具有增强的对真菌疾病的抗性的遗传修饰过的植物及其生产方法

专利名称：具有增强的对真菌疾病的抗性的遗传修饰过的植物及其生产方法
本申请享有并且要求被以全文形式收作本文参考的申请日为2001年11月20日的美国临时申请流水号60/331,749的优先权。
1.本发明领域本发明涉及遗传修饰过的植物，更具体地讲，涉及遗传修饰过的马铃薯植物。在用包括具有两个或两个以上壳多糖-结合结构域的壳多糖酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因，特别是具有两个壳多糖结合结构域的芸薹属壳多糖酶基因和三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶基因的载体转化所述植物之后，所述遗传修饰过的植物具有增强的对病原体的抗性。本发明还涉及能转化马铃薯植物，以便赋予所述马铃薯植物对病原体的免疫力的重组载体。所述载体包括具有两个或两个以上壳多糖结合结构域的壳多糖酶基因；和β-1，3-葡聚糖酶基因。本发明还涉及通过表达壳多糖酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因产生高病原体抗性植物的方法。
2.本发明背景植物在作为包括人类在内的动物的营养物质方面，以及用于生产可用作药品，化妆品等的物质方面起着重要作用。世界人口的稳定增长，导致了对植物作物的不断增长的需求。这种增长的需求，必须通过可供农业使用的减少了的土地资源来满足。通过能够更好地生长并且对植物病原体的抗性更强的工程生产的植物物种，可以用现有的土地资源，提供较高的作物产量。
植物受到多种病原体的威胁，例如，真菌，细菌，病毒，昆虫和线虫。一小部分病原体能成功地侵入植物组织，并因此导致疾病。具体地讲，马铃薯是高度易受真菌感染的主要粮食作用。应对真菌疾病的一种方法包括使用化学杀真菌剂。不过，杀真菌剂的使用会导致较高的成本和环境破坏。以前提高植物病原体抗性的方法，包括在易感线虫的马铃薯品系中表达马铃薯Mi-1.2抗线虫基因。所得到的转基因马铃薯植物在大部分转基因植物中表现出对根瘤线虫M.javanica株VW4和M.incognita株VW6的抗性，但是不抗M.javanica株VW5，因此与Mi基因在野生型植物中的特异性类似(Milligan等，1998，ThePlant Cell 101307-1319)。
在另一项研究中，通过从能表达Avr9，一种Cf-9诱导物的植物中的编码Cf-9抗性基因产物的转基因上的可转座元件，激活失活的编码Cf-9抗性基因产物的转基因而诱导植物抗性(WO 95/31564)。另外，植物Prf抗性基因在马铃薯植物中的超量表达，导致了对P.s.pathovar tomato株DC3000，X.c.pv.vesicatoria株56，R.solanacearum株82细菌病原体和TMV病毒病原体的抗性的增强(Oldroyd等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9510300-10305)。
在提高植物抗性的另一种尝试中，在马铃薯植物中表达葡萄糖氧化酶，以便产生H2O2，即在植物防御反应期间，通过葡萄糖氧化产生的一种试剂。H2O2在转基因马铃薯植物中的增加，被证实增强了对E.carotovora亚种carotovora和P.infestans的抗性(Wu等，1995，The Plant Cell 71357-1368)。生产出了能表达马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的转基因水稻植物，使得所述植物更抗大螟的粉红蛀心螟幼虫(Duan等，1996，Nature Biotechnology 14494-498)。另外，能表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的转基因马铃薯植物对G.pallida的抗性增强了(美国专利号5,494,813)。在美国专利号5,866,777中披露了能破坏植物线虫病原体的采食结构的蛋白的表达，并且在美国专利号5,824,861中披露了裂解蛋白在苹果树植物中的表达。
包括壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶在内的与发病相关的(PR)蛋白是由植物针对病原体感染的反应而产生的。壳多糖酶能水解壳多糖，它是真菌细胞壁的一种主要成分，而β-1，3-葡聚糖酶能水解葡聚糖成分(Boller等，1985，InJ.L.Key等著，Cellular and MolecularBiology of Plant Stress，Alan R.Liss，New York，pp.247-262；Boller，1992，InS.J.Gurr等(著)，Molecular Plant PathologyVolume II，A Practical Approach，IRL press，Oxford，pp.23-30)。Schlumbaum等(1986，Nature 324365-367)业已证实了纯化的植物壳多糖酶在体外具有抗真菌活性，并且具有一个壳多糖结合结构域的壳多糖酶在转基因植物中的表达，增强了它们对真菌病原体的抗性(Broglie等，1991，Science 2541194-1197；Lin等，1995，Bio/Technology 13686-691)。在抗病的欧洲油菜栽培变种中，通过Phoma lingam感染，诱导了具有一种壳多糖结合蛋白的壳多糖酶ChB4的mRNA，并且通过northern印迹分析，在一天内就可以检测到(Rasmussen等，1992，Plant Mol.Biol.20277-287)。另外，在抑制真菌生长方面，壳多糖酶与β-1，3-葡聚糖酶协同发挥作用(Mauch等，1988，Plant Physiol.88936-942；Zhu等，1994，Bio/Technology12807-812；Jach等，1995，Plant J.897-109)。
仍然需要具有较高的对真菌的抗性的植物，如马铃薯植物。具体地讲，具有增强的对土壤真菌的抗性的马铃薯植物。
在本说明书的这一部分或任何部分中对参考文献的引用，不应当被理解成承认所述参考文献是本发明的现有技术。
3.本发明概述本发明基于本发明人的以下发现在受到真菌感染时，诱导了编码具有双壳多糖结合结构域的壳多糖酶的BjCH11的转录和翻译。壳多糖酶和β-葡聚糖酶是作用于真菌细胞壁的两种主要糖类成分壳多糖和β-1，3-葡聚糖的水解酶。本发明试图提供植物对真菌的抗性，包括用与分解病原体相关的糖类成分，特别是真菌细胞壁相关的酶转化植物，如作物，特别是马铃薯植物。在一种具体实施方案中，本发明提供了具有增强的抗土壤真菌茄属丝核菌的抗性的转基因马铃薯植物，包括共同表达具有两个壳多糖结合结构域的芥菜(Brassia juncea)壳多糖酶和三叶橡胶属(Hevea)β-1，3-葡聚糖酶。
本发明提供了转基因植物，它具有包括可操作地与包括两个或两个以上壳多糖-结合结构域的壳多糖酶的编码序列结合的启动子和终止子的基因。在具体实施方案中，所述壳多糖酶分别包括两个，三个，四个或五个壳多糖结合结构域。包括含有编码壳多糖酶的核酸序列的基因的植物细胞以及其他植物部分也是本发明的一个方面，例如，含有本发明基因的转化植物的种子。
在一种具体实施方案中，本发明提供了转基因马铃薯植物，它具有包括可操作地与芥菜壳多糖酶的编码序列结合的启动子和终止子的基因。含有包括编码芥菜壳多糖酶的核酸序列的基因的马铃薯植物细胞以及其他植物部分也是本发明的一个方面，例如，含有本发明基因的转化植物的种子。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了转基因马铃薯植物，它具有包括可操作地与β-1，3-葡聚糖酶的编码序列结合的启动子和终止子的基因。含有包括编码β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列的嵌合基因的马铃薯植物细胞以及其他植物部分也是本发明的一个方面，例如，含有本发明基因的转化植物的种子。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了转基因马铃薯植物，它具有包括可操作地与三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的编码序列结合的启动子和终止子的基因。含有包括编码三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列的嵌合基因的马铃薯植物细胞以及其他植物部分也是本发明的一个方面，例如，含有本发明基因的转化植物的种子。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了包括壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的转基因植物。在一种具体实施方案中，所述壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶是由独立的载体编码的。在另一种具体实施方案中，所述壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶是由相同的载体编码的。在一种具体实施方案中，所述壳多糖酶具有两个或两个以上壳多糖结合结构域。在另一种具体实施方案中，所述壳多糖酶是BjCHI1，而β-1，3-葡聚糖酶是HbGLU。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了转基因植物，它具有包括可操作地与芥菜壳多糖酶的编码序列结合的第一启动子和终止子，可操作地与三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的编码序列结合的第二启动子和第二终止子的嵌合基因。在一种具体实施方案中，所述遗传修饰过的植物在通过重组DNA技术导入芥菜壳多糖酶三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的编码序列之后，具有增强的真菌抗性。在一种具体实施方案中，利用同时具有BjCHI1和HbGLU cDNAs的pBI121-衍生的植物转化质粒，通过农杆菌属介导的转化，转化马铃薯(Solanum tuberosum L.cv.Desiree)。
在另一种实施方案中，除了壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的编码酶之外，可以将编码植物防御蛋白的其他基因序列导入所述植物。所述基因序列包括，但不局限于编码核糖体失活蛋白，外源凝集素(lectins)和凝集素(agglutinins)的基因。在一种具体实施方案中，可以使用丝氨酸蛋白抑制剂。在另一种具体实施方案中，可以使用SaPINIIa(XuZ.F..等，2001，Plant Molecular Biology 47727-738)。
在一种具体实施方案中，本发明提供了包括嵌合基因的植物细胞。所述嵌合基因包括编码具有两个或两个以上壳多糖结合结构域的壳多糖酶的核酸序列和编码β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列。在一种具体实施方案中，所述嵌合基因包括编码具有四个壳多糖结合结构域的壳多糖酶的核酸序列。在一种具体实施方案中，所述植物细胞能抗昆虫或细菌或这两者。在一种具体实施方案中，所述核酸序列编码芥菜壳多糖酶和三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了一种增强植物对病原体的抗性的方法，该方法包括以下步骤将编码包括两个或两个以上壳多糖结合结构域的壳多糖酶的核酸序列导入所述植物基因组，并且再生具有改变了的基因组的植物。在一种具体实施方案中，所述壳多糖酶是受合适的启动子和合适的终止子控制的芥菜壳多糖酶。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了一种增强植物对病原体的抗性的方法，该方法包括以下步骤将编码受合适的启动子和合适的终止子控制的三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列导入所述植物基因组，并且再生具有改变了的基因组的植物。在一种具体实施方案中，所述葡聚糖酶是受合适的启动子和合适的终止子控制的三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶。
在一种具体实施方案中，本发明还提供了一种增强植物对病原体的抗性的方法，该方法包括以下步骤将编码受合适的启动子和合适的终止子控制的芥菜壳多糖酶和受合适的启动子和合适的终止子控制的三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列导入所述植物基因组，并且再生具有改变了的基因组的植物。
4.


为了更好地理解和更方便地实施本发明，下面将通过举例形式提供了以下附图，其中图1表示芥菜(B.juncea)BjCHI1的核苷酸序列和BjCHI1的结构。A.BjCHI1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，在核苷酸序列下面示出了推测的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在壳多糖结合结构域下面划线。用点划线在铰链区下面划线。在推测的聚腺苷酸化信号下面加双线。N-末端信号肽和C-末端液泡导向肽的推测的裂解位点标有(↓)。壳多糖-结合结构域是具有两个氨基酸差别的串联重复。BjCHI1的25号位置上的氨基酸残基“S”和30号位置上的“E”在第一个壳多糖-结合结构域上，而76号位置上的氨基酸残基“R”和81号位置上的“A”在第二个结构域上。引物的位置(P1至P4)用方框圈出来；对于P2和P4来说，所述核苷酸相当于它们的互补序列。示出了HindIII限制位点。B.BjCHI1的示意图。N-末端信号肽(黑色方框SP)在两个壳多糖结合结构域(CBDI，22-61号氨基酸；CBD2，73-112号氨基酸)前面，这两个结构域是由一个间隔区(灰色方框S)隔离的。CBD2和壳多糖酶催化结构域(146-393号氨基酸)是通过一个铰链区(加交叉斜线的方框H)连接的。液泡导向序列用加斜线的方框v表示。
图2是BjCHI1与其他类型的植物壳多糖酶的比较。A.烟草Chia1(Shinshi等，1990，Plant Mol.Biol.14357-368)和Chia2(Payne等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci USA 8798-102)，菜豆Chia4(Margis-Pinheiro等，1991，Plant Mol.Biol.17243-253)，小荨麻Chia5(Lerner和Raikhel，1992，J.Biol.Chem.26711085-11091)和甜菜Chia6(Berglund等1995，Plant Mol.Biol.27211-216)。加点的空位被用于优化比对。星号表示同一性的位置。信号肽和液泡导向序列的推测的裂解位点标有(↓)。在BjCHI1的壳多糖-结合结构域下面划线。BjCHI1的铰链区下面加点划线。所述间隔区和铰链区中的PPTP重复标有箭头。用方框圈出了被用于产生多克隆抗体的合成肽(YKEEIDKSDPHC)，它相当于BjCHI1的231-242号氨基酸残基。用方框圈出了相当于BjCHI1的268-272号氨基酸残基的序列NYNYG。在Chia类型中保守的8个氨基酸残基标有(◆)。在序列的末端示出了与BjCHI1的同一性(％)，在括号中示出了在壳多糖酶催化结构域内的比较。B.BjCHI1的示意图，Chia1和UDA1表示参与二硫键(通过条上方的连线表示)形成的半胱氨酸残基(C)的位置。黑色方框表示信号肽(SP)；灰色方框表示间隔区(S)；划交叉线的方框表示铰链区(H)；而加斜线的方框表示液泡导向序列(V)。
图3表示BjCHI1，BjCHI2，和BjCHI3的凝集活性分析结果。BjCHI2和BjCHI3是BjCHI1的衍生物，它们分别包括一个和没有壳多糖-结合结构域。凝集分析是按照Does等披露的方法，用HPLC-纯化的毕赤酵母属表达的壳多糖酶进行的(1999，Plant Physiol.120421-431)。将来自毕赤酵母属表达培养物的不同数量的(0.12，0.25，0.5，2，4，8，16或24μg)的FPLC-纯化的蛋白(BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3)添加到微量滴定板上的每一个孔中的30微升胰蛋白酶处理过的兔红细胞中。加入5倍浓度的磷酸盐水，使一个孔的最终体积为60微升。在对照孔中(即“con”；每一排的最后一个孔)，用磷酸缓冲的盐溶液取代蛋白。
图4是芥菜基因组中BjCHI1-相关基因的分析。A.Southern印迹分析。用EcoRI(泳道1)，HindII(泳道2)，HindIII(泳道3)和XbaI(泳道4)消化DNA，与32P-标记过的BjCHI1 cDNA杂交，在室温下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤。泳道5-8表示在65℃下洗涤的相同的印迹。B.使用引物P1和P2(泳道1)或P2和P3(泳道2)的PCR产物，在2％琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色。C.在(b)中示出的琼脂糖凝胶与32P-标记的BjCHII cDNA杂交的Southern印迹。
图5三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列。A.三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。B.三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的推测的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。C.三叶橡胶属(Hb)β-1，3-葡聚糖酶的推测的氨基酸序列与N.plumbaginifolia(Np)gnl(De Loose等，1988，Gene 7012-23)，II型(CII)，III型(CIII)和IV型(CIV)β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列的比较。通过点表示相同的位点。三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶上的推测的N-糖基化位点用星号标明。分别在三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的预测的N-末端延伸部分和C-末端延伸部分上面和下面划线。
图6表示基因组Southern分析。用BamHI(B)，EcoRI(E)，HindII(H)和Xba I(X)消化三叶橡胶属基因组DNA(20μg)，通过凝胶电泳分离，吸印到Hybond N(Amersham)膜上，并且与32P-标记的三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶cDNA探针杂交。
图7表示质粒pBj17，pHEV43和pBj47和pBj48的构建。质粒pHEV43是通过将完整长度HbGLU cDNA的1.2kb的SmaI-HindII片段克隆到质粒pBI121的SmaI位点上，位于CaMV 35S启动子下游而制备的。质粒pBj17是通过将完整长度的BjCHI1 cDNA的1.3kb SmaI片段克隆到pBI121的SmaI位点上而制备的。在pBj17上，由CaMV 35S启动子驱动BjCHI1 cDNA的表达。然后将来自pHEV43的平端处理的2.04kb的HindIII片段克隆到pBj17的SnaBI位点上。由于这种平端片段可以以两种可能的方向插入，获得了质粒pBj47和pBj48，它们各自包括位于单一质粒上的HbGLU cDNA和BjCHI1 cDNA。在pBj47上，壳多糖酶和葡聚糖酶cDNAs分别是沿相反的方向由CaMV 35S启动子转录的，而在pBj48上，这两种DNAs是沿相同方向转录的。RB，T-DNA的右缘；LB，T-DNA的左缘；nptII，编码由Nos启动子转录的用于卡那霉素选择的新霉素磷酸转移酶的基因；35S pro，CaMV 35S启动子；GUS；编码β-葡糖醛酸酶的无启动子基因；H，HindIII；E，EcoRI；S，SnaBI。在质粒pBj47和pBj48的图谱的HbGLU cDNA上方的箭头表示该cDNA从它的5’-末端(5’)至它的3’-末端(3’)的转录方向。附图不是按比例绘制的。
图8表示在芥菜受到茄属丝核菌感染之后诱导了BjCHI1的表达(a)使用32P-标记过的总RNA的BjCHI1 cDNA进行的Northern印迹分析，所述总RNA是从在茄属丝核菌感染的土壤中生长0天(泳道1)，1天(泳道2)，2天(泳道3)，3天(泳道4)，4天(泳道5)，5天(泳道6)，6天(泳道7)，7天(泳道8)，8天(泳道9)和9天(泳道10)之后收获的芥菜叶片中分离的。在下面示出了用32P-标记的18S rDNA探针再次检测的相同的印迹。箭表示1.3kb BjCHI1 mRNA，而箭头表示18S rRNA；(b)使用抗-BjCHI1抗体的Western印迹分析。总蛋白是从在茄属丝核菌感染的土壤中生长0天(泳道1)，1天(泳道2)，2天(泳道3)，3天(泳道4)，4天(泳道5)，5天(泳道6)，6天(泳道7)，7天(泳道8)，8天(泳道9)和9天(泳道10)之后收获的芥菜叶片中分离的。用箭头标出了交叉反应性37kDa BjCHI1的带。位于该带上方的弱的带很可能是前体蛋白；(c)与(b)加样相同的考马斯染色的蛋白凝胶，以表明在每一个孔中加载了相同数量的蛋白。
图9表示R0转基因马铃薯植物的Nothern印迹分析A.用32P-标记的HbGLU cDNA探针检测到的1.2kb杂交HbGLU mRNA(用箭头表示)在未转化过的马铃薯(泳道1)和转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和pHEV-P14(泳道5)中的表达；B.用32P-标记的BjCHI1 cDNA探针检测到的1.3kb BjCHI1杂交mRNA(用箭头表示)在未转化过的马铃薯(泳道1)和转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBI121转化过的马铃薯(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)中的表达。
图10表示R0转基因马铃薯植物的Southern印迹分析A.用32P-标记的HbGLU cDNA探针和来自未转化过的马铃薯(泳道1)，pBI121转化过的马铃薯(泳道2)，和转基因马铃薯品系pHEV43-P14(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBj47-P8(泳道5)，和pBj47-P10(泳道6)的EcoRI消化过的DNA。箭头表示1.2kb的EcoRI杂交带；B.用32P-标记的BjCHI1 cDNA探针和来自未转化过的马铃薯(泳道1)，pBI121转化过的马铃薯(泳道2)和转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)，pBj47-P10(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)的HindIII消化过的DNA。箭头表示0.9kb的HindIII杂交带；C.用32P-标记的BjCHI1cDNA探针和来自未转化过的马铃薯(泳道1)，pBI121转化过的马铃薯(泳道2)和转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)和pBj47-P7(泳道5)的EcoRI消化过的DNA。
图11表示R0转基因马铃薯植物的Western印迹分析A.使用抗HbGLU抗体对来自转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)，pHEV43-P14(泳道4)，pBI121转化过的马铃薯(泳道5)和未转化过的马铃薯(泳道6)粗制蛋白进行的Western印迹分析。用一个箭头标明相当于HbGLU的带(35kDa)。使用抗-BjCHI1抗体对来自转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)，pHEV43-P14(泳道4)，pBI121转化过的马铃薯(泳道5)，未转化过的马铃薯(泳道6)和转基因马铃薯品系pBj17-P6(泳道7)的粗制蛋白进行的Western印迹分析。用箭头标明相当于BjCHI1的带(52kDa)。
图12表示对转基因马铃薯品系进行的葡聚糖酶和壳多糖酶分析A.使来自pBI121-转化体和用pBj47转化的转基因R0品系的粗制蛋白，以500nm波长下的光密度测量的葡聚糖酶分析；B.使用pBI121-转化体和用pBj47转化的转基因R0品系的粗制蛋白，以550nm波长下的光密度测量的壳多糖酶分析。误差线条表示3次独立实验的标准差。
图13表示使用T.viride进行的体外菌丝抑制分析A.将每一种马铃薯品系的50μg蛋白提取物添加到孔中16小时之后真菌的生长情况。1号孔共表达BjCHI1和HbGLU的转基因马铃薯品系pBj47-P10；2号孔仅有缓冲液的对照；3号孔野生型马铃薯Desiree；4号孔马铃薯pBI121转化体；5号孔能表达BjCHI1的转基因马铃薯品系pBj17-P6；6号孔能表达HbGLU的转基因马铃薯品系pHEV43-P14；B.在添加50μg蛋白提取物24小时之后，图13A中所示平板的真菌生长情况。位于左下方的条表示0.9cm。
图14表示使用茄属丝核菌进行的体内真菌生物测定。将马铃薯植物移栽到预先接种了茄属丝核菌的土壤中。在移栽2周之后，检查所述植物，并且照相A.共表达BjCHI1和HbGLU的转基因马铃薯品系pBj47-P10；B.能表达BjCHI1的转基因马铃薯品系pBj17-P6；C.能表达HbGLU的转基因马铃薯品系pHEV43-P14；和D.未转化过的马铃薯。
5.本发明的详细说明病原体抗性是植物的一个重要特征，并且是植物保护，特别是农作物保护的有用工具。本文所使用的术语“植物”包括完整的植株，植物部分，单个植物细胞，植物细胞团(例如，培养的植物细胞)及其后代。在本文中，当术语“增强”被用于表示植物对病原体的抗性提高时，包括提高对病原体可能没有抗性，或具有某些抗性或显著抗性的植物的抗性，以便实现所述抗性的提高。
植物病原体包括，但不局限于细菌，病毒，真菌，线虫和昆虫。病原体可以感染植物，并且导致对所述植物的严重损伤，包括死亡。在感染时，植物可能启动对所述病原体的保护性反应，例如过敏反应，这取决于所述植物是否能识别所述病原体。
各种类型的病原体可能改变，例如，通过诱变改变。另外，可能产生植物物种以前没有遇到过的新的病原体。例如，当一种植物(例如，作物，果树，蔬菜等)被引入一个国家(例如，通过进口)时，植物物种有可能接触它以前没有遇到过的病原体。
5.1编码芥菜壳多糖酶和三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶基因的多核苷酸的克隆5.1.1.编码具有两个壳多糖酶结合结构域的芥菜壳多糖酶的cDNA的分离在使用通过PCR制备的32P-标记过的拟南芥属碱性壳多糖酶探针(Samac等，1990，Plant Physiol 93907-914)筛选扩增的芥菜cDNA文库中的壳多糖酶克隆时，获得了5个推测的阳性克隆。核苷酸序列分析表明，3个克隆具有1.3kb的cDNA，它被命名为BjCHI1，而其他2个是不完整长度的cDNAs。BjCHI1 cDNA由3bp的5’-非翻译区，1200bp的翻译区，86bp的3’-非翻译区和poly(A)+尾组成(图1a)。具有400个氨基酸的开放读框，编码与植物Chia1壳多糖酶具有同源性的推测的Mr42,774(等电点4.7)的蛋白。有趣的是，该cDNA包括两个120bp的重复(67-186号核苷酸和220-339号核苷酸，图1a)，它们编码通过11个氨基酸的间隔区连接的两个壳多糖-结合结构域；它们存在七个核苷酸的差别，导致了两个氨基酸的改变。具有33个氨基酸的铰链区，将第二个壳多糖-结合结构域连接在所述壳多糖酶催化结构域上(图1b)。所有其他以前表征过的壳多糖酶仅包括一个壳多糖-结合结构域。所述壳多糖-结合结构域是壳多糖结合所必需的(Iseli等，1993，Plant Physiol.103221-226)，并且细胞凝集需要至少两个这样的结构域(Peumans等，1995，Plant Physiol.109347-352)。壳多糖-结合结构域的存在并不局限于壳多糖酶。该结构域还存在于植物凝集素中，例如，橡胶蛋白(hevein)——来自橡胶乳液中的4.7kDa的蛋白(Van Parijs等，1991，Planta 183258-264)具有一个壳多糖-结合结构域。BjCHI1是具有两个壳多糖-结合结构域的特殊的壳多糖酶，并且，本发明利用毕赤酵母属表达的BjCHI1证实了这两个壳多糖-结合结构域赋予了凝集特性(参见下文的5.1.2节)。以前没有报导过具有凝集特性的壳多糖酶。
5.1.2.BjCHI1与其他壳多糖酶的比较图2A表示BjCHI1与不同类型的壳多糖酶的代表的比对来自烟草的Chial(Shinshi等，1990，Plant Mol Biol 14357-368)，来自烟草的Chia2(Payne等，1990，Proc Natl Acad Sci USA8798-102)，来自P.vulgaris的Chia4(Margis-Pinheiro等，1991，Plant Mol Biol 17243-253)，来自小荨麻的Chia5(Lerner等，1992，J Biol Chem 26711085-11091)和来自B.vulgaris的Chia6(Berglund等，1995，Plant Mol Biol 27211-216)。Chia1和Chia2壳多糖酶的代表是来自烟草的与BjCHI1具有最高同一性的壳多糖酶。对86种植物壳多糖酶进行的分析，业已证实了在Chia类型中有8个氨基酸是保守的(Levorson等，1997，Plant Mol Biol Reptr15122-133)。其中的7个氨基酸在BjCHI1中是保守的(E-201，A-203，T-213，C-230，N-270，P-286和G-377，图2A)。在BjCHI1中第8个残基(Q)被M-264所取代(图2A)。尽管BjCHI1与烟草Chia1(62.0％)和Chia2(54.8％)具有高的同一性，但是它具有两个壳多糖-结合结构域，而Chia1具有一个壳多糖-结合结构域，而Chia2没有这种结构域。
在与来自其他植物的Chia1壳多糖酶进行比较时，BjCHI1与欧洲油菜具有72.7％的同一性(Hamel等，1993，Plant Physiol1011403)，与拟南芥具有70.2％的同一性(Samac等，1990，PlantPhysiol 93907-914)，与P.vulgaris具有60.9％的同一性(Broglie等，1986，Proc Natl Acad Sci USA 836820-6824)，而与水稻具有51.8％的同一性(Zhu等，1994，BioTechnology 12807-812)。BjCHI1还包括在Chia1壳多糖酶中高度保守的序列“NYNYG”(268-272号氨基酸，图2)(Verburg等，1992，J Biol Chem 2673886-3893)。对玉米壳多糖酶的催化位点进行的研究业已证实了该序列“NYNYG”上的第一个Y被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺修饰过，导致了活性的丧失(Verburg等，1992)。
两个壳多糖-结合结构域的存在可以识别具有Chia5的BjCHI1，其中只有一种例子，好小荨麻UDA1凝集素是已知的(Levorson等，1997)。UDA1是小荨麻(U.dioica)凝集素的具有372个氨基酸的前体(Lerner和Raikhel，1992，J Biol Chem 26711085-11091)，并且表现出昆虫抗营养活性(Chrispeels等，1991，Plant Cell 31-9)。该前体由一个信号肽，两个壳多糖-结合结构域和一个壳多糖酶催化结构域组成。8.5kD的成熟的凝集素仅由86个氨基酸组成，具有两个壳多糖-结合结构域，因为所述壳多糖酶结构域通过翻译后裂解被切除了(Lerner和Raikhel，1992)。尽管BjCHI1和UDA1具有结构相似性，但是它们仅具有36.9％的同一性(图2A)。按照Beintema(Beintema，1994，FEBS Letters 350159-163)的方法比较壳多糖酶中的二硫键，发现了BjCHI1，Chia1和UDA1之间的相似性(图2B)；Chia1的C-末端二硫键在UDA1中不存在，但存在于BjCHI1中。与UDA1不同，BjCHI1的铰链区和间隔区是富含脯氨酸的，分别具有63.6％和54.5％的脯氨酸残基。Chia6壳多糖酶的唯一成员(Levorson等，1997)B.vulgarisCh1，包括一个具有128个残基的铰链结构域，其中，70.3％的残基是脯氨酸(Berglund等，1995，Plant Mol Biol 27211-216)。BjCHI1和Ch1都含有“PPTP”重复(图2A)。相反，Ch1仅具有1/2个壳多糖-结合结构域，并且在它们之间仅存在45.2％的同一性。
两个壳多糖-结合结构域在BjCHI1中的存在，促使本发明人探索BjCHI1具有凝集特性的可能性。因此，按照Does等的方法(1999，PlantPhysiol.120421-431)用FPLC-纯化的毕赤酵母属表达的BjCHJI1进行了凝集分析。作为对照，分别采用了含有一个和不含壳多糖-结合结构域的BjCHI2和BjCHI3。简单地讲，利用酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen)在巴斯德毕赤酵母中表达BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3。将BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3框内克隆到pPIC9K上的分泌信号肽上，以便所述融合蛋白能够分泌到生长培养基中。BjCHI1包括存在于天然蛋白的18-393号氨基酸残基上的两个壳多糖-结合结构域(Zhao和Chye，1999，Plant Mol.Biol.401009-1018)，它与pPIC9K上的分泌信号肽融合；BjCHI2仅包括一个壳多糖-结合结构域，而BjCHI3缺乏这两个壳多糖-结合结构域。将BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3DNAs克隆到载体pPIC9K的EcoRI和NotI位点上。为此，将以下引物用于PCR中C1(正向)引物5’CTGAATTCTCCTCC GGTGAGCAATGCG 3’(SEQID NO5)；C21(正向)引物5’CTGAATTCGGGGATCTTTCTGGCATC 3’(SEQID NO6)；和C2(反向)引物5’GCGACTGCGGCCGCGTTACTACCTTCATTAAACG 3’(SEQ ID NO7)。将正向引物设计成具有一个EcoRI位点，而将反向引物设计成具有一个NotI位点。通过PCR扩增编码BjCHI1的1.1kb的DNA，在PCR中使用C1和C2引物，并且用pBj17作模板。通过PCR扩增编码BjCHI2的0.95kb的DNA片段(具有一个壳多糖-结合结构域)，使用C1和C2引物，并且用pBj28作模板。Fung等以前业已披露了质粒pBj28(2002，PlantMolecular Biology 50283-294)。通过PCR获得编码BjCHI3(缺乏两个壳多糖-结合结构域)的0.74kb的DNA，使用C21和C2引物，并且用pBj17作模板。用EcoRI和NotI消化PCR扩增的片段，并且克隆到pPIC9K的EcoRI和NotI位点上。在用于酵母转化之前，通过DNA序列分析，分析pPIC9K上的插入片段。毕赤酵母属表达的蛋白被分泌到生长培养基中，并且按照Invitrogen提供的说明，用65％的硫酸铵沉淀。然后通过FPLC纯化粗制提取物，并且使用抗BjCHI1的抗体通过Western印迹分析检查HPLC-纯化的蛋白，然后用于凝集分析。由于用于制备抗BjCHI1的多克隆抗体的肽保留在BjCHI2和BjCHI3肽内，所述BjCHI1衍生物能够与所述抗体发生交叉反应。
在凝集分析中，将来自毕赤酵母属表达培养物的不同用量的(0.12，0.25，0.5，2，4，8，16或24μg)的FPLC-纯化的蛋白(BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3)添加到微量滴定板上的每一个孔中的30μl胰蛋白酶处理过的兔红细胞中(参见图3)。将五倍浓度的磷酸盐水添加到每一个孔中，使最终体积为60μl。在对照孔中，用磷酸缓冲的盐溶液取代了所述蛋白。
所述结果表明BjCHI1的凝集特性与包括至少两个壳多糖-结合结构域的杀昆虫蛋白，包括小麦胚乳凝集素，小荨麻凝集素和来自番茄，水稻和曼佗罗属的凝集素的特性相似(Chrispeels等，1991，同上)。由于业已证实了具有两个或两个以上壳多糖-结合结构域的植物凝集素，能够通过结合细菌和真菌表面上的以及食草性昆虫的外骨骼和肠腔上的糖缀合物而凝集细胞(Peumans等，1995，同上)，BjCHI1的抗微生物和抗昆虫作用提供了作进一步研究的前景和理由。
5.1.3.芥菜中的BjCHI1的基因组组构利用Southern印迹分析，研究芥菜中与BjCHI1-相关的基因的存在。用EcoRI，HindII，HindIII和XbaI消化过的基因组DNA与BjCHI1cDNA杂交。只有HindIII能在所述cDNA的内部进行裂解(图1A)。检查6-9个杂交带(图4A，泳道1-4)，发现了存在于B.nigra和芸薹的杂交种——异源四倍体芥菜中的相关基因；这些带可能是由于编码壳多糖酶或具有壳多糖-结合结构域的蛋白的基因产生的。在65℃下进一步洗涤所述印迹，发现了较少的带；泳道6-8中的带(图4A)可能是BjCHI1-特异性的。为了研究具有一个壳多糖-结合结构域的壳多糖酶的存在，利用策略定位的引物进行PCR分析。引物P1靠近编码第一个壳多糖-结合结构域的区，而P2位于编码表现出与其他壳多糖酶的同源性的壳多糖酶结构域的区域内(图1A，图2)。如果在它们之间不存在内含子的话，用这些引物对BjCHI1进行PCR扩增，能得到0.5kb的产物；拟南芥属壳多糖酶基因的第一个内含子(Samac等，1990)位于P2后面的相应区。在琼脂糖凝胶电泳上的预期的0.5kb的产物(图4B)能与Southern印迹分析上的BjCHI1 cDNA杂交，同时能与一个较弱的0.35kb的带杂交(图4C)。这种较小的带，暗示了具有一个壳多糖-结合结构域的相关壳多糖酶的存在，并且由于所述引物对BjCHI1的特异性而显得较弱。相反，用引物P2和P3对BjCHI1进行PCR扩增，发现了一条0.35kb的带(图4B和C，泳道2)。位于编码间隔区的区域内的P3(图1A)是BjCHI1-特异性的，并且被认为适合测定在RT-PCR中表达的BjCHI1-特异性mRNA。
5.1.4.三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶基因的分离将编码β-1，3-葡聚糖酶的N.plumbaginifolia cDNA，gnlcDNA(De Loose等，1988，Gene 7012-23)用作异源杂交的探针，从三叶橡胶属中分离相应的cDNA克隆。通过在42℃下，在含有30％的甲酰胺的溶液中进行原位噬斑杂交，筛选用三叶橡胶属乳液制备的cDNA文库。分离了编码β-1，3-葡聚糖酶的若干推测的三叶橡胶属cDNA克隆。对1.2和1.1kb的两个最长的克隆进行的核苷酸序列分析，证实了它们属于相同的类型。完整长度的1.2kb的cDNA由一个40bp的5’-非翻译区，一个1125bp的编码区，一个76bp 3’-非翻译区，和一个poly(A)尾组成。所述编码区编码一种具有374个氨基酸的碱性蛋白，推测的Mr为41,305。
三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列与N.plumbaginifolia gnl cDNA的核苷酸序列具有68％的核苷酸序列同一性。比较三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的推测的氨基酸序列和由gnl编码的I型β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列，发现了66％的氨基酸同源性(图5C)。三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶与II型(烟草PR-N(Linthorst等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 878756-8760))，III型(烟草ec321391(Payne等，1990，Plant Mol Biol 15797-808))和IV型(烟草sp41a(Ori等，EMBO J，1990，93429-3436))β-1，3-葡聚糖酶分别具有54％，60％和51％的氨基酸同一性(图5C)。
5.1.5三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶I型β-1，3-葡聚糖酶是作为蛋白前体合成的，并且在该蛋白转运到液泡期间或之后裂解它的N-末端延伸部分和C-末端延伸部分(Shinshi等，1988，Proc Natl Acad Sci USA 855541-5545)。N-末端延伸部分(1-36号氨基酸残基)和C-末端延伸部分(353-374号氨基酸残基)在三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的推测的氨基酸序列上的存在进一步表明，它属于I型β-1，3-葡聚糖酶(图5C)。三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的N-末端延伸部分，包括富含丝氨酸和苏氨酸残基的区(4-19号氨基酸残基)，随后是一个疏水区(22-29号氨基酸残基)(图5C)。尽管在三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的N-末端和gnl-编码的β-1，3-葡聚糖酶之间不存在显著的氨基酸序列同源性，但是它们都包括信号肽所特有的疏水区(Von Heijne等，1985，J.Mol.Biol.18499-105)，并且被认为与蛋白向液泡中的导向相关。有趣的是，业已被证实负责将所述蛋白导向液泡的大麦aleurain的前肽的N-末端序列同样富含丝氨酸残基(Holwerda等，1992，Plant Cell 4307-318)。比较三叶橡胶属的C-末端延伸部分和N.plumbaginifolia的C-末端延伸部分发现了在氨基酸序列和推测的N-糖基化位点上(三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶中的364号氨基酸)上存在某些保守性。C-末端延伸部分，特别是三叶橡胶属中的365-370号氨基酸残基富含疏水性氨基酸。业已表明，是疏水性/酸性基序结构，而不是特殊的氨基酸序列形成了羧基延伸前肽的分选信号(Nakamura等，1993，PlantPhysiol 1011-5)。业已证实了β-1，3-葡聚糖酶的I型同I型的C-末端延伸部分和N-聚糖在加工期间被去掉(Shinshi等，1988)。
5.1.6.三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的基因组组构将本发明人分离的乳汁器特异性cDNA用于基因组Southern印迹分析，以便研究三叶橡胶属中β-1，3-葡聚糖酶基因家族的存在。按照Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Rep 119-21的方法，从幼小叶片中获得基因组DNA。用BamHI，EcoRI，HindII和XbaI限制总基因组DNA，电泳并且印迹。用1.2kb的三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶探针进行的Southern印迹分析，发现了每一种消化产物具有2-4条杂交带(图6)。以上结果表明，在三叶橡胶属中存在β-1，3-葡聚糖酶的低拷贝基因家族。
可以利用本领域已知的技术分离并且表征其他壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶。可以克隆芥菜壳多糖酶和三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶蛋白或核酸所特有的cDNA或基因组DNA，并且用多种方法进行测序，例如双脱氧链终止测序方法，例如，参见Sambrook等，同上。
可用于本发明中的多核苷酸包括具有本发明提供的DNA序列的多核苷酸，并且还包括编码能在高严格条件下与本文所提供的DNA序列的互补体杂交的连续的和功能性壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶编码开放读框(ORF)的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，高严格杂交条件可以定义如下滤膜结合的DNA在含有50％去离子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt’s，1％SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中，在42℃下杂交过夜(大约4-16小时)，并且在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤(Ausubel F.M.等著，1989，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.，and JohnWiley & Sons，Inc.，New York)，并且编码一种功能等同的基因产物。
对于寡核苷酸探针来说，例如，而不是限定，高严格条件可以表示，例如，在6×SSC/0.05％焦磷酸钠中，在37℃(用于14-碱基的寡聚体)，48℃(用于17-碱基的寡聚体)，55℃(用于20-碱基的寡聚体)，和60℃(用于23-碱基的寡聚体)下洗涤。
可用于本发明中其他相关的多核苷酸，包括能够在中等严格条件下与编码壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列的互补体杂交的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，所述中等严格条件可以包括，例如，在0.2×SSC/0.1％SDS中，在42℃下洗涤(Ausubel等，1989，同上)。
可用于本发明中的其他考虑的多核苷酸包括能够在低严格条件下与编码壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列杂交的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，使用所述低严格条件性条件的方法披露于以下文献中Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792。
另外，还可以将壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的变体用于本发明中。与野生型酶相比，变体可以包括所述酶的氨基酸序列上的一个或多个变化，例如，通过添加、取代或缺失一个或多个氨基酸所产生的变化。任何改变都不应当破坏所述酶发挥其功能的能力。不过，它可能根据所述改变的性质，增强或减弱这种能力。所述氨基酸改变优选是保守性的。
在各种实施方案中，所述壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，片段，变体，类似物，或衍生物可以作为融合体或嵌合蛋白产物表达(包括酶，片段，类似物，或通过肽键与异源(不同蛋白的)蛋白序列连接的衍生物)。所述嵌合基因产物可以通过本领域已知方法，以正确的编码读框将编码需要的氨基酸序列的合适的核酸序列彼此连接，并且通过本领域公知的方法表达所述嵌合产物而制备的。另外，所述嵌合产物可以通过蛋白合成技术制备，例如，通过使用肽合成仪而制备。所述融合蛋白中的所述酶的片段，类似物和衍生物优选保留了发挥所述酶的功能的能力。
可以通过筛选cDNA或基因组DNA文库，克隆对植物壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特异的cDNA或基因组DNA。例如，所述文库可以用来自所述植物的mRNA或基因组DNA制备。有关分子生物学技术的一般背景以及如何制备cDNA文库或基因组文库，可以参见，例如，AusubelF.M.等，同上；Sambrook等，1989，同上；和美国专利号5,650,148。
所述文库可以用对芥菜壳多糖酶和三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶的一部分特异的核苷酸片段筛选。例如，可以用本领域技术人员所熟知的技术确定壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的蛋白序列，如通过Edman降解技术(例如，参见Creighton，1983，“ProteinsStructures andMolecular Principles”，W.H.Freeman & Co.，New York，pp.34-49)。所获得的氨基酸序列可以被用作制备可用于筛选编码壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的cDNA序列的cDNA文库的寡核苷酸混合物的指导。
或者，举例来说，可以确定对壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特异的两段蛋白序列。制备了对每一段特异的一套简并寡核苷酸，并且将所述寡核苷酸用于聚合酶链式反应(“PCR”)扩增。寡核苷酸的长度至少为大约6个核苷酸，更优选至少大约10个，更优选至少大约15个，更优选至少大约20个，更优选至少大约30个，更优选至少大约40个核苷酸。例如，所述PCR反应中的模板，可以是已知含有或推测含有对感兴趣的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特异的DNA多核苷酸的cDNA或基因组DNA混合物。可以用多种方法获得cDNA模板，例如，从cDNA文库中分离不同类型cDNA的混合物，或者例如，逆转录来自已知(或推测)能表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的细胞或生物的总mRNA。例如，有关PCR的背景可以参见Ausubel，同上，和PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications，1990，Innis，M.等著，AcademicPress，Inc.，New York。
为了克隆来自任何物种的完整长度的cDNA或基因组DNA序列，或克隆壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的变体或异源形式，可以用相当于本文所披露的任何多核苷酸的核酸片段制备或用本发明的方法制备的标记过的DNA探针筛选cDNA文库或基因组DNA文库(例如，噬菌体文库)，正如在以下文献中所披露的例如Ausubel F.M.等，同上；Sambrook等，1989，同上。
5.2抗体的生产为了生产抗体，可以通过注射壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶(例如，相当于壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的功能结构域)，截短的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多肽(业已去掉了其中的一个或多个结构域的壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶)，壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的功能性等同物，壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的突变体，或壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的短肽(或片段)，对各种宿主动物进行免疫。所述宿主动物可以包括，但不局限于兔、小鼠、山羊、和大鼠等等。根据宿主的物种，可以用各种佐剂增强免疫学反应，所述佐剂包括，但不局限于弗氏(完全和不完全)佐剂，矿物凝胶，如氢氧化铝，表面活性物质，如溶血卵磷脂，多元醇，聚阴离子，肽，油类乳化液，匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚，以及潜在有用的人类佐剂，如BCG(bacille Calmette-Guerin)和小棒杆菌。多克隆抗体，是来自所述免疫动物血清的抗体分子的异源群体。
可用于本发明的抗体包括单克隆抗体(例如，参见Kohler等，1975，Nature 256495-497；和美国专利号4,376,110)，嵌合抗体(例如，参见Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)，单链抗体(例如，参见美国专利4,946,778；Bird，1988，Science 242423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 341544-546)，抗体片段(例如，参见Huse等，1989，Science，2461275-1281)，抗独特型抗体或所述抗独特型抗体的Fab片段(例如，参见Greenspan & Bona，1993，FASEB J 7(5)437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)2429-2438)。
5.3利用重组DNA技术表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，它们的片段或它们的融合蛋白有利地是采用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术生产的。可以利用所述方法构建含有壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸和合适的转录和翻译控制信号的嵌合基因或表达载体。例如，所述方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。例如，参见披露于以下文献中的技术Sambrook等，1989，同上，和Ausubel等，1989，同上。在本文中，术语嵌合基因表示所述嵌合基因的每一部分的核酸序列的组合，业已通过重组DNA技术将所述序列功能改造成相关的，所述序列还处于对于要导入所述嵌合基因的植物来说的内源或外源独立部分。
另外，举例来说，可以利用合成仪化学合成相当于由壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列编码的转录物的全部或一部分的RNA。例如，参见披露于以下文献中的技术“Oligonucleotide Synthesis”，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford，该文献以它的全文形式被收作本文参考。
生物技术领域已知的宿主表达载体系统都可用于表达壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列，包括，但不局限于在细菌，酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞，真核细胞和植物细胞中表达。在所述表达系统中，可以使用任何筛选系统。所述筛选系统可以包括在选择培养基上生长(例如抗生素，基本培养基等)，或使用一种指示剂(例如染料，荧光试剂等)。
在使用植物表达载体时，壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶编码序列的表达，可以通过多种调控元件中的任意一种驱动。例如，可以使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等，1984，Nature 310511-514)，或TMV的外被蛋白启动子(Takamatsu等，1987，EMBO J.6307-311)；另外，可以使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie等，1984，Science 224838-843)；或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。可以通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，定向DNA转化，biolistics/粒子轰击，显微注射，电穿孔等将所述构建体导入植物细胞。有关所述技术的综述可以参见，例如，Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。在本文中，调控元件包括，但不局限于诱导型和非诱导型启动子，增强子，操纵子和本领域技术人员已知的能驱动并且调控表达的其他元件。
所述启动子优选能够指导在植物的特定组织和/或植物发育的特定阶段的表达。所述启动子对所述植物来说可以是异源的或同源的。所述启动子优选指导在植物种子的胚乳或植物的根或块茎中的表达。优选的启动子是小麦的高分子量麦谷蛋白(HMWG)启动子。其他合适的启动子为本领域技术人员所熟知，如麦醇溶蛋白，分支酶，ADPG焦磷酸化酶，淀粉合成酶和肌动蛋白的启动子。
5.4表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的转基因植物可以通过用包括编码植物壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列的基因构建体转化植物细胞，工程生产具有能表达植物壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶多肽的转基因植物。在一种实施方案中，植物启动子可操作地与编码需要的植物壳多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列结合。在本文中，术语“可操作地结合”或“可操作地连接”表示这样一种结合，其中，调控区(例如启动子，增强子)和要表达的核酸序列是共价连接的，并且是以允许在合适的条件下转录，翻译的方式定位的。在本发明的一种优选实施方案中，所述结合的启动子是强效的和非组织或发育特异性植物启动子(例如，能够在很多或所有植物组织类型中强表达的启动子)。所述强效“组成型”启动子的例子包括，但不局限于CaMV 35S启动子(Odell等，1985，Nature313810-812)，T-DNA甘露碱合成酶启动子，和它们的各种衍生物。在另一种优选实施方案中，将一种诱导型或阻抑型启动子用于在植物中表达感兴趣的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，例如，披露于Weinmann等，1994，The Plant Journal 5559-569中的操纵基因启动子；或披露于McNellis等，1998，The Plant Journal 14247-257中的糖皮质素诱导型启动子；或披露于Caddick等，1998，NatureBiotechnology 16177-180中的乙醇诱导型启动子。还可参见Gatz，1995，Methods In Cell Biology 50411-424，该文献披露了用于植物的诱导型和阻抑型基因表达系统。
在本发明的一种实施方案中，在植物中表达壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶，以便所述壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽定位于质外体间隙中。当在植物中表达时，可以将壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶导向质外体间隙，包括以与起着信号或转运蛋白作用的肽形成的融合蛋白形式，表达壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽，以便将壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶定位于转基因植物的质外体间隙中。可以使用多种信号或转运肽，例如，Lund等，1992，Plant MolecularBiology 1847-53所披露的PR1b信号序列；或Pfitzner等，1987，Nucleic Acids Research 154449-4465中所披露的PR-1a，b和c信号序列。通过彼此连接对每一种成分特异的多核苷酸(例如，框内连接多核苷酸)，可以构建包括信号或转运肽和壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽的融合蛋白，以便当所述融合多核苷酸在转基因植物中表达时，产生需要的融合蛋白。本领域人员了解如何构建可用于在转基因植物的质外体间隙中表达壳多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶的多核苷酸。
在本发明的另一种实施方案中，通过工程方法制备一种具有这样一种基因构建体的植物可能是有利的，所述基因构建体包括可操作地与组织或发育特异性启动子结合的编码植物壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列，所述启动子例如，但不局限于CHS启动子，PATATIN启动子等。
在本发明的另一种实施方案中，用包括可操作地与一种修饰过的或人工启动子结合的编码植物壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的基因构建体转化植物可能是有利的。通常，通过重组不同启动子的结构元件构建的所述启动子，具有在天然启动子中不存在的独特的表达模式和/或水平。例如，参见Salina等，1992，Plant Cell41485-1493，例如，通过组合顺式调控元件和启动子核心构建的人工启动子。
在本发明的另一种实施方案中，可以通过工程方法实现壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多核苷酸的表达，包括利用本领域已知的技术增加编码需要的蛋白或多肽的基因的拷贝数量。
5.5植物和植物细胞的转化可以用本领域已知的任何方法转化植物和植物细胞。在本发明的一种实施方案中，利用农杆菌属将所述基因构建体导入植物。所述转化优选使用二元农杆菌属T-DNA载体(Bevan，1984，Nuc.Acid Res.128711-8721)，和共培养方法(Horsch等，1985，Science2271229-1231)。一般，利用农杆菌属转化系统对双子叶植物进行工程改造(Bevan等，1982，Ann.Rev.Genet 16357-384；Rogers等，1986，Methods Enzymol.118627-641)。还可以利用农杆菌属转化系统，将DNA转化和转移到单子叶植物和植物细胞中(参见Hernalsteen等，1984，EMBO J 33039-3041；Hooykass-VanSlogteren等，1984，Nature 311763-764；Grimsley等，1987，Nature 3251677-179；Boulton等，1989，Plant Mol.Biol.1231-40.；和Gould等，1991，Plant Physiol.95426-434)。
在其它实施方案中，可以采用各种其他方法将重组核酸构建体导入植物和植物细胞。当目标是单子叶植物或植物细胞时，所述其他方法是特别适用的。其他基因转移和转化方法包括，但不局限于粒子枪轰击(biolistics)，通过钙-，聚乙二醇(PEG)-或电穿孔-介导的裸露DNA摄取而实现的原生质体转化(参见Paszkowski等，1984，EMBO J32717-2722，Potrykus等1985，Molec.Gen.Genet.199169-177；Fromm等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 825824-5828；和Shimamoto，1989，Nature 338274-276)以及植物组织的电穿孔(D’Halluin等，1992，Plant Cell 41495-1505)。用于植物细胞转化的其他方法包括显微注射，碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等，1990，Plant Cell Reporter 9415-418)，和显微粒子轰击(参见Klein等，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 854305-4309；和Gordon-Kamm等，1990，Plant Cell 2603-618)。在任何一种方法中，可以使用可选择标记，至少在开始使用这种标记，以便确定是否确实发生了转化。有用的可选择标记包括能赋予对一种抗生素的抗性的酶，如对庆大霉素，潮霉素，卡那霉素等的抗性。另外，可以使用具有通过颜色改变识别的化合物的标记，如GUS，或通过发光识别，如荧光素酶。
在所述嵌合基因中还可以包括一个基因开关机制，由它决定在何种条件下或在何时表达所述编码序列。例如，所述基因开关可以是化学诱导的启动子或温度控制的启动子。
根据本发明，可以利用本发明的核酸构建体和上面所提到的各种转化方法，工程制备具有本文所披露的需要的生理学和农学特性的多种植物和植物细胞系统。在优选实施方案中，用于工程改造的目标植物和植物细胞包括，但不局限于单子叶植物和双子叶植物，如农作物，包括谷类作物(例如，小麦，玉米，水稻，小米，大麦)，果实类作物(例如，番茄，苹果，梨，草莓，橙子)，饲料类作物(例如苜蓿)，根类蔬菜作物(例如胡萝卜，马铃薯，甜菜，山药)，叶类蔬菜作物(例如，莴苣，菠菜)；开花植物(例如，矮牵牛，玫瑰，菊花)，针叶树和松树(例如，松树，冷杉，云杉)；用于植物补救(phytoremediation)的植物(例如，重金属积累植物)；油类作物(例如向日葵，油菜籽)和用于实验目的的植物(例如，拟南芥属)。
5.6转化过的植物和植物细胞的筛选根据本发明，可以通过以下方法获得需要的植物通过工程方法将能表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的一种或多种基因构建体导入多种植物细胞类型，包括，但不局限于原生质体，组织培养细胞，组织和器官外植体，花粉，胚胎，以及完整植株。在本发明的一种实施方案中，按照下文所披露的途径和方法从工程改造的植物材料中选择或筛选转化体(业已导入或整合了所导入的基因构建体的植物)。然后，可以将分离的转化体再生成植株。另外，可以先将工程改造的植物材料再生成植株，然后再选择或筛选所产生植株的标记基因性状。在选择或筛选标记基因之前或之后，由植物细胞，组织或器官再生植株的方法为本领域技术人员所熟知。
可以通过选择或筛选所述工程改造的植物材料的由存在于转化DNA上的标记基因编码的性状，可以鉴定并且分离转化过的植物细胞，愈伤组织，组织或植物。例如，选择可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基上生长工程改造的植物材料而进行，转化基因构建体能产生对所述抗生素或除草剂的抗性。另外，还可以通过筛选可能存在于本发明重组核酸构建体上的任何可见标记基因(例如，β-葡糖醛酸酶，荧光素酶，B或C1基因)的活性，鉴定转化过的植物和植物细胞。所述选择和筛选方法为本领域技术人员所熟知。
还可以用物理和生物化学方法鉴定含有本发明基因构建体的植物或植物细胞转化体。所述方法包括，但不局限于1)用于检测和确定重组DNA插入片段结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测和检查所述基因构建体的RNA转录物的Northern印迹，S1 RNase保护，引物-延伸或逆转录酶-PCR扩增；3)用于检测酶活性的酶促分析，其中，所述基因产物是由所述基因构建体编码的；4)蛋白凝胶电泳(PAGE)，Western印迹技术，免疫沉淀，或酶联免疫测定，其中的基因构建体产物是蛋白。还可以使用诸如原位杂交，酶染色，和免疫染色的其他技术，检测所述重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。用于完成所有上述测定的方法，为本领域技术人员所熟知。
5.7能表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多核苷酸的转基因植物制备了能表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的转基因植物。能表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的转基因植物不太容易受感兴趣的病原体的致病作用。转基因植物可以通过本领域已知的任何技术制备，例如用于上文所披露的能表达植物壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的转基因植物的技术。
能表达一个或多个壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因多核苷酸的转基因植物，能够使得所述植物对感兴趣的病原体的抗性更高，所述转基因植物可以来自植物界的任何植物种，植物属，植物科，植物目，植物纲，植物门。例如，参见美国专利号5,889,189；5,869,720；5,850,015；5,824,842；PP10,742；PP10,704；PP10,682，它引用了其中可以使用壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的植物种、属、科、目、纲和门。
植物的例子有单子叶植物，双子叶植物，作物类植物(即用于包括人类在内的动物的农业，食品生产目的而种植的任何植物物种，通常以超过大约10个植株的群体形式种植的植物，以便由于任何原因收获所述植物的完整植株或一部分，例如，水果，花卉或作物，例如所述植物所长出的谷粒等)，树木(即果树，为了生产木材而种植的树木，为了装饰而种植的树木等)，任何类型的花卉(即为了装饰而种植的植物，例如，在它们收获之后种植)，仙人掌等。
可以在其中表达壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的植物的其他例子包括Viridiplantae，Streptophyta，Embryophyta，Tracheophyta，Euphyllophytes，Spermatophyta，Magnoliophyta，Liliopsida，Commelinidae，Poales，Poaceae，稻属，水稻，玉米属，玉米，大麦属，大麦，小麦属，小麦，Eudicotyledons，Coreeudicots，Asteridae，Euasterids，Rosidae，Eurosids II，Brassicales，Brassicaceae，拟南芥属，Magnoliopsida，Solananae，Solanales，茄科，茄属，烟草属。
例如，所述植物还包括特别感兴趣的作物，包括茄科作物，包括加工过的和新上市的番茄，辣椒和茄子；叶类植物，包括莴苣和菠菜；芸薹属，包括花椰菜，抱子甘蓝，花茎甘蓝，羽衣甘蓝，花椰菜，红甘蓝和白甘蓝；葫芦科，包括黄瓜，甜瓜，西瓜，zucchini和南瓜；大型有籽植物，包括豌豆，菜豆和甜玉米；根类植物，包括胡萝卜和洋葱；营养繁殖的植物，包括草莓，葡萄，香蕉，菠萝和蔷薇科果实和坚果类作物；以及热带作物，包括芒果和番木瓜。
因此，本发明业已利用了多种植物，包括，但不局限于来自下列属的种腰果属，落花生属，天门冬属，颠茄属，燕麦属，芸薹属，柑橘属，西瓜属，辣椒属，红蓝花属，椰子属，咖啡属，甜瓜属，南瓜属，Daucus，油棕属，草莓属，大豆属，棉属，向日葵属，Heterocallis，大麦属，天仙子属，莴苣属，亚麻属，黑麦草属，羽扇豆属，番茄属，苹果属，木薯属，Majorana，苜蓿属，烟草属，木犀榄属，稻属，Panieum，Panneserum，鳄梨属，菜豆属，Pistachia，豌豆属，梨属，李属，萝卜属，蓖麻属，黑麦属，千里光属，白芥属，茄属，高粱属，可可树属，胡卢巴属，小麦属，野豌豆属，葡萄属，豇豆属和玉米属。
5.8用于在转基因植物中表达工程改造过的基因的多核苷酸构建体用生物技术领域已知的普通重组DNA和克隆技术，构建能够指导工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物在感兴趣的转基因植物中表达的多核苷酸构建体，例如，参见Sambrook等，同上；Ausubel等，同上。所述多核苷酸构建体通常包括编码工程改造的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的多核苷酸序列和一个或多个调控多核苷酸序列。可用于本发明多核苷酸构建体的调控序列包括，但不局限于启动子，增强子，内含子，剪接供体，剪接受体，聚腺苷化序列，RNA稳定性调控序列或上述任意一种的元件(例如，启动子元件，包括，但不局限于TATA盒)。
多核苷酸构建体包括一个或多个调控元件，所述元件能够指导本发明工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的表达。在一个优选方面，所述调控元件能够指导在植物物种中的表达，其中，工程改造的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的表达是需要的。在另一个优选方面，所述调控元件能够指导在一种细胞类型中的表达，其中，工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物在感兴趣的植物物种中的表达是需要的。
可用于本发明的多核苷酸构建体的调控元件为本领域技术人员所公知，例如，已知能够在感兴趣的细胞类型和植物物种中表达的基因的启动子和增强子元件。还可以通过常规实验，分离可用于在感兴趣的植物物种的细胞类型中表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的启动子，例如，通过分离已知能够以需要的方式表达的基因的启动子区。例如，人们可以利用对已知能在感兴趣的植物物种的感兴趣的细胞类型中表达的mRNA的5’末端特异的cDNA探针筛选基因组文库。所述5’末端cDNA探针优选仅为大约100个-大约300个碱基对，以便在所述基因组文库中鉴定的克隆有可能包括所述基因的5’末端，它可能包括对所述探针特异的基因的启动子区。所述启动子区通常包括位于转录起始位点上游的大约1000-大约2000个碱基对。因此，可用于表达本发明工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的启动子，是从已知能够在感兴趣植物物种的感兴趣细胞类型中表达的基因的转录起始位点上游大约2000个碱基对到下游的大约50个碱基对的多核苷酸，或者是所述多核苷酸的一部分。
为了有利于工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的正确加工，可能需要包括编码所述加工所必须的肽序列的核苷酸片段。例如，可能需要例如能够由转基因宿主植物识别并且能在所述植物中起作用的肽序列，即信号序列，以便促进壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物进入内质网。
5.9用于检测工程产生的抗性植物品系的分析与不能表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的相同物种的植物品系(即野生型植物)相比，用本发明方法制备的能表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因产物的植物品系对感兴趣的病原体的致病作用的抗性更大。用本发明方法制备的植物品系的较高的抗性，可以用本发明领域技术人员已知的任何技术分析。例如，人们可以用感兴趣的病原体感染所制备的植物品系的植物，和野生型植物品系的植物。在进行所述感染之后，所制备的植物品系的植物与野生型植物相比具有高出至少大约20％的从感染中存活下来的可能性，这种可能性更优选至少大约40％，更优选至少大约60％，最优选至少大约80％。
测试用本发明方法生产的转基因植物的另一种方法，是测试坏死诱导活性，例如，在以下文献中所披露的Mahe等，1998，J.PeptideRes.52482-494。因此，人们可以在转基因植物中表达工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因，并且用感兴趣的病原体感染所述转基因植物。例如，当将一种病原体涂在能表达所述工程改造过的壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的转基因植物上时，人们能够在野生型植物上看到明确的坏死或严重扩散的坏死，但是在产生所述转基因植物的植物品系的转基因植物上看不到这种坏死。
除了肉眼检查之外，通过组织化学染色反应还可以观察到坏死性的细胞死亡。
提供以下实施例是为了进一步说明本发明，而不是要以任何方式限定本发明的范围。
6.实施例6.1材料和方法植物材料让芥菜植物在22-24℃下，在12小时光照/12小时黑暗周期的生长箱中生长。
从芥菜cDNA文库中筛选壳多糖酶克隆合成了一对寡核苷酸引物，5’GGTGGATGGGCTACAGCACCAGAC 3’和5’GCCACGTCCACACTCCAA 3’，用于PCR扩增拟南芥属壳多糖酶基因的414bp片段(1625-2038号核苷酸)(Samac等，1990，Plant Physiol93907-914)。在用于筛选芥菜cDNA文库之前(Pua等，1992，PlantMol Biol 19541-544)，通过在42℃下，在含有30％去离子化甲酰胺的溶液中进行原位噬斑杂交，证实相当于保守壳多糖酶结构域的该片段的核苷酸序列(Sambrook等，1989，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。在室温下，在0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤印迹。
DNA序列分析使用DNA测序试剂盒，采用Sequenase Version 2.0(UBS，Amersham Life Science)和GCG序列分析程序(Genetics ComputerGroup)分析M13mp18中含有感兴趣的序列的DNA片段(Yanisch-Perron等，1985，Gene 33103-119)。
基因组DNA分离和Southern印迹分析为了进行Southern印迹分析，用各种限制性内切酶消化从芥菜中分离的20μg DNA(Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Reptr119-21)，通过在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳进行分离，并且吸印到Hybond-N(Amersham)上(Sambrook等，1989)。在42℃下，在含有30％去离子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt’s，1％SDS和500μg/ml变性的超声处理过的鲑鱼精子DNA的溶液中，让所述印迹与32P-标记过的BjCHI1 cDNA探针杂交过夜。在室温下以及在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤所述印迹。
Northern印迹分析在50℃下，在存在乙二醛的条件下，使20μg从幼苗的叶片中提取的RNA变性(Nagy等，1988，Plant Molecular Biology Manual p.B41-29.Kluwer Academic Publisher，Dordrecht)，通过在1.5％琼脂糖凝胶中电泳进行分离，并且吸印到Hybond-N(Amersham)膜上。在42℃下，在50％甲酰胺，1×Denhardt’s，6×SSPE，1％SDS，100μg/ml变性的超声处理过的鲑鱼精子DNA和10％硫酸葡聚糖中，让印迹与32P-标记过的BjCHI1 cDNA一起培养过夜。在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤所述印迹。
聚合酶链式反应利用GeneAmp PCR Reagent试剂盒(Perkin Elmer)，用引物P1和P2或P2和P3进行PCR。图1A表示所述引物的定位P1(5’CCTCCGGTGAGCAATGCG3’)相当于56-73号核苷酸，P2(5’TTAGCGGCGGTGATGAAGG3’)互补于554-5 36号核苷酸，而P3(5’TCCTCCAACCCCGCAGTGT3’)相当于2 07-225号核苷酸。用引物使在94℃下变性5分钟的芥菜DNA进行35轮PCR94℃1分钟，68℃1分钟，和72℃3分钟。最终的延伸是在72℃下进行7分钟。将在2％琼脂糖凝胶中电泳的PCR产物吸印到Hybond-N(Amersham)膜上，以便与32P标记过的BjCHI1 cDNA杂交。
按照Lasserre等，1996，Mol Gen Genet 25181-90的方法(Nagy等，1988)，使用利用硫氰酸胍从幼苗的叶片中提取的总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。让引物P4，5’CCACTCGAGGTTGTTGC3’(互补于750-734号核苷酸；图1A)与50μg总RNA退火。在使用引物P2和P3的PCR中，用第一条cDNA链作模板(图1A)。所有RT-PCR反应都重复进行三次。
抗HbGLU和BjCHI1的多克隆抗体的制备相当于HbGLU(SEQ ID NO4)的94-107号氨基酸的合成肽(SDLQSLTNPSNAKS)(Chye和Cheung，1995，Plant Mol.Biol.29397-402)是从Chiron Technologies(Australia)购买的，并且用于按照Sambrook等，1989中披露的方法，在兔子体内制备多克隆抗体。将相当于BjCHI1(SEQ ID NO1)的231-242号氨基酸的合成肽(YKEEIDKSDPHC)(Zhao和Chye，1999，同上)用于对兔进行免疫，以便制备多克隆抗体，并且所述抗-BjCHI1抗体是从ChironTechnologies(Australia)购买的。将每一种肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合，并且与弗氏完全佐剂混合，用于制备抗体。采集血液，并且利用蛋白A Sepharose CL-4B(Pharmacia)和CNBr-激活的Sepharose4B(Pharmacia)柱纯化抗HbGLU的抗体，而抗BjCHI1的抗体是利用Thiopropyl-Sepharose 6B(Pharmacia)柱纯化的。
用茄属丝核菌感染芥菜将芥菜种子播种到高压灭菌的土壤中，并且在24℃的生长箱中培养，采用12小时光照(08:00-20:00)和12小时黑暗(20:00-08:00)的昼夜循环。将两周龄的幼苗小心移栽到用1周龄的茄属丝核菌培养物接种过的土壤中。让所述真菌在室温下在马铃薯葡萄糖营养液中生长1周时间，并且在移栽所述幼苗之前3天添加到所述土壤中。在移栽到感染过的土壤中之后，从第0天到第9天，每天从幼苗上采集叶片。从所述叶片中提取总RNA和总蛋白，分别进行northern印迹分析和western印迹分析。
同时具有三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶和芸薹属壳多糖酶BjCHI1的质粒构建体将被命名为HbGLU的完整长度的H.brasiliensis β-1，3-葡聚糖酶cDNA的1.2kb的SmaI-HindII片段(Chye和Cheung，1995，Plant Mol.Biol.29397-402)克隆到二元质粒载体pBI121(Clontech)的CaMV 35S启动子下游的SmaI位点上，以便制备质粒pHEV43(图7)。而将编码芥菜壳多糖酶的完整长度cDNA的1.3kb SmaI片段BjCHI1(Zhao和Chye，同上)克隆到pBI121(Clontech)的CaMV 35S启动子下游的SmaI位点上，以便制备质粒pBj17。然后将来自pHEV43的一个含有CaMV 35S启动子和HbGLU cDNA的2.04kbHindIII片段用Klenow平端化，并且连接到pBj17的GUS基因内的SnaBI位点上，制备两种质粒pBj47和pBj48(图7)。pBj47中的CaMV35S启动子是颠倒的，而pBj48中的该启动子是串联，并且质粒pBj47和pBj48中的每一个都携带有位于单一质粒上的HbGLU cDNA和BjCHI1cDNA(图7)。将质粒pBj17，pBj47和pHEV43用于马铃薯转化。
6.2制备具有三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶和芸薹属壳多糖酶BjCHI1构建体的转基因马铃薯植物植物转化通过利用辅助菌株HB101(pRK2013)进行三亲交配，将每一种质粒pHEV43，pBj17，pBj47和pBI121从大肠杆菌菌株DH5α转移到根癌农杆菌菌株LBA4404中。通过携带所述质粒之一的根癌农杆菌衍生物进行的马铃薯植物品种Desiree(Solanum tuberosum L.)的转化是按照以下文献中的方法进行的Dietze等，1995，In Potrykus I，Sprangenberg G(eds)，Gene Transfer to Plants，New York，ColdSpring Harbor Laboratory，p.24-29。在补充了卡那霉素(100μg/ml)的Murashige和Skoog培养基上筛选转化体。在20-25℃的温度和16小时光照/18小时黑暗方案下，将马铃薯组织培养物保持在生长箱中。在24℃下让转基因R0马铃薯植物生长在生长箱中的土壤里，采用12小时光照/12小时黑暗的昼/夜方案。
6.3测定三叶橡胶属β-1，3-葡聚糖酶和芸薹属壳多糖酶BjCHI1产物在稳定转化的马铃薯植物中的功能Northern印迹分析按照以下文献中所披露的方法从完整植株中提取总RNANagy等，1988，InSV Gelvin，RA Schilperoort，(eds)，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.B41-29)。在存在乙二醇的条件下，在50℃下让20μg RNA变性30分钟。通过在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳进行分离，并且转移到Hybond-N膜(Amersham)上。让印迹预杂交4-6小时，然后与通过随机引发标记而制备的32P-标记过的BjCHI1 cDNA或HbGLU cDNA在42℃下，在含有50％甲酰胺，1×Denhardt′s，6×SSPE，0.1％SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA和10％硫酸葡聚糖溶液中杂交过夜。在65℃下，用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤印迹。
Southern印迹分析为了进行Southern印迹分析，用限制性内切酶消化按照Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Rep.119-21中所披露的方法分离的20μg基因组DNA，通过在0.7％的琼脂糖凝胶中电泳进行分离，并且吸印到Hybond-N(Amersham)膜上(Sambrook等，1989)。在42℃下让所述膜在含有50％去离子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt′s，1％SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中预杂交4-6小时，添加32P-标记过的BjCHI1 cDNA探针或32P-标记过的HbGLUcDNA探针，并且杂交过夜。在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤膜。
Western印迹分析按照以下文献中所披露的方法制备总植物蛋白Kush等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 871787-1790。通过SDS-PAGE分离20μg的总蛋白，并且按照Sambrook等，1989所披露的方法转移到Hybond-C(Amersham)膜上。在western印迹分析中，按照扩增的碱性磷酸酶山羊抗兔免疫印迹分析试剂盒(BioRad)中披露的方法，使用抗BjCHI1的多克隆抗体或抗HbGLU的多克隆抗体检测交叉反应带。
制备用于酶分析的植物蛋白提取物按照Boller等，1983，Planta 15722-31中所披露的方法制备植物蛋白提取物。在液氮中将植物研磨成细粉，转移到含有1％(v/v)β-巯基乙醇的0.1M柠檬酸钠(pH5.0)的缓冲液中，并且涡旋搅拌。在离心(14,000rpm，5分钟，4℃)之后将上清液转移到另一个试管中，在50℃下培养10分钟，并且在冰上冷却10分钟。然后对所述样品进行离心(14,000rpm，4分钟，4℃)，并且将所述上清液用作粗制蛋白用于分析壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。按照Bradford的方法测定蛋白浓度(1976，Anal.Biochem，72248-254)。
β-1，3-葡聚糖酶分析按照以下文献中所披露的方法进行β-1，3-葡聚糖酶的比色分析Abeles和Forrence，1970，Plant Physiol 45395-400。在50℃下，将100μl(25μg)植物蛋白提取物和100μl的2％(w/v)昆布多糖(Sigma)的反应混合物温育2小时。通过添加600μl的二硝基水杨酸试剂，并且在100℃下加热5分钟，终止该反应。在冷却到室温之后，以1∶20的比例用水稀释内含物，并且在500nm下测定吸光度。
壳多糖酶分析按照以下文献中所披露的方法进行比色壳多糖酶分析Wirth和Wolf，1990，J.Microbiol Meth 12197-205。在37℃下，将150μl的底物羧甲基/壳多糖/Remazol亮紫(Loewe Biochemica；2mg/ml母液)，150μl的0.2M乙酸钠(pH5.0)和300μl(15μg)植物蛋白提取物反应混合物培养0.5小时。通过添加150μl的1N HCl终止反应，然后在冰上培养5-10分钟，然后离心(14,000rpm，3分钟，4℃)。将上清液用于在550nm下读取吸光度。作为空白对照，用300μl的0.1M乙酸钠，pH5.0缓冲液取代蛋白样品。
利用Tricoderma viride进行的体外真菌生物分析在马铃薯葡萄糖(Difco)琼脂(PDA)平板上培养T.viridePersoon(ATCC 12582)。按照以下文献中披露的方法用它进行体外菌丝抑制测试Schlumbaum等，1986，Nature 324365-367。将PDA上的生长中的T.viride培养物的一个栓转移到一个新的PDA平板的中央。在25℃下培养24小时，在此期间，菌丝从所述中央向外生长。然后在PDA外表面上钻孔，与所述栓的距离相等。将植物蛋白提取物(50μg)添加到每一个孔中，并且在25℃下，在黑暗中继续培养所述平板，然后观察T.viride的生长抑制作用。在16小时和24小时拍照。
使用茄属丝核菌的体内生物分析在以前的northern印迹分析中证实了BjCHI1 mRNA是通过创伤或MeJA处理诱导的(Zhao等，1999，同上)。随后还证实了通过黑曲霉感染和毛虫采食也能诱导BjCHI1(Fung等，2002，同上)。在这里，体内生物分析是按照以下文献中披露的方法用幼小的马铃薯植物进行的Jach等，1995，Plant J.897-109。将在25℃下，在固体PDA培养基上培养5-6天的茄属丝核菌接种到100ml马铃薯葡萄糖营养液(PDB)中，并且在室温下振荡培养(100rpm)1-2周。然后将该培养物转移到装有500ml新鲜PDB的锥形烧瓶中，并且再培养3-4天。然后在装有消毒的8升无菌土壤的植物生长盘中，将该培养物与6L无菌土壤(Bio-Mix Super，The Netherlands)充分混合，10天之后，对该土壤进行均匀混合，然后将来自组织培养物的在无菌土壤中事先生长了2周的马铃薯植物移栽到感染过的土壤中，并且在24℃下，在生长箱中再进行培养，采用12小时光照/12小时黑暗的方案。在移栽到感染过的土壤中2周之后，对马铃薯植物进行拍照。将在没有真菌的无菌土壤中生长的植物用作对照。
6.4结果BjCHI1表达是受茄属丝核菌感染诱导的为了研究真菌诱导对BjCHI1表达的影响，让芥菜幼苗在预先接种了土壤真菌——茄属丝核菌的土壤中生长。在图8a上的我们的结果，证实了在感染过的土壤中生长1天之后，1.3kb BjCHI1 mRNA的表达增强。图8b表示具有37kDa的表观分子量的交叉反应带，它是从在感染过的土壤中生长3天之后开始积累的预期的成熟BjCHI1蛋白。位于该带上面的42-kDa的微弱的带有可能是前体蛋白(图8b)。计算分子量为42,774kDa的BjCHI1前体进行了翻译后裂解，以便除去N-末端信号肽和C-末端液泡导向肽(Zhao和Chye，同上)。我们的结果表明，BjCHI1 mRNA及其相应的蛋白在茄属丝核菌感染之后积累，暗示了它在真菌防御方面的作用。
BjCHI1和HbGLU在转基因马铃薯植物中的表达
BjCHI1表达是通过茄属丝核菌诱导的这一发现，导致我们研究了它们在转基因马铃薯植物中的异源表达是否能赋予对茄属丝核菌的保护作用。通过根癌农杆菌介导的转化，将含有BjCHI1 cDNA的质粒pBj17和pBj47分别导入马铃薯品种Desiree。质粒pBj47还含有HbGLU cDNA，有利于我们研究HbGLU在增强BjCHI1作用方面的功能(如果有这种功能的话)。同样将仅含有HbGLU cDNA的质粒pHEV43和载体对照pBI121用于马铃薯转化。通过northern，Southern和western印迹分析，检查了来自每一种转化的大约20个独立的卡那霉素抗性推测的转基因植物。在图9，10和11中，示出了来自被最终选择用于茄属丝核菌感染实验的每一种转化的代表性品系的分析结果。图9A表示共表达HbGLU和BjCHI1的转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和仅表达HbGLU的转基因马铃薯品系pHEV-P14(泳道5)的northern印迹分析中，用32P-标记过的HbGLU cDNA检测的1.2kb杂交HbGLU mRNA的存在。这条带不存在于未转化过的马铃薯中(图9A，泳道1)。图9B表示用32P-标记的BjCHI1cDNA探针检测的1.3kb BjCHI1杂交mRNA在转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和pBj17-P6(泳道6)中的表达。这条带在未转化过的马铃薯(图9B，泳道1)和pBI121转化过的马铃薯(图9B，泳道5)中不存在。
转基因马铃薯品系的Southern印迹分析然后，将来自所述转基因马铃薯品系的DNA用于利用由BjCHI1或HbGLU cDNA制备的32P-标记过的探针进行Southern印迹分析。图10A中的结果表明在转基因马铃薯品系pHEV43-P14(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBj47-P8(泳道5)和pBj47-P10(泳道6)中存在1.2kb HbGLUEcoRI-杂交带，而在未转化过的马铃薯(泳道1)和pBI121转化过的马铃薯(泳道2)中不存在。所述1.2kb的EcoRI-杂交带相当于在pHEV43的图谱中所示出的带(图7)，并且包括完整长度的HbGLU cDNA。在Southern印迹分析中使用32P-标记过的BjCHI1 cDNA探针和HindIII-消化过的DNA(图10B)，在转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)，pBj47-P10(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)中，检测到了一个0.9kb的HindIII-杂交带。该0.9kb的带相当于在pBj17的图谱中所示出的位于BjCHI1内第二和第三个内部HindIII位点之间的片段(图7)。在未转化过的马铃薯(图10B，泳道1)和pBI121转化过的马铃薯(泳道2)中不存在所述0.9kb的杂交带。在Southern印迹分析中，当用32P-标记过的BjCHI1 cDNA探针检测EcoRI-消化过的DNA时(图10C)，在转基因马铃薯品系pBj47-P10(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)和pBj47-P7(泳道5)中出现了各种大小的杂交带，这表明它们是独立的转基因品系。在未转化过的马铃薯(泳道1)和pBI121转化过的马铃薯(泳道2)中不存在所述杂交带。
转基因马铃薯中BjCHI1和HbGLU的蛋白检测使用抗-HbGLU抗体和抗-BjCHI1抗体，通过Western印迹分析进一步分析转基因植物。使用抗-HbGLU抗体对来自转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pHEV43-P14(泳道4)的粗制蛋白进行的Western印迹分析(图11A)，发现了一个表观分子量为35kDa的相当于HbGLU的交叉反应带。在pBI121转化过的马铃薯(图11A，泳道5)和未转化过的马铃薯(泳道6)中不存在这条带。使用抗-BjCHI1抗体对来自转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pHEV43-P14(泳道4)，pBI121转化过的马铃薯(泳道5)，未转化过的马铃薯(泳道6)和转基因马铃薯品系pBj17-P6(泳道7)的粗制蛋白进行的Western印迹分析，在转基因马铃薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pBj17-P6(泳道7)中发现了表观分子量为52kDa的交叉反应BjCHI1带。在只能表达HbGLU的转基因品系pHEV43-P14(图11B，泳道4)，pBI121转化过的马铃薯(图11B，泳道5)和未转化过的马铃薯(图11B，泳道6)中不存在这条带。马铃薯表达的BjCHI1的表观分子量(52kDa)，类似于观察到的烟草表达的BjCHI1的分子量(Fung等，2002，同上)，并且大于天然BjCHI1的分子量(37kDa)，这有可能是由于在异源宿主烟草和马铃薯中不能进行正确的翻译后加工。
壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶活性分析将进行壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶分析的转基因马铃薯品系与pBI121转化过的马铃薯进行比较(图12)。利用来自pBI121-转化体和转基因马铃薯品系pBj47-P7，pBj47-P8和pBj47-P10的粗制蛋白进行的葡聚糖酶分析(图12A)表明，转基因品系比pBI121转化体具有更高的β-1，3-葡聚糖酶活性水平。利用粗制蛋白进行的壳多糖酶分析(图12B)表明，转基因马铃薯品系pBj47-P7，pBj47-P8和pBj47-P10具有比pBI121转化体更高的壳多糖酶活性。在pBI121转化体中检测到的活性是由于内源马铃薯β-1，3-葡聚糖酶和壳多糖酶的存在。
用T.viride进行体外生物分析然后，对来自转基因马铃薯品系的粗制提取物进行体外T.viride生长抑制实验。在所述生物分析中，用来自未转化过的马铃薯和用pBI121转化过的转基因品系的提取物作对照，用缓冲液作空白对照。在添加蛋白提取物16小时(图13A)和24小时(图13B)之后拍摄的照片表明，T.viride的生长受到了来自能共表达BjCHI1和HbGLU的转基因马铃薯品系pBj47-P10的提取物的抑制，而在仅有缓冲液的对照(2号孔)，来自野生型马铃薯的提取物(3号孔)和pBI121转化过的马铃薯(4号孔)中缺乏抑制作用。仅表达BjCHI1的转基因马铃薯品系pBj17-P6(5号孔)，和仅表达β-1，3-葡聚糖酶的pHEV43-P14(6号孔)表现出比pBj47-P10(1号孔)弱的抑制作用。
用茄属丝核菌进行的体内生物分析体内生物分析是用在用茄属丝核菌预先接种的土壤上生长的幼小植物进行的。在转移到受感染的土壤中之后两周所获得的结果表明，能共表达BjCHI1和HbGLU的转基因马铃薯品系pBj47-P10(图14A)具有比只能表达BjCHI1的转基因马铃薯品系pBj17-P6(图14B)略好一些的生长。转基因马铃薯品系pBj47-P10和pBj17-P6的根发育要比只能表达HbGLU的转基因马铃薯品系pHEV43-P14(图14C)好的多。然而转基因品系pHEV43-P14的根发育比未转化过的马铃薯好(图14D)，这表明HbGLU本身的表达产生了某种保护作用。在无菌土壤(未用茄属丝核菌接种)中生长的对照植物，表现出类似于pBj47-P10转基因植物的根发育(数据未示出)。用茄属丝核菌进行的这种体内生物分析重复产生了一致的结果。
本发明的范围并不局限于所披露的具体实施方案，这些实施方案只是作为对本发明某一方面的具体说明，并且功能等同方案和要素都属于本发明的范围。实际上，除了在本文中所示出的和所披露的之外，本领域技术人员通过以上说明和附图，可以理解本发明的各种改进。这些改进被认为属于所附权利要求书的范围。在本文中引用了多份参考文献，这些文献的内容被以它的全文形式收作本文参考。
序列表<110>Chye，Mee LenZhao，Kai Jun<120>具有增强的对真菌疾病的抗性的遗传修饰过的植物及其生产方法<130>9661-025-999<140>
<141>
<150>60/331,749<151>2001-11-20<160>7<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1297<212>DNA<213>芥菜(B.juncea)<220>
<223>芥菜壳多糖酶(BjCHI1)<400>1aacatgaaga cttatctcct tctccttctc atcttctcac ttctcttatc attttcctcc 60ggtgagcaat gcggtagtca atccataccc gagggagcac tctgccccaa cggtctatgc 120tgcagcgagg ctggatggtg cggcaccacc gaagcttact gcgggcatgg ttgtcaaagc 180cagtgcaatc ctggtcccta tcctcctcct ccaaccccgc agtgtggtcg tcaatccata 240cccgcgggag ccctctgccc caacggtcta tgctgtagcg aggctggatg gtgcggcacc 300accgaagctt actgcgggca tggttgccaa agccagtgca ctcccattcc cactcctcct 360gctcccactc ccactcctcc tactcccact cctcctagtc ctacccctcc tggtcccact 420cctcctggtc ccagcgggga tctttctggc atcatttcaa gagatcagtt ctataaaatg 480cttaagcaca tgaacgacaa tgattgtcat gctgttggtt tcttcactta cgacgccttc 540atcaccgccg ctaagtcttt cccaagtttc gggaacaccg gagaccttgc catgaggaag 600
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<223>芥菜壳多糖酶推测的氨基酸序列(BjCHI1)<400>2Met Lys Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Phe Ser Ser Gly Glu Gln Cys Gly Ser Gln Ser Ile Pro Glu Gly Ala20 25 30Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp Cys Gly Thr35 40 45Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gln Ser Gln Cys Asn Pro Gly50 55 60Pro Tyr Pro Pro Pro Pro Thr Pro Gln Cys Gly Arg Gln Ser Ile Pro65 70 75 80Ala Gly Ala Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp85 90 95
Cys Gly Thr Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gln Ser Gln Cys100 105 110Thr Pro Ile Pro Thr Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro115 120 125Thr Pro Pro Ser Pro Thr Pro Pro Gly Pro Thr Pro Pro Gly Pro Ser130 135 140Gly Asp Leu Ser Gly Ile Ile Ser Arg Asp Gln Phe Tyr Lys Met Leu145 150 155 160Lys His Met Asn Asp Asn Asp Cys His Ala Val Gly Phe Phe Thr Tyr165 170 175Asp Ala Phe Ile Thr Ala Ala Lys Ser Phe Pro Ser Phe Gly Asn Thr180 185 190Gly Asp Leu Ala Met Arg Lys Lys Glu Ile Ala Ala Phe Phe Gly Gln195 200 205Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Trp Ser Gly Ala Pro Asp Gly Ala210 215 220Asn Thr Trp Gly Tyr Cys Tyr Lys Glu Glu Ile Asp Lys Ser Asp Pro225 230 235 240His Cys Asp Ser Asn Asn Leu Glu Trp Pro Cys Ala Pro Gly Lys Phe245 250 255Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Met Met Leu Ser Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly260 265 270Pro Cys Gly Arg Asp Leu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Asn Pro Asp Val275 280 285Ala Ser Ser Asp Pro Val Ile Ala Phe Lys Thr Ala Ile Trp Phe Trp290 295 300Met Thr Pro Gln Ala Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val Ile Thr Asp305 310 315 320Gln Trp Glu Pro Ser Ala Ala Asp Ile Ser Ala Gly Arg Leu Pro Gly325 330 335Tyr Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Ala Gly340 345 350
Arg Asp Val Ala Lys Val Gln Asp Arg Ile Ser Phe Tyr Thr Arg Tyr355 360 365Cys Gly Met Phe Gly Val Asp Pro Gly Ser Asn Ile Asp Cys Asp Asn370 375 380Glu Arg Pro Phe Asn Glu Gly Ser Asn Val Phe Leu Asp Ala Ala Ile385 390 395 400<210>3<211>1242<212>DNA<213>三叶橡胶属(Hevea)<220>
<223>三叶橡胶属1，3-葡聚糖酶(HbGLU)<400>3aaattataag caactttctt ctaatttccc cccttcttaa tggctatctc ctcttcaact 60tcaggaacta gtagttcctt cccctcaaga actactgtca tgcttcttct gtttttcttt 120gcagcaagcg ttggtataac agatgcccag gtaggtgttt gctatggaat gcaaggcaac 180aaccttccac ctgtttcaga ggtcatagct ctctataaaa aatctaacat cacgagaatg 240agaatttatg atccaaatcg agcagtattg gaagccctta gaggctcaaa cattgaactc 300atactaggtg ttccaaactc agatctccaa agccttacca atccttccaa tgcaaaatca 360tgggtacaaa aaaatgttcg tggcttctgg tcaagtgtcc tgttcagata tatagcagtt 420ggcaacgaaa ttagtcctgt caatagaggc acagcttggt tggctcaatt tgttttgcct 480gccatgagaa atatacatga tgctataaga tcagctggtc ttcaagatca aatcaaggtc 540tccactgcaa ttgacttgac cctggtagga aattcctacc ctccttctgc aggtgctttc 600agggatgatg ttagatcata cttggaccca attattggat ttctatcctc tatcaggtca 660cctttacttg ccaatattta tccttacttt acttatgctt ataatccaag ggatatttcc 720cttccctatg ctttgttcac ttcaccatca gttgttgtgt gggatggtca gcgaggttat 780aagaaccttt ttgatgcaac gttggatgca ttgtactctg ctcttgagag ggctagtggt 840ggttctctgg aggtggttgt ttcggaaagt ggctggccgt ctgccggagc atttgctgcc 900acatttgaca atgggcgtac ttatctctca aatttgatcc aacatgttaa aggaggtact 960cctaagaggc ctaacagagc tatagagact tacttatttg ccatgtttga tgaaaataag 1020aagcaaccag aggttgagaa acactttgga cttttctttc ctgataaacg gccaaaatat 1080
aatctcaatt ttggtgcaga aaagaactgg gatatttcta ctgaacacaa tgcaacaata 1140cttttcctta agagtgatat gtgagattgt gagaatttaa gtactatata tatttccaat 1200gtatgcatgt atccatgtat taaataagag aaccttttct ca1242<210>4<211>374<212>PRT<213>三叶橡胶属<220>
<223>三叶橡胶属1，3-葡聚糖酶的推测的氨基酸序列(HbGLU)<400>4Met Ala Ile Ser Ser Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ser Ser Phe Pro Ser1 5 10 15Arg Thr Thr Val Met Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ala Ala Ser Val Gly20 25 30Ile Thr Asp Ala Gln Val Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Gly Asn Asn35 40 45Leu Pro Pro Val Ser Glu Val Ile Ala Leu Tyr Lys Lys Ser Asn Ile50 55 60Thr Arg Met Arg Ile Tyr Asp Pro Asn Arg Ala Val Leu Glu Ala Leu65 70 75 80Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Ile Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu85 90 95Gln Ser Leu Thr Asn Pro Ser Asn Ala Lys Ser Trp Val Gln Lys Asn100 105 110Val Arg Gly Phe Trp Ser Ser Val Leu Phe Arg Tyr Ile Ala Val Gly115 120 125Asn Glu Ile Ser Pro Val Asn Arg Gly Thr Ala Trp Leu Ala Gln Phe130 135 140Val Leu Pro Ala Met Arg Asn Ile His Asp Ala Ile Arg Ser Ala Gly145 150 155 160Leu Gln Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Thr Leu Val
165 170 175Gly Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Asp Asp Val Arg180 185 190Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Phe Leu Ser Ser Ile Arg Ser Pro195 200 205Leu Leu Ala Asn Ile Tyr Pro Tyr Phe Thr Tyr Ala Tyr Asn Pro Arg210 215 220Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ser Pro Ser Val Val Val225 230 235 240Trp Asp Gly Gln Arg Gly Tyr Lys Asn Leu Phe Asp Ala Thr Leu Asp245 250 255Ala Leu Tyr Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Leu Glu Val260 265 270Val Val Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Ala Gly Ala Phe Ala Ala Thr275 280 285Phe Asp Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Ser Asn Leu Ile Gln His Val Lys290 295 300Gly Gly Thr Pro Lys Arg Pro Asn Arg Ala Ile Glu Thr Tyr Leu Phe305 310 315 320Ala Met Phe Asp Glu Asn Lys Lys Gln Pro Glu Val Glu Lys His Phe325 330 335Gly Leu Phe Phe Pro Asp Lys Arg Pro Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Gly340 345 350Ala Glu Lys Asn Trp Asp Ile Ser Thr Glu His Asn Ala Thr Ile Leu355 360 365Phe Leu Lys Ser Asp Met370<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工序列说明C1(正向)引物<400>5ctgaattctc ctccggtgag caatgcg 27<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列说明C21(正向)引物<400>6ctgaattcgg ggatctttct ggcatc 26<210>7<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列说明C2(反向)引物<400>7gcgactgcgg ccgcgttact accttcatta aacg 3权利要求
1.一种重组载体，包括(a)SEQ ID NO1的核苷酸序列或编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸；和(b)SEQ ID NO3的核苷酸序列或编码SEQ ID NO4的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.一种重组载体，包括(a)能在严格条件下与SEQ ID NO1的核苷酸序列的互补体杂交的第一核苷酸序列；和(b)能在严格条件下与SEQ ID NO3的核苷酸序列的互补体杂交的第二核苷酸序列；其中，所述严格条件包括在42℃下，在50％去离子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml变性的50％去离子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA中杂交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤；并且，其中，所述第一核苷酸序列编码功能性壳多糖酶；而所述第二核苷酸序列编码功能性β-1，3-葡聚糖酶。
3.一种重组载体，包括(a)编码包括一个以上壳多糖-结合结构域的壳多糖酶的第一核苷酸序列；和(b)编码β-1，3-葡聚糖酶的第二核苷酸序列。
4.如权利要求1，2或3的重组载体，还包括可操作地与所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列连接的一个或多个调控核酸。
5.如权利要求4的重组载体，其中，所述调控核酸是花椰菜花叶病毒的35S启动子。
6.包括权利要求1，2或3的载体的重组细胞。
7.包括权利要求4的载体的重组细胞。
8.如权利要求6的重组细胞，其中，所述细胞是植物细胞。
9.如权利要求7的重组细胞，其中，所述细胞是植物细胞。
10.如权利要求8的重组细胞，其中，所述植物选自下组小麦，玉米，水稻，大麦，番茄，苹果，梨，草莓，胡萝卜，马铃薯，甜菜，山药，莴苣和菠菜。
11.如权利要求9的重组细胞，其中，所述植物选自下组小麦，玉米，水稻，大麦，番茄，苹果，梨，草莓，胡萝卜，马铃薯，甜菜，山药，莴苣和菠菜。
12.如权利要求10的重组细胞，其中，所述植物是马铃薯。
13.如权利要求11的重组细胞，其中，所述植物是马铃薯。
14.一种重组细胞，包括(a)包括编码包括一个以上壳多糖-结合结构域的壳多糖酶的第一核苷酸序列的第一重组载体；和(b)包括编码β-1，3-葡聚糖酶的第二核苷酸序列的第二重组载体。
15.一种重组细胞，包括(a)包括能在严格条件下与SEQ ID NO1的核苷酸序列的互补体杂交的第一核苷酸序列的第一重组载体；和(b)包括能在严格条件下与SEQ ID NO3的核苷酸序列的互补体杂交的第二核苷酸序列的第二重组载体；其中，所述严格条件包括在42℃下，在50％去离子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA中杂交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤；并且，其中，所述第一核苷酸序列编码功能性壳多糖酶，而所述第二核苷酸序列编码功能性β-1，3-葡聚糖酶。
16.一种生产抗病原体的转化过的植物的方法，包括(a)用一种重组载体转化植物，该载体包括(i)能在严格条件下与SEQ ID NO1的核苷酸序列的互补体杂交的第一核苷酸序列；和(ii)能在严格条件下与SEQ ID NO3的核苷酸序列的互补体杂交的第二核苷酸序列，其中，所述严格条件包括在42℃下，在50％去离子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA中杂交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤；并且，其中，所述第一核苷酸序列编码功能性壳多糖酶，而所述第二核苷酸序列编码功能性β-1，3-葡聚糖酶；和(b)选择其中表达了第一和第二核苷酸序列的转化过的植物。
17.一种用于生产抗病原体的转化过的植物的方法，包括(a)用第一种重组载体转化植物，该载体包括能在严格条件下SEQ ID NO1的核苷酸序列的互补体杂交的第一核苷酸序列；(b)用第二种重组载体转化植物，该载体包括能在严格条件下与SEQ ID NO3的核苷酸序列的互补体杂交的第二核苷酸序列；其中，所述严格条件包括在42℃下，在50％去离子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA中杂交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤；并且，其中，所述第一核苷酸序列编码功能性壳多糖酶，而所述第二核苷酸序列编码功能性β-1，3-葡聚糖酶；和(c)选择其中表达了第一和第二核苷酸序列的转化过的植物。
18.如权利要求16或17的方法，其中，所述病原体是真菌。
19.如权利要求18的方法，其中，所述真菌是茄属丝核菌。
全文摘要
本发明披露了遗传修饰过的植物，如马铃薯植物。在用包括壳多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因的嵌合基因转化植物细胞之后，所述植物对感兴趣的病原体的抗性更高。本发明还提供了一种提高植物对病原体抗性的方法，该方法包括导入编码两种或两种以上壳多糖－结合结构域的芸薹属壳多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因，并且表达所述壳多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因。
文档编号C12N15/56GK1589326SQ02822987
公开日2005年3月2日 申请日期2002年11月18日 优先权日2001年11月20日
发明者蔡美莲, 赵开军 申请人:香港大学