通过热硫化氢热厌氧杆菌dna聚合酶i变体进行的核酸标记的制作方法

专利名称：通过热硫化氢热厌氧杆菌dna聚合酶i变体进行的核酸标记的制作方法
背景技术：
1.发明领域热硫化氢热厌氧杆菌(Tts)DNA聚合酶已被克隆并在大肠杆菌中表达并被纯化。最近一份美国专利(美国专利5744312)已经授予给Amersham生命科学公司。这种聚合酶的显著特点是除了具有DNA依赖型DNA聚合酶催化活性外，还具有RNA依赖型DNA聚合酶和反转录酶催化活性(美国专利5744312)。这种聚合酶的最佳温度范围是37-65℃，最大活性温度是60℃。酶的这些活性结合其热稳定性产生了以下所讨论的优点。这种酶的几种不同变体已经获得并应用于DNA测序，第一链cDNA合成，RT-PCR和链置换扩增。
2.相关技术描述从细菌，病毒，古细菌等不同生物分离出的DNA聚合酶和反转录酶(RTs)已成功用于各种应用的分子生物学领域。这些生物的生长温度范围可以从极高到极低。从这些生物获取的酶可以应用于克隆，聚合酶链式反应(PCR)(美国专利4683195，Mullis等.)，DNA测序，诱变，基因组文库的构建和核酸标记，如微型和巨型阵列的cDNA标记。
DNA聚合酶在DNA合成过程中能辨别非天然碱基的掺入。大多天然DNA聚合酶也不使用RNA作为模板分子，然而，反转录酶的天然模板是RNA和DNA。DNA聚合酶和反转录酶的天然组成元件是四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)。大多天然存在的聚合酶和反转录酶对大多核苷酸类似物表现出很弱的掺入效率。这些类似物可以是天然存在的dNTPs的变体，例如ddNTPs，rNTPs，dNTPs和ddNTPs的结合物(染料或其他)。在宿主的存活中这样的选择是很重要的。非天然碱基的频繁掺入会阻碍后续的复制循环，导致生物的最终死亡。在极端条件下，假如聚合酶使非天然碱基掺入宿主，则有可能使生物最终存活下来。然而这种导致生物体突变的事件仅在极端情况下对其存活是必要的。因此，直接从宿主分离或通过重组方法获得的具有野生型氨基酸序列的天然聚合酶表现出对非天然碱基的辨别作用是不常见的。然而，在类似物有非常高的浓度下，天然聚合酶在DNA合成中虽然很弱但还是会掺入这些类似物。这一特点目前被应用于使用DNA聚合酶或反转录酶进行核酸标记的所有应用中。用天然聚合酶或反转录酶制成的探针的比活性通常是比较低的，目前的使用天然酶来标记的方法遇到了许多技术上的困难。例如，在反应中使用过量的标记核苷酸只能使这些天然存在的酶掺入标记的荧光核苷酸的能力有轻微的提高。但这产生了另外的问题。反应后除去未使用的过量的标记核苷酸通常是困难的，考虑到低的信噪比，这就产生了严重的问题。另外，使用了大量通常稀有的原料，仅获得了极少的标记。除了这些问题，还牺牲了产生的总探针的产量，这是由于野生型聚合酶和反转录酶对一个已掺入的dNTP类似物，例如染料-dNTP的延伸的辨别性。这也是野生聚合酶和反转录酶的固有特点。
在不同应用中更高专一性的探针是有应用价值的，这需要染料-dNMP能很容易的添加以及随后的延伸。染料-dNMP的添加及延伸的重复循环导致形成更高专一性的探针。由于天然聚合酶和反转录酶对dNTP类似物或染料-dNTP的添加和延伸的辨别性，产生的探针的比活性很低。
如上所述，我们期望获得一种改变聚合酶的天然特性，以便在DNA合成中使核苷酸类似物更好地掺入。例如，掺入标记的核苷酸的能力的提高在不同核酸应用如滚环扩增和单核苷酸多态性的检测中是很有用的。这将在下面更详细的予以解释。
发明概述相应的，本发明的目的是提供一种具有酶活性的DNA聚合酶，它能够提高核苷酸类似物和天然碱基在DNA合成中的掺入，还提供一种使用DNA聚合酶或其活性片断掺入染料标记的dNTPs的方法。本发明进一步的目的是提供一种利用DNA聚合酶进行直接的RNA测序的方法和试剂盒，并且提供一种含有DNA聚合酶的试剂盒，用于标记采用DNA或RNA引物从DNA或RNA模板获得的多核苷酸。
本发明能满足这些目标，在一方面涉及一种DNA聚合酶或其活性片断。该DNA聚合酶或活性片断在氨基酸序列上具有同热硫化氢热厌氧杆菌DNA聚合酶或其片断至少80％的同一性，并且在Tts Pol I位点720或ΔTts位点426或针对Tts DNA聚合酶确定的同源位点上有一个氨基酸改变，与未改变的酶相比提高了核苷酸类似物和天然碱基在DNA合成中的掺入。在一个实施方案中所述核苷酸类似物是dNTP，ddNTP和rNTP类似物。在第二个实施方案中，该dNTP，ddNTP和rNTP类似物是染料偶联或生物素偶联的，在第三个实施方案中染料偶联核苷酸类似物中的染料是若丹明或花青衍生的染料，在第四个实施方案中若丹明染料是R110，R6G，TMR或ROX，在第五个实施方案中花青衍生染料是Cy3，Cy3.5，Cy5.0或Cy5.5，在第六个实施方案中DNA聚合酶在Tts Pol I位点720或ΔTts Pol I位点426的天冬氨酸被精氨酸取代。
本发明相关的一方面涉及使用热硫化氢热厌氧杆菌DNA聚合酶或其片断的方法，该酶在Tts Pol I的位点720或ΔTts位点426或针对Tts DNA聚合酶确定的同源位点有一个氨基酸改变，与未改变的酶相比提高了核苷酸类似物和天然碱基在DNA合成中的掺入，用于在37-65℃的反应温度范围掺入Cy3和Cy5染料偶联的dNTPs。
更进一步，本发明涉及一种利用DNA聚合酶进行直接RNA测序的方法，更进一步的方面涉及提供含有DNA聚合酶的试剂盒，用于标记采用DNA或RNA引物从DNA或RNA模板获得的多核苷酸。
下面结合附图对发明作出具体描述，以使本发明的上述目标和特点显得更加清楚。
附图的简要说明

图1(SEQ ID NO1)是全长Tts DNA聚合酶I的氨基酸序列。全长重组形式的酶，具有天然的5’-3’DNA模板介导的DNA聚合酶功能和5’-3’核酸外切酶功能(在美国专利5744312中公开)，作为参考氨基酸序列，另外，这种酶具有反转录酶的活性。
图1A(SEQ ID NO2)是全长Tts DNA聚合酶I的DNA序列(在美国专利5744312中公开)。
图2(SEQ ID NO3)是ΔTts DNA聚合酶I的氨基酸序列，一种氨基端被截短的5’-3’核酸外切酶缺陷(exo-)的酶形式(在美国专利5744312中公开)，方框内部分代表从酶的全长形式中缺失的氨基酸。
图2A.ΔTts DNA聚合酶I的DNA序列(SEQ ID NO4)(在美国专利5744312中公开)。
图3ΔTts DNA聚合酶I的F412Y变体的氨基酸序列(在美国专利5744312中公开)。方框内部分代表从酶的全长形式中缺失的氨基酸(ΔTts的位点412对应于全长酶的706，该位点的苯丙氨酸与辨别ddNTP有关，F412Y的改变促进了ddNTP的掺入(SEQ ID NO5)。
图3AΔTts DNA聚合酶I的F412Y变体的DNA序列(SEQ ID NO6)(在美国专利5744312中公开)。
图4ΔTts F412YD426R变体聚合酶的氨基酸序列。方框部分是从酶的全长形式中缺失的氨基酸，ΔTts位点412对应于全长酶的706，该位点的苯丙氨酸与辨别ddNTP有关。ΔTts位点426对应于全长酶的720。对于染料与dNTP，rNTP，ddNTP偶联物的掺入和延伸的辨别作用由该位点天冬氨酸残基支配。通过基于寡核苷酸的定点突变技术产生突变，以在Tts F412Y背景中引入ΔTtsD426R改变(SEQ ID NO7)。
图5ΔTts D426R聚合酶的氨基酸序列。方框部分是从酶的全长形式中缺失的氨基酸，ΔTts位点426对应于全长酶的720。对于染料与dNTP，rNTP，ddNTP偶联物的掺入和延伸的辨别作用由该位点天冬氨酸残基支配(SEQ ID NO8)图6不同微生物的野生型Pol I序列的比对。显示了Pol1家族的聚合酶“指纹区”附近的同源位点。Richardson，“DNA polymerase from Escherichia coli”，Procedures in Nucleic Acid Research，Cantoni，Davies editors，Harper，Row，NewYork，pp.263-276(1996).Scopes，Protein Purification，Springerverlag，New York，New York，pp.4648(1994)图7ΔTtsPol I的D426R形式提高了染料(Cy3.5)-dCTP和dCTP的掺入图8用AMV RT，ΔTts和ΔTtsF412Y Pol I进行的直接RNA测序图9ΔTts F412YD426R在使用Cy3和Cy5-dCTP进行cDNA标记中的性能和在微阵列应用中的用途图10ΔTts F412YD426R在使用Cy3和Cy5-dUTP进行cDNA标记中的性能和在微阵列应用中的用途图11ΔTts F412Y或ΔTtsF412YD426R Pol I在以RNA作模板的单核苷酸引物延伸(SnuPE)中的作用。显示了染料标记或未标记的ddA，ddT，ddG，ddC的掺入。
图12ΔTts DNA聚合酶在滚环扩增反应中的应用图13DNA依赖型DNA合成ΔTts，ΔTts F412Y，ΔTtsF412YD426R过程中对染料标记的核苷酸的掺入。
图14a和bΔTtsF412YD426R在使用Cy3/Cy5-dCTP进行cDNA标记中的性能，显示了在很宽的温度范围内基因表达的精确测定。
发明详述本发明公开了热硫化氢热厌氧杆菌的天然DNA聚合酶I和DNA聚合酶I变体形式在用荧光核苷酸类似物进行核酸标记中的用途。也涵盖了例如cDNA标记，滚环扩增，RNA测序，和RNA上的单核苷酸引物延伸的领域中的应用。
本发明中我们发现了改变聚合酶的天然特性以提高核苷酸类似物在DNA合成中的掺入的途径。这里所描述的是可引入天然聚合酶/反转录酶以促进荧光标记核苷酸掺入的修饰。本发明鉴定了聚合酶中负责提高某些核苷酸类似物的掺入的一个单独的氨基酸残基。在该氨基酸位点残基的改变导致该酶使染料标记的核苷酸的掺入和延伸能力大大提高。这一特性应用于通过DNA聚合酶使核苷酸类似物掺入来进行荧光标记的核酸应用领域。这些应用包括在例如用微阵列分析基因表达等多种应用中，在DNA合成过程中进行标记。我们还展示了该酶的不同变体在直接RNA测序，滚环扩增，使用DNA或RNA为模板通过单核苷酸引物延伸的单核苷酸多态性(SNP)检测中的用途。本发明涉及酶的野生型和突变形式以及它们的DNA序列，氨基酸序列，以及用于产生它们的载体。
本发明的第一个方面涉及产生和纯化热硫化氢热厌氧杆菌的天然DNA聚合酶I的变体形式，该变体的聚合酶序列与图1所示氨基酸序列(美国专利5744312)至少有80％同一性。
图1显示了在专利(美国专利5744312)(SEQ ID NO1)中披露的Tts基因组DNA位点1056-3674编码的氨基酸参考序列。先前的公开内容中已经对该酶进行工程化以去除在天然酶中相关的5’-3’核酸外切酶功能，这里在图2中作为参考序列示出。
为便于参考，在此列出了图1，2，3(在美国专利5744312中公开)。图1是酶的全长重组形式，具有天然的5’-3’DNA模板介导的DNA聚合酶功能和5’-3’核酸外切酶(在美国专利5744312中公开)，在图1中作为一个参考氨基酸序列。本说明书中的酶的全长形式将称作Tts DNA Pol I。
图2是酶的5’-3’核酸外切酶缺陷(exo-)形式，氨基末端被截短(在美国专利5744312中公开)。此处将酶的这种形式称作ΔTts酶。酶的截短形式的氨基酸编号从截短形式的第一个氨基酸开始计算。另外，在本说明书的一些情况下，为了易于比较，氨基酸的编号也表示于酶的未截短的全长形式。
图3是酶的一种核酸外切酶缺陷的截短形式，在O-helix区位点412具有F(苯丙氨酸)变为Y(酪氨酸)的改变，在此列出作为参考(在美国专利5744312中公开)。
图4是在酶的ΔTts F412Y形式的位点426中引入将天冬氨酸(D)改变为精氨酸(R)的点突变的酶，酶的这种形式在此称作ΔTts F412YD420R。
图5显示了称作ΔTtsD426R的酶的另一种形式，将酶ΔTts F412Y形式的位点412从酪氨酸残基(Y)恢复为苯丙氨酸(F)。单字母氨基酸是以本领域的传统代码表示。
美国专利5744312显示了天然的Tts，ΔTts，ΔTts F412Y在cDNA制备，链的置换扩增(Walker et al.″Isothermal in vitro amplification of DNA by a restrictionenzyme/DNA polymerase system，″Proc.natl.Acad.Sci.USA89392-396(1992))和DNA测序中的用途。
本发明显示了不同形式的Tts酶在非天然碱基类似物在DNA合成中的掺入方面的应用。一些例子是dNTPs，rNTPs，和ddNTPs的未标记或染料标记形式的掺入。DNA合成可以是DNA模板介导(DNA聚合酶活性)或RNA模板介导(反转录酶活性)。DNA或RNA模板介导的cDNA探针在微阵列领域有越来越高的需求。本发明证实这种酶变体在DNA合成中的核酸标记，特别强调了在用于基因表达研究的微阵列领域的用途。
ddNTP或ddNTP类似物的掺入在例如DNA或RNA测序领域是非常有用的。在此证实了酶的ΔTts F412Y和ΔTts F412YD426R在例如直接RNA测序的领域和监测单核苷酸引物延伸的情形中有很好的前景。例如ΔTts F412Y变体相对于逆转录病毒的反转录酶可以从RNA的短片断中获得很好的序列信息。本说明书的试验结果还表明一些酶变体在用于探测DNA或RNA主链的靶序列的单核苷酸引物延伸(SnuPE)中的用途。
这一发现还应用于涉及DNA或RNA的单多态性检测和突变检测的领域。RNA水平的直接突变检测在许多方面都是有用的。这样的领域的一个例子是从接受药物治疗的病人中检测人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的药物抗性突变。HIV反转录酶和蛋白酶抑制因子的抗性突变直接归结于RNA基因组中编码这些蛋白的基因的突变。另外，在人和高等生物中导致缺陷mRNA的不正确RNA剪接与主要的疾病相关。依靠ΔTts F412Y或ΔTts F412YD426R变体利用SnuPE直接对限制片断RNA测序或直接对不正确剪接的RNA进行突变检测是可行的。这同下述现行方法是不同的。现行方法中由于逆转录病毒反转录酶不是很好的测序酶，因此在测序之前需要进行一个RT-PCR步骤。
除了突变检测，Tts Pol I变体可被用于评估RNA拷贝数目。这在HIV研究或基因表达研究中很有价值。这种酶在cDNA合成中掺入染料-终止子和掺入染料标记的dNTP及ddNTP的潜力可应用于评估HIV-RNA的拷贝数，进而评估病毒浓度。这种通过ΔTtsD426R得到染料标记核苷酸掺入的特点在微型或巨型阵列的mRNA定量、基因表达研究中是有用的。可选用目前广泛应用的策略1)用于评估病毒RNA和mRNA的定量RT-PCR，2)病毒的分支DNA/核酸酶切除和mRNA定量。
本发明还证实了Tts酶变体在链置换扩增如滚环扩增(RCA)中的用途。
实施例下述实施例用以解释本发明DNA聚合酶的用途，仅出于解释目的，不应该用于以任何方式用以限制所附权利要求。
实施例1ΔTtsF412YD426R变体的产生(图4)携带美国专利5744312中披露的ΔTts F412Y的表达载体PLS-3作为本发明的起始质粒。我们设计了引物使ΔTts Pol 1中编码残基426的密码子从编码天冬氨酸变为编码精氨酸。我们使用了一个正向引物序列“gggctttctcgacgccttaaaatatca″(SEQ ID NO9)(编码位点422到430)和一个互补序列来引入目的点突变。用于编码氨基酸R的新密码子是“cgc”。引物退火，然后在所有四种dNTPs存在下利用Pfu DNA聚合酶循环反应以产生新链。最终产物用于转化大肠杆菌菌株，然后分别进行DNA测序筛选，以选择具有所需突变的克隆。
实施例2ΔTts D426R变体的产生(图5)一个包含如实施例1所示具有ΔTts F412YD426R变体的质粒的克隆作为产生ΔTts D426R变体的起始物质。使用类似上述的策略。设计了两个互补引物以在ΔTts F412YD426R位点412引入预期的最初的苯丙氨酸“F”残基。我们设计了一个正向引物GCCGTAAATTTTGGCATAATATATGGC(SEQ ID NO10)(跨ΔTts F412YD426R聚合酶的位点409到417)和一个互补序列以改变“Y”残基。使用编码苯丙氨酸的密码子“TTT”以实施改变。
实施例3来源于不同微生物的野生型Pol I的比对图6这里显示了Pol I家族的聚合酶的指纹区的同源位点。注意对应于全长TtsPol I的位点720(ΔTts的位点426)的氨基酸的比对。方框区表明了这些酶之间的同源区。对应于Tts Pol I 706位点的苯丙氨酸在对ddNTPs辨别方面的作用在此作为参考并已记录于文献。本专利的权利要求覆盖全长Tts DNA聚合酶I的720位点的氨基酸的作用。这一氨基酸的改变促进染料标记的核苷酸类似物的掺入。这一位点的负电荷氨基酸对于染料标记核苷酸的掺入更有辨别性。改变为正电荷氨基酸例如精氨酸，赖氨酸或其他大的残基会降低对于dNTP或ddNTP偶联物的辨别。天然聚合酶作为染料核酸标记的应用和天然具有除谷氨酸天冬氨酸外的残基的聚合酶也包括在本专利中。
实施例4分析条件图7中显示的试验研究了染料-CTP(Cy3.5-dCTP)和dCTP的相对掺入效率。本试验对三种酶制剂ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R进行了分析。
所有Tts Pol I变体的反转录酶(RNA依赖型DNA聚合酶)和DNA聚合酶(DNA依赖型DNA聚合酶)反应的最佳的1x缓冲液组成如下所述。Tris，PH8.0(50mM)，KCL(40mM)，MgCl2(3mM)，DTT(1mM)，DNA或RNA模板(必需时)，引物(5到50 femto mols)，酶0.5到1单位，dNTP或dNTP类似物(浓度根据需要改变)。在标准合成反应中，当监测全长合成时，还要包括50uM包括所有四种dNTPs。典型反应体积是10uL，反应温度根据试验需要保持在37-60℃。对于单核苷酸掺入反应时间限制在10分钟。依试验目的可以改变时间，如果进行更长的延伸有时则监测最多至1小时。
图7中显示的试验研究了染料-CTP(Cy3.5-cCTP)和dCTP的相对掺入效率。本试验对三种酶制剂ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R进行了分析。
图7中，球蛋白mRNA作为模板。一个5’P-33标记的引物(DNA 25聚体)与模板进行退火。反应中对单独的Cy3.5-dCTP或dCTP控制浓度仅仅包括一种dNTP保证了下一步正确的单独的核苷酸掺入。允许检测单个核苷酸“C”掺入的模板-引物的序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO11)TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16 3’-5’(SEQ ID NO12)第1，2，3和4道包含20，2，0.2和0.02uM的dNTP或染料-dNTP。没有标记的道没有酶，显示起始P-33标记的引物的完整性。对单核苷酸延伸产物进行定量是判断酶中的DR改变是否产生了任何结果的一种方法。“P”代表放射标记的引物，“P+1”表示单个核苷酸或核苷酸类似物的延伸产物。P+1随着染料-dNTP偶联物缓慢移动。注意含Cy3.5 dCMP的带与dCTP延伸产物相比在凝胶上移动缓慢。比较A，B，C板，1-4道都显示出将酶的氨基酸主链从D改变到R导致天然核苷酸效率的提高。采用进行了DR改变的酶，在较低dCTP浓度下获得了10-100倍的P+1产物。同样，比较A’，B’，C’可以发现DR改变导致染料-CTP掺入的提高。重要的是，与野生型聚合酶相比可在更低染料-dNTP浓度(低10倍)的情况下获得掺入。很明显，DR酶可在0.2uM(Cy3.5CTP)或甚至更低的浓度下掺入Cy3.5dCTP。将其与D酶相比，在这么低的浓度下D酶表现出相对差的掺入。这些结果也表明该突变大大逆转了在B板中所见的TtsF412Y对染料-CTP掺入的下降。在这一实验中模板-引物是与放射标记的引物退火的mRNA。天然核苷酸的延伸定量监测为P+1，染料标记的核苷酸的延伸监测为P+1*。这是第一次观察到有希望用于cDNA探针标记的微阵列应用。
实施例5用AMV RT，ΔTts和ΔTtsF412Y Pol I直接进行RNA测序(图8)球蛋白mRNA作为模板。50聚体DNA作为引物。Amersham PharmaciaThermo Sequenase试剂盒中的标准测序成分用来测序。P-33标记的终止子(ddNTP)是从Amersham Pharmacia Biotech获得。测序后反应产物是从6％尿素-聚丙烯酰胺凝胶上分离。AMV，禽成髓细胞瘤病毒RT。
实施例6ΔTtsF412YD426R在使用Cy3和Cy5-dCTP进行cDNA标记中的作用和在微阵列领域中的应用(图9)典型的20μl反应，Cy3或Cy5反应，在1x反应缓冲液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和TTP以及取决于反应的50um CTP，Cy3-dCTP，或Cy5-dCTP中的每一种)中具有1ug人骨肌mRNA，寡dT(25)和随机九聚体引物和TtsFYDR聚合酶。不同浓度的已知序列组成的对照mRNAs(APBiotech Inc.)作为动态范围和基因表达比值的对照。Tts反应在从50℃开始的温度下进行。模板RNA通过碱处理水解并用HEPES中和。
探针用MultiScreen滤器(Millipore)纯化，用分光光度法计量。包含有人cDNA基因目标的载玻片与同等量(每个30pmol)Cy3和Cy5标记的cDNA探针杂交。载玻片用GenePix(Axon)扫描仪进行扫描，用ImageQuant软件进行定量。此图显示了探针的精确特征，Cy3与Cy5的接近平均的掺入，和Cy3与Cy5反应中的差示基因表达。
实施例7ΔTtsF412YD426R在使用Cy3和Cy5-dUTP进行cDNA标记中的作用和在微阵列领域中的应用(图10)典型的20μl反应，Cy3或Cy5反应，在1x反应缓冲液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和CTP以及取决于反应的50um TTP，Cy3-dUTP，或Cy5-dUTP中的每一种)中具有1ug人骨肌mRNA，寡dT(25)和随机九聚体引物和TtsFYDR聚合酶。不同浓度的已知序列组成的对照mRNAs(APBiotech Inc.)作为动态范围和基因表达比值的对照。Tts反应在从50℃开始的温度下进行。模板RNA通过碱处理水解并用HEPES中和。
探针用MultiScreen滤器(Millipore)纯化，用分光光度法计量。包含有人cDNA基因目标的载玻片与同等量(每个30pmol)Cy3和Cy5标记的cDNA探针杂交。载玻片用GenePix(Axon)扫描仪进行扫描，用ImageQuant软件进行定量。此图显示了探针的精确特征，Cy3与Cy5的接近平均的掺入，和Cy3与Cy5反应中的差示基因表达。
实施例8ΔTtsF412Y或ΔTtsF412YD426R Pol I应用于SnuPE，基于RNA的单核苷酸引物延伸以检测目标碱基(图11)。第1道是dNTP(A，B，C，D中的板G，A，T或C)。第2道是冷ddNTP。第3道是染料标记的ddNTP(连接臂长度11个碳原子)。第4道是染料标记的ddNTP(连接臂长度4个碳原子)。染料选自若丹明家类，包括FAM，R6G，TMR，ROX，用4或11碳键偶联于ddG，ddA，ddT和ddC。
检测单核苷酸“G”掺入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO13)TCTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-18(3’-5’)(SEQ ID NO14)检测单核苷酸“A”掺入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO15)GTCTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-19(3’-5’)(SEQ ID NO16)检测单核苷酸“T”掺入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO17)CTTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-17(3’-5’)(SEQ ID NO18)检测单核苷酸“C”掺入的模板-引物序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’mRNA(SEQ ID NO19)
TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16(3’-5’)(SEQ ID NO20)用Tts变体检测染料-ddNTP或ddNTP的效率的分析如下所述。含有除了ddNTP或染料-ddNTP之外的所有反应成分的混合物以如下方法制备。反应包含下述成分Tris，PH8.0(50mM)，KCl(40mM)，MgCl2(3mM)DTT(1mM)dNTP或染料dNTP0.2uM(1，2，3，4道)，5’标记的p-33引物(0.2皮摩尔)，mRNA球蛋白模板(100ng)，10ul反应体积的酶。
各成分在60℃处理10分钟，然后缓慢冷却到37℃以允许进行正确的退火，从而完成模板-引物退火。反应在适当温度进行10分钟。然后加入6ul甲酰胺终止溶液终止反应。分离样品并在16％变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。湿的疑胶在Whatmann滤纸上干燥，利用放射自显影或磷光成像仪成像。
实施例9应用ΔTts于RCA反应(图12)等温滚环扩增反应如下进行。如下混合模板环形DNA与引物1(与环互补)和2(与环的极性相同)，与包括酶的所有成分混合。反应在55℃下进行1小时，产物在1％琼脂糖凝胶上分离然后分析。20ul的反应液包括，Tris pH8.0(50uM)，KCl(40uM)，MgCl2(3uM)，DTT(1uM)，和dNTP(400uM)，引物1和2(各1uM)，模板和酶20单位。Tth Pol I反应在70℃进行，Bst DNAPol反应在55℃进行。
实施例10在DNA依赖型DNA合成中ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R对染料标记的核苷酸的掺入作用(图13)使用一个确定的模板-DNA引物监测引物延伸在本实验中我们检测了染料-CTP(Cy3.5-dCTP)的相对掺入效率。检测了ΔTts，ΔTtsF412Y，ΔTtsF412YD426R三种酶。
如下所示的确定的DNA作为模板。一个P-33标记引物(DNA 25聚体)退火到模板上。反应中对单独的Cy3.5-dCTP或dCTP控制浓度。仅仅包括一种dNTP保证了接下来正确的单独的核苷酸掺入。允许检测单个核苷酸“C”的掺入的模板-引物的序列如下所示CAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCA5’3’DNA(SEQ ID NO21)TTCCACCACCGACCACACCGGTTACGG*CP-16 3’-5’(SEQ ID NO22)1，2，3，4，5道包含了20，2，0.2，0.02和0uM染料-dCTP。5道没有酶，以显示起始P-33标记的引物的完整性。定量单核苷酸延伸产物是辨别酶的DR改变是否产生了结果的一种方法。“P”表示放射标记的引物，“P+1”表示单核苷酸或核苷酸类似物的延伸产物。P+1同染料-dNTP偶联物缓慢移动，注意含Cy3.5-dCTP的带与dCMP延伸产物相比在胶体上移动缓慢。比较板A，B，和C，1-4道都显示出将酶的氨基酸主链从D改变到R导致天然核苷酸掺入效率的提高。采用进行了DR改变的酶，在较低染料-dCTP浓度下，获得了10-100倍的P+1产物。重要的是，与野生型聚合酶相比可在更低的染料-dNMP浓度下获得掺入。很明显DR酶可在0.2uM或甚至更低的浓度下掺入Cy3.5-dCTP。与此相比，在这么低的浓度下D酶(野生型)表现出相对低的掺入。这些结果也表明该突变大大逆转了在图B板中所见的Tts F412Y对染料-CTP掺入作用的下降。这些结果证明了DR变体在DNA模板依赖型合成中的标记方面的用途。
实施例11ΔTtsF412YD426R在使用Cy3/Cy5-dCTP的cDNA标记中的性能，表明了在一个很宽的反应温度范围内的基因表达的精确测量(图14a和b)20μl反应，Cy3或Cy5反应，在1x反应缓冲液(50mM Tris，PH8.0，1mMDDT，40mM KC，100uM dA，G和TTP以及取决于反应的50um CTP，Cy3-dCTP，Cy5-dCTP中的每一种)中具有1μg人骨骼肌mRNA，寡dT(25)和随机九聚体引物和TtsFYDR聚合酶。不同浓度的已知序列组成的对照mRNAs(APBiotech Inc.)作为动态范围和基因表达比值的对照。Tts反应在从37，42，45，50，55，60，65℃开始的温度下进行。用Superscript II(LIFETECHNOLOGIES)，cDNA合成反应在42℃下进行。模板RNA通过碱处理水解并用HEPES中和。
探针用MultiScreen滤器(Millipore)纯化，用分光光度法计量。包含人cDNA目标基因的载玻片与同等量(各30pmol)的Cy3和Cy5标记的cDNA探针杂交。载玻片用GenePix(Axon)扫描仪进行扫描，用ImageQuant软件进行定量。将标准化因子2(由于Cy3和Cy5不同的激发效率)用于观察到的粗荧光信号比值的标准化。本图显示了Cy3和Cy5反应中基因表达差异的精确的测量。例如在所有的温度范围内，标准化的观察到的比值与目标比值非常接近，表明使用ΔTtsF412YD426R在一个很宽的温度范围内精确测定基因表达差异的能力。
实施例12蛋白纯化方案ΔTtsF412YD426R或ΔTtsD426R Pol I纯化方案以下是改进用于将从1L LB培养基中收获的细胞用于起始酶评价研究(典型湿细胞是产量4-6g)的方案。包含表达载体的大肠杆菌细胞根据先前的专利所描述的方法培养，收获，冰贮直至准备使用。每克湿细胞糊加入5ml溶胞缓冲液进行溶胞作用(50mM Tris Ph8.0，1mM EDTA，50mM NaCl，10％甘油，并含有1mg/ml溶菌酶)。细胞在冰上放置40分钟。重悬浮后细胞在15000PSI条件下通过弗氏压碎机。溶胞之后，细胞抽提物在70℃下处理以使宿主酶失活。抽提物然后在12000rpm离心30分钟。包含酶级分的上清液然后用做进一步纯化。
溶胞产物上样于预先用缓冲液A(Tris 50Mm(PH7.5)，EDTA 1mM，Nacl150mM，10％甘油)平衡过的Q-Sepharose HP柱。该柱用缓冲液A冲洗四次，流速是8-10ml/分钟。这一步骤选择性地结合核酸，包含酶的流通液在接下来的柱中继续使用。流通的样品浓缩成小体积，通过切向流和透析过滤装置去盐以准备通过下一个柱。样品上样于第二个预先用缓冲液B(Tris 50mM(PH7.5)，EDTA 1mM，10％甘油)平衡过的Q-Sepharose HP柱。该柱用三倍额外的柱体积的缓冲液B冲洗以除去未结合的蛋白质。ΔTts F412YD426R Pol I制剂物通过用NaCl建立0-30％梯度盐而进行洗脱。洗脱样品通过缓冲液C(30mM磷酸钠，30mM甲酸钠，60mM醋酸钠，1mM EDTA和10％甘油)透析。透析样品上样于预先用缓冲液C平衡过的Resource S柱。该柱用三倍额外的柱体积的缓冲液C冲洗以除去未结合的蛋白。ΔTtsF412YD426R Pol I通过使用NaCl建立0-50％盐梯度洗脱。这一样品包含了纯化的酶制剂。
ΔTtsD426R Pol I应用类似的纯化方案。
序列表<110>AMERSHAM BIOSCIENCES CORP.
<120>通过热硫化氢热厌氧杆菌DNA聚合酶I变体进行的核酸标记<130>PB01107 PCT<140>PCT/US02/40798<141>2002-12-20<150>60/343,023<151>2001-12-20<160>32<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>872<212>PRT<213>热硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)<400>1Met Tyr Lys Phe Leu Ile Ile Asp Gly Ser Ser Leu Met Tyr Arg Ala1 5 10 15Tyr Tyr Ala Leu Pro Met Leu Thr Thr Ser Glu Gly Leu Pro Thr Asn20 25 30Ala Leu Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Ile Lys Leu Ile Glu Glu Glu35 40 45Lys Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Phe Asp Lys Lys Ala Pro Thr Phe50 55 60Arg His Lys Glu Tyr Gln Asp Tyr Lys Ala Thr Arg Gln Ala Met Pro65 70 75 80Glu Glu Leu Ala Glu Gln Val Asp Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gly85 90 95Phe Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile100 105 110Ile Gly Thr Ile Ser Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Met Glu Val Leu115 120 125Val Val Thr Gly Asp Arg Asp Ala Leu Gln Leu Val Ser Asp Lys Val130 135 140Lys Ile Lys Ile Ser Lys Lys Gly Ile Thr Gln Met Glu Glu Phe Asp145 150 155 160Glu Lys Ala Ile Leu Glu Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Gln Gln Phe Ile165 170 175Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val180 185 190
Pro Asn Ile Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu Lys Asp Phe Gly195 200 205Thr Ile Glu Asn Leu Ile Gln Asn Leu Ser Gln Leu Lys Gly Lys Ile210 215 220Lys Glu Asn Ile Glu Asn Asn Lys Glu Leu Ala Ile Met Ser Lys Arg225 230 235 240Leu Ala Thr Ile Lys Arg Asp Ile Pro Ile Glu Ile Asp Phe Glu Glu245 250 255Tyr Lys Val Lys Lys Phe Asn Glu Glu Lys Leu Leu Glu Leu Phe Asn260 265 270Lys Leu Glu Phe Phe Ser Leu Ile Asp Asn Ile Lys Lys Glu Ser Ser275 280 285Ile Glu Ile Val Asp Asn His Lys Val Glu Lys Trp Ser Lys Val Asp290 295 300Ile Lys Glu Leu Val Thr Leu Leu Gln Asp Asn Arg Ash Ile Ala Phe305 310 315 320Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Gly Glu Ile Lys Lys Ile Ala Phe Ser Phe325 330 335Gly Lys Asp Thr Val Tyr Ile Asp Val Phe Gln Thr Glu Asp Leu Lys340 345 350Glu Ile Phe Glu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Thr Thr His Glu Ile Lys355 360 365Asp Phe Leu Val Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Ile Glu Cys Lys Ser Lys370 375 380Tyr Ile Asp Thr Ala Val Met Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Glu Ser385 390 395 400Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Val Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Val Asp Val405 410 415Pro Ser Tyr Glu Gly Ile Phe Gly Lys Gly Arg Asp Lys Lys Lys Ile420 425 430Glu Glu Ile Asp Glu Asn Ile Leu Ala Asp Tyr Ile Cys Ser Arg Cys435 440 445Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Glu Lys Leu Met Asn Phe Ile Glu Glu450 455 460Met Asp Met Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ile Glu Met Pro Leu Val Glu465 470 475 480Val Leu Lys Ser Met Glu Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lys Glu Val485 490 495Leu Lys Glu Leu Ser Gln Lys Ile Asp Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu500 505 510
Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Ala Gly Tyr Gln Phe Asn Val Asn Ser Pro515 520 525Lys Gln Leu Ser Glu Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asn Leu Pro Val Ile530 535 540Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp Ser Glu Val Leu Glu Gln545 550 555 560Leu Val Pro Tyr Asn Asp Ile Val Ser Asp Ile Ile Glu Tyr Arg Gln565 570 575Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Gly Phe Leu Pro Leu Met580 585 590Asp Glu Asn Asn Arg Val His Ser Asn Phe Lys Gln Met Val Thr Ala595 600 605Thr Gly Arg Ile Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile610 615 620Arg Glu Glu Phe Gly Arg Gln Ile Arg Arg Ala Phe Ile Pro Arg Ser625 630 635 640Arg Asp Gly Tyr Ile Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg645 650 655Val Leu Ala His Val Ser Gly Asp Glu Lys Leu Ile Glu Ser Phe Met660 665 670Asn Asn Glu Asp Ile His Leu Arg Thr Ala Ser Glu Val Phe Lys Val675 680 685Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val690 695 700Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Arg Asp705 710 715 720Leu Lys Ile Ser Arg Lys Glu Ala Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Tyr Phe725 730 735Glu Arg Tyr Lys Gly Val Lys Asp Tyr Ile Glu Lys Ile Val Arg Phe740 745 750Ala Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Thr Ile Met Asn Arg Arg Arg Tyr755 760 765Ile Pro Glu Ile Asn Ser Arg Asn Phe Thr Gln Arg Ser Gln Ala Glu770 775 780Arg Leu Ala Met Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile785 790 795 800Lys Met Ala Met Val Lys Val Tyr Asn Asp Leu Lys Lys Leu Lys Leu805 810 815Lys Ser Lys Leu Ile Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Val Asp Thr820 825 830
Tyr Lys Asp Glu Val Asp Ile Ile Lys Lys Ile Leu Lys Glu Asn Met835 840 845Glu Asn Val Val Gln Leu Lys Val Pro Leu Val Val Glu Ile Gly Val850 855 860Gly Pro Asn Trp Phe Leu Ala Lys865 870<210>2<211>2619<212>DNA<213>热硫化氢热厌氧杆菌<400>2atgtataaat ttttaataat tgatggaagt agcctcatgt acagagccta ttatgccttg 60cccatgctta ctacaagtga gggattgcct acaaatgctc tgtatggttt tactatgatg 120cttataaaac ttatcgagga ggaaaaacct gattacatag ctattgcttt tgacaaaaaa 180gctcctactt ttagacacaa agaatatcaa gactacaaag ctacaagaca agctatgcct 240gaagaacttg ctgaacaagt agactatttg aaagaaatta tagatggctt taatataaag 300acattagaat tagaaggtta tgaagctgat gacattatag ggactatttc aaagctggca 360gaggaaaaag gaatggaagt gcttgtagtt acaggagaca gagatgctct tcaattagtt 420tcagataaag tgaagataaa aatttctaaa aagggtatta ctcagatgga agagtttgac 480gaaaaggcta ttttagaaag gtatggaata actcctcagc agtttataga tttaaaaggg 540cttatgggag ataaatctga taatatccct ggagtaccta atatagggga aaaaactgcg 600attaagctat taaaggattt tggaacaatt gaaaatttaa tccaaaatct ttctcagctt 660aaaggtaaaa taaaagaaaa tatagaaaac aataaagagt tagctataat gagtaagagg 720cttgctacta taaaaagaga cattcccatt gagatagatt ttgaggagta taaagtaaaa 780aaatttaatg aggagaagct tttagagctt tttaataaat tagaattctt tagtttaatt 840gataacataa agaaagaaag tagcatagag attgtagata atcataaagt tgaaaaatgg 900tcaaaagtag atataaaaga attagtaact ttgttgcaag ataacagaaa tattgctttt 960tacccgttaa tttatgaagg ggaaataaaa aaaatagcct tttcttttgg aaaggatacg 1020gtttatattg acgttttcca aacagaagat ttaaaggaga tttttgaaaa agaagatttt 1080gaatttacaa cccatgaaat aaaggatttt ttagtgaggc tttcttataa aggaatagag 1140tgtaaaagca agtacataga tactgctgta atggcttatc ttctgaatcc ttctgagtct 1200aactatgact tagaccgtgt gctaaaaaaa tatttaaagg tagatgtgcc ttcttatgaa 1260ggaatatttg gcaaaggtag ggataaaaag aaaattgaag agattgacga aaacatactt 1320gctgattata tttgcagtag atgtgtgtat ctatttgatt taaaagaaaa gctgatgaat 1380tttattgaag agatggatat gaaaaaactt ctattagaaa tagaaatgcc tcttgtagaa 1440gttttaaaat caatggaggt aagtggtttt acattggata aagaagttct aaaagagctt 1500tcacaaaaga tagatgatag aataggagaa atactagata aaatttataa agaggcagga 1560tatcaattta atgtaaattc acctaagcaa ttaagtgaat ttttgtttga aaagttaaac 1620ttaccagtaa taaagaaaac aaaaacagga tactctacgg attctgaagt tttggaacaa 1680ttggttcctt ataatgatat tgtcagcgat ataatagagt atcggcaact tacaaaactt 1740aaatctactt atatagatgg atttttgcct cttatggatg aaaacaatag agtacattct 1800aattttaaac aaatggttac tgctacaggt agaataagca gcaccgagcc aaatctacaa 1860aatataccta taagagaaga gtttggcaga caaattagaa gggcttttat tccgaggagt 1920agagatggat atattgtttc agcagattat tctcagattg aactgagggt tttagcacat 1980gtttcgggag atgaaaagct aatagaatct tttatgaata atgaagatat acatttaagg 2040acagcttcgg aggtttttaa agttcctatg gaaaaagtta caccggagat gagaagagca 2100gcaaaagccg taaattttgg cataatatat ggcataagcg attatgggct ttctcgagac 2160cttaaaatat caagaaaaga agcaaaagag tacataaata attattttga aagatataaa 2220ggagtaaaag attatattga aaaaatagta cgatttgcaa aagaaaatgg ctatgtgact 2280acaataatga acagaaggag atatattcct gaaataaact caagaaattt tactcaaaga 2340tcgcaggccg aaaggttagc aatgaatgct ccgatacagg gaagtgcggc tgatataata 2400aaaatggcaa tggttaaggt atacaacgat ttaaaaaaat taaagcttaa gtctaagctt 2460atattgcaag ttcatgacga gcttgtagtg gatacttata aggatgaagt agatatcata 2520aaaaagatac ttaaagaaaa tatggaaaat gtagtgcaat taaaagttcc tctggttgtt 2580gaaattggcg tagggcctaa ttggtttttg gccaagtga2619
<210>3<211>872<212>PRT<213>热硫化氢热厌氧杆菌<400>3Met Tyr Lys Phe Leu Ile Ile Asp Gly Ser Ser Leu Met Tyr Arg Ala1 5 10 15Tyr Tyr Ala Leu Pro Met Leu Thr Thr Ser Glu Gly Leu Pro Thr Asn20 25 30Ala Leu Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Ile Lys Leu Ile Glu Glu Glu35 40 45Lys Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Phe Asp Lys Lys Ala Pro Thr Phe50 55 60Arg His Lys Glu Tyr Gln Asp Tyr Lys Ala Thr Arg Gln Ala Met Pro65 70 75 80Glu Glu Leu Ala Glu Gln Val Asp Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gly85 90 95Phe Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile100 105 110Ile Gly Thr Ile Ser Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Met Glu Val Leu115 120 125Val Val Thr Gly Asp Arg Asp Ala Leu Gln Leu Val Ser Asp Lys Val130 135 140Lys Ile Lys Ile Ser Lys Lys Gly Ile Thr Gln Met Glu Glu Phe Asp145 150 155 160Glu Lys Ala Ile Leu Glu Arg Tyr Gly Ile Thr Pro Gln Gln Phe Ile165 170 175Asp Leu Lys Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val180 185 190Pro Asn Ile Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu Lys Asp Phe Gly195 200 205Thr Ile Glu Asn Leu Ile Gln Asn Leu Ser Gln Leu Lys Gly Lys Ile210 215 220Lys Glu Asn Ile Glu Asn Asn Lys Glu Leu Ala Ile Met Ser Lys Arg225 230 235 240Leu Ala Thr Ile Lys Arg Asp Ile Pro Ile Glu Ile Asp Phe Glu Glu245 250 255Tyr Lys Val Lys Lys Phe Asn Glu Glu Lys Leu Leu Glu Leu Phe Asn260 265 270Lys Leu Glu Phe Phe Ser Leu Ile Asp Asn Ile Lys Lys Glu Ser Ser275 280 285
Ile Glu Ile Val Asp Asn His Lys Val Glu Lys Trp Ser Lys Val Asp290 295 300Ile Lys Glu Leu Val Thr Leu Leu Gln Asp Asn Arg Asn Ile Ala Phe305 310 315 320Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Gly Glu Ile Lys Lys Ile Ala Phe Ser Phe325 330 335Gly Lys Asp Thr Val Tyr Ile Asp Val Phe Gln Thr Glu Asp Leu Lys340 345 350Glu Ile Phe Glu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Thr Thr His Glu Ile Lys355 360 365Asp Phe Leu Val Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Ile Glu Cys Lys Ser Lys370 375 380Tyr Ile Asp Thr Ala Val Met Ala Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Glu Ser385 390 395 400Asn Tyr Asp Leu Asp Arg Val Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Val Asp Val405 410 415Pro Ser Tyr Glu Gly Ile Phe Gly Lys Gly Arg Asp Lys Lys Lys Ile420 425 430Glu Glu Ile Asp Glu Asn Ile Leu Ala Asp Tyr Ile Cys Ser Arg Cys435 440 445Val Tyr Leu Phe Asp Leu Lys Glu Lys Leu Met Asn Phe Ile Glu Glu450 455 460Met Asp Met Lys Lys Leu Leu Leu Glu Ile Glu Met Pro Leu Val Glu465 470 475 480Val Leu Lys Ser Met Glu Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Lys Glu Val485 490 495Leu Lys Glu Leu Ser Gln Lys Ile Asp Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu500 505 510Asp Lys Ile Tyr Lys Glu Ala Gly Tyr Gln Phe Asn Val Asn Ser Pro515 520 525Lys Gln Leu Ser Glu Phe Leu Phe Glu Lys Leu Asn Leu Pro Val Ile530 535 540Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Asp Ser Glu Val Leu Glu Gln545 550 555 560Leu Val Pro Tyr Asn Asp Ile Val Ser Asp Ile Ile Glu Tyr Arg Gln565 570 575Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Gly Phe Leu Pro Leu Met580 585 590Asp Glu Asn Asn Arg Val His Ser Asn Phe Lys Gln Met Val Thr Ala595 600 605
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tttgaaaaag aagattttga atttacaacc catgaaataa aggatttttt agtgaggctt 240tcttataaag gaatagagtg taaaagcaag tacatagata ctgctgtaat ggcttatctt 300ctgaatcctt ctgagtctaa ctatgactta gaccgtgtgc taaaaaaata tttaaaggta 360gatgtgcctt cttatgaagg aatatttggc aaaggtaggg ataaaaagaa aattgaagag 420attgacgaaa acatacttgc tgattatatt tgcagtagat gtgtgtatct atttgattta 480aaagaaaagc tgatgaattt tattgaagag atggatatga aaaaacttct attagaaata 540gaaatgcctc ttgtagaagt tttaaaatca atggaggtaa gtggttttac attggataaa 600gaagttctaa aagagctttc acaaaagata gatgatagaa taggagaaat actagataaa 660atttataaag aggcaggata tcaatttaat gtaaattcac ctaagcaatt aagtgaattt 720ttgtttgaaa agttaaactt accagtaata aagaaaacaa aaacaggata ctctacggat 780tctgaagttt tggaacaatt ggttccttat aatgatattg tcagcgatat aatagagtat 840cggcaactta caaaacttaa atctacttat atagatggat ttttgcctct tatggatgaa 900aacaatagag tacattctaa ttttaaacaa atggttactg ctacaggtag aataagcagc 960accgagccaa atctacaaaa tatacctata agagaagagt ttggcagaca aattagaagg 1020gcttttattc cgaggagtag agatggatat attgtttcag cagattattc tcagattgaa 1080ctgagggttt tagcacatgt ttcgggagat gaaaagctaa tagaatcttt tatgaataat 1140gaagatatac atttaaggac agcttcggag gtttttaaag ttcctatgga aaaagttaca 1200ccggagatga gaagagcagc aaaagccgta aattttggca taatatatgg cataagcgat 1260tatgggcttt ctcgagacct taaaatatca agaaaagaag caaaagagta cataaataat 1320tattttgaaa gatataaagg agtaaaagat tatattgaaa aaatagtacg atttgcaaaa 1380gaaaatggct atgtgactac aataatgaac agaaggagat atattcctga aataaactca 1440agaaatttta ctcaaagatc gcaggccgaa aggttagcaa tgaatgctcc gatacaggga 1500agtgcggctg atataataaa aatggcaatg gttaaggtat acaacgattt aaaaaaatta 1560aagcttaagt ctaagcttat attgcaagtt catgacgagc ttgtagtgga tacttataag 1620gatgaagtag atatcataaa aaagatactt aaagaaaata tggaaaatgt agtgcaatta 1680aaagttcctc tggttgttga aattggcgta gggcctaatt ggtttttggc caagtga1737<210>5<211>872<212>PRT<213>热硫化氢热厌氧杆菌<400>5Met Tyr Lys Phe Leu Ile Ile Asp Gly Ser Ser Leu Met Tyr Arg Ala1 5 10 15Tyr Tyr Ala Leu Pro Met Leu Thr Thr Ser Glu Gly Leu Pro Thr Asn20 25 30Ala Leu Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Ile Lys Leu Ile Glu Glu Glu35 40 45Lys Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Phe Asp Lys Lys Ala Pro Thr Phe50 55 60Arg His Lys Glu Tyr Gln Asp Tyr Lys Ala Thr Arg Gln Ala Met Pro65 70 75 80Glu Glu Leu Ala Glu Gln Val Asp Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gly85 90 95Phe Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Ile100 105 110Ile Gly Thr Ile Ser Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Met Glu Val Leu115 120 125Val Val Thr Gly Asp Arg Asp Ala Leu Gln Leu Val Ser Asp Lys Val130 135 140
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<223>人工序列的描述引物<400>20ggcattggcc acaccagcca ccacctt 27<210>21<211>50<212>DNA<213>热硫化氢热厌氧杆菌<400>21caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca50<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>22ggcattggcc acaccagcca ccacctt 27<210>23<211>40<212>PRT<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)<400>23Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu Met Arg Arg Ala Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val Thr Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys35 40<210>24<211>40<212>PRT<213>那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)<400>24Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Asn Glu Glu Met Arg Arg Val Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val Thr Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys35 40<210>25<21l>40<212>PRT<213>Thermotoga subterranea<400>25Gly Val Ser Glu Met Phe Val Ser Glu Gln Met Arg Arg Val Gly Lys1 5 10 15Met Val Asn Phe Ala Ile Ile Tyr Gly Val Ser Pro Tyr Gly Leu Ser20 25 30Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser35 40<210>26<211>40<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>26Gly Leu Pro Leu Glu Thr Val Thr Ser Glu Gln Arg Arg Ser Ala Lys1 5 10 15
Ala Ile Asn Phe Gly Leu Ile Tyr Gly Met Ser Ala Phe Gly Leu Ala20 25 30Arg Gln Leu Asn Ile Pro Arg Lys35 40<210>27<211>40<212>PRT<213>Thermus caldophilus<400>27Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu35 40<210>28<211>40<212>PRT<213>丝状栖热菌(Thermus filiformis)<400>28Gly Leu Asp Pro Ala Leu Val Asp Pro Lys Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Gly Ile Asp Tyr Lys35 40<210>29<211>40<212>PRT<213>黄栖热菌(Thermus flavus)<400>29Gly Val Ser Pro Glu Gly Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu35 40<210>30<211>40<212>PRT<213>嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)<400>30
Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu35 40<210>31<211>40<212>PRT<213>水生栖热菌(Thermus aquaticus)<400>31Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser20 25 30Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu35 40<210>32<211>40<212>PRT<213>热硫化氢热厌氧杆菌<400>32Lys Val Pro Met Glu Lys Val Thr Pro Glu Met Arg Arg Ala Ala Lys1 5 10 15Ala Val Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser20 25 30Arg Asp Leu Lys Ile Ser Arg Lys35 40
权利要求
1.一种具有酶活性的DNA聚合酶或其活性片断，在氨基酸序列上具有同热硫化氢热厌氧杆菌DNA聚合酶或其片断至少80％的同一性，并且在Tts PolI位点720或ΔTts Pol I位点426或针对Tts DNA聚合酶I确定的同源位点上有一个氨基酸的改变，与未改变的酶相比提高了核苷酸类似物和天然碱基在DNA合成中的掺入。
2.权利要求1的聚合酶，其中所述核苷酸类似物是dNTP，ddNTP和rNTP类似物。
3.权利要求2的聚合酶，其中所述dNTP，ddNTP和rNTP类似物是染料-偶联或生物素偶联的dNTP，ddNTP和rNTP。
4.权利要求3的聚合酶，其中所述染料-偶联的dNTP，ddNTP和rNTP中的染料是若丹明或花青衍生的染料。
5.权利要求4的聚合酶，其中所述若丹明染料是R110，R6G，TMR或Rox。
6.权利要求4的聚合酶，其中所述花青衍生的染料是Cy3，Cy3.5，Cy5.0或Cy5.5。
7.权利要求1的聚合酶，其中所述聚合酶在Tts Pol I位点720或ΔTtsPolI位点426的天冬氨酸被精氨酸取代。
8.利用权利要求1的聚合酶进行直接RNA测序的方法。
9.利用权利要求1的聚合酶在37-65℃的反应温度范围掺入Cy3和Cy5染料偶联的dNTPs的方法。
10.包含权利要求1的DNA聚合酶的试剂盒，该试剂盒用于标记采用DNA或RNA引物从DNA或RNA模板获得的多核苷酸。
全文摘要
一种具有酶活性的DNA聚合酶或其活性片断，在氨基酸序列上具有同热硫化氢热厌氧杆菌DNA聚合酶或其片断至少80％的同一性，并且在Tts Pol I位点720或ΔTts Pol I位点426或针对Tts DNA聚合酶I确定的同源位点上有一个氨基酸的改变，与未改变的酶相比提高了核苷酸类似物和天然碱基在DNA合成中的掺入。
文档编号C12N1/21GK1604907SQ02825310
公开日2005年4月6日 申请日期2002年12月20日 优先权日2001年12月20日
发明者M·达维斯, C·帕拉尼亚潘 申请人:阿默森生物科学有限公司