步骤可以基本保留敏感类群的农业特征(1)将抗病子代与来自敏感类群的疾病敏感植物回交；和(2)在回交的子代中选择过氧化氢生产酶活性的表达(或相关的标记基因)，直到需要百分数的敏感类群的特征和给予草酸降解和/或过氧化氢酶活性的基因出现在子代中。
本文的术语“类群”是指生物分类的一个单位。它包括，属，种，品种，变种，变异种和其他不一致命名的小类群组。
转化体的再生来自单个植物原生质体或各种外植体的植物的发育或再生是本领域已知的(Weissbach and Weissbach，1988)。这一再生和生长的过程通常包括步骤选择转化的细胞，培养那些单个细胞，经过胚发育的一般时期到长根的小植株时期。同样地再生转基因的胚和种子。然后，在适当的植物生长培养基入土壤中种植得到的转基因的长根的苗。
利用本领域已知的方法如(Horsch等人，1985)所述可以进行含有编码从叶子外植体通过农杆菌导入的需要的多肽的外源基因的植物的发育或再生。在这一方法中，在存在选择试剂和在诱导待转化的植物品系的苗的再生的培养基中培养转化体，如(Fraley等人，1983)所述。特别是，美国专利号5,349,124(该文通过在此引述而合并于本文)详细叙述了从中可以表达给予植物抗鳞翅目蛾类的杀昆虫活性的杂合体结晶蛋白质的遗传转化莴苣细胞和植物的生产。
这一方法通常在2到4个月产生了苗，然后将那些苗转移到含有选择因子和房细菌生长的抗生素的适当的根诱导培养基上。然后将存在选择因子时长根形成小植株的苗移植到土壤中或其他允许根生长的介质中。这些方法可以根据利用的特定的植物品系变化，这样的变化是本领域已知的。
优选地，将再生的植株自花授粉提供纯合的转基因植物，或将从再生植株得到的花粉与农业上重要的，优选地自交系种子生长植物杂交。相反地，还利用来自这些重要的品系的植物的花粉对再生植株授粉。利用本领域已知的方法培养含有需要的多肽的本发明的转基因植物。
优选的转基因植物是独立的分离子，可以将FT基因和它的活性传递到它的子代。更优选的转基因植物是该基因的纯合子，在有性交配的基础上可以将那个基因传递到它所有的子代。来自转基因植物的种子可以在田野或温室中生长，得到的性成熟转基因植物自花授粉后产生纯育植物。来自这些植物的子代变成FT转基因的表达增强的纯育系。
生产转基因植物的方法包括在本发明中的是胁迫抗性提高，衰老延迟或对ABA的敏感性提高的转基因植物的生产方法。改方法包括在一个或多个植物细胞中导入改变植物中法尼基转移酶表达(即，法尼基转移酶alpha或beta)或活性的化合物。该化合物可以是例如，(i)法尼基转移酶多肽的抑制剂；(ii)编码法尼基转移酶多肽抑制剂的核酸；(iii)降低编码法尼基转移酶多肽的核酸，和其衍生物，片段，类似物和同源物的表达核酸；(iv)反义法尼基转移酶核酸。降低编码法尼基转移酶多肽的核酸的表达的核酸包括例如，反义核酸或RNA抑制性核酸。该核酸可以是内源的或外源的。优选地，该化合物是法尼基转移酶多肽，或编码法尼基转移酶多肽的核酸。例如，该化合物是SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ IDNO8，SEQ ID NO31，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37的核酸序列。更优选地，该化合物是与编码法尼基转移酶多肽的核酸互补的核酸。例如，一个反义核酸分子。可作为例子的化合物包括SEQ ID NO1，3，4，29，30，32，35，38，40-57和58。
同样包括在本发明中的是在编码法尼基转移酶(即，alpha或beta)的基因中已经导入了一个突变的植物，这样导致植物与野生型植物比较法尼基转移酶活性降低，对胁迫的耐性降低。该突变可以通过化学或机械的方法来导入。
胁迫的例子包括例如，寒冷胁迫，热胁迫，盐胁迫，水胁迫，营养限制胁迫，疾病，食植害虫，创伤愈合，致病原如真菌，细菌，线虫，病毒或寄生杂草和杀虫剂。
胁迫抗性提高是指该转基因植物可以在胁迫条件下(例如，高盐，脱水，低温)或在正常时抑制未转化的植物的生长的条件下可以生长。确定植物的生长或对胁迫的应答的方法包括例如，测量高度，测量重量，叶子面积，开花的能力，水的利用，蒸腾的速度和产量。
如实施例11所述，可以利用ABA的浓度曲线评估ABA的敏感性，并且在平板上萌发种子。评估萌发的频率，用于确定敏感性。但是，敏感性也可以在除了简单萌发以外的许多发育时期观察。例如，在子叶扩展，第一片真叶的扩展，或苗期的发育停滞时期也可以观察到敏感性的提高。
能观察到敏感性的ABA浓度是根据品种不同而变化的。例如，转基因拟南芥中的敏感浓度比苜蓿或大豆中观察到的更低。
通过提高ABA敏感性，可以看到，转基因植物展示与野生型植物相同的表现型需要的ABA浓度更低。确定ABA敏感性的方法包括例如，植物萌发，生长或发育。
植物可以是如下的任何植物类型，包括Cucurbita，Rosa，Vitis，Juglans，Fragaria，Lotus，Medicago，Onobrychis，Trifolium，Trigonella，Vigna，Citrus，Linum，Geranium，Manihot，Daucus，Arabidopsis，Brassica，Raphanus，Sinapis，Atropa，Capsicum，Datura，Hyoscyamus，Lycopersicon，Nicotiana，Solanum，Petunia，Digitalis，Majorana，Ciahorium，Helianthus，Lactuca，Bromus，Asparagus，Antirrhinum，Heterocallis，Nemesis，Pelargonium，Panieum，Pennisetum，Ranunculus，Senecio，Salpiglossis，Cucumis，Browaalia，Glycine Pisum，Phaseolus，Lolium，Oryza，Zea，Avena，Hordeum，Secale，Triticum，Sorghum，Picea，Caco，和Populus.
筛选方法本发明的分离的核酸分子(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO34，或SEQ ID NO37)可用于表达FT蛋白质(例如，通过寄主中的重组表达载体)，检测FTmRNA(例如，在生物样品中)，或FT基因中的遗传损伤，和调节FT活性，如下面进一步叙述。另外，FT蛋白质可以用于筛选调节FT蛋白质的活性或表达的化合物。另外，本发明的抗FT抗体可以用于检测和分离FT蛋白质和调节FT活性。
本发明提供了用于鉴定结合FT蛋白质或对例如FT蛋白质的表达或FT蛋白质的活性具有刺激或抑制效果的调节物，即候选或测试化合物或试剂(例如，肽，肽模拟物，小分子，或其他药物)的方法(本文也称为“筛选实验)。本发明也包括在本文所述的筛选实验中鉴定的化合物。本发明也包括利用诱变，基因标记，插入性基因标记，激活标记，或其他这样的基因或表现型鉴定方法在筛选方案中利用本发明的转基因植物鉴定相关基因的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选结合FT蛋白质或多肽其生物活性部分的候选或实验化合物的测试方法。本发明的测试化合物可以利用本领域已知的结合文库方法中的许多途径来得到，包括生物文库；空间可知的平行固相或液相文库；需要解旋的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和利用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库途径仅限于肽文库，而其他四个途径可应用于肽，非肽寡聚物或化合物的小分子文库。参见例如，Lam，1997，Anticancer Drug Design 12145。
如本文所用，“小分子”是指分子量小于约5Kd，更优选地小于约4kD的组合物。小分子可以例如是核酸，肽，多肽，肽模拟物，碳水化合物，脂或其他有机或无机分子。化学和/或生物混合物，如真菌，细菌，或藻类萃取物的文库是本领域已知的，并且可以利用本发明的实验筛选。
合成分子文库的方法的例子可以在本领域中找到，例如，在Dewitt，等人，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb，等人，1994。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422；Zuckermann，等人，1994.J.Med.Chem.372678；Cho，等人，1993.Science2611303；Carrell，等人，1994.J.Med.Chem.372678；Cho，等人，1993.Science 2611303；Carrell，等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell，等人，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；and Gallop，等人，1994.J.Med.Chem.371233。
化合物的文库可以存在于溶液中(例如，Houghten，1992.Biotechniques 13412-421)，或在小珠上(Lam，1991.Nature35482-84)，在条上(Fodor，1993.Nature 364555-556)，细菌(Landner，美国专利号5,223,409)，芽胞(Landner，美国专利5,233,409)，质粒(Cull，等人.，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869)或在嗜菌体上(Scott and Smith，1990 Science249386-390；Devlin，1990.Science 249404-406；Cwirla，等人，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A876378-6382；Felici，1991.J.Mol.Biol.222301-310；Landner.美国专利号5,233,409)。
在一个实施方案中，测试是基于细胞的测试，其中表达FT蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并且确定了测试化合物结合FT蛋白质的能力。该细胞例如可以是哺乳动物起源，植物细胞或酵母细胞。确定测试化合物结合FT蛋白质的能力可以例如将测试化合物与放射性同位素或酶标记结合来完成，使测试化合物与FT蛋白质或其生物活性部分的结合可以通过检测复合物中的标记化合物来确定。例如，测试化合物可以是用125I，35S，14C，3H，直接或间接地标记，通过直接计数辐射发散或通过闪烁计数检测放射性同位素。或者，可以用例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，或荧光酶来酶标记，并且通过确定适当的底物与产物的交换检测酶标记。在一个实施方案中，测试包括将表达FT蛋白质或其生物活性部分额细胞与结合FT的已知化合物接触形成测试混合物，将测试混合物与测试化合物接触，确定测试化合物与FT蛋白质的相互作用的能力，其中确定测试化合物与FT蛋白质的相互作用的能力包括确定测试化合物优先结合FT蛋白质或其生物活性部分的能力，并且与已知化合物比较。
在另一个实施方案中，测试是基于细胞的测试，包括将表达FT蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触和确定测试化合物调节(例如，刺激或抑制)FT蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。确定测试化合物调节FT或其生物活性部分的活性的能力可以例如通过确定FT蛋白质结合或与FT靶分子相互作用的能力来完成。如本文所用，“靶分子”是FT蛋白质自然情况下结合或相互反应的分子，例如在表达FT相互作用蛋白质的细胞表面上的分子，在第二个细胞的表面上的分子，在细胞外环境中的一个分子，与细胞膜或细胞质分子的内部表面结合的分子。FT靶分子可以是本发明的一个非FT分子或FT蛋白质或多肽。在一个实施方案中，FT靶分子是简化细胞外信号(例如，化合物与膜结合分子结合产生的信号)传导通过细胞膜和进入细胞的信号传导途径的成分。靶例如可以是具有催化活性的第二个细胞内蛋白质，或简化下游信号分子与FT的结合的蛋白质。
FT蛋白质结合或与FT靶分子相互作用的能力的确定可以通过如上所述的确定直接结合的方法中的一个来完成。在一个实施方案中，确定FT蛋白质与FT靶分子结合或相互作用的能力可以通过确定靶分子的活性的来完成。例如，靶分子的活性可以通过确定靶的细胞第二信使(即，细胞内Ca2+，二乙酰甘油，IP3，等等)的诱导，检测靶对适当的底物的催化/酶活性，检测报道基因(包括与编码可检测标记，例如荧光酶的核酸可操作地连接的FT应答调节元素)的诱导；或检测细胞应答，例如细胞的生存，细胞分化，或细胞增殖来确定。
仍然在另一个实施方案中，本发明的测试是无细胞测试，包括将FT蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，和确定测试化合物与FT蛋白质或其生物活性部分结合的能力。测试化合物与FT蛋白质的结合可以如上所述直接或间接测定。在一个这样的实施方案中，测试包括将FT蛋白质或其生物活性部分与结合FT的已知化合物接触形成测试化合物，将测试混合物与测试化合物接触，确定测试化合物与FT蛋白质相互作用的能力，其中测试化合物与FT蛋白质相互作用的能力的测定包括确定测试化合物与FT或其生物活性部分优选结合的能力，并且与已知的化合物比较。
仍然在另一个实施方案中，测试是无细胞测试，包括将FT蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，确定测试化合物调节(例如，刺激或抑制)FT蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。测试化合物调节FT的活性的能力的确定可以例如通过如上所述的确定直接结合的一个方法确定FT蛋白质结合FT靶分子的能力来进行。在一个或选的实施方案中，测试化合物调节FT蛋白质的活性的能力的确定可以通过确定FT蛋白质进一步调节FT靶分子的能力来完成。例如，可以如上所述确定适当的底物上靶分子的催化/酶活性。
仍然在另一个实施方案中，无细胞测试包括，将FT蛋白质或其生物活性部分与结合FT蛋白质的已知化合物接触形成测试混合物，将测试混合物与测试化合物接触，确定测试化合物与FT蛋白质相互作用的能力，其中测试化合物与FT蛋白质相互作用的能力的确定包括确定FT蛋白质优先结合或调节FT靶分子的活性的能力。
本发明的无细胞测试方法可以修改成利用FT蛋白质的可溶形式或膜结合形式。在包括FT蛋白质的膜结合形式的无细胞测试的情况中，需要利用溶解试剂使FT蛋白质的膜结合形式保留在溶液中。这样的溶解试剂的例子包括非离子去垢剂如n-辛基葡糖苷，n-十二烷基葡糖苷，n-十二烷基甘露糖苷，辛酰基-N-甲基葡糖酰胺，葵酰基-N-甲基葡糖酰胺，曲通X-100，曲通X-114，Thesit，异三葵基聚(乙二醇醚)n，N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸，3-(3-氯酰丙基)二甲基氨基-1-丙烷磺酸(CHAPS)，或3-(3-氯酰丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸(CHAPSO)。
在本发明的上面的测试方法的不止一个实施方案中，需要将FT蛋白质或它的靶分子固定，简化一个或两个蛋白质的复合形式从非复合形式中的分离，以及需要使测试方法自动化。在存在和没有候选化合物时，测试化合物与FT蛋白质的结合，或FT蛋白质与靶分子的相互作用可以在任何适于装载反应剂的容器中进行。这样的容器的例子包括微滴平板，试管，和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供了加入允许一个或两个蛋白质结合基质的区域的融合蛋白质。例如，GST-FT融合蛋白质或GST靶融合蛋白质可以吸收到谷光甘肽琼脂糖珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷光甘肽派生微滴平板，然后结合测试化合物或测试化合物和非吸收靶蛋白质或FT蛋白质，在指导复合物形成的条件下(例如，在生理盐和pH)条件下温育混合物。在温育后，洗涤小珠或微滴平板的孔除去未结合的成分，在小珠的情况中除去固定的基质，如上所述直接或间接测定复合物。或者，可以从基质离解复合物，利用标准的技术测定FT蛋白质结合或活性水平。
在基质上固定蛋白质的其他技术也可以用于本发明的筛选实验中。例如，FT蛋白质或它的靶分子可以利用生物素和链霉抗生物素蛋白的结合来固定。生物素化FT蛋白质或靶分子可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰)，利用本领域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)来制备，并且在链霉抗生物素蛋白包衣的96孔平板(Pierce Chemical)的孔中固定。或者，可以将与FT蛋白质或靶分子反应但不干扰FT蛋白质与它的靶分子结合的抗体通过抗体结合派生到平板的孔中，和未结合的靶或陷入孔中的FT蛋白质上。检测这样的复合物的方法，除了如上所述固定GST复合物的那些还包括利用与FT蛋白质或靶分子反应的抗体免疫检测复合物，以及依赖检测与FT蛋白质或靶分子相关的酶活性的酶联测试方法。
在另一个实施方案中，细胞与候选化合物接触，测定细胞中的FTmRNA或蛋白质的表达的方法中鉴定了FT蛋白质表达的调节物。将存在候选化合物时FTmRNA或蛋白质的表达水平与没有候选化合物时FTmRNA或蛋白质的表达水平比较。然后，根据这一比较可以确定候选化合物是FTmRNA或蛋白质表达的调节物。例如，当存在候选化合物时FTmRNA或蛋白质的表达比没有候选化合物时更大(即，在统计学意义上更大)，则候选化合物可以鉴定为FTmRNA或蛋白质表达的刺激物。或者，当存在候选化合物时FTmRNA或蛋白质的表达比没有候选化合物时更低(统计学意义上更低)，则候选化合物可以鉴定为FTmRNA或蛋白质表达的抑制剂。细胞中的FTmRNA或蛋白质的表达水平可以用本文所述的检测FTmRNA或蛋白质的方法来测定。
仍然在本发明的另一个方面，FT蛋白质可以用作双杂合体实验或三杂合体实验中的“饵蛋白质”(参见例如，美国专利号，5,283,317；Zervos，等人，1993.Cell 72223-232；Madura，等人，1993.J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel，等人，1993.Biotechniques 14920-924；Iwabuchi，等人，1993.Oncogene 81693-1696；and Brrent WO94/1-3000)，鉴定与FT结合或相互作用的其他蛋白质(“FT结合蛋白质”或“FT-bp”)和调节FT活性。这样的FT结合蛋白质也可以类似地参与通过例如FT途径的上游或下游元素的FT蛋白质的来传播信号。
双杂合体系统是基于包括可分离的DNA结合和激活区的大多数转录因子的调节特性的。简要地所，该实验利用了两个不同的DNA构建体。在一个构建体中，编码FT的基因与编码已知转录因子(例如，GAL-4)的DNA结合区的基因融合。在另一个构建体中，编码未鉴定的蛋白质(“捕获物”或“样品”)的来自DNA序列的文库的DNA序列与编码已知转录因子的激活区域的基因融合。如果“饵”和“捕获物”蛋白质能够在体内相互作用，形成依赖FT的复合物，那么转录因子的DNA结合和激活区就接近了。这一接近允许与对应转录因子的转录调节位点可操作连接的报道基因(例如，LacZ)的转录。可以检测报道基因的表达，可以分离含有功能性转录因子的细胞克隆，用于得到编码与FT相互作用的蛋白质的已克隆基因。
仍然在本发明的另一方面的是通过遗传筛选方案，利用本发明的转基因植物鉴定FT相互作用成分。这些成分例如可以是修饰FT基因表达的调节元素，直接改变FT活性的相互作用蛋白质或改变相同的信号传导途径的成分，从而对FT的表达或活性产生效果的的相互作用的蛋白质。简要地说，遗传筛选方案可以用于本发明的转基因植物，并且这样来鉴定野生型筛选背景不能鉴定的相关基因。例如，利用本发明的转基因植物作为遗传背景可以产生激活标记文库(Weigel，等人，2000.Plant Physiol.1221003-1013)。然后，筛选植物中与亲本植物具有的相比有变化的表现型。可以利用从本发明的转基因植物生产文库的方法，例如化学或辐射诱导的突变，插入失活或激活方法。
本发明另外涉及通过前面提到的筛选实验鉴定的新试剂和它们的用途。
本发明不打算局限于本文所述的特定实施方案的范围。确实，除了本文所述的那些，本发明的各种修改都是本领域技术人员可以从前面的叙述和附图中得到理解的。这样的修改是在附加的权利要求的范围内的。
本发明将进一步在下面的实施例中叙述，这些实施例并不限制权利要求所述的本发明的范围。
实施例实施例1克隆拟南芥FTA和构建转化载体利用对应于SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物，从叶子组织分离的总RNA通过RT-PCR得到拟南芥FTA序列。用BamHI和SmaI消化得到的片段，并且克隆进质粒pCR2.1。利用Clonetech载体pBI121作为反义构建体的骨架。通过BamHI和EcolCRI消化除去GUS基因，用SmaI和BamHI从pCR2.1-FTA切出的FTA插入片段替代，连接进载体SEQ ID NO4。
表1SEQ ID NO115’-AAAGGATCCTCAAATTGCTGCCACTGTAAT-3’SEQ ID NO125’-AAACCCGGGATGAATTTCGACGAGAACGTG-3’实施例2克隆非全长苜蓿FTA和FTB核酸序列利用Qiagen Rneasy试剂盒，从叶子和根组织分离RNA。利用表2所示的引物，通过已知技术进行RT-PCR。利用引物对SEQ ID NO19和SEQ ID NO20得到FTA序列。利用引物对SEQ ID NO21和SEQ ID NO22得到FTB序列。
表2SEQ ID NO195’-GGATCCATGGATTACTTCCGTGCGATTTACTTCTCC-3’SEQ ID NO205’-AAAAAGCTTCCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATC-3’SEQ ID NO215’-AAAAAGCTTTGGCTTTGTTACTGGATTCTTCATTCAAT-3’SEQ ID NO225’-AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTT-3’利用Qiagen PCR柱旋转试剂盒从RT-PCR反应混合物分离PCR产物，连接进克隆载体pBluescript KS+。用EcoRV消化载体，在存在dTTP时用Taq聚合酶处理产生3’突出，用于PCR产物的连接。将连接产物转化进大肠杆菌DH5α细胞，选择阳性克隆，将得到的插入片段测序。
实施例3克隆来自大豆和玉米的非全长FTA和FTB核酸序列利用Qiagen Rneasy试剂盒，从叶子和根组织分离RNA。利用表3所示的引物通过已知技术进行RT-PCR。利用引物对SEQID NO23和SEQ ID NO24得到大豆FTA序列。利用引物对SEQ ID NO25和SEQ ID NO26得到大豆FTB序列。利用引物对SEQ ID NO27和SEQ ID NO28得到玉米FTB序列。
表3SEQ ID NO235’-AAAGGATCCATGGAATCTGGGTCTAGCGA-3’SEQ ID NO245’-AAATCTAGAAGGAAGTCTGCTCTTGCGC-3’SEQ ID NO255’-AAATCTAGAGCCACCATTCCTCGCAACG-3’SEQ ID NO265’-AAAGAGCTCGTGGTGGAGAATCTGGGTGC-3’SEQ ID NO27 5’-GGCGGATCCCGACCTACCGAGG-3’SEQ ID NO285’-AAAGAGCTCGTGGATGGATTGGCTCCAGC-3’利用Qiagen PCR柱旋转试剂盒，从RT-PCR反应混合物分离PCR产物，连接进克隆载体pBluescript KS+。用EcoRV消化载体，在存在dTTP时用Taq聚合酶处理，产生一个用于连接PCR产物的3’突出。将连接产物转化进大肠杆菌DH5α细胞，选择阳性克隆，将得到的插入片段测序。
实施例4序列分析拟南芥FTA在表4A中显示了999核苷酸(也称为FT1)的公开的核酸。用于PCR的引物是黑体。
SEQ ID NO1编码的公开的FT1多肽(SEQ ID NO5)具有326个氨基酸残基，在表4B中表示成单字母氨基酸密码。
由于克隆方案的特性，表示的序列不含有任何5’或3’非翻译序列。利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或利用cDNA末端(RACE)技术的快速扩增或其他PCR技术。拟南芥核苷酸序列和它的编码氨基酸与公开的序列的同一性百分数表示在图8。
本发明也包括了与SEQ ID NO1的拟南芥法尼基转移酶alpha亚单位互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ IDNO2。SEQ ID NO3的核苷酸序列显示，已经制备的SEQ IDNO2的核酸序列可用于连接进表达载体。
SEQ ID NO2aaaggatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgccgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtctgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatcccgggtttSEQ ID NO3gatcctcaaattgctgccactgtaatcttgctcttcctccatgcccaatagttagctcttataggatctacacgaccaagaatagtacacaccaaattggccaagttagtctctggttcttcattagctagagctctcactgagtctttatgctcgttggttggtctcagtccatcacatagaagatccaaaagggtgctcagagcgaatccatggaagcaatctgtgcgggatagaacattcaaacagactgaggaaacacttggatcactaatccaggattctttgtcgtctttgtaaagcgcttttaggtatcgccatgagctctcgtttgcaggattggttaaaatggctttgattgtgtagcttacttcagattctctcatggcttctaggcctcccaacaaaggagattgggtgatgacataatacctctgattccaggcggaattgttaaagacgtcagcttcaaggagctcgtgacagtaatcgagctcatcttcccatcctcctaatgcccgtagtgtccactgcctatgtgaccaagcatgataatgtttggcatcaagtgaaagtactctacgggtaaattcaagttctctccctgcaacatcaggacccagtttctctgcaacccatcgccgatgatgccacagttggtagttcttagagttatcctcagcaatgcgttcgatgaactcgagttcttcaaacaagtcgtgattaagggcctcgagtactaggcgcctgaaatgccacactgtgtagttgccggagtttaagaggagggtttcttccgtgagtcgtagtgcgcgaggagatcgctcgtcggaaaagtaaatcgcacggaagtaatccatagtctcgcggaactcttccttgtaggcaattggcaccactggattcggaccatcgtcctgagtcaatgggaccacgtctgaccactccaatcgttggctcagtggcacggtctcgtcgaaattcatccc苜蓿FTA
表5表示了822核苷酸(也称为FT2)的公开的核酸序列。
SEQ ID NO6编码的公开的FT多肽(SEQ ID NO7)具有274个氨基酸残基，并且在表5B中表示成单字母氨基酸密码。
由于克隆方案的特性，与拟南芥序列比较，表示的序列不是全长的。其中有氨基末端丢失了42个氨基酸，羧基末端丢失了10个氨基酸。图8表示了苜蓿核苷酸序列和它的编码氨基酸序列与公开的序列之间的同一性百分数。
利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或使用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术或其他PCR技术。
本发明也包括与SEQ ID NO6的苜蓿法尼基转移酶alpha亚基互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ ID NO29。
SEQ ID NO29CCATGCCCAATAGTTAGCTCTTATTGGATCAACACGACACAGAATGGTACACACCAAATTGGCCAAGTTAGTCTCTGGTTCTTCATTAGCTAGAGCTTTCACCGAGTCTCTATGCTCGTTGGTTGGTCTCAACCCATCGCACAGAAGATCCAAAAGGGTGCTCAGAGCGAATCCATGGAAGCAGTCCGCGCGTGAGAGAACTTTCAAACAGACTGAGGAAACACTTGGATCACTAATCCAAGACTCTGTGTCGTCTTTGTAAAGGGCTTTCAGGTACCTCCAAGAGCTCTCGTTCCCGGGATTTGCTAAAATGGCTTTGACTGTGTAGCTTACTTCAGATTCTCTCATGGCTTCTAGGCCTCCCAACGAAGGTGATCTAGTTATAACGTAATACCTCTGATTCCATGCAGAGTTGTTAAAGACGTCAGCTTCAAGGAGCTCGTGGCAGTAGTTAAGCTCATTTTCCCATCCTCCTAATGCTTGTAGCGCCCACTGCCTATGTGACCAAGCATGATAATGCTTGGCATCAAGTGATAGTACCCTCCGAGTAAACTCAAGTTCCTTTCCTGCAACATCAGGACCCAGTTTCTCTGCGACCCATCGTCGATGATGCCACAACTGGTAGTTCTTAGAGTTATCCTCAGCAATGCTTTCGATGAACTTGAGCTCTTCATACAAGTCGTTATTAAGCTCCTCGAGTACTAAGCGCCCGAAGTGCCACACGGTGTAGTTGCCCGAGTTTAAGCGGAGAGCTTCTTCCGTGAGTCGCAGCGCGCGAGCAGAACGCTCGTCGGAGAAGTAAATCGCACGGAAGTAATCCAT苜蓿FTB1110核苷酸(也称为FT3)的公开的核酸表示在表6A。
SEQ ID NO7编码的公开的FT3多肽(SEQ ID NO9)具有370个氨基酸残基，以单字母氨基酸密码表示在表6B。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全长的。与拟南芥比较，在氨基末端丢失了31个氨基酸，在羧基末端丢失了5个氨基酸。欧洲欧洲油菜核苷酸序列和它的编码氨基酸序列与公开的序列的同一性百分数表示在图9。
利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或使用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术或其他的PCR技术。序列比较已经进行，图8和图9表示了同一性百分数。
本发明也包括了与SEQ ID NO8的苜蓿法尼基转移酶beta亚基互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ ID NO30。
SEQ ID NO30AAATCTAGAAGCTTCATAATACCGATCCAAGACAATGTTGTGGAGGAGGTGAACAGGTTCAAGGTGGTTTGCGTAGCCACCCAAAATGTCACGAGTCAAAGGAGGAGTGTCCTCGTCTTTTGACCAAGCGTGTTGAGCCACGGAAAGACCGCTTAGGCAGTAACATGTGTGGTAGAAGTCACGGGGTTTCCTCAGCTTGTCTCTGAATCCACCATCAGCAACCTGAGAGCACAAGAGCACATATCTTTGCAAGCCGAGGCTATCAAAAACAGGTTGAATTCTCCTGTCAATGTAGGTAGACGTATGATGAACTTGGTGACCATTCCCTGAATCTTCATCGCTATCCTCATCAGAATCATCTTCATCACTGTCTTCAGGATCATCTTCATCATGACCATGTTCCTCGTGATCTTCATCTGTCCCTTGTGACATATGTGATGATGATCCATGAGGTGCCATATCCTGGGATGAAAAAAATCGCTGTAGTAGAACACAGGGGGCTGCCTGCCAAAACGTGTAGCAACCGTCGACCAATTTGTTCGTCCTACCTTGGAATCCCATTTCTACTCCTTGTCGATGTACAACCCAATTCATTAACGAATCCAAATTCAAGCGGTCGACTTCATTGATTAAAATCATAGTAGCCAACCCACAGTACGTGTACCCACCATGAGCTTCGGAGCCAGGTTCCCCTCCAATGCCACCTTCATAAGTTTGGCAACTCAAAATGTAATCTCCTAAGCCGCGGGTGAGTTCATCATCCACAATGTTCAGGATGCTTGCAATCAAAATCGCAGTGTAGCACGCTCGCACATCTATTTCTCCCATATTATGCATCCTGAAACCTCCATTTGTATCCTTCATTCGTCTTAAGAAACAAGCCATTTGTTCTCTGTTAATTGAAGAGAAGGCTTTCTCACCTCCTAAAGTAACAAGTGTATTCACTGCAGCATAACTTGTTGCAAGATGTGGAAGTTGGCCAGGACCACCACCATATCCACCATCAGAACCCTGGCAACGTCCAAGAAAATCGATTGCATTGTTTTCTAAGTCATCATCCACAGACTCCCCAAGCAAAGCAATTGAATGAAGAATCCAGTAACAAAGCCA大豆FTA表7A中表示了1041核苷酸(也称为FT4)的公开的核酸。
SEQ ID NO31编码的公开的FT多肽(SEQ ID NO33)具有347个氨基酸残基，以单字母氨基酸密码表示在表7B中。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全长的。大豆核苷酸序列和它的编码的氨基酸序列与其他序列的同一性百分数表示在图8。
利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或使用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术或其他的PCR技术。
本发明也包括与SEQ ID NO31的大豆alpha亚基互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ ID NO32。
SEQ ID NO32AGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTCATTGTTTCTAGCTTCAGGACCTAACTTCTCGGCAACCCATCGTCTAGGATGCCTACAGAACATNCACATCTGATAATTTTTAGAATTTCCAGCGGCCATACGCTCCACAAACTCCAGTTCATCGTTCAAGTCGACTTTTAGCGACTCAAGTAACAACCGTCGGAAATGCCACACAGTGTAGTTGCCGGAGTTGAATTGAACGGCTTCGGCTGTGAGAGCGAGGGCGCGAGGGGAGCGTTCATCGGTGAGGTAAACGGCGCGAAAGTAATCCATAACTTCGGAAAACTCTTCAGTGTACTGGATCGGAACGACAGGGTTAGGGCCGTCGTTTTGAGGAACCGGAGTAACATCTGACCACTCCACTCTCTCCCTCAACGGCACGCGTTGCTGCACCTCTTCTCCTTCGCTAGACCCAGATTCCAT大豆FTB
表8A中表示了也称为FT5的1035核苷酸的公开核酸。
SEQ ID NO34编码的公开的FT5多肽(SEQ ID NO36)具有378个氨基酸残基，以单字母氨基酸密码表示在表8B。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全长。大豆核苷酸序列和它的编码氨基酸序列与其他序列的同一性百分数表示在图8。
利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或使用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术或其他这样的PCR技术。
本发明也包括与SEQ ID NO34的大豆beta亚基互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ ID NO35。
SEQ ID NO35GTGGTGGAGAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTCCACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGC玉米FTB公开的1235核苷酸的核酸(也称为FT6)表示在表9A。
SEQ ID NO37编码的公开的FT6多肽(SEQ ID NO39)具有414个氨基酸残基，以单字母氨基酸密码表示在表9B中。
由于克隆方案的特性，表示的序列不是全长的。大豆核苷酸序列和它的编码氨基酸序列与其他序列的同一性百分数表示在图8。
利用本文公开的序列作为杂交探针，可以从cDNA或基因组文库筛选和分离全长序列，或使用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术或其他PCR技术。
本发明也包括与SEQ ID NO37的玉米beta亚基互补的核酸序列。公开的互补序列表示为SEQ ID NO38。
SEQ ID NO38GGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCC本文公开的FTA和FTB核酸和氨基酸与FT蛋白质的家族的其他成员(GenBank ID N0sU63298，U83707，和U73203；WO00/14207；Cutler等人，Science 273(5279)1239-41，1996；Ziegelhoffer等人，Proc Natl Acad Sci USA 97(13)7633-8，2000)。这些和那些序列的同源性在Clustal W分析中如图表示在表10A-10D。在Clustal W排列中，黑轮廓的氨基酸残基表示了保守序列的区域(即，保存结构或功能特性需要的区域)，而非重点氨基酸残基更不保守，并且可以潜在地改变到更大的程度，但不改变蛋白质结构或功能。
表10A.FT Alpha亚基的ClustalW核酸分析1)BNA-12；FT2(SEQ ID NO6)2)At-FTA；FT1(SEQ ID NO1)3)PPI-大豆-FTA；FT4(SEQ ID NO31)4)桃-FTA(SEQ ID NO59)5)西红柿-FTA(SEQ ID NO60)6)水稻-FT-A(SEQ ID NO61)7)玉米-FT-A(SEQ ID NO62)8)大豆1-FT-A(SEQ ID NO63)9)大豆2-FT-A(SEQ ID NO64)10)氚-FT-A(SEQ ID NO65)



1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BNA-12 ----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------------------------------西红柿-FTA CTGCTATGTTTTGTAAGTTTTGGATATGGATGCATAGCTTATTGATACTTTTGGTGACTTAAAATACTCT水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A CAGGTGTGTTTGTTAATGTATTACACTT--G-CCATGGGAGCCTAAATGAGACCCATAATCACTTCCACT大豆1-FT-A AAAA------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------------------------------------氚-FT-A AAACTCCAACGAGCAGATTGTTACAGTAACGGCCACTGGTGGTGTGAAAATCCTGAAATCTGCTTCAGTC1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|A-12----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A ----------------------------------------------------------------------西红柿-FTA GGAAGGCAGGTAGCATGTGTATAATTCACTGTTACTTCCCATGTCGAGTTAGATGCTTGAAAATTTTAGT水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A AGAGTCGGAAGACCGT-GTCGAGCAGTTCACTCATATGGTCACTTAAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-大豆1-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A ----------------------------------------------------------------------氚-FACTTTGCCTTGTTTACAGTTGAGTCTGTTGTTGTGATCTGTACCTAATGCATGTACACAATCATCAAATT1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BNA-12 ----------------------------------------------------------------------At-FT-A ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTA----------------------------------------------------------------------桃-FT-A ----------------------------------------------------------------------西红柿-FTA AGGTGTTCTTTTATGAAGCACACATTAATGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA水稻-FT-A ----------------------------------------------------------------------玉米-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆1-FT-A ----------------------------------------------------------------------大豆2-FT-A ----------------------------------------------------------------------氚-FT-A ATTAGTTTTTGTACCAATGAGTATTCGATGAAAAAAAAAAAAAAAAA-----------------------
BnA-12 -At-FT-A -PPI-大豆-FTA-桃-FT-A -西红柿-FTA A水稻-FT-A -玉米-FT-A -大豆1-FT-A -大豆2-FT-A -氚-FT-A -表10B.FT Alpha亚基的ClustalW氨基酸分析1)BNA-12；FT2(SEQ ID NO7)2)At-FT-A；FT1(SEQ ID NO5)3)PPI-大豆-FTA；FT4(SEQ ID NO33)4)桃-FT-A(SEQ ID NO66)5)西红柿-FTA(SEQ ID NO67)6)水稻-FT-A(SEQ ID NO68)7)玉米-FT-A(SEQ ID NO69)8)大豆1-FT-A(SEQ ID NO70)9)大豆2-FT-A(SEQ ID NO71)10)氚-FT-A(SEQ ID NO72)

表10C.FT Beta亚基的ClustalW核酸分析1)PPI-BnFTb；FT3(SEQ ID NO8)2)Eral(SEQ ID NO73)3)Wiggum(SEQ ID NO74)4)PPI-大豆-FTB；FT5(SEQ ID NO34)5)DuP-大豆-FTB(SEQ ID NO75)6)PPI-玉米-FTB；FT6(SEQ ID NO37)7)DuP-玉米-FTB(SEQ ID NO76)8)豌豆-FT-B(SEQ ID NO77)9)西红柿(SEQ ID NO78)10)烟叶(SEQ ID NO79)
10203040506070....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ATGCCAGTAGTAACCCGCTTGATTCGTTTGAAGTGTGTAGGGCTCAGACTTGACCGGAGTGGACTCAATCPPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B ----------------------------------------------------------------------西红柿 ----------------------------------------------------GTAAACGAGCGTTGATTT烟叶---------------------------------------------------------------------- 150 160 170 180 190 200 210....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------



1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eralAGTTTCGGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAG---------------------------------Wiggum AGTTTTCGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAGAAGTTTCACTAATTTAACCTTAAAACCTGTTACPPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B AATGTAAAATGTAAACTAAAATATGAAATATGAAATACCAAAAAGATATTATTGGATGAAATTCACGTGG西红柿 AAACTTAGTTGCAATCCAGAAGTTAAAAGTGTCATTGGGTTCAAAAGAGTTGTGATCGTTTATGTACATA烟叶---TCTAGTTG---TTCAGAATCAGAGACTAATCTATTATTTTGAGGGATTGGATTCAAAAAAAAAAAAA 1690 1700 1710 1720 173017401750....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B TCTTATTCATACATTTGTTAAGAGCTTAAGGCTTAATGGTTAAGCCAATGATATAAATATTTATGCAGAA西红柿 GTAAATTCGTCTCTGGTTTAGTGAGGTCTGTAAACATCAATGTGAAATTGCGAGATATGCATGTAATAGT烟叶----------------------------------------------------------------------1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B AGCTGTTGCTTATCACCAACGGTAATATTAATAAGCAAACAAGTATTCTGTGAT----------------西红柿 GGCTAAGATTTACAAATCTGGATACCGGTTATTAGTGATCAGAAATTTCATTCAATTTCCCAAACGGTCA烟叶----------------------------------------------------------------------1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------
Wiggum ----------------------------------------------------------------------PPI-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-大豆-FTB----------------------------------------------------------------------PPI-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------DuP-玉米-FTB----------------------------------------------------------------------豌豆-FT-B ----------------------------------------------------------------------西红柿 CCTAAGTTTAGGATATTGCTTTAAAATATTATTTATTTTTCATTTAAGAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAA烟叶----------------------------------------------------------------------....|....
PPI-BnFTberal---------Wiggum ---------PPI-大豆-FTB---------DuP-大豆-FTB---------PPI-玉米-FTB---------DuP-玉米-FTB---------豌豆-FT-B ---------西红柿 AAAAAAAAA烟叶---------表10D.FTBeta亚基的ClustalW氨基酸分析1)PPI-BnFTb；FT3(SEQ ID NO9)2)Eral(SEQ ID NO80)3)Wiggum(SEQ ID NO81)4)PPI-大豆-FTB；FT5(SEQ ID NO36)5)DuP-大豆-FTB(SEQ ID NO82)6)PPI-玉米-FTB；FT6(SEQ ID NO39)7)DuP-玉米-FTB(SEQ ID NO83)8)豌豆-FT-B(SEQ ID NO84)9)西红柿(SEQ ID NO85)10)烟叶(SEQ ID NO86)
10203040506070....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ----------------------------------------------------------------------eral----------------------------------------------------------------------Wiggum MPVVTRLIRLKCVGLRLDRSGLNRRICHGGHGESTRRRVMEELSSLTVSQREQFLVENDVFGIYNYFDASPPI-大豆-FTB-------------------------------------------------------------------ATIDuP-大豆-FTB-------------------------------------------------------------------ATIPPI-玉米-FTB--------------------------------------ADPDLPRLTVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGADuP-玉米-FTB--------------------------------------ADPDLPRLTVTQVEQMKVEARVGDIYRSLFGA豌豆-FT-B -------------------------------------------------------------------MEA西红柿 ----------------------------------------MESRKVTKTLEDQWVVERRVREIYDYFYSI烟叶------------------------------------------GTSGTRTLEDQWMVERQVREIYNFFYSI

同时包括在本发明中的是SEQ ID NO87的法尼基转移酶Alpha同感序列和SEQ ID NO88的法尼基转移酶beta同感序列。为了产生同感序列，将本发明的法尼基转移酶alpha和法尼基转移酶beta序列利用程序BioEdit排列。在本发明的法尼基转移酶alpha(FTA)多肽序列之间的同源性如图表示在表10E中的ClustalW分析中。在本发明的法尼基转移酶beta(FTB)多肽序列之间的同源性如图表示在表10F的ClustalW的分析中。
表10E FT Alpha的Clustal W氨基酸分析..
BnA-12 --(SEQ ID NO7)At-FT-A AI(SEQ ID NO2)PPI-大豆-FTA --(SEQ ID NO33)同源性 --(SEQ ID NO87)
表10F FT Beta的ClustalW氨基酸分析
同时包括在本发明中的是SEQ ID NO89的法尼基转移酶alpha同感序列和SEQ ID NO90的法尼基转移酶beta同感序列。为了产生同感序列，利用程序BioEdit，排列本发明的法尼基转移酶alpha和法尼基转移酶beta序列。本发明的法尼基转移酶alpha(FTA)核酸序列之间的同源性如图表示在表1OG所示的ClustalW分析中。在本发明的法尼基转移酶beta(FTB)核酸序列之间的同源性如图表示在表1OH的Clustal分析中。
表10G FT Alpha的ClustalW核酸分析

1090 1100 1110 1120 1130 1140....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|BnA-12 ------------------------------------------------------------ 822At-FT-A AACTGCTTATTTATGAATCACATGTTCATGTTAACATGTATCAAACAATMCTTGATTTCT 1112PPI-大豆-FTA------------------------------------------------------------ 1041同源性 ------------------------------------------------------------ 9001150 1160 1170....|....|....|....|....|....|.
BnA-12 ------------------------------- 822 (SEQ ID NO6)At-FT-A CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1143 (SEQ ID NO1)PPI-大豆-FTA------------------------------- 1041 (SEQ ID NO31)同源性 ------------------------------- 900 (SEQ ID NO89)表10H FT Beta的ClustalW核酸分析 708090 100 110 120....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb ------------------------------------------------------------ 1eral------------------------------------------------------------ 1PPI-大豆-FTB---------------------------GCCACCATTCCTCGCAACGCCCAAAACCCTCAT 32PPI-玉米-FTBCAGGGTTGGCGACATCTACCGCTCCCTCTTCGGGGCCGCGCCCAACACGAAATCCATCAT 120同源性 ---------------------- 1

1330 1340 1350 1360 1370 1380....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|PPI-BnFTb CTAGATTT---------------------------------------------------- 1110eralTCGAGTTCTTCTTTAAAGCAGCATGACCCGTTGTTGCTAATGTATGGGAAACCCCAAACA 1249PPI-大豆-FTB------------------------------------------------------------ 1135PPI-玉米-FTB------------------------------------------------------------ 1245同源性 ------------------------------------------------------- 7971390 1400 1410 1420....|....|....|....|....|....|....|....|.
PPI-BnFTb ----------------------------------------- 1110 (SEQ ID NO8)eralTAAGAGTTTCCGTAGTGTTGTAACTTGTAAGATTTCAAAAG 1290 (SEQ ID NO73)PPI-大豆-FTB----------------------------------------- 1135 (SEQ ID NO34)PPI-玉米-FTB----------------------------------------- 1245 (SEQ ID NO37)同源性 ----------------------------------------- 797 (SEQ ID NO90)
实施例5转化的载体构建体FTA或FTB序列已经用于适于在植物中转化和在适当的调节序列的控制下的构建体。基因序列是在有意义方向过度表达或反义方向下调。这些序列的部分已经用于构建双链RNA抑制(dsRNAi)构建体。优选地不超过21nt的序列作为倒转重复克隆，被接头分开，当表达时导致靶基因的下调。双反义(DA)载体已经产生，其中反义序列的直接重复被间隔序列如GUS分开。启动子已经用于构成性表达，如35S CaMV启动子，MuA玉米启动子或者是特定的环境或细胞cues如诱导RD29A启动子的表达的ABA水平或干燥条件可诱导的。或者，可以利用组织或细胞器特异启动子如HIC或CUT1启动子。这样的构建体已经转化进拟南芥，苜蓿，玉米，大豆。其他种类可以如要求转化。正如对那些特别的种类适当的，各个待转化的种类可以利用特定的调节序列。已转化的植物已经选择，它们的表现型特性已经分析。评估了转基因植物的特性，如对干燥的耐性提高，生物量累积改变，产量，营养要求，如矿质或微营养，生物胁迫，如真菌，细菌，或其他这样的致病原感染或攻击，或任何其他这样的物理或生物化学特征。
实施例6植物转化通过花蘸方法，将拟南芥菜转基因植物进行农杆菌培养。在标准条件下生长野生型植物直到它们开花。将植物在农杆菌溶液中倒转2分钟。然后，包裹植物2天，维持湿度，然后解开继续生长，长成种子。大量收获成熟的种子。
通过在含有50ug/ml卡那霉素的MS平板上萌发和生长来选择已转化的T1植物。在2星期的生长后鉴定绿色的，卡那霉素抗性的秧苗，移植到土壤。包裹植物保证自花育种，独立地收获各个植物的T2种子。在T1植物的生长过程中，收获叶子样品。萃取DNA和进行Southern分析。
分析T2种子进行KanR分离。种植那些显示3∶1抗性表现型的那些系中的存活的T2植物，在种子生长过程中包裹，从每个系收获T3种子。再次将T3种子用于KanR分离分析，并且选择那些显示100％KanR表现型的系作为纯合系。利用T3种子进行进一步的分析。
利用农杆菌介导的子叶叶柄组织的转化生产转基因苜蓿植物。如下灭菌种子。用95％的乙醇湿润种子一个短的时期15秒。加入约30毫升的灭菌溶液(70％Javex，100ul Tween 20)，保留约15分钟。除去溶液I，用30ml的溶液II(0.25％氯化汞，100ul Tween20)，温育约10分钟。用至少500ml双蒸馏无菌水漂洗种子，储存在灭菌的盘中。在用1％蔗糖和0.7琼脂补充的1/2 MS培养基，pH5.8的平板上萌发种子。收获完全扩展的子叶，放置于培养基I上(Murashige minimal organics(MMO)，3％蔗糖，4.5mg/L苄基腺嘌呤(BA)，0.7％phytoagar，pH5.8)。在AB基本培养基中生长含有需要的核酸构建体的农杆菌培养物2天。蘸子叶外植体，只使叶柄的切出部分接触农杆菌溶液。然后，在培养基I中保埋外植体，在24℃维持5天，其中光暗循环是16，8小时。将外植体转移到培养基II(培养基I，300mg/Ltimentin)中，保留7天，然后转移到培养基III(培养基II，20mg/L卡那霉素)。将这时已经发育的根或苗组织解离。在14-21天后转移外植体到新鲜的培养基III的平板中。当再生的苗组织发育时，将再生的组织转移到培养基IV(MMO，3％蔗糖，1.0％植物琼脂，300mg/L timentin，20mg/L卡那霉素)。一旦健康的苗组织发育，在10X IBA中蘸从任何愈伤组织分离的苗组织，转移到培养基V(Murashige and Skooge(MS)，3％蔗糖，0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)，0.7％琼脂，300mg/L timentin，20mg/L卡那霉素)，长根。将健康的小植体转移到土壤。
利用本领域已知的农杆菌方法生产转基因大豆，玉米和棉花。或者，可以利用颗粒或非颗粒生物炸弹转化方法。在美国专利申请20010026941中给出了非颗粒生物转化例子。繁殖存活的植物，产生纯合系。测试植物中干旱耐性，生理和生物化学表现型。
下面的表格鉴定了已经转化的构建体和种类。
表II
适于植物转化的载体构建体的非限制例子是SEQ ID NO4，40-58中给出的。
SEQ ID NO4gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaact
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SEQ ID NO40gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgatatcttgctgcgttcggatattttcgtggagttcccgccacagacccggatgatccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggcctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcagcccacagatggttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagc
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SEQ ID NO46GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGGTGAAACTACTTCATGGGTAAATGATCCTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGAYGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatt
tatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(下面划线的是大豆FTA反义部分；黑体MuA启动子；斜体大豆FTA有意义部分；较低的情况NOS终止子序列)SEQ ID NO47ggagccatagatgcaattcaatcaaactgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatattgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccccatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgaccagacacgcgtagagagcaaaatgaactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattggaaagAGGAAGTCTGCTCTTGCGCCAAATCCAATAGTTGGTTCTAATTGGATCAACTTGTTTTAGGATAGAACAAATATTTCGTGCTATATTTAAATTTTGTTGTTCCCCTTTCTCATCATCATCTAAATCTTGTTTATCCATATCTGCGGTCTTTAAGGCGTCAATGGCATCTCTAATGTCTTCATTTGGTTGATAACCAAAGCATATAAGATCTAAAATAGTGCTAAGAGCAAACACGTAGTTGCTCTTAGTTCTCAAAATCTTTAAGCATACTGAAGAAACTTGAGGATCATTTACCCATGAAGTAGTTTCACCTTTATAAAGTCCTCGTAGATATCTCCACGAGCTTTCATTTTCAGGGTAGGCTATAATGGCTTCGATGGTGTAAAGCACTTCAGACTCTCTCATAGCTTTTAGGCCCCCCAAGAAAGGAGACCTTGTTATGACAAAATATCTCTGATTCCAAGCAGAATTGTTAAAAATGTCTTCTTTAAGTAGTTCTGTGCAATAATTAAGTTCATCTTCCCATCCTCCTAGTGTTTGAAGAGCCCACTGTCTATGAGACCATGCATGATAATGTTTGGCATCAACGGACAAGTATCTTTTTGGTGAACTCGAGCTTAAAGGTGAAACTACTTCATGGGGTAAATGTCAAGTTTCTTCAGTATGCTTAAAGATTTTGAGAACTAAGAGCAACTACGTGTTTGCTCTTAGCACTATTTTAGATCTTATATGCTTTGGTTATCAACCAAATGAAGACATTAGAGATGCCATTGACGCCTTAAAGACCGCAGATATGGATAAACAAGATTTAGATGATGATGAGAAAGGGGAACAACAAAATTTAAATATAGCACGAAATATTTGTTCTATCCTAAAACAAGTTGATCCAATTAGAACCAACTATTGGATTTGGCGCAAGAGCAGACTTCCTgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(黑体的下面的部分RD29A启动子；下面划线的，上面的部分反义GmFTA；上面的部分有意义的GmFTA；下面的部分NOS终止子)SEQ ID NO48gtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcaccggatctggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgggatctctgcggaacaggcggtcgaaggtgccgatatcattacgacagcaacggccgacaagcacaacgccacgatcctgagcgacaatatgatcgggcccggcgtccacatcaacggcgtcggcggcgactgcccaggcaagaccgagatgcaccgcgata
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TATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGCGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCCAGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATGCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACAGATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATTTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATGCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGCACCCAGTGAATCCAGTTCATCTGATTTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面部分MuA启动子；下面划线反义GmFTB；黑体有意义GmFTB；下面部分NOS终止子)SEQ ID NO56GGAGCCATAGATGCAATTCAATCAAACTGAAATTTCTGCAAGAATCTCAAACACGGAGATCTCAAAGTTTGAAAGAAAATTTATTTCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAAATTTAGGTAGAACTTATATACATTATATTGTAATTTTTTGTAACAAAATGTTTTTATTATTATTATAGAATTTTACTGGTTAAATTAAAAATGAATAGAAAAGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGGTAAACATTTTCTTCTATTTTTTCATATTTTCAGGATAAATTATTGTAAAAGTTTACAAGATTTCCATTTGACTAGTGTAAATGAGGAATATTCTCTAGTAAGATCATTATTTCATCTACTTCTTTTATCTTCTACCAGTAGAGGAATAAACAATATTTAGCTCCTTTGTAAATACAAATTAATTTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTAATTTTACGTATAAAATAAATGATCATACCTATTAGAACGATTAAGGAGAAATACAATTCGAATGAGAAGGATGTGCCGTTTGTTATAATAAACAGCCACACGACGTAAACGTAAAATGACCACATGATGGGCCAATAGACATGGACCGACTACTAATAATAGTAAGTTACATTTTAGGATGGAATAAATATCATAGCGACATCAGTTTTGAAAGAAAAGGGAAAAAAAGAAAAAATAAATAAAAGATATACTACCGACATGAGTTCCAAAAAGCAAAAAAAAAGATGAAGCCGACACAGACACGCGTAGAGAGCAAAATGACTTTGACGTCACACCACGAAAACAGACGGTTCATACGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTCTCTCTATAAACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTTTTAGTCACAAATATGCAAAAGTAGAAACAATCATCAGGAATAAAGGGTTTGATTACTTCTATTGGAAAGGTGGTGGAGAATCTGGGTGCTTTGACCAACTATACTGGCACAATGAGAGTCCACTTAAACAGTAACATGTGTGATAATGATCTCTACGTTTACCCGGTTTGTCTCTCAGTCCACCCTCTTGCTCCTGTGCACATAAGAGAATATATTGCTGTAAAGCAATACTGTGAAAAAGTGGTTCTTGTGCTCTCCACTCATTAATAAATTTATAGGCAATATTTTTAAAATCAGATGAACTGGATTCACTGGTGCCTTCATGCTCACCACGGCATGTTGCATGACTAGAGGTTCCATCCAAACTTTCTTTTGCTTCAGATACATAAGATACCGCAAAAATCTGTGATGTCTCTTCCATCTGTTTGTTGATAATAGAAGATAATCTTTGCAATAGAGCAACAGCACCTCCCTGCCAAAAGGAATAGCATCCATCCACCAGTTTATTTGTTCTCCCCTGGAATCCACATTCCTTACCTTGTCGGAATACCACCCAGTCAACTAATCGAGGCAGATCCAAGTGATTAACCTCACCAATCAGAATCATTGTAGCTAATCCACAAAAGGTGTACCCACCATGAGCCTCAGAACCAGGCTCACCAGCAATGCCACCCTCATATGTTTGACAGCTTATAATGTAGTCTCCAACATTCTGGATCAGCTCATCATCCAAAATGTTCAAAACACTTGCAACAGAAATGGCAGTGTAGCAAGCTCGAACATCAATTTCACCTTCATCATGCATCCTGAATCCACCATTTGGTTGCTTCATCCGCCGCAGAAACCCATACAGTTTATCTCTATTAATTGATGCCAGGGATTTCTCACCACCCAAAGTAATAAGTGAATTAACAGCAGCATAAGTTGTGGCAATATGAGGCATCTGGCCTGGTCCCCCGGCATATCCACCATTCGGATCCTGGCAACGGTTAAGAAAATCGATAGCGTTATCTTCGAGTTCATCATCGACGGATTCTCCCAACAAAGCAATGGAGTGGAAGATCCAGTAGCAGAGCCAGGGTCGATTAGCGTCCAAAACGGAAAATGCGGAACTGAGATGGCGAAGGCCTTTGGAGACATACTGCATGTGATTATCGCGTTGAAGCTCCAACATGAGGGTTTGGGCGTTGCGAGGAATGGTGGCGGTGAGGTTAATCACTTGGATCTGCCTCGATTAGTTGACTGGGTGGTATTCCGACAAGGTAAGGAATGTGGATTCCAGGGGAGAACAAATAAACTGGTGGATGGATCCTATTCCTTTTGGCAGGGAGGTGCTGTTGCTCTATTGCAAAGATTATCTTCTATTATCAACAAACACATGGAAGAGACATCACAGATTTTTGCGGTATCTTATGTATCTGAAGCAAAAGAAAGTTTGGATGGAACCTCTAGTCATCCAACATGCCGTGGTGAGCATGAAGGCACCAGTGAATCCAGTTCATCTTGATTTAAAAATATTGCCTATAAATTTATTAATGAGTGGAGAGCACAAGAACCACTTTTTCACAGTATTGCTTTACAGCAATATATTCTCTTATGTGCACAGGAGCAAGAGGGTGGACTGAGAGACAAACCGGGTAAACGTAGAGATCATTATCACACATGTTACTGTTTAAGTGGACTCTCATTGTGCCAGTATAGTTGGTCAAAGCACCCAGATTCTCCACCACgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面的部分RD29A启动子；下面划线反义GmFTB；黑体部分有意义GmFTB；下面部分NOS终止子)
SEQ ID NO57GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGYYTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGHGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAHAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCgagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattc(上面部分MuA启动子；下面划线反义玉米FTB；下面部分NOS终止子)SEQ ID NO58GAATTCAAATTTTTCGCCAGTTCTAAATATCCGGAAACCTCTTGGGATGCCATTGCCCATCTATCTGTAATTTATTGACGAAATAGACGAAAAGGAAGGTGGCTCCTATAAAGCACATCATTGCGATAACAGAAAGGCCATTGTTGAAGATACCTCTGCTGACATTGGTCCCCAAGTGGAAGCACCACCCCATGAGGAGCACCGTGGAGTAAGAAGACGTTCGAGCCACGTCGAAAAAGCAAGTGTGTTGATGTAGTATCTCCATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCAACTATCCATCGCAAGACCATTGCTCTATATAAGAAAGTTAATATCATTTCGAGTGGCCACGCTGAGCTCGGATGGATTGGCTCCAGCAAATTAGAGTACGGTCCAAGCACATGCTGAGGTAATGGGCACGAACCAGTATCAGTCATGGCACTGTACTGGCTAACTGCGAGGCCACTGAGGCAGTAGCATGAATGATAGTGATCTCTGTTCTTTCCAGGCTTATCCCTCAAGCCTCCCTCTAGTACCTGAGAACAAAGTAGGATGTATTGTTGCAGGGCAATGTTATGGAAGAGTGGGCCAATTTGGTTGCTCTGTTGTATAAAATCAAATCCAAACTTCGCATAGTCCACAGCAGAGGAAGACTTATTCGCGGTGCACCCATATGAACTGGTGCTGCAGGCATCCTCTCCTGATGGCCTTTTGCAGGAATACGAGGACCTCAATTGCTTATCAACAATCGTAATTAACTTTTGTGTGAAAGCAATGGCAGCTCCCTGCCAAAAGGAGTAGCAACCATCAACCAATTTATTAGTTCGTCCTTGAAATCCGCATTCCACTCCTTGACGAAAAGCCACCCAGCCAATCAAACTAGGCAAGTCAACTTTCTCTGCCTCATTAAGCAGGATCAAAGCAGCCAATCCACAGAATGTATACCCACCATGTGCTTCAGCATAAGGCTCCCCAGCAATACCACCTTCATAAGTTTGACATCTTGCTATGTAGTCGCCTACACCTTTTGCCAGTTTAAAATCAAGAATATTCACAAGGCTGGCAACCGATATAGCGGTGTAGGAAGCACGGACATCAATTTCGCCACCATCATGCATTCTGAAAGCACCTGATACATCTTTCATCTGCAGCATAAAATTGTACAGGTTGCCCCTATTGATTGATGACAATGCTCTTTCGCTCCCTATTGTCACAAGTGTATTTACAGCAGCATAAGTCGTAGCTAGGTGAGGCAACTGTCCAGGTCCACCACTATATCCACCATCTTTATCCTGACATCGAGCTAAGAAGTCTATGATATCATTCTCAAGATCATCATCAAGTGCTTCATCCAGCAAAGCAAGTGGATGAACCATCCAGTAGCATAGCCAAGGGCGATTGGCATCTAGAACATGAAAGGCTGGTCCCATATGCCTCAGCCCAGGCGTCAGATACTCGATATGCTGATCACGCCACAGCTCTAGCATGATGGATTTCGTGTTGGGCGCGGCCCCGAAGAGGGAGCGGTAGATGTCGCCAACCCTGGCCTCCACCTTCATCTGCTCCACCTGCGTCACCGTGAGCCTCGGTAGGTCGGGATCCGCCggatccGCTGGGGAGCCTTATGCTGAAGCACATGGTGGGTATACATTCTGTGGATTGGCTGCTTTGATCCTGCTTAATGAGGCAGAGAAAGTTGACTTGCCTAGTTTGATTGGCTGGGTGGCTTTTCGTCAAGGAGTGGAATGCGGATTTCAAGGACGAACTAATAAATTGGTTGATGGTTGCTACTCCTTTTGGCAGGGAGCTGCCATTGCTTTCACACAAAACTTAATTACGATTGTTGATAAGCAATTGAGGTCCTCGTATTCCTGCAAAAGGCCATCAGGAGAGGATGCCTGCAGCACCAGTTCATATGGGTGCACCGCGAATAAGTCTTCCTCTGCTGTGGACTATGCGAAGTTTGGATTTGATTTTATACAACAGAGCAACCAAATTGGCCCACTCTTCCATAAC
ATTGCCCTGCAACAATACATCCTACTTTGTTCTCAGGTACTAGAGGGAFGGCTGAGGGATAAGCCTGGAAAGAACAGAGATCACTATCATTCATGCTAGTGCCTCAGTGGCCTCGCAGTTAGCCAGTACAGTGCCATGACTGATACTGGTTCGTGCCCATTACCTCAGCATGTGCTTGGACCGTACTCTAATTTGCTGGAGCCAATCCATCCaagcttgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcggaagctt(上面部分MuA启动子；下面划线反义玉米-FTB；黑体有意义玉米FTB；下面部分NOS终止子)实施例7推断的转基因植物的PCR分析为了证实推断的转基因植物携带了需要的PCR的基因，进行了分析。分离基因组DNA，根据本领域已知的标准方案和条件进行PCR。在25ul的体积中进行典型的反应，利用的引物对是依据特定的构建体中的基因和启动子的结合的(表12)。
利用下面的表中详述的引物的结合筛选推断的转基因苜蓿。显示PCR分析结果的代表性凝胶表示在图15，代表了携带pRD29A抗FTA构建体的转基因植物。以类似的方式证实，对各个种类证实转化体，并且进行构建体的转化。
表12.
实施例8Southern分析抗FTA转基因拟南芥的转基因Southern析。编号表示了系的号。用HindIII(T-DNA质粒的独特的位点)消化5微克的T1植物的基因组DNA，并且在0.8％的凝胶中分离。将NPTII编码区用作放射标记的探针。图2显示了来自Southern分析的典型的结果，表明了存在转基因。
实施例9反义FTA系的Northern印迹从5个35S-抗FTA拟南芥系(T3植物)的发育的叶子组织分离RNA。用P32标记，单链有意义FTA转录物(图3组A)首先探测印迹，检测反义转录物，然后做条带，和用单链FTA的反义转录物再探测(图3组B)，检测有意义转录物。图3组C显示了溴化乙锭染色的凝胶，用于印迹。在各个条带中加载约5ug的总RNA。图3表示了转基因反义转录物的积累，和转基因植物中有意义的转录物的减少。
实施例10具有抗FTα抗体的Western印迹反义FTA系利用实施例19的方法产生的抗体分析Western印迹上来自转基因植物的蛋白质萃取物。图4的道1是分子量标准，道2纯化FTA蛋白质，道3-10是来自转基因拟南芥的ERA1突变，野生型，和4系的蛋白质萃取物。图4说明了转基因系中的可检测FTA蛋白质的减少。
实施例11转基因秧苗的ABA敏感性在没有ABA(A)，0.3uM(B)，0.5uM(C)或1.0uM ABA(D)的基本培养基(1/2MS)上铺35S-反义-FTA的两个反义，干旱耐受系的野生型Columbia，era1-2和T3纯合种子的种子。将平板在4℃，在暗中冷却3天，在22℃温育11天，连续光照24小时。在萌发中抑制转基因系比野生型更甚。结果显示在图5。
在没有(A)或有(B)1uM ABA的基本培养基中生长野生型Columbia，era1-2和两个干旱耐受35S反义FTA系(9.9&21.2)的12天大的秧苗表现型。图6显示了与野生型植物相关的era1和转基因系的根生长和发育降低。35S反义FTA系显示了根生长降低，在对ABA的应答中与era1突变体相似。
评估了携带35S-反义-FTA构建体的转基因苜蓿系的ABA敏感性。在约10uM时，观察到了效果，显示在子叶和第一个叶时期秧苗的发育和活方降低，从而表明对ABA的敏感性提高。
在工程化的所有转基因植物中评估ABA敏感性，通过上面的方法，FTA或FTB表达或活性降低或提高。利用的ABA浓度根据种类的不同，在检测下是不同的。
实施例12干旱实验为了评估水胁迫或干旱条件下对植物的应答，可以将植物暴露在各种情况下。例如，可以从土壤或培养基中除去植物，放置于纸巾上一个时期，如4小时，然后，回到平板上继续生长和发育。可以评估生存和活力。
或者，可以停水一个时期，如6天来更紧密地装备田间状态，以这样的方式来施加水胁迫。在重复的水胁迫实验中，每4英寸一个点种植5个植株。用同等量的均一的预混合和湿润的土壤填充所有的点。生长条件是在22℃和70％的相对湿度下，16小时光照(150-200umol/m2/s)。在第一朵花开的那天，通过在重量基础上平衡每个点的土壤水含量开始进行干旱处理，然后终止供水。在水胁迫处理结束时，通常收获植物的生物量数据，或再灌水完成生命循环，确定生物量和产量数据。已经在胁迫和光条件下评估生理参数，例如，秧苗和根生物量积累，土壤水含量，水损失，或作为参数如生物量，种子产量，和叶子数目和叶子面积的功能。图7显示了8天水胁迫处理后野生型Columbia(A)和4个35S-反义FTA转基因拟南芥系(B，C，D，E)的照片。对照植物明显地受胁迫，不太健康。已经对含有SEQ ID NO4，40-58所述的载体的转基因系进行该实验。
在所有工程化的转基因植物中评估干旱或水胁迫耐受，使通过如上所述的方法降低或提高FTA或FTB的表达或活性。
实施例13在干旱胁迫过程中，在拟南芥pRD29A-DA-FTA系中分析水损失每4英寸5个植株和每个系6个点种植植株。当植物生长到第一个开花时期，如实施例12所述开始干旱处理。每天称重这些点，在7天干旱处理结束时，收获所有植物，称重秧苗的鲜重和干重。图10显示了，在水胁迫处理4天时，每个秧苗干重基础上水的损失。在这一实验中检测的31个系中，25个显示了与Columbia野生型比较，水损失较低，其中22个在统计学上是明显的。如实施例6所述，评估了所有系的ABA敏感性，ABA敏感性(ABAS)的提高也与干旱处理过程中水损失下降有关。确定具有野生型ABA敏感性(ABAWT)的那些系是与野生型相比不表现出水损失降低的相同的6个系(系2，36，69，29，24，21)。
利用两个ABAS系，一个ABAWT和Columbia对照重复上面的实验。在水胁迫处理2，4和6天后收获植物，确定秧苗的干重。当与ABAWT或Columbia对照比较时，ABAS转基因植物的每个秧苗的干重中具有更大的叶子和秧苗的生物量，更大的土壤水含量和更低的水损失。结果在所有三个收获时期是一致的。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植物得到这一实施例显示的数据。在携带这一构建体的变体，如35S-DA-FTA，pRD29A-反义FTA或35S-反义-FTA的系同时进行了该实验，观察到了相同的水胁迫耐受趋势。在所有工程化的转基因植物中评估土壤水损失，通过所示的方法，FTA或FTB的表达或活性降低或提高。
实施例14在干旱胁迫过程中，拟南芥pRD29A-DA-FTA系中秧苗鲜重的分析每4英寸点5个植物和每系8个点种植植物。当植物生长到第一个开花时期时，如实施例12所述开始干旱处理。在6天干旱处理后再浇水植物，允许恢复后再保留6天。收获植物，确定秧苗鲜重。图11显示了秧苗鲜重。这一实验包括了25个转基因系，其中的2个是ABAWT(系2和69)和Columbia野生型对照。所有23个ABAS转基因系具有统计上更大的秧苗鲜重，平均重了44％。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植物得到这一实施例显示的数据。对携带这一构建体的变体如35S-DA-FTA，pRD29A-反义-FTA或35S-反义-FTA的系已经进行了这一实验，观察到了相同的趋势。
实施例15在干旱胁迫过程中，和在光条件下，拟南芥pRD29A-DA-FTA系中种子产量的分析每4英寸的点种植1个植株。当植物生长到第一个开花时期时，如实施例12所述开始干旱处理。在6天干旱处理后灌溉植株，允许生长到成熟。照光组不进行干旱处理。
产量分析表明，虽然干旱处理导致了产量降低，但对转基因植物的影响不如对照严重，维持了如实验14中前面所示的生产力的优势。比较ABAS转基因植物与对照植物产生的产量的比较，显示在照光条件下得到了15％更大的产量，和在干旱条件下20％的提高。在干旱处理组，9个转基因系中有8个显示了比对照更大的产量。在光照条件下作为它的性能的百分数在干旱处理下得到的各个系的产量的表达表明9个ABAS系中的8个超过了对照系，而9个中的4个超过了ABAWT对照。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植物得到了这一实施例中所示的数据。对携带这一构建体的变体的系如35S-DA-FTA，pRD29A-反义-FTA或35S-反义-FTA，已经进行了该实验，观察到了相同的趋势。
实施例16在最佳生长条件下，拟南芥菜pRD29A-DA-FTA系中蔬菜生长的分析每3英寸和每个系8个点生长1个植株。在3个时期收获植株，确定鲜重。蔬菜时期确定为14天大的秧苗，抽苔时期为第一朵花出现(19-21天秧苗)，中间的开花时期为第一朵花后的6天。在上面的各个时期的每一个中，测试的10个ABAS中的转基因系的7，8和10在统计上显示了比对照植物更大的秧苗鲜重生物量(图13)。一个Columbia系和ABAWT(系2)系用作对照组。另外，转基因系有统计上明显的玫瑰花形骨针叶子的数目提高的趋势。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植物，得到了这一实施例中所示的数据。对携带这一构建体的变体如35S-DA-FTA，pRD29A-反义FTA或35S-反义-FTA的系已经进行了这一实验，同时观察到了相同的趋势。
实施例17在干旱处理和biotic胁迫条件下对拟南芥pRD29A-DA-FTA株系进行分析将植株以每个4英寸钵种植1株的方式种植8个钵。当植株生长到第一个花期时开始进行干旱处理，如实施例12所示。在7天干旱处理之后再给植株浇水，使之生长到成熟。对一个哥伦比亚对照系(col)和一个转基因品系进行评价。对种子产量进行分析显示低于正常产量，约为预期的最大产量的12％。对所使用的土壤含有的真菌污染物进行测定，所述的真菌污染物导致了产量降低，因为通过在使用之前将土壤灭菌可以去除生命胁迫。与具有转基因株系22％产量的对照相比，转基因株系的生命胁迫较不严重。但是在干旱处理的植株组，生命胁迫降低，转基因植株比对照组几乎降低了4.5倍(附图14)。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植株获得了本实施例中显示的数据。在携带所述构建体的变化形式如35S-DA-FTA，pRD29A-反义-FTA或35S-反义-FTA的株系中进行该试验，观察到类似的动向。
实施例18对拟南芥pRD29A-DA-FTA株系的气孔数进行分析对两个转基因品系和野生型哥伦比亚对照的叶子的上表面和下表面的气孔数进行评价。在15个叶子的上表面和下表面用指甲擦出印迹，植株处于早开花期。没有观察到气孔密度的不同。
利用携带pRD29A-DA-FTA构建体的转基因植株获得了本实施例中显示的数据。在携带所述构建体的变化形式如35S-DA-FTA，pRD29A-反义-FTA或35S-反义-FTA的株系中进行该试验，观察到类似的动向。
实施例19抗FT-A和FT-B的多克隆抗体的生产将分离的拟南芥FT序列克隆到来源于pET11D的大肠杆菌表达载体。为了产生带组氨酸标记的FT-B构建体，用BamHI消化拟南芥FT-B克隆和pET载体，将其连接在一起。进行限制性消化以验证插入物的定向。为了产生FT-A构建体，用BamHI和EcoRI消化拟南芥FT-A克隆和pET载体，将其连接在一起。获得的质粒指导在其AtFTA和AtFTB的N-末端含有6个连续的组氨酸残基的融合蛋白的表达。在细菌宿主BL21(DE3)中表达所述的融合蛋白，利用Hi-Trap络合色相方法，根据制造商的描述(Parmacia)进行纯化。将含有组氨酸-FT融合蛋白的细菌粗提取物的可溶性组分上样到Hi-Trap柱(1.5cm×2.0cm)，用溶于柱缓冲液(25mM This-HCL，pH 7.5，1mM DTT)的200毫升0.0-0.3M线性梯度的咪唑洗脱所述的蛋白。将含有纯化的组氨酸-FT蛋白质的组分合并，脱盐和用Centripep-30浓缩器(Amicon)将其浓缩。将所有的纯化步骤在4℃进行。为了产生抗体，进一步通过SDS/PAGE分离纯化的融合蛋白，切下对应于融合蛋白的考马斯亮蓝染色谱带。通过电洗脱从凝胶切片上洗脱蛋白质，然后在Ribi佐剂(Ribi Immunochem)中乳化到最终体积1毫升。1天后将组氨酸-AtFTA或组氨酸-AtFTB(250微克)注射到3千克的新西兰兔，在21天和35天以200微克的蛋白质加强注射。在最后注射之后一星期获得了高效价的抗血清。这些抗体用于实施例10，附图4的Western印迹分析。
实施例20相关基因的筛选将本发明的转基因植株用于识别与本发明的基因相互作用的基因。可以将本发明的转基因植物用于筛选相关的基因，例如基因表达的阻遏子，加强子或调节子或可以通过遗传筛选方法识别的活性。例如，利用本发明的转基因植物作为遗传背景制备突变文库。可以利用各种方法，并且是本领域技术人员已知的。例如，可以将化学诱变剂如EMS用于诱导基因组的点突变，种子的快速中子衍射导致缺失突变，由于插入作用可以产生使基因失活的T-DNA文库，或者将活化标签的方法用于产生具有上调基因的文库。分析这些类型的文库可以识别挽救或调节在本发明的转基因植物中观察到的表现型的基因。
权利要求
1.一种制备转基因植物的方法，其中与野生型织物相比，所述的植物对胁迫的忍受性增强或老化延迟，该方法包括将抑制法尼基转移酶α表达或活性的核酸导入到植物细胞以产生转基因细胞，从所述的转基因细胞再生转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸包括编码法尼基转移酶α的反义核酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的反义核酸包括与SEQ ID NO1，6或31互补的20或以上连续的核酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述的反义核酸包括SEQ ID NO2，3，29或32。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸选自于由SEQ ID NO4，40-46或47组成的组。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述的反义核酸可操作的连接到一个启动子上。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的启动子选自于由组成性启动子，ABA诱导性启动子，组织特异性启动子或守卫细胞特异性启动子组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中核酸是法尼基化或geranylgeranyl化的抑制剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸序列编码法尼基转移酶α。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的核酸报哦看SEQID NO1，6或31。
11.一种制备转基因植物的方法，其中所述的植物对胁迫的忍受性增强或老化延迟，该方法包括将抑制法尼基转移酶α表达或活性的核酸导入到植物细胞以产生转基因细胞，其中所述的核酸是法尼基转移酶α的反义核酸；从所述的转基因细胞再生转基因植物。
12.由权利要求1或11之一所述的方法制备的转基因植物。
13.权利要求12所述的转基因植物产生的种子，其中所述的种子产生对胁迫的忍受性增强或老化延迟的植物。
14.一种分离的多肽，包括具有选自于下列组SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列成熟形式。
15.一种分离的多肽，包括选自于下列组SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列。
16.一种分离的多肽，包括与选自于下列组SEQ ID NO5，7或9的氨基酸序列至少85％等同的氨基酸序列。
17.一种分离的多肽，包括与选自于下列组SEQ ID NO5，7或9的氨基酸序列至少99％等同的氨基酸序列。
18.根据权利要求15所述的多肽，其中所述的多肽具有法尼基转移酶活性。
19.一种分离的多肽，其中所述的多肽包括一个氨基酸序列，该序列在选自于下列组SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列中包括一个或多个保守的替代。
20.根据权利要求14所述的多肽，其中所述的多肽是天然存在的。
21.一种分离的核酸分子，包括选自于下列组SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的核酸序列。
22.根据权利要求21的核酸分子，其中核酸分子是天然存在的。
23.一种分离的核酸分子，编码具有选自于下列组SEQ ID NO5，7，9，33，36或39的氨基酸序列的多肽的成熟形式。
24.一种分离的核酸分子，其中所述的核酸分子在严格条件下与选自于下列组SEQ ID NO1，6，8，31，34或37的核苷酸序列杂交。
25.一种分离的核酸分子，包括与选自于下列组SEQ IDNO1，6或8的氨基酸序列至少90％等同的核苷酸序列。
26.一种分离的核酸分子，包括与选自于下列组SEQ IDNO31，34或37的核苷酸序列至少99％等同的核苷酸序列。
27.一种分离的核酸分子，包括选自于下列组SEQ ID NO2，3，29，30，32，35或38的核酸序列。
28.一种分离的核酸分子，包括与选自于下列组SEQ IDNO2，3，29或30的核苷酸序列至少90％等同的核苷酸序列。
29.一种分离的核酸分子，包括与选自于下列组SEQ IDNO32，35或38的核苷酸序列至少99％等同的核苷酸序列。
30.一种分离的核酸分子，包括选自于下列组SEQ ID NO4，40-58的核酸序列。
31.一种载体，包括权利要求21所述的核酸。
32.根据权利要求31所述的载体，进一步包括可操作连接到所述的核酸分子的启动子。
33.包括权利要求32所述的载体的细胞。
34.包括权利要求27所述的核酸分子的载体。
35.根据权利要求34所述的载体，进一步包括可操作连接到所述的核酸分子的启动子。
36.包括权利要求34所述的载体的细胞。
37.免疫特异性地结合到权利要求14所述的多肽的抗体。
38.根据权利要求37所述的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
39.根据权利要求37所述的抗体，其中抗体是多克隆抗体。
40.识别结合到权利要求14所述的多肽的试剂的方法，该方法包括(a)将所述的多肽导入到所属的试剂；和(b)决定所述的试剂是否与所述的多肽结合。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该试剂是法尼基转移酶抑制剂。
42.一种识别法尼基转移酶调节剂的方法，该方法包括(a)提供表达权利要求14所述的多肽的细胞；(b)将细胞与候选物质接触；(c)测定该物质是否改变了法尼基转移酶活性；如果在该物质存在下观察到改变，则当在没有该物质时将细胞与一种组合物接触时，没有观察到改变，则将该物质识别为法尼基转移酶调节剂。
43.用于识别法尼基转移酶的相互作用的基因的方法，该方法包括(a)提供其路由器12所述的转基因植物；(b)从(a)制造被诱变的植物的文库；(c)测定是否诱变的植物含有改变的表现型；因此当诱变的植物已经改变了法尼基转移酶的相互作用基因的功能，导致表现型从(a)的转基因植物改变为野生型非转基因植物的表现型。
44.一种植物，其中在编码法尼基转移酶的基因中已经导入了一个突变，导致与野生型植物相比所述的植物显示法尼基转移酶活性降低，对胁迫的忍受性增强。
45.一种制备转基因植物的方法，其中与野生型植物相比，所述的植物对胁迫的忍受性增强或老化延迟，包括将含有SEQID NO30，35，38，48-57或58的核酸序列的一个核酸导入到植物细胞中以产生转基因细胞；从所述的转基因细胞再生为转基因植物。
46.一种制备转基因植物的方法，其中所述的植物与野生型植物相比，对abscisic a酸的敏感性增强，包括将含有SEQ ID NO30，35，38，48-57或58的核酸序列的一个核酸导入到植物细胞中以产生转基因细胞；从所述的转基因细胞再生为转基因植物。
全文摘要
本发明提供了FT聚核苷酸编码的新分离的FT聚核苷酸和多肽。同时提供了与FT多肽或FT多肽，聚核苷酸或抗体的任何衍生物，变异体，突变体或片段免疫特异结合的抗体。本发明另外提供了构建FT聚核苷酸和多肽水平改变的转基因植物。
文档编号C12N9/10GK1535315SQ02814781
公开日2004年10月6日 申请日期2002年5月31日 优先权日2001年5月31日
发明者黄亚帆, 玛丽茜·查利福克斯, 王洋, 蒙妮卡·D·库泽马, 安吉拉·P·吉尔伊, D 库泽马, P 吉尔伊, 查利福克斯 申请人:波夫曼斯种植公司